Article de méthode

Formulation de doses tracantes de vitamine A pour l’administration à des sujets humains utilisant la technique de dilution des isotopes de rétinol

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DOI :

10.3791/69240

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31 mars 2026

 , 
1Human Nutrition and Exercise Research Centre, Newcastle University, 2Fera Science Ltd

Dans cet article

Résumé

La préparation de la vitamine A stable marquée par des isotopes, nécessaire à la technique de dilution des isotopes du rétinol, doit respecter les normes de sécurité alimentaire. Le protocole indique la préparation des dosages dans de l’huile végétale à des concentrations adaptées au système de délivrance choisi et à la plateforme analytique appliquée.

Résumé

La technique de dilution isotopique du rétinol (RI) repose sur l’administration de traceurs de vitamine A marqués isotopiquement à des sujets humains. Ici, nous présentons une méthode pour guider les équipes de recherche sur la préparation des traceurs isotopiques stables de la vitamine A pour les études de recherche et les enquêtes de population. L’article présente un aperçu de la préparation, de l’approvisionnement des matériaux, des équipements nécessaires et des procédures pour garantir que les traceurs sont sûrs pour la consommation humaine. Les traceurs isotopiques stables de vitamine A peuvent être obtenus commercialement et sont généralement marqués soit avec du deutérium [2H], soit avec du carbone-13 [13C] avec une pureté isomérique entièrement trans à > 95 % et un enrichissement isotopique >99 %. La préparation des traceurs isotopiques stables en vitamine A consiste à dissoudre le traceur dans de l’huile végétale comestible par sonication et chaleur. Les traceurs doivent être préparés à une concentration bien dans les limites volumétriques du système de délivrance. Enfin, le traceur est aliquoté dans des fioles en verre ambré stériles, et les concentrations du traceur sont confirmées spectrophotométriquement.

Introduction

Pour permettre un suivi efficace des programmes d’intervention visant à réduire la carence en vitamine A, la méthode de dilution isotopique du rétinol (RID) a été appliquée avec succès pour fournir des informations sur les réserves de vitamine A corporelle totale (TBS) dans divers groupesde population 1, 2, 3, 4. Alors que le rétinolsérique 5, la protéine de liaison sérique au rétinol (RBP) 6,7,8 et la réponse à la dose relativemodifiée (MRDR) 9 sont souvent utilisés pour confirmer la carence en vitamine A, le DI est la seule méthode qui quantifie avec précision les réserves totales de vitamine A corporelle sur tout le spectre — de la carence subclinique à latoxicité 3,10. En administrant une dose connue de vitamine A marquée et en mesurant sa dilution dans le plasma après l’équilibre, la méthode RID fournit des estimations précises du TBS et des réserves de vitamine Ahépatique 11,12. Il est important de noter que la méthode RID reste fiable même dans les populations inflammatoires, ce qui la rend indispensable pour évaluer l’efficacité de l’intervention et évaluer les risques de toxicité dans les programmes de supplémentation et de renforcement qui sechevauchent 13,14.

Pour appliquer la méthode de la DRI, la vitamine A marquée isotopiquement doit être administrée sous forme de dose orale d’ester de rétinyl, qui dans la plupart des cas est de l’acétate de rétinyle dissous dans de l’huile végétale comestible. La plupart des laboratoires obtiennent la vitamine A marquée par des isotopes auprès de fournisseurscommerciaux 1,3,7,15,16,17,18,19,20,21,22. Presque tous les traceurs isotopiques de vitamine A disponibles dans le commerce sont marqués à l’aide d’isotopes stables de carbone-13 [13C] ou de deutérium [2H] (Tableau 1). Le choix de la dose isotopique appliquée dépend de l’instrument analytique utilisé pour déterminer la concentration sérique ou plasmatique du rétinol marqué en masse. Alors que la chromatographie gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS) et la chromatographie liquide-spectrométrie de masse tandem (LC-MS/MS) peuvent analyser à la fois [13C] et [2H]22,23,24,25,26,27, la chromatographie gazeuse-combustion-rapport isotope spectrométrie de masse (GC-C-IRMS) ne peut analyser que les traceurs de rétinol marqués [13C] 4,25,28. Les limites de détection de l’instrument analytique choisi, du groupe cible (enfants ou adultes) et la durée de l’enquête détermineront la taille de la dose à appliquer 3,25,29. À ce jour, les doses d’isotopes appliquées varient de 0,3 à 4,3 mg équivalent rétinol (ER ; équivalent à 1 - 15 μmol RE) chez lesenfants de 3, 4, 30 et de 0,6 à 10,0 mg d’RE (équivalent à 2 - 35 μmol RE) chezles adultes 2, 3, 31, avec des études plus récentes appliquant des doses plus faibles allant de 0,3 à 0,6 mg d’ER (1 - 3 μmol RE) chez les enfants et 0,6 à 2,0 mg d’RE (2 - 7 μmol RE) chez les adultes. Bien que des craintes aient été soulevées quant à une forte masse de vitamine A dans cette dose pourrait perturber la cinétique sous-jacente de la vitamine A, une analyse récente utilisant la modélisation compartimentée a confirmé que des doses isotopiques allant jusqu’à 7 μmol RE chez les enfants ou 14 μmol RE chez les adultes ne devraient pas affecter la précision des prédictionsTBS 29. Ici, nous allons démontrer comment préparer un traceur marqué par un isotope pour une application orale dans la méthode RIM, en tenant compte des préoccupations liées à la sécurité alimentaire et en obtenant des concentrations de dose précises. La préparation de la dose isotopique est essentielle pour la méthode de DRI.

Protocole

L’étude 1 a été approuvée par le National Research Ethics Service, North-East Sunderland Committee (REC 09/H0904/20) avant son enregistrement auprès du UK Clinical Research Network (UKCRN : 7413). L’étude 2 a été approuvée par le Research Ethics Board de l’Université des Philippines, Manille (IRB ID : UPMREB 2016-282-01), le Institutional Review Board de l’UC, Davis (IRB ID : 903681-2), et enregistrée au ClinicalTrials.gov (ID : NCT03030339). L’étude 2 faisait partie du projet GloVitAS financé par la Fondation Bill et Melinda Gates (OPP1115464 : Évaluation du risque de toxicité à la vitamine A due à la fortification alimentaire à grande échelle et à d’autres interventions). Georg Lietz était l’enquêteur principal du projet GloVitAS et supervisait la mise en œuvre de l’étude de terrain. Un aperçu du protocole d’étude est présenté à la Figure 1.

1. Critères d’inclusion et d’exclusion

  1. Pour l’étude 1, les critères donnés étaient : Critères d’inclusion : inclure des volontaires masculins et féminins en bonne santé âgés de 18 à 45 ans. Critères d’exclusion : Excluez les volontaires ayant une grossesse, du tabagisme, de l’hypertension artérielle, du diabète, un IMC >30, des maladies du foie/des reins/gastro-intestinaux, des troubles métaboliques lipidiques et la consommation de multivitamines (contenant les vitamines A, C, E) ou de suppléments de β-carotène 3 mois avant le début de l’étude.
  2. Pour l’étude 2, les critères donnés étaient : Critères d’inclusion : inclure les enfants de 12 à 18 mois restant dans la zone d’étude pendant toute la durée de l’étude. Critères d’exclusion : Exclure si les enfants n’ont pas reçu de supplémentation en vitamine A à forte dose et vivaient dans des zones non exposées aux aliments enrichis en vitamine A sur les marchés locaux.

2. Détermination de la quantité totale de traceur isotopique stable pour le RID

  1. Décidez de la quantité de traceur isotopique stable que chaque sujet doit recevoir en tenant compte de la pureté isomérique. Il est recommandé d’utiliser des isotopes stables de la vitamine A avec une pureté all-trans à >95 %, car l’activité biologique et les voies métaboliques diffèrent significativement entre les isomères géométriques. Calculez le niveau de dose en fonction des équivalents de rétinol (RE). Un exemple de calcul est donné dans le tableau 2.
  2. Multipliez le niveau de dose par le nombre total de sujets. Nombre total de base de sujets sur les calculs de puissance pour la taille d’échantillon requise, mais augmente en fonction de l’attrition attendue (voir le tableau 2 par exemple). Augmentez la quantité totale de traceur nécessaire en tenant compte des pertes de pipetage allant jusqu’à 20 %.
    REMARQUE : En règle générale, la préparation des isotopes doit inclure un excédent, car il n’est pas possible de récupérer tout le matériau du flacon. Des pertes supplémentaires surviennent en raison de la viscosité de l’huile qui reste à l’extérieur de la pointe de la pipette. Pour obtenir des volumes précis de la dose pendant l’accouchement, il faut essuyer l’excès d’huile à l’extérieur de la pointe de la pipette. Les opérateurs peuvent minimiser les pertes de pipetage si la pointe de la pipette n’est pas trop profondément plongée dans l’huile.

3. Déterminer la quantité d’huile végétale nécessaire pour dissoudre le traceur isotopique stable

  1. Décidez quelle huile végétale utiliser et le volume de la dose par sujet (Tableau 2). Déterminez la quantité d’huile ajoutée par le système de délivrance utilisé lors du dosage des sujets.
    REMARQUE : Nous utilisons de l’huile de tournesol en raison de la forte teneur en vitamine E, qui favorise la stabilité de la préparation à lavitamine A 32,33. Cependant, d’autres huiles végétales ont été utilisées par d’autres groupes pour satisfaire aux normes alimentaires locales. Puisque le RID repose sur une délivrance précise de traceurs stables marqués par des isotopes, il est recommandé d’utiliser une pipette à déplacement positif pour l’application de dose préparée dans de l’huile comestible. Les études les plus récentes ont utilisé des volumes allant jusqu’à 250 μL, en particulier si la dose est administrée auxenfants 1, 7, 23.
  2. Calculez la concentration de dose du traceur isotopique stable dans l’huile végétale [mg/mL]. Déterminez le volume total d’huile végétale nécessaire. Calculez le poids de l’huile nécessaire, en fonction du volume calculé et de la densité relative de l’huile végétale (voir le tableau 2 pour un exemple).
    REMARQUE : Pour des raisons de précision, il est recommandé de peser l’huile pour une préparation stable du traceur isotopique. Une fois le volume total de pétrole nécessaire calculé, le traceur stable marqué par un isotope peut être commandé. Il est important de demander que le traceur isotopique soit expédié dans une bouteille de volume suffisant afin que l’équipe de recherche puisse peser l’huile végétale directement dans la bouteille contenant le traceur marqué par l’isotope.

4. Préparation d’un traceur stable marqué par des isotopes dans des zones dédiées à la préparation des aliments

  1. Ouvrez soigneusement le couvercle de la bouteille ambrée contenant la quantité totale prédéterminée du traceur isotopique stable et placez-la sur une balance analytique, qui est ensuite placée à zéro.
  2. Ajoutez l’huile goutte par goutte jusqu’à atteindre le poids désiré (avec une précision de ± 0,1 g) à l’aide d’une seringue stérile de 10 mL.
    REMARQUE : Comme certains cristaux d’acétate de rétinyl peuvent être piégés à l’intérieur du bouchon de la bouteille ambrée, il faut ouvrir la bouteille avec beaucoup de précaution. Après avoir ajouté l’huile végétale dans la bouteille ambrée, le bouchon est soigneusement replacé sur la bouteille, puis secoué à la main pour resuspendre les cristaux d’acétate de rétinyle restants à l’intérieur du bouchon.
  3. Placez la bouteille dans un bain-marie à sonique avec une puissance ultrasonique : 14 W/L et une fréquence de fonctionnement : 44 kHz. Remplissez d’eau au-dessus du niveau d’huile dans la bouteille, mais en dessous du niveau du couvercle, pour éviter que l’eau ne pénètre accidentellement dans la préparation.
  4. Sonicez la bouteille pendant 15 minutes avant de mixer soigneusement à la main, puis faites une sonorisation supplémentaire de 15 minutes. Il faut veiller à ce que la température du bain-marie sonicant ne dépasse pas 50 °C.
    REMARQUE : En utilisant de l’huile de tournesol pour la préparation, nous avons constaté que l’isomérisation en rétinoïdes cis ne se produit pas lorsque la dose est exposée à 50 °C pendant 30 minutes (voir Figure 2). Cependant, les préparations doivent être analysées par HPLC afin d’évaluer l’étendue de l’isomérisation thermique.
  5. Placez la bouteille dans un bain-marie chauffé à 50 °C pendant 30 minutes pour dissoudre complètement les microcristaux.
  6. Prélever un échantillon de 20 μL d’huile pour vérifier la présence de microcristaux sous un microscope optique à un gros 200x en laboratoire. Si des microcristaux sont présents, répétez la procédure de sonication et de chauffage.
  7. Une fois la dissolution complète obtenue, aliquotez la préparation totale de l’huile dans des fioles en verre ambré stériles de 2 à 4 mL. Utilisez des pipettes à déplacement positif pour cette procédure afin d’éviter la contamination croisée.
    REMARQUE : Le volume de traceur isotopique stable ajouté aux fioles ambrées en verre peut être guidé par le taux de recrutement quotidien, par exemple, si 5 sujets sont recrutés par jour et que le volume de dose est de 150 μL, le flacon doit contenir un volume suffisant pour supporter 5 doses plus les pertes de pipetage : 5 x 150 μL x 1,2 = 900 μL.
  8. Déterminer la concentration isotopique stable en triple exemplaire. Réservez 200 μL d’huile végétale pure (utilisée pour la préparation d’un blank spectrophotométrique) et 200 à 350 μL de la dose isotopique stable dans des fioles ambrées séparées de 2 mL lors de la préparation du traceur marqué par l’isotope stable.
    1. Si la concentration de dose est ≤ 0,5 mg d’éponge renouvelable, réservez 350 μL de l’isotope stable dans un flacon ambre séparé de 2 mL. Pour les concentrations de dose > 0,5 mg d’éponge de l’épaule épongique (EE), réservez 200 μL de la dose isotopique stable dans un flacon ambre séparé de 2 mL.
  9. Recouvrir les flacons d’un gaz inerte (Ar) pour retarder l’oxydation potentielle du traceur marqué par l’isotope, fermer hermétiquement et stocker dans une cryobox marquée par la concentration isotopique, le volume de dose (déterminé ensuite), la date de préparation et le nom du projet. Conservez la cryobox dans un congélateur alimentaire à -20 °C jusqu’à l’expédition. Dans ces conditions, la dose de traceur reste stable pendant au moins 2 ans.

5. Détermination de la concentration stable de traceurs isotopiques en laboratoire

  1. Diluez le traceur isotope stable dans 3 flasques volumétriques avec du n-hexane. Remplissez les flasques volumétriques de n-hexane jusqu’à 1 cm sous la ligne d’étalonnage avant d’ajouter la dose tracante.
    1. Déterminez la dilution du traceur isotopique stable par la dose de traceur. Si la concentration de dose du traceur isotopique stable est ≤ 0,5 mg d’éponge épongiculaire, diluez 100 μL de la dose isotopique stable dans un flacon volumétrique de 50 mL avec du n-hexane. Si la concentration de dose est comprise entre 0,5 et 2 mg de remède, alors 50 μL de la dose isotopique stable dans une fiole volumétrique de 50 mL contenant du n-hexane. Si la concentration de dose est de >2 mg d’éponge de l’éponge de 100 mL dans une fiole volumique de 100 mL avec du n-hexane.
    2. Injectez directement 50 ou 100 μL d’huile dans l’hexane et la fiole est produite à un volume de 50 ou 100 mL avec de l’hexane supplémentaire à l’aide d’une pipette Pasteur en verre. Inversez la fiole 10 fois pour mélanger l’huile avec l’hexane.
      ATTENTION : L’hexane doit être manipulé dans une armoire à fumée, en utilisant des équipements de protection appropriés. Les déchets hexanes sont collectés dans un contenant dédié pour une élimination spécialisée par un entrepreneur agréé.
  2. Préparez la fiole spectrophotométrique en pipettant le même volume d’huile végétale que le traceur isotopique stable (50 ou 100 μL) et en le distribuant dans de l’hexane. Assurez-vous que la dilution appliquée (50 ou 100 mL) est la même que pour le traceur isotope stable. Inversez la fiole 10 fois pour mélanger l’huile avec l’hexane.
    REMARQUE : Pour la pipetage soit d’un traceur isotopique stable, soit d’huile pure, une pipette à déplacement positif de 100 μL est utilisée. Pour garantir que des volumes précis sont pipetés, il est crucial que la pointe soit essuyée vers le bas à l’aide de papier sans peluches pour éliminer les traceurs ou l’huile résiduelles de l’extérieur de la pointe. Il faut faire attention lors de l’essuyage de la pointe de la pipette de remplacement directe afin que le papier ne touche pas l’ouverture de la pointe, car de l’huile sera prélevée à l’intérieur de la pointe.
  3. Mesurez les concentrations stables de traceurs isotopiques dans une cuvette en quartz à l’aide d’un spectrophotomètre réglé à une longueur d’onde de 325 nm, en utilisant l’huile végétale de l’hexane comme blanc spectrophotométrique (voir le tableau 3 pour un exemple).
    1. Commencez les mesures en utilisant l’huile végétale de l’hexane comme blank spectrophotométrique. Nettoyez la cuvette UV en quartz entre chaque mesure en la rinçant 3 fois avec du n-hexane. Après que tous les échantillons ont été mesurés, nettoyez soigneusement la cuvette avec du n-hexane pur.
  4. Déterminer la concentration du traceur isotopique stable en utilisant les lectures moyennes d’UA et appliquer le coefficient d’extinction molaire spécifique à l’isotope en utilisant la loi de Beer-Lambert. À partir de cela, calculez le volume du traceur isotopique stable préparé nécessaire par dose (voir exemple dans les résultats représentatifs ci-dessous et dans le tableau 3).

Résultats

Calcul de la taille totale de la dose du traceur isotopique
Pour une étude portant sur un échantillon de 100 sujets, la quantité totale d’acétate de rétinyle [13C 10] a été calculée afin d’identifier la quantité de [13C10]acétate de rétinyle à synthétiser (Tableau 2). La quantité est basée sur des calculs de puissance pour la taille requise des échantillons (n = 100), l’attrition attendue (n = 15 ; 15 % d’attrition), les pertes par pipetage (20 %) et la concentration de rétinyle acétate de rétinyle par dose [13C10] ; selon la sensibilité du spectromètre de masse appliqué, la durée de l’expérience et le groupe d’âge des sujets). La quantité totale obtenue de RE nécessaire (55,2 mg d’ER) est ensuite convertie en poids requis pour obtenir [13C10]acétate de rétinyle (63 mg).

Pour calculer le volume d’huile de tournesol nécessaire à dissoudre [13C10]acétate de rétinyle à la concentration souhaitée, nous avons d’abord fixé le volume de dose à 150 μL/dose (0,15 mL/dose). Ensuite, la concentration de [13C10]acétate de rétinyle dans 1 mL d’huile de tournesol est calculée (Tableau 2). Diviser le poids requis pour [13C, 10]acétate de rétinyle (63 mg) par la concentration de dose requise donne le volume total d’huile de tournesol nécessaire. Enfin, le poids de l’huile de tournesol est déterminé en utilisant la densité relative de l’huile de tournesol.

La concentration précise de dose cible de [13C10]acétate de rétinyle dans l’huile a été confirmée en mesurant les concentrations stables de traceurs isotopiques à l’aide d’un spectrophotomètre basé sur la loi de Beer-Lambert (Tableau 3). En tenant compte de la dilution du traceur isotopique stable lors de la mesure (facteur de dilution de 500), on obtient une concentration de 2,58 μmol/μL [13C10]acétate de rétinyle dans l’huile. Le volume final du traceur isotopique stable préparé nécessaire pour une dose de 0,4 mg d’RE a donc été déterminé à 155 μL (Tableau 3).

Vérification de la possible isomérisation de la dose de traceur
La pureté isomérique de la dose de traceur obtenue a été déterminée en vérifiant l’isomérisation cis à l’aide de la chromatographie liquide haute performance (HPLC ; Figure 2). Pour cela, un échantillon de la solution tracante diluée de l’étape 5.1.2 a été séché sous azote et le résidu dissous à 100 % d’éthanol pour injection. L’analyse HPLC de 3 échantillons répétés a été réalisée à l’aide de la méthode de Liu et al.34 pour vérifier toute isomérisation cis (voir Figure 2). La pureté de la dose de traceur doit être surveillée tout au long de l’étude afin de s’assurer que la dose ne se dégrade pas.

Effet des concentrations de la dose tracante sur une fraction de la dose au fil du temps
L’application de différents niveaux de dose entraînera une fraction variable de la dose ingérée au fil du temps, ce qui pourrait affecter la capacité de la plateforme analytique à détecter [13C10]rétinol chez tous les sujets aux moments requis. L’application d’une dose de 1 mg ou de 0,4 mg d’acétate de rétinyle [13C 10]dans de l’huile chez l’adulte (Figure 3A) ou chez l’enfant (Figure 3B) a révélé une fraction de dose plus élevée après administration de 1 mg comparée à 0,4 mg d’acétate de rétinyle [13C10] et a confirmé la capacité du LC-MS/MS appliqué à détecter [13C10]Rétinol chez les sujets jusqu’à 28 jours après la dose. Cela corrobore que l’information sur la fraction de dose à différents moments est cruciale pour déterminer si le niveau de dose appliqué est suffisamment élevé pour obtenir un signal au-delà du niveau de détection de la plateforme analytique appliquée, et que ces informations devraient idéalement être obtenues lors d’une étude pilote avec des échantillons représentatifs.

figure-results-1
Figure 1 : Organigramme pour la préparation des doses tracantes de vitamine A. Les étapes clés pour réaliser la préparation de la dose d’isotopes stable, incluant la détermination des quantités requises, la concentration de la dose de traceur obtenue et la confirmation de la pureté de la dose. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 2 : Chromatogramme HPLC de la dose tracante pour étudier l’isomérisation de l’acétate de rétinyle. Le potentiel d’isomérisation de [13C10]acétate de rétinyle après (A) sonication et (B) chauffage à 50 °C pendant 30 minutes chacun a été évalué à l’aide d’une analyse HPLC de la dose isotopique après chaque étape. L’analyse a été réalisée sur un HPLC avec détection de réseau de diodes selon la méthode de Liu et al.34. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 3 : Moyennes observées de la fraction plasmatique de la dose de rétinol sur le long du temps après l’ingestion de [13C10] acétate de rétinyl. Fraction de la dose de (A) : 45 adultesbritanniques : 16 ans et (B) 112 enfantsphilippins, 1 à qui l’on a administré respectivement soit une dose de 1 mg [13C, 10] d’acétate de rétinyle. Fraction de la dose = {concentration plasmatique [13C]rétinol (μmol/L) X volume plasmatique estimé (L) / [13C]dose (μmol). Les données affichées sous forme de moyenne géométrique ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Isotope stableFournisseur/Fabricant
[D4]-acétate de rétinyleBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratory
[D6]-acétate de rétinyleBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratory
[D8]-acétate de rétinyleBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratory
[13C3]-acétate de rétinyleBuchem BV/ReseaChem GmbH
[13C4] - acétate de rétinyleBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratory
[13C 8] - acétate de rétinyleBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratory
[13C10] - acétate de rétinyleBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratory

Tableau 1 : Traceurs isotopiques de vitamine A stables disponibles dans le commerce. Liste des traceurs d’acétate de rétinyle marqués 13C et 2H provenant de différents fournisseurs.

Paramètres
Taille de l’échantillon [n] :100
Attrition [n] ( %) :15 (15%)
Pertes par pipet :20%
Acétate de rétinyle MW [13 C 10] :338,5 μg/μmol
MW [13C10]rétinol :296,46 μg/μmol
Taille de la dose :0,4 mg d’RE de [13C10]acétate de rétinyle par volontaire
Calcul
Quantité totale de RE requise := taille de dose en mg RE x taille d’échantillon x attrition x pertes par pipetage
= 0,4 mg RE x 100 x 1,15 x 1,2
= 55,2 mg RE
Quantité totale de [13C10]acétate de rétinyle requise := mg RE x MW [13C10]acétate de rétinyle / MW [13C10]rétinol
= 55,2 mg RE x 338,5 μg/μmol / 296,46 μg/μmol
= 63,0 mg [13C 10] acétate de rétinyle
Concentration de dose de [13C10]acétate de rétinyle dans l’huile :[13C10]acétate de rétinyl [mg/ml] =
(mg RE x MW [13C10]acétate de rétinyle / MW [13C10] rétinol) / 0,15 ml
= (0,4 mg RE x 338,5 μg/μmol / 296,46 μg/μmol) / 0,15 ml
= 3,04 mg/ml
Volume total d’huile de tournesol requis := Concentration totale de [13C10] acétate de rétinyle / concentration en dose dans l’huile
= 63,0 mg / 3,04 mg/ml
= 20,7 ml d’huile
Poids d’huile de tournesol nécessaire := Volume total d’huile de tournesol x densité relative d’huile de tournesol
= 20,7 ml x 0,92 g/ml
= 19,0 g d’huile de tournesol

Tableau 2 : Exemple de calculs de taille de dose de traceur isotopique stable. Indication des paramètres et calculs pour déterminer la dose de traceur et la quantité d’huile végétale.

Paramètres
Coefficient d’extinction molaire (E1 %1 cm) de [13C10]acétate de rétinyle en hexane :52718 L mol-1 cm-1 x 1 cm
Facteur de dilution :500 (100μL de préparation à l’huile dans 50 mL d’hexane)
Absorbance moyenne mesurée :0.917
MW [13C10]rétinol :296,46 μg/μmol
Calcul
Concentration (mol/L) de [13C10]acétate de rétinyle dans l’hexane :Concentration (mol/L) = Absorption / E1 % 1 cm x Longueur de la cuvette (1 cm)
= 0,917 / 52718 L mol-1 cm-1 x 1 cm = 1,739 x 10-5 mol/L
Conversion de la concentration en μmol/μL :Concentration (mol/L) = Concentration (μmol/μL)
1,739 x 10-5 mol/L équivaut à 1,739 x 10-5 μmol/μL
Correction pour dilution :1,739 x 10-5 μmol/μL x 500 = 8,697 x 10-3 μmol/μL dans l’huile
Poids par μL (μg/μL) := [13C10] acétate de rétinyle μmol/μL dans le pétrole x MW [13C10] rétinol
= 8,697 x 10-3 μmol/μL x 296,45 μg/μmol = 2,58 μg/μL
Volume par dose := Volume (μL/ 400 μg dose) = 400 μg / 2,58 μg/μL = 155 μL

Tableau 3 : Détermination de la concentration stable de dose de traceur isotopique. Paramètres et calculs requis pour déterminer les concentrations de dosage traceur et les volumes requis pour la dose orale.

Discussion

Les traceurs isotopiques stables utilisés dans les études humaines sont généralement considérés comme sûrs, sans effets biologiques ou physiologiques néfastes rapportés aux concentrationsappliquées 25,35. Cependant, puisque le traceur isotopique stable doit être administré par voie orale, il est essentiel que la dose du traceur respecte les normes de sécurité alimentaire. Cela peut être obtenu en exigeant que les fournisseurs et fabricants de vitamine A marquée par des isotopes stables réalisent des tests de sécurité alimentaire sur les isotopesfournis 7,20,24. De même, il est impératif que la préparation et le stockage des isotopes ne soient effectués que dans des zones dédiées à la préparation des aliments. De plus, tout l’équipement utilisé pour préparer les isotopes stables doit être dédié uniquement à la préparation des isotopes et conservé dans les zones destinées à la préparation des aliments.

Les isotopes marqués à l’acétate de rétinyle ont déjà été dissous à l’aide d’éthanol, puis séchés sous du gaz azoté avant d’être dissous dans de l’huilevégétale 36. Ici, nous présentons une méthode permettant de dissoudre le traceur marqué par un isotope en huile végétale grâce à une combinaison de sonication et de chaleur. Bien que cette méthode soit plus facile à réaliser dans une zone de préparation alimentaire, il faut faire preuve de prudence lors de l’application de chaleur pour dissoudre le traceur dans l’huile végétale. Le tout-trans-rétinol est isomérisé en 13-cis-rétinol lors d’un traitement thermique, qui s’accélère avec des températures plusélevées 37. L’isomérisation du rétinol augmente encore lors de l’exposition à la lumière32. De plus, la stabilité du rétinol est influencée par la propriété d’oxydation lipidique de l’huilevégétale 32,38. Comme la teneur en α-tocophérol dans l’huile végétale a un impact positif sur la rétention de lavitamine A 32, et que l’huile de tournesol contient l’une des plus fortes teneurs en α-tocophérol33, nous avons choisi d’utiliser de l’huile de tournesol pour préparer les doses tracantes. La décision d’appliquer jusqu’à 50°C pour dissoudre le traceur reposait sur l’application de chaleur pour dissoudre les cristaux de rétinol dans des produits cosmétiques sans perte significative39. Bien que nous n’ayons pas observé de dégradation significative de l’acétate de rétinyl selon le protocole décrit, il est essentiel de vérifier la présence d’isomérisation cis de la dose tracante juste après le traitement thermique (Figure 2). Nous recommandons en outre que la stabilité de la dose de traceur soit surveillée tout au long de l’étude afin de confirmer la concentration de dose appliquée.

Le traceur doit être préparé à une concentration bien dans les limites volumétriques du système de délivrance utilisé pour administrer la dose requise. Puisque le RID repose sur une délivrance précise de traceurs stables marqués par des isotopes, il est recommandé d’utiliser une pipette à déplacement positif pour l’application de la dose. Bien que des doses allant jusqu’à 1 mL aient été appliquées par le passé auxadultes 16, 20, 40, il est plus facile d’appliquer des volumes compris entre 100 et 250 μL, car ces volumes ont été bien tolérés par les nourrissons etles enfants 1. Alternativement, les doses peuvent également être administrées sous forme decapsule 17, mais il est essentiel de sélectionner des capsules spécifiquement conçues pour prévenir les fuites d’huile et garantir leur acceptabilité au sein de la population étudiée. Enfin, les niveaux de dose appliqués dépendent du groupe d’âge de la populationcible 29, de la capacité de la plateforme analytique appliquée à détecter les faiblesniveaux 3 et des réserves corporelles totales de la population cible, avec une fraction plasmatique plus faible lors des réserves corporelles totaux plusélevées 1.

Comme indiqué dans l’exemple ci-dessus, [13C10]acétate de rétinyle à une concentration de 2,58 μg/μL dans de l’huile de tournesol fournira une dose de 0,4 mg de traceur de rétinyle dans 155 μL d’huile de tournesol, qui peut être administrée avec précision à l’aide d’une pipette à déplacement positif de 250 μL. Pour obtenir des concentrations qui respectent les limites volumétriques du système de délivrance, il est crucial que l’huile végétale choisie pour solubiliser le traceur soit correctement pesée à l’aide d’une balance analytique (précise à 0,1 g) dans la bouteille contenant le traceur isotopique stable. Par exemple, si un total de 63 mg [13C10] acétate de rétinyle doit être préparé à une concentration de 3,04 mg/mL dans de l’huile de tournesol, et que la densité spécifique de l’huile de tournesol est de 0,92 g/mL à 25 ◦C, alors 19,0 g (20,7 mL x 0,92 g/mL) d’huile doivent être pesés dans la bouteille contenant le traceur. Bien que la concentration finale du traceur isotopique stable soit confirmée à l’aide d’une lecture par spectrophotomètre, une pesée précise du traceur isotopique et de l’huile appliquée garantit que les concentrations obtenues sont proches du volume de délivrance choisi pour chaque dose.

Il est conseillé d’aliquoter les préparations d’huile en fonction des besoins quotidiens prévus afin de s’assurer que toutes les doses dans un flacon sont utilisées dans les 2 semaines suivant l’ouverture du flacon. Il est préférable de conserver les préparations d’huile sur des poches de glace dans le champ pendant l’utilisation et de les recongeler dès que possible après le dosage. Bien que les préparations huileuses ne soient pas affectées par des cycles répétés de congélation et de décongélation, elles doivent toujours être protégées de la lumière et congelées lorsqu’elles ne sont pas utilisées.

En résumé, ce protocole détaille la préparation précise et le contrôle qualité des doses tracantes pour la méthode DID, garantissant une dosage précis, une stabilité et une sécurité précises. La méthode calcule les besoins en traceurs, optimise la solubilisation dans l’huile végétale et vérifie la pureté et la concentration grâce à la spectrophotométrie et à la HPLC. Des directives rigoureuses de manipulation et de stockage garantissent une intégrité fiable des traceurs pour des évaluations précises basées sur les isotopes.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à déclarer.

Remerciements

Le soutien à ce travail a été assuré par la Fondation Bill & Melinda Gates (Projet numéro : OPP1115464) et l’Agence internationale de l’énergie atomique (AIEA) à Vienne (Projet Numéro E4.30.30).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Fioles en verre ambré de 2 ml pour l’aliquotation des dosesFisher11573690Selon la taille de l’échantillon de l’étude et le nombre de volontaires administrés quotidiennement, il peut être plus efficace d’utiliser des fioles ambrées plus grandes, par exemple de 4 ml,
Flasques volumétriques de 100 mlFisher11323644Flacon volumétrique certifié Pyrex Borosilicate Class A
Fioles volumétriques de 50 mlFisher11313644Flacon volumétrique certifié Pyrex Borosilicate Class A
Balances analytiques & nbsp ;Fisher13592970
Pistons capillaires (pointes de pipette) CP100 10x96 TIPACKGilsonFD148314
Pistons capillaires CP1000ST 2x91GilsonF148180
Pistons capillaires CP250ST 6x96GilsonF148714
Cryobox en cartonStarlabA9623-8181
Hellma Cuvette UV quartzSLSCEL1600
Hexane 95 % N-Hexane pour HPLC certifié HPLCFisherH/0406/17
Couvercles pour fioles en verre ambré de 2 mlFisher11573542
Microman E M1000E Pipette (déplacement positif)GilsonFD10006
Microman E M100E Pipette (déplacement positif)GilsonFD10004
Pipette Microman E M250E (déplacement positif)GilsonFD10005
MicroscopeNikonEclipse E400
Lames de verre pour microscope & nbsp ;Sigma41122601
Bain marie sonoreVWRUSC100T
SpectrophotomètreThermo Fisher ScientificA51119600C
Traceur stable marqué par isotope de rétinyle acétate de rétinyleBuchem BVN/AUne gamme d’isotopes stables peut être utilisée pour la méthode de la méthode de la RDI. Une liste des différents isotopes disponibles dans le commerce est donnée dans le tableau 1. & nbsp ;
Bain marie non agitéSLSSLS1176
Huile végétaleN’importe quel supermarchéN/AIl est important d’utiliser de l’huile végétale fraîche avec une durée de conservation suffisante pour préparer des doses isotopiques.
Pipette à pasteur en verre débranché Volac 150mmSLSPIP4150

Références

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Mots-clés

Traceur isotopes stablesenrichissement isotopiquepr paration du traceurconfirmation spectrophotom triquemarquage au deut riummarquage au carbone 13dissolution dans l huile v g tale
Formulation de doses tracantes de vitamine A pour l’administration à des sujets humains utilisant la technique de dilution des isotopes de rétinol
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