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Un test sérologique multiplex pour la détection des réponses anticorps aux arbovirus

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DOI :

10.3791/69259

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4 novembre 2025

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1Infectious Diseases Epidemiology and Analytics G5 Unit, Department of Global Health, Institut Pasteur, Université Paris-Cité, INSERM U1347, 2Laboratory for Urgent Response to Biological Threats (CIBU), Environment and Infectious Risks (ERI) Unit, Institut Pasteur, Université Paris Cité, 3Immunology of Infectious Diseases Unit, Institut Pasteur de Madagascar, 4MRC Centre for Infectious Disease Analysis and Modelling, School of Public Health, Imperial College London, 5Immunophysiopathology and Infectious Diseases Department, Institut Pasteur de Dakar, 6Pasteur Network, Institut Pasteur, 7Department of Immunology, Institut Pasteur

Dans cet article

Résumé

Les immunodosages à fluorescence multiplex deviennent une référence pour les tests sérologiques. Leur application est toutefois limitée par la complexité et le temps nécessaire des processus de couplage bile-analyte. Ce rapport présente un protocole de couplage de microsphères multiplexes semi-automatisé et reproductible, comparable à la méthode standard, tout en réduisant considérablement le temps d’obtention des résultats.

Résumé

Les virus transmis par les arthropodes (arbovirus) sont un groupe d’agents pathogènes transmis par les moustiques qui sont distribués à l’échelle mondiale. Depuis l’épidémie de virus Zika (ZIKV) dans les Amériques en 2016, qui a porté ces infections à la connaissance du public, les arbovirus continuent d’imposer un fardeau considérable pour la santé publique. Leur émergence dans des régions auparavant non endémiques est une source de préoccupation pour la santé publique. La surveillance et le contrôle des infections à arbovirus sont une priorité actuelle pour l’Organisation mondiale de la santé (OMS), qui a lancé un plan stratégique mondial de lutte contre les maladies à arbovirus en 2024. La technologie multiplex® a révolutionné le domaine de la surveillance sérologique, permettant la mesure simultanée de plusieurs anticorps tout en nécessitant un volume d’échantillon minimal. S’appuyant sur l’expertise dans la mise au point de tests sérologiques multiplex, un test multiplex basé sur des billes pour la détection des anticorps contre les antigènes des arbovirus a été mis au point. Le test comprend plusieurs antigènes spécifiques des arbovirus courants, notamment les virus de la dengue (DENV), de la fièvre jaune (YFV), du Zika et du chikungunya (CHIKV). Une méthode semi-automatisée a été utilisée pour lier de manière covalente les antigènes aux billes de microsphères. Ce nouveau protocole est très efficace, car il permet de coupler jusqu’à 96 antigènes en une seule expérience tout en garantissant des résultats reproductibles. Les données d’intensité médiane de fluorescence (MFI) ont été acquises à l’aide d’un système d’imagerie de fluorescence convivial. Lorsqu’il est appliqué à des échantillons de sérum humain provenant de pays endémiques, nous prévoyons que ce test constituera un outil puissant pour les efforts de sérosurveillance.

Introduction

Les arbovirus sont responsables de milliers de décès chaque année. Ces virus sont transmis à l’homme par l’intermédiaire d’arthropodes infectés, principalement des moustiques et des tiques. La gravité des infections à arbovirus est diverse et va d’une infection asymptomatique à une maladie grave pouvant entraîner la mort. En 2024, l’Organisation mondiale de la santé (OMS) a enregistré plus de 10 000 décès causés par les quatre sérotypes du virus de la dengue (DENV) 1. La même année, le virus a infecté plus de 14 millions de personnes, dont 50 000 cas graves1. Bien que le DENV soit l’arbovirus le plus important, le groupe comprend d’autres agents pathogènes potentiellement mortels qui ont été responsables de plusieurs épidémies dans le monde entier. Un récent examen sommaire des infections à arbovirus en Afrique a révélé que ces virus, notamment le DENV, le virus de la fièvre jaune (YFV), le virus du chikungunya (CHIKV), le virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo (CCHFV), le virus de la fièvre de la vallée du Rift (RVFV), le virus du Nil occidental (WNV) et le virus Zika (ZIKV), ont provoqué au moins 29 épidémies sur le continent en 20232. En 2022, un rapport publié par le Bureau régional de l’OMS pour l’Afrique a mis en évidence les limites actuelles de la surveillance des arbovirus dans la Région, soulignant le besoin urgent de développer des méthodes de surveillance et de contrôle des arbovirus3.

Le diagnostic clinique des infections à arbovirus est difficile en raison des similitudes des symptômes, tels que la fièvre, l’arthralgie et le malaise général, qui sont communs à d’autres agents pathogènes présents dans les régions endémiques4. De plus, en raison de la co-circulation et potentiellement de la co-infection des virus, la distinction de l’agent pathogène étiologique est difficile5. La confirmation en laboratoire est cruciale pour le diagnostic différentiel. Plusieurs méthodes existent pour la détection des arborvirus dans les échantillons humains. Les méthodes directes, y compris les tests de diagnostic moléculaire, la détection de l’antigène viral et l’isolement viral, détectent la présence de l’agent pathogène, tandis que les méthodes indirectes, telles que le diagnostic sérologique, mesurent la réponse immunitaire à l’infection virale6.

Une pléthore de méthodes pour la détection des réponses anticorps aux arbovirus a été développée. Il s’agit notamment des tests immuno-enzymatiques (ELISA), de la fixation du complément, de l’inhibition de l’hémagglutination et des tests immunologiquesdes microsphères 6,7. Ce rapport présente un dosage immunologique basé sur des microsphères à fluorescence multiplex (FMIA) pour la détection des réponses anticorps aux antigènes d’arbovirus. Les tests basés sur les microsphères8 sont largement utilisés en sérologie et offrent plusieurs avantages, le plus important, la capacité de détecter plusieurs analytes en une seule réaction avec un volume d’échantillon minimal. Des microsphères codées optiquement (billes de polystyrène magnétiques) recouvertes d’antigènes recombinants d’intérêt sont utilisées dans un dosage immunologique sérologique indirect. Les billes couplées sont ensuite incubées avec des échantillons, et les anticorps spécifiques de l’antigène sont détectés à l’aide d’un anticorps secondaire IgG anti-humain conjugué à un rapporteur fluorophore de phycoérythrine (PE). Plusieurs analyseurs sont disponibles pour la détection de la fluorescence émise, qui est signalée comme MFI.

Le principe du test est détaillé dans Angeloni et al.8. En bref, les antigènes d’intérêt sont chimiquement liés à des microsphères codées par couleur. Pour cela, les billes sont d’abord traitées avec du 1-éthyl-3-[3-diméthylaminopropyl] carbodiimide (EDC) et du N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS), qui activent le groupe carboxyle à la surface des billes, créant ainsi un composé réactif aux amines. Ce composé semi-stable intermédiaire est ensuite mélangé à la protéine d’intérêt, les fractions amines de la protéine étant liées de manière covalente aux billes, générant des microbilles stables recouvertes de la protéine d’intérêt à la surface. Les billes liées à l’antigène sont incubées avec des échantillons, ce qui permet aux anticorps de se lier à des antigènes spécifiques. Les anticorps liés à l’antigène sont détectés à l’aide d’un anticorps secondaire anti-immunoglobuline conjugué à un colorant fluorescent. Nous utilisons des anticorps secondaires marqués au PE. Les IMF sont mesurées à l’aide d’un imageur de lumière (les détails de l’instrument sont fournis dans le tableau des matériaux). L’instrument utilise deux lumières LED, une LED rouge et une LED verte, qui excitent séparément les colorants internes des billes et une fluorescence rapporteure à la surface des billes9. Des filtres sont ensuite utilisés pour classer les billes en fonction de la couleur et pour quantifier la fluorescence émise par les analytes.

Nous avons déjà appliqué la technologie pour la détection des réponses anticorps au SRAS-CoV-210 et aux maladies évitables par la vaccination11 et montré que les tests multiplex constituent un outil inestimable pour les études de séroprévalence et de surveillance. L’objectif de ce projet est d’étendre l’utilisation de la FMIA à la détection des réponses anticorps à plusieurs antigènes appartenant aux arbovirus dans le but d’appliquer le test au criblage d’échantillons de la région africaine.

Des tests multiplexes d’arbovirus utilisant la technologie multiplex ont été décrits ailleurs en utilisant différentes cibles antigéniques telles que la protéine non structurale 1 (NS1)12,13 ou le domaine d’enveloppe III (EDIII)14. Un test 50-plex, qui comprend 26 antigènes d’arbovirus (y compris NS1, EDIII, des particules de type viral (VLP) et plusieurs autres antigènes pour tester les agents pathogènes qui co-circulent dans la région, est présenté. Le test permettra d’évaluer l’intensité de transmission de ces agents pathogènes. Le tableau 1 présente un résumé des antigènes recombinants utilisés pour la mise au point de l’essai.Le protocole présenté dans ce rapport a été développé en complément d’une étude approfondie de développement de méthodes axée sur l’optimisation de la détection des arbovirus.

Habituellement, le couplage (ou la fixation) des antigènes aux billes de microsphères est effectué dans des tubes simples8 (couplage manuel). Ce processus est chronophage, lourd et sujet à des erreurs de reproductibilité. Cet article présente un protocole utilisant un instrument automatisé pour effectuer les étapes successives impliquées dans la liaison chimique des antigènes aux billes. Dans ce manuscrit, nous rendons compte des étapes entreprises pour la validation du nouveau protocole. La validation du nouveau protocole a été effectuée en comparant les réponses IgG mesurées avec une FMIA 50-plex à l’aide de billes couplées à l’antigène préparées avec la méthode manuelle ou le protocole automatisé. Une validation supplémentaire de la méthode a été réalisée en analysant des échantillons de sérum humain provenant de cohortes africaines et françaises.

Le protocole de couplage automatisé des billes est rapide, permettant le couplage simultané de jusqu’à 96 analytes en une seule fois. Plus important encore, les résultats sont comparables à ceux obtenus à l’aide du protocole manuel établi, avec une variation réduite d’un lot à l’autre.

Protocole

L’utilisation d’échantillons humains a reçu l’approbation éthique appropriée. Les échantillons étaient des résidus anonymisés d’études antérieures. Le protocole d’utilisation d’échantillons ORPAL « standard pool » a été approuvé par le Conseil national d’éthique du Suriname (CMWO (Commissie voor Mensgebonden Wetenschappelijk Onderzoek), avis n° VG 25-17). L’utilisation d’échantillons provenant de Madagascar a été approuvée dans le cadre du projet PvSTATEM par le Comité d’éthique de la London School of Hygiene & Tropical Medicine (28541) et le Comité d’éthique de la recherche biomédicale de Madagascar (135MSANP/SG/AMM/CERBM), tandis que l’utilisation d’échantillons sénégalais a été approuvée dans le cadre du projet Dielmo et Ndiop en cours par le Comité national d’éthique de la recherche en santé du Sénégal (CNERS Sénégal). L’autorisation de mesurer les anticorps dirigés contre les MTN dans ces échantillons a été délivrée par le CNERS Sénégal (N 00000007 MSAS/CNERS/Sec). Les échantillons français non endémiques ont été prélevés à partir d’analyses médicales de routine dans des laboratoires hospitaliers français et traités conformément à la réglementation en vigueur et aux directives de la Commission Nationale de l’Informatique et des Libertés. Des échantillons de sérum humain ont été prélevés sur des sujets provenant de régions à forte prévalence d’arbovirus et d’une population française naïve. Les échantillons de sérum ont été inactivés à la chaleur avant d’être utilisés par incubation à 56 °C pendant 30 min. Si les échantillons ne sont pas inactivés, manipulez-les sous une enceinte de sécurité. La plupart des antigènes recombinants ont été obtenus commercialement, à l’exception des protéines recombinantes EDIII, qui ont été synthétisées en interne. Un analyseur basé sur l’imagerie9 a été utilisé pour l’acquisition des données. Les réactifs et l’équipement utilisés sont indiqués dans la table des matières.

1. Déterminer les concentrations optimales d’antigènes pour le couplage

REMARQUE : Pour éviter le photoblanchiment, minimisez l’exposition des billes de microsphères à la lumière tout au long de la procédure. Avant le couplage en vrac, optimisez les concentrations de couplage pour chaque antigène à l’aide d’un protocole de couplage manuel. Le protocole a été adapté d’Angeloni et al.8. Les zones tampons et les solutions sont détaillées dans le tableau supplémentaire 1.

  1. Sélectionnez les régions de cordon à utiliser pour le couplage. Tourbillon complet pendant 20 s. Sonicez le tube pendant au moins 60 s.
  2. Transférez 200 μL (billes de 2,5 m) de billes dans un tube de 1,5 mL.
  3. Lavez les billes avec 200 μL 100 mM de phosphate de sodium monobasique/0,125x Triton.
    1. Placez le tube sur un séparateur de tube magnétique pendant 60 s. Retirez délicatement le surnageant sans toucher les billes.
    2. Ajouter un tampon de phosphate de sodium monobasique. Laisser sur la grille magnétique pendant 60 s. Retirez le surnageant.
  4. Activez les billes avec un tampon contenant 80 μL de phosphate de sodium monobasique 100 mM, 0,125x Triton, 10 μL de sulfo-NHS et 10 μL d’EDC.
    1. Ajouter du phosphate de sodium monobasique -sulfo-NHS -EDC dans les tubes. Incuber dans l’obscurité pendant 20 min à température ambiante sur un rouleau.
    2. Lavez les billes dans 250 μL de PBS (1x) et de Triton 0,125x. Répétez le lavage trois fois.
  5. Lier les antigènes.
    1. Préparer les différentes concentrations (dilutions en série) des antigènes dans un volume total de 1 mL 1x PBS et 0,125x Triton. Testez au moins deux concentrations d’antigènes.
    2. Ajouter des solutions d’antigènes aux billes activées. Incuber dans l’obscurité 2 h à température ambiante ou une nuit à 4 °C sur un rouleau.
  6. Laver les billes couplées en 500 μL PBS-TBN et 0,125x Triton. Répétez le lavage trois fois.
  7. Remettre en suspension les billes couplées dans 1 mL de PBS-TBN et 0,125x Triton.
    REMARQUE : Stockez les billes couplées à 4 °C pendant au moins 24 h avant de les utiliser. Les billes couplées ont montré une variabilité dans les IMF lorsqu’elles ont été testées immédiatement après l’accouplement par rapport aux tests après 24 h.
  8. Sélectionnez une concentration optimale à utiliser lors d’un couplage ultérieur à grande échelle. Utilisez différentes billes couplées pour l’immunodosage sur un pool standard. Sélectionnez la concentration la plus faible à laquelle une courbe standard linéaire a été obtenue.
    REMARQUE : Un exemple de linéarité de la réponse des anticorps à un pool standard est fourni dans la section des résultats, Figure 1.

2. Couplage de talon automatisé à grande échelle

  1. Préparez des billes COOH Pro Magnetic.
    1. Calculez les billes requises : En utilisant 500 billes/échantillon, 2,5 millions de perles suffisent pour 5000 échantillons.
    2. Préparez les zones de cordon à utiliser pour le couplage comme décrit précédemment.
    3. Transférez le volume souhaité de billes dans les puits alloués. Pour 2,5 millions, 200 μL de billes (la concentration standard de Luminex est de 1,25e7 billes/mL) ont été utilisés.
  2. Préparez les antigènes. Il s’agit d’une étape essentielle pour garantir des quantités précises d’antigènes.
    1. Calculer les quantités d’antigène requises, après optimisation. Les concentrations utilisées pour chaque antigène sont détaillées dans le tableau 1.
    2. Dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml, mélangez soigneusement un volume adéquat d’antigènes d’intérêt avec 1x PBS / 0,125x Triton jusqu’à un total de 1 mL.
  3. Préparez des plaques avec des réactifs. Préparez des plaques à 96 puits de profondeur comme suit. Les volumes sont par puits et calculés pour 2,5 millions de billes de couplage.
    1. Plaque 1 (Peignes à pointes) : chargez les peignes à pointes.
    2. Planche 2 (billes) : Ajouter 8 μL de 0,125x Triton et 200 μL des régions de billes d’intérêt.
    3. Planche 3 (Wash1) : Ajouter 200 μL de phosphate de sodium monobasique 100 mM / 0,125x Triton.
    4. Planche 4 (activation) : Ajouter 80 μL de phosphate de sodium monobasique 100 mM / 0,125x Triton + 10 μL de sulfo-NHS + 10 μL d’EDC.
    5. Planche 5 (lavage 2) : Ajouter 250 μL de 1x PBS / 0,125x Triton.
    6. Planche 6 (couplage) : Transférer 1 mL de solution d’antigène dans le puits alloué.
    7. Planche 7 (Wash3) : Ajouter 500 μL de PBS-TBN/0,125x Triton.
    8. Plaque 8 (plaque finale, contient des billes couplées) : Ajouter 1 mL de PBS-TBN + 0,125x Triton.
  4. Configurez l’exécution du cycle de couplage dans le processeur automatisé.
    1. Suivez les instructions du fabricant pour allumer la machine et configurer le protocole. Le logiciel nécessaire est téléchargeable sur le PC15. Les paramètres spécifiques à l’exécution sont détaillés dans le tableau supplémentaire 2.
    2. Chargez les plaques dans la fente prévue à cet effet sur la machine. Sélectionnez le protocole. Démarrez le cycle. Le temps estimé pour terminer le programme est de 2:50 h.
  5. Fin de cycle
    1. Suivez les instructions du fabricant pour éteindre la machine. Déchargez les plaques comme indiqué. Vérifiez visuellement que la planche 8 contient les perles (pastille brune). De plus, un rapport d’exécution est exporté à partir des instruments.
    2. Transférez les billes couplées de la plaque 8 vers des tubes individuels de 1,5 mL pour le stockage. Stocker les billes accouplées à 4 °C jusqu’à utilisation.
  6. Comptez les perles.
    REMARQUE : Un compteur de cellule a été utilisé. Pour le comptage manuel à l’aide d’un hémacytomètre, reportez-vous au manuel du livre de cuisine Luminex8.
    1. Perles entièrement couplées par vortex. Transférez 10 μL dans une chambre de comptage de cellules. Suivez les instructions du fabricant pour lire le nombre de billes par ml.
    2. Vérifiez l’agrégation en visualisant l’image sur le compteur de cellules. Voir la figure supplémentaire 1 pour une image représentative des billes non agrégées.
    3. S’il y a des agrégats, agiter soigneusement et soniser pendant au moins 5 min. Comptage répété
      REMARQUE : Après le comptage des billes, l’efficacité du couplage a été évaluée en effectuant un dosage immunologique des billes couplées sur un pool standard afin d’évaluer la linéarité de la réponse anticorps.

Tableau 1 : Panel d’antigènes inclus dans le 50-plex. Le test comprend plusieurs antigènes pour la détection des infections arbovirales et des agents pathogènes co-circulants. Les quantités d’antigènes utilisées pour le couplage de 1,25 million de billes sont fournies. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

3. Immunodosage multiplex

REMARQUE : Les étapes détaillées du protocole de mesure de l’IFM sont fournies dans le manuel respectif9. Pour minimiser l’exposition des billes à la lumière et le risque de photoblanchiment, toutes les solutions et tous les échantillons sont préparés avant de sortir les billes du réfrigérateur.

  1. Configurez la disposition des plaques. Des plaques de 96 puits ont été utilisées et comprenaient des dilutions en série d’une piscine standard ainsi qu’un blanc (tampon uniquement) dans la première rangée.
  2. Diluer les échantillons et l’étalon dans un tampon PBT dans une plaque non contraignante séparée. Une dilution de 1:200 (concentration finale de 1:400) a été utilisée pour les échantillons. Pour la courbe standard, une dilution de 1:50 du pool de sérum standard (résultant en une concentration finale de 1:100) et dix dilutions en série de 2 fois ont été utilisées.
  3. Déterminer la quantité de billes couplées à utiliser dans un volume total de 50 μL/puits. 500 billes de chaque cordon par puits ont été utilisées et ajustées au volume avec un tampon PBT.
  4. Tourbillonnez soigneusement les billes couplées pendant 30 s. Sonicate pendant au moins 60 s.
  5. Calculez le volume de chaque bille couplée à ajouter au prémélange multiplex pour garantir des billes égales pour chaque analyte. Les volumes de billes ont été calculés comme suit : Volume de billes par puits = nombre de billes par puits/nombre de billes.
    REMARQUE : Le tableau supplémentaire 3 illustre un exemple de calcul des billes et des volumes de tampon nécessaires au prémélange.
  6. Transférez des volumes adéquats de billes et d’antigène dans un tube à centrifuger.
  7. Réglez le volume avec PBT.
  8. Mélangez soigneusement le prémélange.
  9. Répartissez 50 μL du prémélange dans la microplaque d’imagerie (par exemple, ps, plaques à fond f).
  10. Ajouter 50 μL des échantillons dilués dans les billes.
  11. Mélanger sur une plaque agitée pendant 30 min à température ambiante, 700 tr/min.
  12. Lavez les plaques trois fois comme suit (lavage manuel).
    1. Placez la plaque sur une grille magnétique pendant 60 s à température ambiante. Tenez fermement la plaque sur la grille et jetez le surnageant.
    2. Ajouter 100 μL de tampon PBT. Laisser sur la grille magnétique pendant 60 s. Répétez les lavages
      REMARQUE : Alternativement, une rondelle de plaque16 peut être utilisée. La laveuse a été réglée comme suit : 1 cycle de trempage, suivi de 3 cycles (aspiration, distribution et trempage) et d’un dernier cycle d’aspiration.
  13. Jeter le surnageant et ajouter 50 μL d’anticorps secondaire dilué.
    1. Suivez les instructions du fournisseur pour préparer une solution mère de l’anticorps secondaire. Une solution de dilution 1/120 d’anticorps secondaire a été utilisée. Les volumes d’anticorps secondaires ont été calculés comme suit : volume d’anticorps secondaires = volume total/facteur de dilution.
    2. Mélangez l’anticorps secondaire avec un volume adéquat de tampon PBT. Bien mélanger. Ajouter 50 μL d’anticorps secondaires dilués aux billes lavées.
  14. Incuber sur un agitateur pendant 15 min à température ambiante, 700 tr/min.
  15. Effectuez trois lavages comme décrit précédemment.
  16. Remettre les billes en suspension dans un tampon PBT de 150 μL.
  17. Incuber sur un agitateur pendant 5 min à température ambiante, 700 tr/min. Suivez les instructions du fabricant pour configurer les instruments9.
    REMARQUE : Le logiciel xPONENT17 fourni avec l’instrument imageur a été utilisé. Les paramètres de lecture de la fluorescence ont été réglés comme suit : le volume de collecte a été réglé à 50 μL, avec une mesure minimale de 50 billes, sans chauffage XY, et le type d’analyse à aucun.

4. Analyse des données

  1. Exécuter la validation
    1. Vérifiez que le nombre minimum de billes a été atteint. Au moins 35 billes par puits sont recommandées pour obtenir un IFM8 statistiquement valide.
    2. Les valeurs MFI de l’échantillon de contrôle négatif et de contrôle négatif sont minimales.
    3. Vérifiez les valeurs MFI pour les normes en traçant une courbe standard. Celles-ci sont plus élevées que celles de l’échantillon de contrôle à blanc et/ou négatif.
  2. Analyse d’échantillons de données
    1. Exportez les données sous forme de fichiers CSV et analysez-les en externe à l’aide du logiciel R.

Résultats

Pour illustrer le processus suivi pour la validation du protocole, nous avons sélectionné trois antigènes qui représentent trois familles d’arbovirus : les flavivirus (protéine DENV1 NS1), les alphavirus (protéine CHIKV VLP) et les Bunyavirus (RVFV NP). Les antigènes ont été testés sur un pool standard d’une population pré-exposée (ORPAL), de sérums de population française (non exposée) et de deux cohortes d’Afrique (Sénégal et Madagascar).

Linéarité de dilution de la réponse anticorps
La concentration d’antigènes à utiliser pour le couplage des billes a été déterminée à l’aide de dilutions en série du pool ORPAL. La concentration optimale a été choisie comme étant la concentration la plus faible à laquelle une courbe standard linéaire a été obtenue (données non présentées). La figure 1 montre la linéarité des antigènes d’arbovirus sélectionnés à la concentration optimale pour chaque antigène. Pour le contrôle de la qualité de l’accouplement, la linéarité de dilution de chaque lot de billes couplées a été testée sur le pool standard ORPAL en utilisant la concentration présélectionnée.

Comparabilité avec le test d’accouplement manuel standard
Pour évaluer la comparabilité des données obtenues à l’aide du nouveau protocole automatisé avec le couplage manuel bien établi, nous avons comparé les courbes standard générées à partir des résultats obtenus avec le couplage manuel par rapport au couplage automatisé. La figure 2 montre la linéarité parallèle pour les deux essais. Les valeurs de l’IMF varient selon l’antigène.

Variation du lot d’accouplement des billes
La variation du lot d’accouplement, au fur et à mesure de l’évaluation de la reproductibilité des essais à partir d’un même lot d’accouplement, a été évaluée à l’aide de la carte de Levey-Jennings18. Les antigènes représentatifs et les billes de contrôle couplées à la BSA ont été utilisés et testés sur le pool standard ORPAL. La figure 3 montre les IMF de 19 plaques différentes, testées à des jours différents pour chaque antigène. Les IMF résultantes se situent dans la fourchette de la moyenne ± 3 ET pour les trois antigènes et le contrôle.

Effet du multiplexage sur les IMF
Pour évaluer davantage les performances du test, nous avons testé si le multiplexage de plusieurs antigènes affectait la réponse anticorps mesurée. La réponse a été comparée à celle d’un seul antigène (ou d’une seule bille de plex) à l’aide du pool standard ORPAL. La figure 4 montre une forte corrélation (R = 0,99, p < 2,2e-16) entre les résultats obtenus lorsque les IMF ont été mesurées sur des antigènes uniques ou à partir d’un prémélange contenant 50 antigènes.

Réponses anticorps à partir d’échantillons de sérum humain dans des populations africaines
Pour évaluer l’applicabilité du test à des échantillons de diverses cohortes, nous avons comparé les réponses anticorps dans des échantillons de sérum humain de populations africaines, qui ont une forte probabilité d’exposition aux arbovirus, avec celles d’une cohorte française qui a probablement une exposition plus faible à ces virus. Au total, 1 596 échantillons ont été analysés pour Madagascar, 1 428 pour le Sénégal et 84 pour la cohorte française. La figure 5 présente les graphiques de densité pour les différentes cohortes. Pour la cohorte sénégalaise, une distribution bimodale claire des données est observée pour les réponses au VLP du CHIKV, suggérant deux réponses distinctes au CHIKV dans la population. Une queue bimodale subtile est également observée pour DENV1, NS1 et RVFV NP dans la cohorte sénégalaise, alors qu’il n’y a pas de différence entre les cohortes française et malgache.

figure-results-1
Figure 1 : Linéarité de la réponse anticorps testée sur le pool standard ORPAL. Des antigènes d’arbovirus sélectionnés sont présentés à titre d’exemple. Les intensités médianes de fluorescence (MFI) sont indiquées sur l’axe des y (échelle logarithmique) et la dilution en série du pool standard sur l’axe des x. Tous les antigènes du panel ont été pré-testés sur le pool standard avant d’être testés en vrac sur des échantillons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Linéarité parallèle de la réponse des anticorps par les méthodes de couplage. Log de l’IFM (axe y) des antigènes représentatifs (facette) testé sur des dilutions en série du pool standard ORPAL (axe x). Les couleurs représentent différentes méthodes de couplage : automatisation (rouge, vert, bleu) et manuelle (violet). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Variation d’une plaque à l’autre. Levey_Jennings graphiques pour le cordon couplé BSA (témoin), DENV1 NS1, CHIKV VLP et RVFV sont présentés pour le pool standard ORPAL à une concentration de 1:400. Les résultats représentent 19 assiettes exécutées à des jours différents. Les IFM sont présentées sur l’axe des y, le nombre de tests est sur l’axe des x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Corrélation de la réponse anticorps aux tests mono et multiplex. Le pool standard a été dilué à une concentration finale de 1:400 et testé sur un prémélange contenant les antigènes 50-plex en parallèle avec des billes enrobées d’antigène unique. La corrélation de Pearson a été utilisée pour l’analyse. Trois antigènes représentatifs sont présentés à titre d’exemple. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Application du test sur les cohortes d’échantillons endémiques et non endémiques. Le test a été testé sur des échantillons provenant de Madagascar (vert), du Sénégal (bleu) et de France (rouge). Les échantillons ont été dilués à une concentration finale de 1:400. L’axe des X représente les IFM normalisées (nMFI), calculées comme un rapport entre l’IFM de l’échantillon et l’IFM du pool standard à la même concentration (1:400). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Exemple d’image représentative de l’agrégation de billes. Le panneau (A) montre les billes non agrégées et le panneau (B) montre les agrégats de billes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 1 : Tableau des zones tampons. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 2 : Paramètres du protocole de couplage des billes KingFisher Apex. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 3 : Exemple de calcul des volumes de billes pour le prémélange. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

L’utilisation de la LIMF a changé le paysage des tests sérologiques. La force des tests réside dans leur capacité à évaluer les réponses des anticorps à plusieurs antigènes en une seule réaction, ce qui réduit le temps d’obtention des résultats et le coût des tests. Ceci est particulièrement important dans la surveillance sérologique. L’utilisation systématique des tests FMIA est toutefois entravée par l’étape de couplage manuel des billes, qui exige beaucoup de main-d’œuvre et de temps, qui nécessite la manipulation d’un seul antigène par réaction. Ce rapport présente une méthode automatisée de couplage chimique d’antigènes aux billes. L’automatisation permet le couplage simultané d’un maximum de 96 antigènes en une seule fois, ce qui réduit considérablement le temps nécessaire au couplage d’antigènes à haut débit.

La figure 1 montre que les antigènes ont été liés avec succès aux billes. Les résultats montrent également un fort parallélisme entre le nouveau protocole automatisé et le protocole manuel bien établi (Figure 2), indiquant une précision non inférieure dans la détection des réponses IgG aux antigènes évalués. Les résultats de la variation du lot de couplage de plaque à plaque (figure 3) et de couplage de cordon (figure 2) montrent la comparabilité des données lors de l’utilisation de la méthode automatisée de couplage. Une forte corrélation entre les IMF multiplex et singleplex (Figure 4) montre que le multiplexage d’un grand nombre d’antigènes n’affecte pas la réponse des anticorps à l’ensemble d’antigènes individuels utilisés dans ce test.

Pour valider l’essai, des échantillons provenant de cohortes endémiques et non endémiques ont été analysés (figure 5). Bien que les études de séroprévalence des arbovirus soient encore rares en Afrique, les données disponibles 19,20,21,22 suggèrent une image nuancée avec des séroprévalences d’IgG variables entre et au sein des différents pays. Notamment, les données existantes suggèrent des prévalences plus élevées des trois virus (chikungunya, dengue et vallée du Rift) au Sénégal par rapport à Madagascar, par exemple19. Ces prévalences sont cohérentes avec l’observation de ce rapport, qui a montré une réponse claire et distincte aux différents antigènes au Sénégal par rapport aux autres cohortes. Cela confirme la capacité du test à distinguer les profils d’anticorps dans le contexte d’une séroprévalence relativement élevée. Les données observées pour la cohorte malgache peuvent s’expliquer par la faible prévalence rapportée des virus dans le site de collecte de l’échantillon22, tandis que la comparabilité des données avec la cohorte non endémique peut s’expliquer en partie par la petite taille de l’échantillon de la cohorte française. De plus, la variabilité signalée entre les régions pourrait expliquer les différences observées dans les ensembles de données. Une étude approfondie pour évaluer la séroprévalence des IgG est nécessaire ; cependant, les données présentées dans ce rapport montrent que le test mis au point est spécifique pour détecter les réponses IgG aux antigènes d’arbovirus évalués, distinguant les données des régions endémiques ainsi que les réponses nuancées et distinctes au sein d’une même population.

Les principaux défis techniques comprenaient l’obtention de solutions antigéniques homogènes malgré leur utilisation en très petites quantités, la garantie d’une représentation équimolaire des régions de billes dans le prémélange et la minimisation de l’agrégation des billes. Pour surmonter la difficulté d’obtenir une solution homogène dans la plaque à 96 puits, une étape a été mise en œuvre où toutes les solutions antigéniques ont été soigneusement prémélangées dans un tube de 1,5 mL avant d’être distribuées dans la plaque. De plus, une étape a été ajoutée pour compter les billes couplées et ajuster les volumes afin de s’assurer qu’un nombre égal de régions de billes sont ajoutées au prémélange. Une étape de sonication a également été incluse pour faciliter le mélange des billes et minimiser l’agrégation dans le prémélange.

Dans cette étude limitée, la stabilité des billes couplées et leur impact sur les performances de dosage n’ont pas été évalués, car tous les échantillons ont été testés dans le mois suivant le couplage des billes. Cette évaluation dépassait la portée du présent rapport et sera évaluée dans des études futures. Malgré ces limites, ce rapport présente une méthode rapide et fiable pour détecter les réponses des anticorps à une variété d’agents pathogènes, y compris les arbovirus. La surveillance sérologique des infections à arbovirus est cruciale pour contrôler les maladies, et la disponibilité d’une méthode reproductible et rapide pour détecter les réponses des anticorps à ces virus représente une avancée significative dans les efforts mondiaux visant à évaluer les hétérogénéités de transmission et à cibler les interventions pour atténuer le fardeau de ces infections. De plus, bien que le présent rapport se concentre sur les arbovirus, ce protocole est largement applicable à un large éventail d’antigènes et représente une avancée significative dans le domaine.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Les auteurs remercient sincèrement les participants à l’étude et les agents de santé communautaires dans chacun des sites d’étude. Nous remercions également tout le personnel de laboratoire et de terrain pour leurs efforts dévoués dans la collecte d’échantillons, l’acquisition de données et les analyses de laboratoire. Ce travail a été soutenu par la subvention xSTAR (Reconstructing the transmission intensity of transmission of arboviruses across Africa and the impact of interventions in a changing climate) du Wellcome Trust [228185/Z/23/Z]. Dans le but du libre accès, les auteurs ont appliqué une licence publique de droit d’auteur CC BY à toute version du manuscrit acceptée par l’auteur découlant de cette soumission. Nous remercions également les personnes suivantes pour l’autorisation d’utiliser des échantillons : Rob Van Der Pluijm (Épidémiologie et analyse des maladies infectieuses, Institut Pasteur, Paris) et Maylis Douine et Alice Sanna (Centre d’Investigation Clinique Antilles-Guyane, Centre Hospitalier de Cayenne, Cayenne).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes microcentrifuges de 1,5 mL  ;-Consommables généraux en laboratoire
Unités de filtre de 1000 mL 0,2 umThermo fisher Scientific567-0020
Réservoirs de 25 mL   ;Thermosciences95128095
Tubes de 50 mLFalcon-Consommables généraux en laboratoire
96 plaques de puits profondes - KingFisher DWThermosciences10373480
Lave-assiettes automatique (optionnel)TECANRondelle microplaques HydroFlex Plus
FHA de la coqueluche BAntigène natif   ;BP-FHA-50
Équilibre-Équipement général de laboratoire
Centrifugeuse à établi   ;  ;-  ;Équipement général de laboratoire
Perles magnétiques de COOH BioPlex Pro   ;LuminexMC10xxx  ; (x = région des perles)
Albumine sérique bovine, BSASigmaA7906
Branson Ultrasonics Ultrasonic Nettoyeur à Ultrasons Modèle B200Fisher scientifique15-337-22
BSASigma AldrichA7906
CCHF GPAntigène natifREC31639-100
Compteur cellulaire/HémacytomètreBiorad/MerckTC20 /Z359629
CHIKV E2Antigène natifREC31617-100
CHIKV VLPAntigène natifCHIKV-VLP-100
Plaques immuno-non stériles à fond plat clair à 96 puitsThermosciences3455
CMV-particulesAntigène natifCMV-HP-100
Comptage des lames, double chambre pour compteur de cellules & nbsp ;BioradL003662 A
CP23Antigène natifProt de production
CT694Antigène natifProt de production
CtxB
DENV1 EDIII + SNAPProduction interne-
DENV1 NS1Antigène natifDENV1-NS1-100
DENV1 VLPAntigène natifDENVX4-VLP-100
DENV2 EDIII + SNAPProduction interne-
DENV2 NS1Antigène natifDENV2-NS1-100
DENV2 VLPAntigène natifDENVX4-VLP-100
DENV3 EDIII + SNAPProduction interne-
DENV3 NS1Antigène natifDENV3-NS1-100
DENV3 VLPAntigène natifDENVX4-VLP-100
DENV4 EDIII + SNAPProduction interne-
DENV4 NS1Antigène natifDENV4-NS1-100
DENV4 VLPAntigène natifDENVX4-VLP-100
Diphtérie ToxAntigène natif   ;DIP-TNL-100
EBV-GP125Antigène natifREC31601-100
EDC  ;Sigma03449
Éthanol à 100 %  ;-Laboratoire général & nbsp ;
Étanchéité en aluminium non stérile  ;-Généralités
Instrument d’imagerie à fluorescence - Système MAGPIXLuminex  ;MAGPIX-XPON4.1-CEIVD
Aimant portatif pour plaques - séparateur magnétique à 96 puitsLuminexCN-0269-01
HEV-ORF2Antigène natif   ;REC31653-100
Inaba OSPBoston_MGH  ;-
Peigne de pointe Kingfisher DeepWell 96 puitsThermosciences17170069
Leishmania K28ClinisciencesMBS3040095
Kit d’étalonnage Luminex MAGPIXLuminexMPX-CAL-K25
Kit de vérification Luminex MAGPIXLuminexMPX-PVER-K25
Séparateur à tubes magnétiquesInvitrogenDynaMag
MAGPIX Drive Fluid PlusLuminex40-50030
NP de rougeoleAntigène natifREC31796
Vibrateur à microplaques   ;Randox
MICROPLATE, 96 PUITS, PS, FOND EN F (PUITS DE CHEMINÉE)Un Greiner-Bio655096
MiliQ H20  ;-Laboratoire général & nbsp ;
Pipettes multicanaux 10, 300SARTORIUS
NIEAntigène natifProt de production
Ogawa OSPBoston_MGH  ;-
ONNV E2ClinisciencesIT-022-006Ep
Instrument de processeur de particulesThermosciencesThermo Scientific KingFisher Flex
PBS 10x PH~7.0EUROMEDEXET330
Anticorps secondaire IgG Fc anti-humain conjugué à PERecherche sur Jackson Immuno709-116-098
PfAMA1Production interne-
PfMSP1Antigène natifREC32013-100
PGP3Antigène natifProt de production
Pointes de pipette (fournisseur) 10 & micro ; L, 200 & micro ; L, 1000 & micro ; L  ;-Consommables généraux en laboratoire
Pm MSP1ClinisciencesCUST-PRT-31102024-1B
Po MSP1ClinisciencesCUST-PRT-31102024-1A
PvMSP1Antigène natifREC31724-100
R logiciel R4.4.1--
Parc national RVFVAntigène natifREC31640-100
Pipettes à canal simple 10p, 20p, 200p, 1000pEppendorf
SNAPProduction interne-
S-NHS&NBSP ;Sigma56485
Azidée de sodiumSigmaS2002
Solution d’hypochlorite de sodium (eau de Javel)  ;-Eau de Javel ménagère générale
Toxine tétaniqueAntigène natifREC31801-100
Thermo Scientific BindIx version 1.1ThermoFisher Scientific-
TRITONThermo ScientificA16046
Rouleau à tubes & nbsp ;IKARouleau 6D -100219627
Préadolescent-20SigmaP7949
USUV EDIII + SNAPProduction interne-
USUV NS1Antigène natifUSUV-NS1-100
Vortex  ;  ;-Équipement général de laboratoire
VSP3Antigène natifProt de production
VSP5Antigène natifProt de production
WNV EDIII + SNAPProduction interne-
WNV NS1Antigène natifWNV-NS1-100
Logiciel xPONENTLuminex89-30000-00-759 Rev A mai-19
YFV EDIII + SNAPProduction interne-
YFV NS1Antigène natifYFV-NS1-100
ZIKV EDIII + SNAPProduction interne-
ZIKV NS1Antigène natifZIKV-NS1-100
ZIKV VLPAntigène natifZIKV-VLP-100

Références

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Mots-clés

D tection d anticorps contre les arbovirusmultiplexage sur billesimagerie de fluorescencecouplage d antig nesintensit m diane de fluorescencevirus transmis par les moustiqueschantillons de s rum humainmesure de la r ponse anticorpales rosurveillance

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