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Article de méthode

Organoïdes intestinaux humains à graines unicellulaires pour la recherche sur les organoïdes

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DOI :

10.3791/69265

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6 février 2026

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1Department of Anatomy, Graduate School of Medical Science, Brain Korea 21 Project, Yonsei University College of Medicine, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, NYU Grossman School of Medicine, 3Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 4Department of Pathobiology, University of Pennsylvania Perelman School of Veterinary Medicine

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole pour générer des organoïdes intestinaux dérivés du patient à une seule cellule, fournissant des cultures standardisées qui réduisent l’hétérogénéité et améliorent la reproductibilité pour les essais en aval et les applications de médecine de précision.

Résumé

Les développements récents en technologie organoïde ont permis la création d’organoïdes intestinaux dérivés du patient (PDIO) qui reproduisent les caractéristiques structurales, fonctionnelles, génétiques et épigénétiques de leurs tissus d’origine. Cependant, les organoïdes conventionnels dérivés du passage produisent inévitablement des populations hétérogènes en taille et en nombre, ce qui conduit à des résultats incohérents même dans des conditions identiques. Pour y remédier, une approche standardisée, appelée ici « PDIO à séparation de cellule unique », a été mise en place. Dans cette méthode, les PDIO matures ont été dissociés enzymatiquement en cellules individuelles et ensemencés à un nombre défini dans des puits individuels d’une plaque à 96 puits. Ce semis contrôlé a normalisé la taille et le nombre de PDIO. Comparés aux organoïdes dérivés du passage, les PDIO à cellule unique ont montré une variabilité inter-puits réduite du nombre d’organoïdes et de la variabilité intra-puits des tailles d’organoïdes, ce qui permet de déterminer l’efficacité de la génération et d’améliorer la reproductibilité des essais de viabilité. De plus, cette plateforme est compatible avec l’analyse en aval, incluant l’analyse transcriptomique et le profilage de l’expression protéique. Collectivement, cette approche peut renforcer la cohérence expérimentale et fournir une base pratique pour des études reproductibles basées sur des PDIO.

Introduction

L’intestin humain est un écosystème très complexe défini par des interactions finement affinées entre le microbiote intestinal, l’épithélium intestinal et le systèmeimmunitaire 1. Ces composants maintiennent l’homéostasie intestinale grâce à des réseaux de signalisation strictement régulés. Par exemple, le microbiote intestinal, composé de plus de dix 000 milliards d’organismes microbiens, interagit avec les cellules immunitaires pour moduler l’activité du système immunitaire et maintient un environnement intestinaléquilibré 2. L’épithélium intestinal joue un rôle clé dans la médiation de ce dialogue entre le système microbiote et le systèmeimmunitaire 3,4. Les cellules souches intestinales (ISC), moteur clé du renouvellement épithélial, se régénèrent et se différencient continuellement en types cellulaires spécialisés, incluant les lignées cellulaires sécrétoires (cellules de Paneth, cellules gobelet, cellules entéroendocrines et cellules Tuft), les entérocytes absorbants et les cellules microfold 5,6. Ensemble, ces cellules forment une barrière physique vitale et une interface fonctionnelle qui protègent l’hôte contre les stimuli inflammatoires.

Ces dernières années, les PDIO se sont imposées comme une plateforme puissante dans la recherchetranslationnelle 7. Ces cultures tridimensionnelles (3D) sont créées à partir de CSI isolés des tissus du patient et maintenus dans une matrice extracellulaire telle que la matrice extracellulaire (ECM), avec des facteurs de croissance définis qui reproduisent la nicheISC 8,9. Notamment, les PDIO conservent les caractéristiques génétiques et épigénétiques du tissu donneur, permettant une expansion soutenue et des expérimentations reproductibles. Depuis que Sato et al. ont développé pour la première fois les PDIO à partir des ISCs 10 du récepteur G couple 5+ (Lgr5⁺) riche en leucine et contenant des répétitions contenant des protéines Gcouplées en leucine (Lgr5⁺), des études ultérieures ont identifié des facteurs de croissance essentiels pour la génération et la différenciation des PDIO, conduisant à des protocoles largement adoptés dans les laboratoires11, 12, 13. Cependant, les contextes expérimentaux utilisés pour traiter les PDIO avec des médicaments candidats varient considérablement selon les études et sont souvent insuffisammentdécrits 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44, 45, 46, 47. De plus, les PDIO sont généralement traversés par perturbation mécanique, ce qui entraîne une hétérogénéité dans la taille des organoïdes, la morphologie et l’agencement spatial. Cette variabilité complique l’évaluation précise de la réactivité au médicament et des mécanismes moléculaires sous-jacents. Pour répondre à cette limitation, des études récentes ont développé des PDIO dérivés de cellules uniques en suspension ou de cellules simplestriées 45,48,49,50,51,52,53,54.

Dans cet article, comme l’une des méthodes complémentaires et pratiques, les « PDIO à graine de cellule unique » sont introduits pour générer des PDIO standardisés à partir d’une suspension à cellule unique utilisant des ECM et des médias conventionnels, permettant des tests précis et reproductibles. En résumé, des cellules isolées des PDIO matures ont été intégrées dans la MCE à des densités cellulaires définies, et les cultures résultantes ont été surveillées pendant 2 semaines tout en quantifiant le nombre, la taille et la morphologie. Comme chaque dôme ECM est intégré d’une entrée cellulaire connue, le nombre d’organoïdes par puits est constant, permettant de calculer l’efficacité de la génération comme une lecture de la capacité régénérative dans chaque ligneorganoïde 49,54. Bien que le Matrigel en forme de dôme produise une hétérogénéité de taille due au gradient spatial de concentration de Wnt3a résultant de son instabilité inhérente et de sa diffusionlimitée 55, la variabilité de taille entre puits dans les PDIO à semence cellulaire unique est nettement inférieure à celle des organoïdes dérivés dupassage 49,54. Cependant, cette approche présente encore des limites pratiques. Sans tri cellulaire activé par fluorescence, certains organoïdes peuvent être générés à partir de doublets ou de triplets, ce qui entraîne une hétérogénéité biologique intrinsèque au sein des PDIO. De plus, le nombre optimal de cellules individuelles doit être déterminé empiriquement pour chaque lignée organoïde en raison des différentes efficacités de génération. Enfin, des PDIO entièrement différenciés à une seule cellule ont été soumis à des analyses en aval, incluant la PCR quantitative par transcription inverse (qRT-PCR), le Western blot et l’immunohistochimie.

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Protocole

Tous les matériaux et réactifs nécessaires à l’expérience sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation des réactifs et des matériaux

  1. Préchauffez la plaque de culture organoïde dans un incubateur à 37 °C pendant plus de 90 minutes.
    REMARQUE : Le préchauffage de la plaque de culture aidera à solidifier l’ECM et à maintenir la forme du dôme. 90 minutes est le temps minimum requis pour la polymérisation ECM. Il est fortement recommandé de préchauffer la plaque pendant plus de 12 heures.
  2. Utilisez un milieu de croissance organoïde (EXP) complété à 0,5 % de pénicilline-streptomycine (PS) comme milieu de culture organoïde.
  3. Pour la différenciation des PDIO à graines cellulaires uniques, utilisez un milieu de différenciation (DIF) composé d’un milieu basal complété de facteurs de croissance (Tableau 1). Le milieu basal est composé de DMEM/F12 avancé complétés à 0,5 % de PS, 0,25 % de sulfate de gentamicine et 1 % de glutamine, ainsi que les facteurs de croissance suivants : Noggin (100 ng/mL), R-Spondin-1 (1 μg/mL), Wnt3a (100 ng/mL), facteur de croissance épidermique (EGF ; 50 ng/mL), N-acétyl-L-cystéine (1 mM), [Leu15]-gastrine I humain (10 nM), A 83-01 (500 nM), facteur de croissance insulino-type 1 (IGF-I ; 200 ng/mL), facteur de croissance des fibroblastes (FGF ; 100 ng/mL) et supplément de B-27 (1x) (Tableau 1).
    REMARQUE : La PS et la gentamicine sont biohazardées et doivent être manipulées avec des gants et une protection oculaire.
  4. Préparez fraîchement la solution de récupération cellulaire (CRS), le tampon de lavage (DMEM à glucose élevé avec 1 % de BSA), 1 mM de Y-27632, EXP et DIF, et laissez sur la glace jusqu’à utilisation.
    REMARQUE : Laissez EXP et DIF s’équilibrer à température ambiante pendant au moins 20 minutes avant de les ajouter aux plaques de culture pré-chauffées.
  5. Dégelez l’ECM sur glace et assurez-vous qu’il reste toujours au frais.
    REMARQUE : La MCE nécessite une décongélation sur glace et doit toujours être conservée froide pour éviter une polymérisation prématurée.
  6. Équilibrez le réactif de dissociation enzymatique à température ambiante. Préchauffez le réactif dans un bain-marie à 37 °C avant l’application.
    REMARQUE : Le réactif de dissociation enzymatique est un irritant et doit être manipulé avec un équipement de protection individuelle approprié.

2. Dégel et récupération des PDIO cryopréservés

  1. Récupérez le tube cryovial contenant des organoïdes dans la cuve d’azote liquide. Desserrez légèrement le bouchon du tube et décongelez dans un bain-marie à 37 °C pendant 60 à 90 secondes.
    REMARQUE : Transférez immédiatement le tube sur la glace après dégel.
  2. Pré-humidifier une pointe de pipette à large âme avec un tampon de lavage et transférer les organoïdes du tube cryovial dans un tube de 50 mL.
  3. Rincez le cryovial avec 1 mL de tampon de lavage et transférez le reste du contenu dans le tube de 50 mL. Répétez cette étape de rinçage deux fois.
  4. Centrifugez à 290 × g pendant 7 minutes à 4 °C. Assurez-vous qu’un granule visible se forme au fond du tube.
  5. Aspirez le surnageant.
  6. Resuspendez dans ECM à l’aide d’une pointe de pipette préhumidifiée à large calibre.
  7. Pointez l’ECM sur une plaque préchauffée à 24 puits et incubez à 37 °C pendant 10 minutes.
    REMARQUE : Utilisez 30 μL d’ECM par puits.
  8. Ajoutez de l’EXP et entourez les puits d’une solution stérile de solution stérile tamponnée phosphate (PBS) ou d’eau distillée.
    REMARQUE : Utilisez 500 μL d’EXP par puits. La culture en EXP est complétée par 10 μM Y-27632 pendant les 3 premiers jours, puis est passée à l’EXP sans Y-27632.

3. Passage des PDIO

  1. Aspirez l’EXP dépensé.
  2. Pré-humidifier une pointe de pipette à large calibre avec un tampon de lavage, ajouter 1 mL de réactif de dissociation cellulaire pour détacher l’ECM, puis transférer le contenu dans un tube de 15 mL.
  3. Faites couver le tube sur un bascule pendant 10 minutes à température ambiante.
  4. Centrifugez à 300 × g pendant 7 minutes à 4 °C.
  5. Décantez le surnageant et ajoutez 1 mL de tampon de lavage. Resuspendez 20 fois.
  6. Ajoutez 1 mL de tampon de lavage, resuspendez 20 fois, puis transférez dans un tube de 50 mL.
  7. Centrifugez à 300 × g pendant 7 minutes à 4 °C.
  8. Aspirez le surnageant.
  9. Resuspendez dans ECM à l’aide d’une pointe de pipette préhumidifiée à large calibre.
  10. Pointez l’ECM sur une plaque préchauffée à 24 puits et incubez à 37 °C pendant 10 minutes.
    REMARQUE : Utilisez 30 μL d’ECM par puits.
  11. Ajoutez de l’EXP et entourez les puits d’eau stérile 1x PBS ou distillée.
    REMARQUE : Utilisez 500 μL d’EXP par puits. La culture en EXP est complétée par 10 μM Y-27632 pendant les 3 premiers jours, puis est passée à l’EXP sans Y-27632.

4. Culture PDIO à grainement cellulaire unique

  1. Aspirez l’EXP dépensé.
    REMARQUE : Les déchets contenant des antibiotiques (par exemple, des déchets utilisés avec du PS ou de la gentamicine) doivent être autoclavés avant leur élimination.
  2. Laver avec 1 mL de 1 ml de PBS stérile.
  3. Préhumidifier une pointe de pipette à large calibre avec un tampon de lavage, ajouter 300 μL de CRS pour détacher l’ECM, puis transférer le contenu dans un tube de 50 mL.
  4. Centrifugez à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C (Figure 1A).
  5. Aspirez le surnageant, ajoutez 3 mL de tampon de lavage, puis resuspendez 20 fois.
    REMARQUE : Cette étape perturbe mécaniquement les organoïdes.
  6. Centrifugez à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C (Figure 1B).
  7. Aspirez le surnageant et ajoutez 5 mL de réactif enzymatique dissociatif pré-chauffé contenant 10 μM Y-27632. Faites tourner 2 à 3 fois et incubez dans un bain-marie à 37 °C pendant 20 minutes, en secouant le tube toutes les 5 minutes.
    REMARQUE : Les agrégats de débris apparaissent généralement dans les 10 minutes suivant l’incubation. Limitez le traitement total du réactif de dissociation enzymatique à moins de 20 minutes. Ne pas dépasser 25 minutes, car la surdigestion compromet nettement le rendement et la viabilité des cellules individuelles.
  8. Ajoutez 10 mL de glucose DMEM élevé.
  9. Centrifugez à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C (Figure 1C).
  10. Aspirez le surnageant et ajoutez 1 mL de tampon de lavage. Resuspendez 20 fois.
    REMARQUE : Les déchets contenant un réactif enzymatique de dissociation doivent être collectés séparément et inactivés avec de l’eau de Javel à 0,5-1 % pendant au moins 30 minutes avant leur élimination, conformément aux directives institutionnelles de biosécurité.
  11. Filtrez à travers un filtre de 40 μm dans un nouveau tube de 50 mL (Figure 1D).
    REMARQUE : Cette étape est cruciale pour isoler les cellules individuelles des organoïdes matures. Un tamis de cellules de 40 μm doit être utilisé pour isoler les cellules individuelles.
  12. Comptez les cellules avec le bleu de trypan. Transférez le volume calculé sur un tube de 1,5 mL.
    REMARQUE : Placez 3 000 à 4 000 cellules par puits dans une plaque préchauffée de 96 puits.
  13. Centrifugez à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C (Figure 1E).
  14. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette.
  15. Resuspendez les cellules en ECM (100-500 cellules/μL) à l’aide d’une pointe de pipette préhumidifiée à large alage.
  16. Pointez l’ECM dans une plaque préchauffée de 96 puits et incubez à 37 °C pendant 10 minutes.
    REMARQUE : Utilisez 10 μL d’ECM par puits.
  17. Ajoutez le DIF aux puits. Entourez les puits d’eau stérile 1x PBS ou distillée.
    REMARQUE : Utilisez 150 μL de DIF par puits. La culture en DIF a été complétée par 10 μM Y-27632 pendant 3 jours, puis est passée à DIF sans Y-27632. Changez le moyen tous les 3 jours et maintenez pendant un total de 10 jours.

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Résultats

Pour générer des PDIO à graines monocellulaires, des biopsies pincées muqueuses de l’iléon terminal et du côlon ascendant ont été prélevées auprès de sujets sains consentants lors d’une coloscopie de surveillance à l’aide de pinces de biopsie standard de 2,8 mm, sous le cadre du NYU Grossman School of Medicine Institutional Review Board (profilage immunitaire mucosal chez les patients atteints de maladie inflammatoire intestinale ; S12-01137). Ensuite, des PDIO à une seule cellule ont ét...

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Discussion

Les PDIO offrent un immense potentiel pour la modélisation de précision des maladies, le dépistage de médicaments et la médecine régénérative, car ils préservent fidèlement le paysage génétique et épigénétique des patients individuels. Cependant, leurs applications pratiques sont souvent entravées par des difficultés à standardiser la génération et la caractérisation des organoïdes. Pour surmonter ces défis, une approche utilisant des PDIO dérivés de la suspension à cellules simples ou à...

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Déclarations de divulgation

Jordan E. Axelrad a reçu des subventions de recherche de BioFire Diagnostics, Genentech, Janssen et Takeda ; honoraires de conseil, honoraires ou honoraires de conseils consultatifs d’AbbVie, Abivax, Adiso, Biomerieux, Bristol-Myers Squibb, Celltrion, Ferring, Fresenius, Janssen, Merck, Pfizer, Sanofi, Takeda et Vedanta. K.C. est un inventeur du brevet américain 10 722 600 et des brevets provisoires 62/935 035 et 63/157 225.

Remerciements

Ce travail a été partiellement soutenu par la subvention de la National Research Foundation of Korea (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIT) (RS-2025-00557588, RS-2024-00411768, RS-2025-18362970, et RS-2025-02214844, Kyung Ku Jang) ; une subvention du projet de R&D en technologie de la santé coréen via l’Institut coréen de développement de l’industrie de la santé (KHIDI) financée par le ministère de la Santé et du Bien-être de la République de Corée (RS-2024-00406488, Kyung Ku Jang) ; DK093668 de subvention des National Institutes of Health (NIH) (Ken Cadwell) ; K23DK124570 (Jordan E. Axelrad) ; Fondation Crohn & Colitis (Jordan E. Axelrad). Les bailleurs de fonds n’ont eu aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
[Leu15]-Gastrin I humainSigma-AldrichG91450-0,1 mg
Tube conique de 15 mLSPL50015
PBS 20X, pH 7,4BiosesangP2007-7.4
Tube conique de 50 mLSPL50050
A 83-01Tocris2939-10 mg
DMEM/F-12 avancéGibco12634010
Axygen 1000 & micro ; Pointes de pipette en L, à large calibre, transparentes, non stérilesAxygèneT-1005-WB-C
Axygen 200 & micro ; Pointes de pipette en L, à large calibre, transparentes, non stérilesAxygèneT-205-WB-C
Supplément de B-27 (50X) sans sérumGibco17504044
Albumine sérique bovineRoche10735078001
Microplaques de polystyrène transparent Corning à 96 puitsCorning3599
Solution de récupération des cellules de CorningCorning354253
Matrice ECM de Corning (Matrigel de Corning) & nbsp ;Corning356231
Plaques multiples à puits Costar 24 puits transparents traitées TCCorning3526
DMEM hypergluque avec glutamine stable et pyruvate de sodiumBiowestL0103-500
GentamicinGibco15750060
Réactif de dissociation cellulaire douxStemcell100-0485
Protéine recombinante FGF-base humaine (FGF-2/bFGF) (154 aa)Gibco100-18B-100UG
IGF-I humain, protéine recombinante sans animauxGibcoAF-100-11-500UG
Protéine humaine de NogginAcrobiosystèmeNON-H5219-1 mg
Protéine R-Spondine 1 / RSPO1 (21-146) humaineAcrobiosystèmeRS6-H4220-1mg
Milieu de croissance organoïde IntestiCult (humain)Stemcell6010
L-glutamine 100XBiowestX0550-100
Protéine recombinante EGF de sourisGibco315-09-100UG
N-acétyl-L-cystéineSigma-AldrichA9165-5 g
Solution de pénicilline-streptomycine 100XBiowestl0022-100
Substitut humain recombinant Wnt3aAcrobiosystèmeWNE-W5253-50ug
Le TrypLE (réactif de dissociation enzymatique) exprime l’enzyme (1X), sans phénol rouge   ;Gibco12604013
Y-27632 dihydrochlorureTocris1254-10MG

Références

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