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Article de méthode

Évaluation de la dynamique de la fission/fusion mitochondriale dans les cellules tubulaires proximales rénales

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DOI :

10.3791/69268

⸱

14 novembre 2025

 ,  ,  ,  , 
1Lewis Katz Medical School at Temple University

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit l’utilisation de la microscopie confocale et d’ImageJ pour évaluer la dynamique de fission/fusion mitochondriale via la fluorescence à commutation photoélectrique Dendra2.

Résumé

Les mitochondries sont surtout reconnues pour leur rôle dans la synthèse de l’ATP et servent de régulateurs clés du métabolisme cellulaire. La dynamique mitochondriale comprend le mouvement intracellulaire et intercellulaire des mitochondries, ainsi que les processus de fission/fusion. Ces événements sont fondamentaux pour maintenir la fonction mitochondriale en maintenant l’homéostasie cellulaire, la morphologie, la bioénergétique, le contrôle de la qualité et les réponses au stress. D’autre part, la dérégulation de la dynamique mitochondriale a un impact sur la morphologie et la fonction cellulaires. Une mesure précise des événements de fission/fusion des mitochondries peut être indicative de la santé cellulaire. Les méthodologies actuelles pour mesurer la dynamique des mitochondries utilisent l’imagerie avancée comme la microscopie à super-résolution, les techniques de fluorescence (Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)) pour la connectivité et les outils optogénétiques pour le contrôle spatio-temporel. L’analyse quantitative utilise des outils informatiques pour mesurer des paramètres tels que la longueur, le nombre et les ramifications, qui indiquent l’équilibre fission/fusion. Cependant, ces méthodes nécessitent des compétences et des instruments sophistiqués. Dans cet article, nous décrivons l’utilisation de la microscopie confocale combinée à des outils gratuits dans ImageJ (Fidji) pour étudier les événements de fission/fusion en utilisant la propriété de photo-commutation de la protéine dendra2, marquée au cytochrome c mitochondrial.

Introduction

Les mitochondries sont un organite dynamique qui joue un rôle essentiel dans la production d’énergie, la mort cellulaire et la transduction du signal1. La morphologie mitochondriale fait référence à la taille et à la forme des compartiments mitochondriaux, qui sont très sensibles aux conditions intracellulaires et extracellulaires et sont cruciaux pour le maintien de la santé cellulaire2. La morphologie des mitochondries peut fournir des informations clés sur leur fonction, cependant, les altérations de la forme des mitochondries peuvent avoir un impact sur le métabolisme cellulaire et la santé globale3. Les perturbations de la morphologie mitochondriale sont associées à plusieurs maladies, notamment les troubles neurodégénératifs, le cancer et les maladies métaboliques4. La morphologie mitochondriale est régulée dynamiquement par les événements de fusion et de fission/fusion, qui sont cruciaux pour maintenir l’homéostasie cellulaire et répondre à diverses exigences métaboliques 5,6.

La dynamique mitochondriale aide l’organite à répondre à différents facteurs de stress et exigences métaboliques7. Il implique une fission/fusion continue et un mouvement des mitochondries à l’intérieur des cellules ou entre les cellules. Les mitochondries s’adaptent aux demandes d’énergie cellulaire par des changements de morphologie via des événements de fission/fusion8. Ces processus déterminent la forme mitochondriale et influencent les fonctions mitochondriales telles que la production d’énergie, la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et le contrôle de la qualité mitochondriale 7,9,10. De plus, la fission/fusion mitochondriale sont des mécanismes compensatoires qui maintiennent un réseau mitochondrial fonctionnel11. La fusion permet l’échange du contenu mitochondrial, favorisant la complémentation et l’amortissement contre les dommages locaux, tandis que la fission permet la ségrégation et l’élimination des mitochondries endommagées via la mitophagie 7,12. De plus, la fission aide à séparer les composants endommagés des mitochondries, qui sont ensuite éliminés par la mitophagie, un processus d’autophagie sélectif13. La fusion, quant à elle, permet la complémentation du contenu mitochondrial, diluant tous les composants endommagés14. Les principaux acteurs de la fission/fusion mitochondriale sont les mitofusines (MFN1/2), essentielles à la fusion de la membrane mitochondriale externe15,16 (OPA1) : cette GTPase de type dynamine est responsable de la fusion de la membrane mitochondriale interne16. Les protéines de fission impliquent la protéine 1 liée à la dynamine (Drp1), la protéine pro-fission13,17. Protéine de fission mitochondriale 1 (Fis1), facteur de fission mitochondriale (Mff) et régulateur de fission mitochondriale1 (MTFR1L). Plusieurs techniques, comme l’EM à super-résolution, ont été utilisées pour étudier l’ultrastructure mitochondriale18. L’hybridation in situ par fluorescence d’une molécule unique (smFISH) combinée à la microscopie à super-résolution STED et MINFLUX (nanoscopie) a été utilisée pour visualiser l’ARNm mitochondrial individuel et les protéines associées18. Les techniques de microscopie de localisation de molécule unique (SMLM) suivent les changements d’espacement des membranes19. La microscopie à super-résolution de la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM) permet l’étude des complexes de membrane interne mitochondriale20. Cependant, l’utilisation de cet équipement de pointe n’est pas facilement accessible. La microscopie confocale est accessible et nécessite moins d’expertise. De plus, le développement de protéines fluorescentes ciblant les mitochondries a considérablement fait progresser l’étude de la dynamique mitochondriale dans les cellules vivantes21, car nous utilisons la protéine fluorescente verte (GFP) photoactivable pour visualiser et quantifier la fusion mitochondriale22.

Pour étudier la fission et la fusion mitochondriales, les cellules sont stressées ou exposées à des médicaments comme le cisplatine, qui se lie à l’ADN et induit des dommages à l’ADN, culminant dans l’apoptose médiée par les mitochondries23. Dans cette étude, nous avons utilisé des mitochondries Dendra2 photo-commutables de souris mitochondries photo-activables pour étudier les événements de fission et de fusion dans les cellules tubulaires rénales traitées au cisplatine, car elles sont riches en mitochondries et ont une grande capacité de régénération. Cependant, ce protocole peut être utilisé dans n’importe quel type de cellule qui possède des mitochondries Dendra2 photo-commutables (Figure 1A-C).

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Protocole

Tous les travaux sur les animaux ont été effectués conformément aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université Temple (Animal Protocol-5183). Les souris Pham, qui ont des mitochondries exprimant la protéine Dendra2, ont été achetées.

1. Préparation du milieu de culture cellulaire

  1. Isolez les cellules tubulaires proximales du rein selon le protocole après qu’elles aient été séparées des cellules endothéliales glomérulaires à l’aide de billes24 (Figure 1A). Bouchareb et al. ont mis au point une méthode pour isoler et cultiver des cellules endothéliales glomérulaires (GEC) à partir des reins de souris transgéniques qui expriment des mitochondries fluorescentes (mito-Dendra2) à l’aide de billes magnétiques. Après l’isolement du GEC, les tubules qui restent dans la pastille sont isolés et cultivés.
  2. Cultivez des cellules tubulaires proximales rénales dans une boîte de 10 cm avec 10 ml de DMF-12 additionnés de 5 % de FBS (inactivé par la chaleur), de pénicilline (100 U/mL) et de streptomycine (100 μg/mL). Faites pousser les tubules pendant 2-3 jours jusqu’à ce qu’ils migrent hors des tubules.
  3. Sélectionner les cellules tubulaires par morphologie après avoir été affamé (avec DMF-12 sans FBS) pendant 2 jours.
    REMARQUE : Pour les expériences, utilisez un disque avec 50 à 70 % de cellules confluentes. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre avant l’ensemencement.
  4. Ensemencement de cellules pour des expériences : Ensemencez les cellules dans des plaques de culture à fond de verre à une densité de 1 à 5 × 10à 5 cellules par puits, en fonction des exigences expérimentales. Laissez les cellules adhérer et se développer pendant la nuit avant l’ajout de cisplatine.
    REMARQUE : Le cisplatine est un médicament de chimiothérapie dangereux, il est crucial de suivre les protocoles de sécurité pour protéger le personnel et l’environnement. À cette fin, suivez les instructions de l’enceinte de sécurité biologique de classe II, de l’équipement de protection individuelle (EPI), de la décontamination, du contrôle des déversements et de l’élimination des déchets (déchets de médicaments dangereux - chimiothérapie) : portez des doubles gantois, des lunettes, décontaminez la surface de travail et gardez le kit de déversement près du poste de travail, étiquetez clairement le conteneur à déchets. Pour le DMSO, portez un EPI, travaillez dans une hotte et suivez les procédures de décontamination et d’élimination des déversements.

2. Induction du stress à l’aide du cisplatine

  1. Préparation du milieu au cisplatine
    1. Préparez une solution mère de 50 mM de cisplatine en le dissolvant dans du DMSO.
    2. Plaquez 1-5 x 106 cellules tubulaires proximales sur la plaque de culture à fond de verre, ajoutez 2 mL de milieu DMF-12.
      REMARQUE : N’importe quel disque de culture à fond en verre peut être utilisé.
    3. Ajouter du cisplatine à une concentration finale de 2 μM sur la plaque expérimentale, pour avoir 0,004 % comme concentration finale de DMSO.
      REMARQUE : Préparez 2 μL de 50 mM de cisplatine dilué dans 1 998 μL de milieu DMF-12 sans FBS, et ajoutez 80 μL à la plaque expérimentale.
    4. Incuber les cellules pendant 24 h.

3. Imagerie

  1. Utilisation du microscope confocal
    1. Configurez les lasers à 405 nm (photoconversion Dendra2), 488 nm (excitation Dendra2 non convertie) et 561 nm (Dendra2 photoconvertie, Alexa 594).
    2. Allumez les lasers et laissez le temps de stabilisation (~10 min)
  2. Étude des événements de fission et de fusion
    1. Configurez les lasers à 405 nm (photoconversion Dendra2), 488 nm (excitation Dendra2 non convertie) et 561 nm (Dendra2 photoconvertie, Alexa 594).
    2. Placez le disque de culture dans la chambre d’incubation.
    3. Ajoutez de l’eau autour de la chambre et réglez la température à 37 °C. L’approvisionnement en CO2 doit être maintenu.
    4. Laissez la chambre d’incubation s’équilibrer. Le changement de température stressera les cellules.
    5. Visualisez les cellules à l’aide d’un grossissement et d’une résolution plus élevés pour l’imagerie mitochondriale.
    6. Ouvrez le menu déroulant dans le coin supérieur gauche et sélectionnez les options FRAP (Figure 2A-D).
    7. Définissez la région d’intérêt (ROI) à l’aide du logiciel LAS X, où le photoblanchiment sera effectué.
      REMARQUE : La région d’intérêt peut être dessinée à n’importe quelle taille, ce qui n’affecte pas les résultats, car les mitochondries individuelles sont analysées.
    8. Acquérir une série d’images de préblanchiment à faible intensité laser pour établir l’intensité de fluorescence de base. SetlaserstoLongueur d’onde de 405 nm pour la photocommutation (0,00), 48 nm (0,20) et 56 nm (0,20), garantissant que les cellules sont focalisées.
      REMARQUE : Les valeurs entre parenthèses après les longueurs d’onde laser indiquent des intensités laser qui peuvent être réglées sur n’importe quelle valeur car cela n’affecte pas le photoblanchiment.
    9. Pour photoblanchir les cellules, appliquez une impulsion laser de haute intensité pour blanchir dans le retour sur investissement. Réglez les lasers FRAP sur 405 nm (4,00), 488 nm (0,00) et 561 nm (0,00). Réglez le pré-blanchiment à 5,140 s pendant 59 itérations, et le post-blanchiment au moment souhaité (Figure 2B) (l’intensité du laser avant et après le blanchiment est mentionnée entre parenthèses).
    10. Pour l’imagerie post-blanchiment, continuez à acquérir des images à une faible intensité laser pour observer la récupération de la fluorescence pendant 10 min. Maintenez les lasers FRAP à 405 nm (0,00), 488 nm (0,50) et 561 nm (0,50).
      REMARQUE : Le temps de blanchiment peut différer selon les types de cellules, entre nos mains, des temps de blanchiment similaires ont été utilisés pour les mitochondries dans les cellules tubulaires et les cellules interstitielles valvulaires (VIC). Une fois le FRAP terminé, les images ou l’imagerie de cellules vivantes (Figure 3 et Vidéo supplémentaire 1) peuvent être réalisées, en plus de l’acquisition des images après le blanchiment.

4. Analyse d’images

REMARQUE : Étant donné que les mitochondries sont marquées avec la protéine Dendra2, lors du photoblanchiment, un changement conformationnel irréversible de la protéine dendra2 entraîne une augmentation de la fluorescence rouge détectée par le laser de 561 nm. Lorsque les mitochondries rouges fusionnent avec les mitochondries vertes non blanchies, la combinaison donne une couleur jaune. En tirant parti de ce phénomène, les événements dynamiques de fission/fusion peuvent être mesurés.

  1. Profilage des mitochondries rouges et vertes fusionnées
    1. Installez le plug-in RGB profiler pour profiler le signal rouge et vert sur la sélection.
      REMARQUE : Suivez les instructions sur le site Web pour ajouter le plugin à la section Fidji.
    2. Ouvrez ImageJ (Figure 4A).
    3. Dans le menu Fichier , recherchez et ouvrez le fichier à analyser (Figure 4B).
    4. Sélectionnez le mode couleur composite, cochez l’option de mise à l’échelle automatique et ouvrez la vidéo à analyser (Figure 4C).
    5. Sélectionnez une zone rectangulaire à analyser (Figure 4D).
    6. Passez la souris près de la zone rectangulaire sélectionnée, cliquez avec le bouton droit de la souris, puis sélectionnez Dupliquer (Figure 4E).
    7. Sélectionnez l’option Dupliquer l’hyper-pile , qui duplique toutes les piles d’images (Figure 4F).
    8. Pour convertir la pile dupliquée au format RVB, sélectionnez l’image et sélectionnez l’option RVB dans la liste déroulante de l’image (Figure 4G-H).
    9. L’image RVB est dupliquée, en ne sélectionnant qu’une seule image (Figure 4I).
    10. Si les mitochondries de l’image sont incurvées, tracez une ligne sur leur longueur. Ensuite, allez dans le menu Édition , choisissez Sélection, puis cliquez sur Redresser (Figure 5A).
    11. Choisissez un titre pour l’image et définissez la largeur de ligne sur 20 pixels (Figure 5B).
    12. Après avoir redressé les mitochondries, tracez une ligne le long des mitochondries d’intérêt pour vous assurer qu’elles sont alignées avec une ligne droite (Figure 5C).
    13. Ouvrez le plug-in RGB Profiler (Figure 5D).
    14. Une fois activé, le plugin générera un graphique montrant les intensités de fluorescence rouge et verte le long de la ligne dessinée. La hauteur de chaque pic est directement proportionnelle à l’intensité de fluorescence (Figure 5E).
      REMARQUE : La morphologie mitochondriale peut également être calculée à l’aide du plugin25 de l’analyseur de mitochondries. Sélectionnez les régions utilisées pour l’exposition, analysez le seuil dans les régions sélectionnées, puis mesurez la morphologie des mitochondries et l’analyse 2D. Le périmètre de la zone et d’autres paramètres peuvent être sélectionnés.

5. Analyser les événements de fusion

  1. Établir la base de référence avant la fusion : Avant la fusion mitochondriale, confirmez que la fluorescence rouge (561 nm) est localisée à une mitochondrie et la fluorescence verte (488 nm) à une mitochondrie adjacente. Le graphique d’intensité correspondant doit afficher deux pics distincts, l’un rouge et l’autre vert, avec un chevauchement minimal.
  2. Confirmer l’événement post-fusion : Après la fusion, le signal rouge (représentant le contenu de la matrice Dendra2) doit se propager dans la mitochondrie verte adjacente, indiquant un mélange de contenu. Le graphique d’intensité montrera désormais des pics rouges et verts qui se chevauchent, confirmant un événement de fusion.
  3. L’évaluation des événements de fusion peut être déterminée en sélectionnant soigneusement les mitochondries saines et les mitochondries photoblanchies pour la fusion dans l’imagerie de cellules vivantes. Un changement dans le rapport rouge/vert au fil du temps indiquerait l’événement de fusion.

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Résultats

Des cellules épithéliales tubulaires primaires ont été isolées du rein de souris par digestion enzymatique et cultivées dans du DMF-12 complété par 5 % de FBS, 1 % de pénicilline-streptomycine à 37 °C sous 5 % de CO2. Après avoir atteint une confluence de 80 %, les cellules ont été trypsinisées (0,25 % de trypsine-EDTA) et ensemencées à une densité de 5 × 104 cellules par puits dans des plaques de culture à fond de verre, pré-enrobées de collagène.

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Discussion

La fission/fusion mitochondriale sont des processus dynamiques cruciaux qui maintiennent l’homéostasie mitochondriale et la viabilité cellulaire26. L’évaluation correcte de ces processus nécessite des techniques d’imagerie avancées pour visualiser et quantifier la morphologie, la dynamique et la fonction mitochondriales27,28. Diverses techniques ont été utilisées pour mesurer la fission/fusion mitochondria...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions de recherche du National Institute of Health numéro de subvention 5R01DK135470-03, de la subvention ISAC-NIH 5U24DK128851-03 et de la bourse postdoctorale de l’American Heart Association.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Culture cellulaire   ;
DMEM/F12  ;Milieu basal   ;(Gibco/Cat. N°11320033 )  ;Culture cellulaire tubulaire proximale   ;
Sérum fœtal-bovin (FBS) & nbsp ;5-10 % de supplémentation   ;(Biowest/Cat. No.S181B)  ;Enrichissement du médium culturel   ;
Pénicilline-Streptomycine   ;100X  ;(Gibco/Cat. N°15140122) & nbsp ;Protection antibiotique & nbsp ;
Collagène IV & nbsp ;revêtement & nbsp ;( Sigma-C5533-5M)   ;Revêtement de plaques Ibidi & nbsp ;
Trypsine-EDTA & nbsp ;0,25 % de solution   ;(Gibco/Cat. N°25200056) & nbsp ;Détachement cellulaire   ;
Solution physiologique tamponnée phosphate (PBS) & nbsp ;(Gibco/Cat. N°10010023 )  ;Lavage cellulaire & nbsp ;
Traitements  ;
Cisplatine & nbsp ;2 & micro ; M concentration de travail   ;(Selleck Chemicals/Cat. N° S1166) & nbsp ;Induction de stress & nbsp ;   ;
Diméthyl Sulfoxyde (DMSO)  ;contrôle des véhicules & nbsp ;(Fisher Scientific/Cat. N° D1391) & nbsp ;Contrôle des solvants au cisplatine   ;
Imagerie  ;
Médium rouge sans phénol & nbsp ;Imagerie en direct   ;(Gibco/Cat. N°21041025)  ;Fluorescence de fond réduite   ;
Biologie moléculaire & nbsp ;
TRIzol® ;   ;Extraction d’ARN   ;(Gibco/Cat. N°15596018) & nbsp ;Isolation totale de l’ARN & nbsp ;
SYBR Green Master Mix & nbsp ;Chimie qPCR & nbsp ;(Thermo Scientific/Cat. N° K0221) & nbsp ;Expression génique de la dynamique mitochondriale (DNM1L, FIS1, MFN1, MFN2, OPA1) et nbsp ;
Outils fluorescents & nbsp ;
Dendra2  ;Tags matriciels mitochondriaux   ;Laboratoire Jacson (PhAMexcisé)  ;Reporter photo-commutable (conversion 405nm, imagerie 488/561nm) & nbsp ;
Microscopes  ;
Microscope confocal & nbsp ;Leica DMi8  ;Imagerie cellulaire vivante et FRAP  ;lasers 405nm/488nm/561nm   ;
Image J  ;https://imagej.net/software/fiji/downloads  ;
Plugin de profileur RGB  ;https://imagej.net/ij/plugins/rgb-profiler.html.  ;Analyse des événements de fusion (chevauchement des signaux rouge/vert)  ;

Références

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Dynamique mitochondrialeFusion mitochondrialeMicroscopie confocaleTechnique FRAPProt ine Dendra2Analyse ImageJImagerie sur cellules vivantesMorphologie mitochondriale
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