Imagerie de cellules vivantes du transport endocytaire à l’aide de nanocorps fonctionnalisés dans des cellules en culture

Résumé

Le transport endocytaire et rétrograde des protéines de la membrane plasmique vers le réseau trans-Golgi est essentiel au maintien de l’homéostasie membranaire et à la régulation de la signalisation. Ici, nous décrivons une méthode pour imager et quantifier le transport endocytaire de protéines cargo transmembranaires par microscopie à cellules vivantes en utilisant des nanocorps anti-GFP dérivés dans des cellules HeLa.

Résumé

L’endocytose des récepteurs et d’autres protéines transmembranaires de la surface cellulaire aux endosomes et au-delà est essentielle pour l’homéostasie, la physiologie et la fonction. Pour étudier l’absorption endocytaire et le trafic rétrograde des protéines, nous avons mis au point une boîte à outils polyvalente comprenant des nanocorps fonctionnalisés pour surveiller le transport de la surface cellulaire vers le réseau trans-Golgi (TGN) au moyen de l’imagerie de cellules fixes et vivantes, de la microscopie électronique et de l’électrophorèse sur gel combinée à l’autoradiographie. Nous avons développé des nanocorps dérivés ciblant la protéine fluorescente verte (GFP) ou mCherry - des liants protéiques monomères, non réticulants et de haute affinité - qui peuvent être ajoutés à des lignées cellulaires exprimant des protéines membranaires d’intérêt portant les marqueurs de fluorescence extracellulaire correspondants. Lorsqu’ils se lient à des rapporteurs transmembranaires marqués GFP ou mCherry, les nanocorps sont spécifiquement internalisés et font l’objet d’un trafic parallèlement aux voies de tri endogènes des rapporteurs. Ces nanocorps ont été fonctionnalisés avec des fluorophores sélectionnés pour suivre le transport rétrograde par microscopie à fluorescence et imagerie en direct, avec de l’ascorbate peroxydase 2 (APEX2) pour résoudre la localisation ultrastructurale par microscopie électronique, et avec des motifs de sulfatation de la tyrosine pour évaluer quantitativement la cinétique d’arrivée des TGN. Dans cette étude méthodologique, nous détaillons le protocole général pour l’expression bactérienne et la purification des nanocorps fonctionnalisés, ainsi que la génération de lignées cellulaires stables GFP-rapporteures. Nous illustrons l’utilité de cette approche pour l’imagerie de cellules vivantes en utilisant un nanocorps anti-GFP modifié par mCherry (VHH-mCherry) pour analyser l’absorption endocytaire du récepteur de la transferrine (TfR) et du récepteur du mannose-6-phosphate dépendant des cations (CDMPR).

Introduction

L’endocytose des récepteurs et d’autres protéines transmembranaires (TM) de la membrane plasmique à divers compartiments intracellulaires est importante pour le maintien de l’homéostasie membranaire ^1,2. Après l’internalisation par endocytose dépendante ou indépendante de la clathrine, les cargaisons de protéines peuplent d’abord les endosomes précoces à partir desquels elles sont ensuite triées soit le long du système endo-lysosomal, soit recyclées dans la membrane plasmique, soit rétrogradées vers le réseau trans-Golgi (TGN)^3,4,5. Le recyclage des endosomes et/ou de la surface cellulaire vers le TGN fait partie du cycle fonctionnel d’un certain nombre de récepteurs de cargaison transmembranaires, tels que les récepteurs du mannose-6-phosphate dépendants des cations et indépendants des cations (CDMPR et CIMPR), délivrant des hydrolases lysosomales nouvellement synthétisées du TGN aux endosomes et lysosomes tardifs ^6,7,8, Wntless (WLS) transporte les ligands Wnt à la surface cellulaire^9, 10,11,12, ou TGN46 qui escorte les protéines de fret sécrétoires solubles, y compris le facteur pancréatique régulé à la hausse (PAUF) et d’autres marchandises de KARTS, du TGN 13,14,15,16. Alors que tous ces récepteurs cargo traversent le TGN pour la collecte de nouvelles protéines clientes, le récepteur de la transferrine (TfR) qui internalise la transferrine liée au fer est exclu du retour de Golgi 17,18,19,20,21.

Pour étudier le trafic endocytaire et rétrograde, nous avons précédemment mis en place une boîte à outils basée sur des nanocorps conçue pour marquer et suivre les protéines cargo de la surface cellulaire aux compartiments intracellulaires¹⁷. Les nanocorps constituent une nouvelle classe de liants protéiques dérivés d’anticorps homodimériques à chaîne lourde uniquement (hcAbs) naturellement présents chez les camélidés et les poissons cartilagineux^22,23. Ils représentent le domaine variable à chaîne lourde (VHH) des hcAbs et offrent de nombreux avantages par rapport aux anticorps conventionnels (par exemple, les IgG) : ils sont monomères, petits (~15 kDa), hautement solubles, dépourvus de liaisons disulfure, peuvent être exprimés de manière bactérienne et se prêtent à la sélection pour une liaison de haute affinité²⁴. Pour améliorer la polyvalence et la large applicabilité de cette boîte à outils de nanocorps, nous avons utilisé des nanocorps anti-GFP fonctionnalisés pour marquer et suivre les protéines marquées avec des marqueurs GFP sur leurs domaines extracellulaires ou luménaux. Grâce à la conjugaison recombinante de nanocorps avec des séquences de sulfatation mCherry, d’ascorbate peroxydase 2 (APEX2) ou de tyrosine, le trafic rétrograde de véritables protéines cargo transmembranaires peut être analysé par microscopie à fluorescence fixe et à cellules vivantes, par microscopie électronique ou par des tests biochimiques à l’aide de l’autoradiographie. Étant donné que la sulfatation de la tyrosine, catalysée par les tyrosylprotéines sulfotransférases TPST1 et TPST2, est une modification post-traductionnelle confinée au trans-Golgi/TGN, cette stratégie permet d’évaluer directement la dynamique et la cinétique de transport de la surface cellulaire vers le compartiment de Golgi 25,26,27. Plus récemment, nous avons élargi ce répertoire de liants protéiques fonctionnalisés pour inclure des nanocorps anti-mCherry dérivés. Ces réactifs se sont avérés utiles pour disséquer les voies de transport dépendantes de la machinerie des MPR, en particulier du CDMPR^17,28, vers le TGN par le biais d’analyses biochimiques.

Alors que l’étude précédente portait principalement sur l’application de nanocorps modifiés avec des séquences de sulfatation de la tyrosine pour évaluer biochimiquement l’arrivée de TGN par autoradiographie¹⁹, cet article décrit la génération de nanocorps fonctionnalisés marqués par fluorescence (VHH-mCherry) et de lignées cellulaires rapporteures pour l’imagerie de cellules vivantes du trafic endocytaire. En combinaison avec une protéine rapporteure fluorescente résidente de Golgi supplémentaire, ce protocole peut être adapté pour servir de flux de travail robuste pour l’analyse quantitative de l’imagerie de cellules vivantes du transport de l’endosome vers le TGN de protéines cargo sélectionnées.

Avant d’appliquer ce protocole, les chercheurs doivent s’assurer que la protéine cible est exprimée sous la forme d’une construction de fusion marquée à la GFP, généralement générée par des approches de clonage moléculaire standard. Les nanocorps fonctionnalisés peuvent être facilement produits dans les bactéries à des rendements suffisants pour les expériences de marquage de surface, les concentrations de travail dans la gamme des nanomolaires faibles convenant à la plupart des tests d’imagerie de cellules vivantes. Les utilisateurs doivent également tenir compte du fait que la cinétique de transport peut varier entre les protéines de chargement, ce qui nécessite un ajustement de la durée de marquage ou de la fréquence d’imagerie pour une visualisation optimale du trafic endocytaire ou endosome-TGN.

Protocole

1. Transformation bactérienne avec VHH-mCherry

REMARQUE : Ce protocole a été optimisé pour l’expression, la purification et l’analyse de nanocorps anti-GFP fonctionnalisés, comme décrit précédemment¹⁷. Les étapes suivantes sont adaptées pour VHH-mCherry et sont cohérentes avec le rapport méthodologique précédent¹⁹.

1. Décongelez les bactéries chimiocompétentes (50-100 μL) appropriées à l’expression des protéines (p. ex., cellules Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3)) en les plaçant sur de la glace.
   REMARQUE : Préparez des cellules bactériennes chimiocompétentes en suivant les protocoles de laboratoire standard. Les cellules BL21 (DE3) de NEB disponibles dans le commerce peuvent être utilisées à cet effet.
2. Ajouter 50 ng d’un plasmide codant pour la construction fonctionnalisée VHH-mCherry (Addgene #109421). Pour assurer une biotinylation efficace spécifique au site du rapporteur du nanocorps pendant l’expression bactérienne, co-transformer avec un excès triple (150 ng) d’un plasmide codant pour la biotine ligase bactérienne BirA (Addgene #109424). Agitez doucement le tube 4x-5x pour mélanger les cellules et l’ADN plasmidique.
   REMARQUE : La co-transformation avec le plasmide codant pour BirA n’est pas nécessaire si la biotinylation par le peptide accepteur de biotine (BAP) n’est pas requise.
3. Incuber le mélange sur de la glace pendant 30 min. Évitez de vous agiter pendant cette étape.
4. Choc thermique des cellules bactériennes en les plaçant pendant exactement 20 s à 42 °C dans un bain-marie ou un bloc chauffant.
5. Ajouter 1 mL de milieu de bouillon Luria à température ambiante (RT) et incuber les bactéries transformées dans un thermoshaker (250-500 tr/min) pendant 1 h à 37 °C pour permettre l’expression phénotypique des gènes de résistance aux antibiotiques.
   REMARQUE : Pour préparer un milieu de 1 L LB, ajoutez 5 g d’extrait de levure, 10 g de tryptone, 10 g de NaCl et complétez le volume avec de l’eau, puis stérilisez à l’autoclave.
6. Granulez les bactéries par centrifugation à 11 000 x g pendant 1 min et remettez la pastille en suspension dans 100 μL de milieu LB frais. Bien mélanger par pipetage.
7. Déposer les bactéries en suspension sur des plaques LB préchauffées contenant les antibiotiques appropriés (p. ex., avec 50 μg/mL de kanamycine ; si elles sont co-transformées avec BirA, inclure également 50 μg/mL de carbénicline, voir l’étape 1.2).
8. Incuber les plaques LB supplémentées en antibiotiques à l’envers à 37 °C pendant 13 à 15 h.
   REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. Les plaques contenant des colonies cultivées peuvent être stockées à 4 °C et scellées avec un film perméable pour éviter le dessèchement.

2. Culture liquide bactérienne et induction de l’expression de VHH-mCherry

1. Sélectionnez une seule colonie bactérienne dans la plaque de transformation et inocunez-la dans un erlenmeyer contenant 20 ml de milieu LB complété par des antibiotiques. Incuber la culture dans un incubateur agitateur pendant 13 à 15 h à 37 °C (voir également l’étape 1.7 concernant la sélection des antibiotiques).
2. Le lendemain, diluez la culture bactérienne de 20 ml dans une fiole fraîche contenant 1 L de milieu LB avec les antibiotiques de sélection correspondants.
3. Continuer l’incubation à 37 °C jusqu’à ce que la culture atteigne une densité optique à 600 nm (OD₆₀₀) de 0,6-0,7.
   REMARQUE : Laisser la culture refroidir à RT ou à 16 °C avant d’induire l’expression des protéines.
4. Induire l’expression de VHH-mCherry (et de BirA, s’il est co-exprimé) en ajoutant 1 mL d’isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) pour obtenir une concentration finale de 1 mM de l’inducteur (dilution 1:1000). Si une co-transformation avec le plasmide d’expression BirA a été effectuée, compléter également la culture avec 10 mL d’une solution mère de D-biotine de 20 mM, ce qui donne une concentration finale de 200 μM de D-biotine dans le milieu de croissance. Cela facilite la biotinylation in vivo de l’épitope de l’accepteur de biotine (BAP) présent dans la construction VHH-mCherry.
   REMARQUE : Préparez le stock de D-biotine dans ddH₂O et solubilisez-le par ajout progressif de 500 mM NaH₂PO₄.
5. Incuber la culture de 1 L induite par l’IPTG pendant 13 à 15 h à 16 °C pour favoriser un repliement et un rendement optimaux des protéines.
   REMARQUE : Les conditions d’expression des constructions de nanocorps nouvellement conçues avec d’autres marqueurs fluorescents peuvent nécessiter une optimisation empirique de la part de l’investigateur.
6. Transvaser la culture dans une bouteille de centrifugation de 1 L et prélever les cellules par centrifugation à 5 000 x g à 4 °C pendant 45 min. Jetez le surnageant dans le biodéchet liquide approprié et procédez aux étapes de purification.
   REMARQUE : Le protocole peut être interrompu à ce stade en stockant la pastille bactérienne à -80 °C. La pastille VHH-mCherry apparaît généralement en rose, ce qui indique un bon repliement de la protéine de fusion fluorescente.

3. Purification de VHH-mCherry basée sur IMAC

1. Si nécessaire, décongelez la pastille bactérienne congelée sur de la glace (voir également l’étape 2.6).
2. Ajouter 30 mL de tampon de liaison glacé (20 mM d’imidazole dans 1x PBS) à la pastille de cellules bactériennes et remettre en suspension complètement en pipetant de haut en bas. Transférez la suspension dans un tube à centrifuger de 50 ml étiqueté.
3. Complétez les cellules remises en suspension avec 200 μg/mL de lysozyme, 20 μg/mL de DNase I, 1 mM de MgCl₂ et 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF). Incuber le mélange pendant 10 min à RT, suivi de 1 h à 4 °C sur un rotateur bout à bout.
   REMARQUE : Le PMSF est toxique. Préparer et manipuler les solutions mères dans une hotte chimique en portant des gants, une blouse de laboratoire et des lunettes de protection ; éliminer les déchets contenant des PMSF dans des conteneurs à déchets organiques halogénés. Pour les expériences, une solution mère de 0,1 M a été utilisée et diluée à nouveau.
4. Perturber mécaniquement les cellules bactériennes à l’aide d’un sonicateur inséré directement dans la suspension. Appliquez trois impulsions de sonication constantes de 1 minute, en laissant un intervalle de refroidissement de 1 minute entre chaque impulsion avec les réglages de sonicateur spécifiés (taille de la pointe de la sonde : 6 mm, pointe pleine ; Amplitude 40 %; Cycle de service (mode impulsion) : 1 s ON/1 s OFF)
5. Clarifier le lysat par centrifugation à 15 000 x g à 4 °C pendant 45 min pour granuler les débris cellulaires bactériens et les bactéries intactes.
   REMARQUE : Le lysat peut être transféré dans une bouteille de centrifugation ou aliquote dans des tubes de 5 mL pour une centrifugation sur paillasse.
6. Transférez soigneusement le surnageant obtenu dans un nouveau tube de 50 mL et jetez la pastille dans les biodéchets appropriés.
7. Conservez le lysat éliminé sur de la glace pendant la préparation de la chromatographie d’affinité métallique immobilisée (IMAC). Pour l’isolement des nanocorps marqués à l’histidine, utilisez des colonnes de purification His-tag préemballées et à usage unique optimisées pour le fonctionnement par gravité.
8. Fixez les colonnes Ni-NTA (acide nickel-nitrilotriacétique) sur un support métallique ou un support de colonne approprié.
   1. Vidangez la mémoire tampon de stockage des colonnes et équilibrez avec 10 mL de tampon de liaison (20 mM d’imidazole dans 1x PBS).
   2. Laissez passer le tampon par gravité ; Jetez le flux comme biodéchet.
9. Appliquer graduellement le lysat bactérien éliminé (~30 mL) sur la colonne. Laissez-le s’écouler par gravité et jetez le flux.
10. Laver la colonne avec deux volumes consécutifs de 10 mL de tampon de liaison (20 mM d’imidazole dans 1x PBS).
11. Éluer les nanocorps liés avec 2 mL de tampon d’élution (500 mM d’imidazole dans 1x PBS) dans un tube de microcentrifugation de 2 mL.
12. Effectuez un échange de tampon.
    1. Équilibrez une colonne de dessalage placée dans un adaptateur de tube de 50 mL en rinçant 5x avec 5 mL de 1x PBS.
    2. Laissez le tampon pénétrer complètement dans la résine emballée ; Jetez le flux continu. Après le lavage final du PBS, centrifugez la colonne à 1 000 x g pendant 2 min.
    3. Jetez le flux continu. Placez la colonne avec l’adaptateur sur un nouveau tube de 50 ml. Chargez 2 mL de nanocorps fonctionnalisé élué (à partir de l’étape 3.11) sur la colonne de dessalage équilibrée en PBS et essorez à 1 000 x g pendant 2 min et récupérez l’éluat.
       REMARQUE : La dialyse peut également être utilisée pour l’échange de tampon.
13. Quantifier la concentration de la protéine VHH-mCherry purifiée à l’aide d’un test d’acide bicinchoninique (BCA) ou de Bradford selon les protocoles du fabricant.
    REMARQUE : Pour une absorption efficace des nanocorps dans les applications d’imagerie de cellules vivantes, une concentration finale de 5 à 10 mg/mL est recommandée.

4. Validation de l’expression et de la pureté de VHH-mCherry (coloration de Coomassie)

1. Préparez un gel de dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium à 10 % (SDS-PAGE) selon les protocoles de laboratoire établis.
   REMARQUE : Comme alternative, les gels à gradient préfabriqués disponibles dans le commerce de Bio-Rad peuvent être utilisés pour plus de commodité et de reproductibilité.
2. Aliquote de 20 μg de VHH-mCherry purifié dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et dénaturation par ébullition dans un tampon d’échantillon à 95 °C pendant 5 min.
3. Chargez l’échantillon de nanocorps dénaturé sur le gel de polyacrylamide SDS et effectuez l’électrophorèse en suivant les procédures PAGE standard jusqu’à ce que le colorant de suivi (par exemple, le bleu de bromophénol) atteigne le fond du gel de résolution.
4. Procédez à la coloration Coomassie et à la décoloration du gel.
   1. Retirez délicatement le gel de la cassette et plongez-le dans la solution de coloration Coomassie (5 % d’un stock de 10 g/L de Coomassie Brilliant Blue dans 10 % d’acide acétique et 45 % de méthanol dans ddH₂O) pendant 20 à 30 min à RT sur une plate-forme à agiter doucement. Assurez-vous que le gel est complètement immergé dans la solution de coloration.
   2. Décolorer le gel à l’aide d’une solution de décoloration (7,5 % d’acide acétique et 15 % de méthanol dans du jdH₂O), en effectuant 2-3 lavages séquentiels de 1 h chacun à RT. Pour une réduction optimale du bruit de fond, laissez le gel pendant 13 à 15 h dans une solution de décoloration fraîche.
      REMARQUE : L’excès de colorant peut être absorbé efficacement en plaçant des essuie-tout ménagers autour du gel pendant le processus de décoloration. Les solutions de coloration/décoloration contiennent du méthanol inflammable et de l’acide acétique irritant. Utiliser dans une hotte, porter des gants et des lunettes de protection, et recueillir les solutions usées dans des contenants de déchets de liquides inflammables désignés.
5. Visualisez le gel à l’aide d’un système de documentation du gel ou de la caméra de votre choix.
   REMARQUE : Pour une confirmation supplémentaire de l’expression des nanocorps, l’immunotransfert à l’aide d’anticorps spécifiques aux épitopes peut être effectué (voir également la figure 1C).

5. Génération de lignées cellulaires HeLa rapporteures marquées à la GFP par transduction rétrovirale

REMARQUE : Diverses lignées cellulaires de rapporteur GFP HeLa α Kyoto (ici simplement appelées HeLa ou HeLa α) ont été précédemment générées¹⁷. Dans le but de démontrer le test d’imagerie de cellules vivantes, des CDMPR ou TfR marqués à la GFP, en tant que protéines cargo représentatives, sont utilisés. Alors que les protéines TM avec une topologie de type I sont marquées GFP à l’extrémité N-terminale, les protéines TM avec une topologie de type II nécessitent une fusion GFP C-terminale.

1. Les gènes codant pour EGFP-CDMPR (Addgene #182642) ou TfR-EGFP (#243763) ont déjà été sous-clonés dans le vecteur rétroviral pQCXIP à l’aide de techniques standard de clonage d’enzymes^{de restriction 17}. Après la transformation en E. coli chimiocompétent, préparer l’ADN plasmidique de haute pureté à l’aide de trousses de préparation au midi (p. ex., de Macherey-Nagel).
   REMARQUE : Les cellules bactériennes chimiocompétentes doivent être préparées selon les protocoles de laboratoire standard. NEB 5-alpha Competent E . coli de NEB peut être utilisé pour le clonage et la purification des plasmides.
2. Pour générer des lignées cellulaires HeLa rapporteures GFP stables, des particules rétrovirales sont produites par transfection de la lignée cellulaire d’emballage Phoenix ampho. Tous les travaux de culture cellulaire sont effectués dans des conditions d’écoulement laminaire BSL2.
   1. La veille de la transfection, ensemencer 2,0 à 3,0 x 10⁶ cellules d’ampho Phoenix dans une boîte de 10 cm dans 10 mL de milieu pour obtenir une confluence de 60 % à 80 % le lendemain. Les ampho Phoenix sont maintenus dans le DMEM GlutaMAX-I à haute teneur en glucose avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 100 unités/ml de pénicilline/streptomycine et 1 mM de pyruvate de sodium.
   2. Le jour de la transfection, remplacer le milieu par 10 mL de milieu complet frais.
   3. Dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL, combinez 1 mL de DMEM à haute teneur en glucose GlutaMAX-I sans sérum ni supplément avec 10 μg de pQCXIP-EGFP-CDMPR ou pQCXIP-TfR-EGFP et 30 μL de réactif de transfection FuGENE HD. Bien mélanger par pipetage.
   4. Incuber le mélange à température ambiante pendant 15 min pour permettre la formation de complexes ADN-réactif.
   5. Ajoutez tout le mélange de transfection goutte à goutte à la culture d’ampho Phoenix. Faites tourner doucement l’assiette pour répartir uniformément les complexes.
   6. Incuber des cellules d’ampho Phoenix transfectées pendant 13 à 15 h à 37 °C avec 5 % de CO₂.
      REMARQUE : D’autres lignées cellulaires d’emballage peuvent être utilisées, à condition qu’elles soient compatibles avec le système vectoriel Retro-X Q.
3. Le lendemain, jetez le milieu de transfection et remplacez-le par 7 ml de milieu complet frais pour améliorer la production virale.
4. À 48 h et éventuellement 72 h après la transfection, prélever le surnageant de culture (~7 mL) contenant des particules virales à l’aide d’une pipette. Surveiller l’expression de la GFP dans les cellules d’ampho Phoenix transfectées à l’aide d’un microscope à fluorescence ou d’un système d’imagerie (p. ex., Bio-Rad ZOE).
   REMARQUE : Encore une fois, les manipulations rétrovirales nécessitent un confinement BSL-2. Effectuez tous les travaux dans une enceinte de biosécurité certifiée, portez des gants, une blouse de laboratoire et des lunettes de protection, et décontaminez les surfaces avec 1 % d’hexaquart suivi de 70 % d’éthanol avant de les éliminer par autoclave.
5. Filtrez le surnageant viral collecté à travers un filtre de 0,45 μm. Le surnageant filtré peut être utilisé immédiatement (voir étape 5.7) ou stocké à 4 °C pour une utilisation à court terme ou à -80 °C pour un stockage à long terme. Notez que les titres viraux peuvent diminuer à la congélation.
6. Pour établir des cellules HeLa rapporteures de la GFP stables, procédez à la transduction rétrovirale à l’aide du surnageant viral filtré. Toutes les procédures doivent être effectuées dans des conditions BSL2.
   1. Un jour avant la transduction, ensemencer environ 2,0 à 3,0 x 10 cellules de α^HeLa dans une boîte de 10 cm avec 10 ml de milieu pour atteindre une confluence de 60 à 80 % le lendemain. Les cellules de α HeLa sont cultivées dans du DMEM GlutaMAX-I à haute teneur en glucose complété par 10 % de FBS et 100 U/mL de pénicilline/streptomycine.
   2. Mélanger du surnageant viral filtré avec 15 μg/mL de polybrène (bromure d’hexadiméthrine) pour améliorer l’efficacité de l’infection.
      REMARQUE : Le polybrène est un irritant - lors de la préparation du stock, manipulez-le avec des gants et des lunettes de protection, évitez la formation d’aérosols et éliminez les solutions contenant du polybrène comme déchets chimiques dangereux.
   3. Le lendemain, remplacez le milieu de croissance standard par un surnageant viral non dilué contenant du polybrène, en veillant à ce que toute la surface de la boîte soit couverte.
   4. Incuber les cellules HeLa α en transduction pendant 13 à 15 h à 37 °C avec 5 % de CO₂.
      REMARQUE : Pour déterminer le titre viral, des tests de dilution et d’infection en série sur les cellules HeLa α peuvent être effectués. Dans ce cas, le titrage est facultatif, car les rétrovirus n’infectent que les cellules en division.
7. Le lendemain de la transduction, jeter le milieu viral dans les déchets BSL2 et le remplacer par 10 ml de milieu de α HeLa complet frais. Incuber pendant 13-15 h à 37 °C avec 5 % de CO₂.
8. Le lendemain, amorcer la sélection en remplaçant le milieu par un milieu complet contenant 1,5 μg/mL de puromycine.
9. Maintenez la pression de sélection pendant 2 à 3 semaines, en passant les cellules au besoin. Avant de transférer des cellules génétiquement modifiées dans un environnement BSL1, assurez-vous qu’elles sont exemptes de particules virales capables de se répliquer.
10. Pour obtenir une population homogène, il faut soit utiliser l’isolement clonal à l’aide d’anneaux ou de cylindres de clonage, soit le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). La FACS peut être réalisée sur des cellules HeLa α transduites à l’aide de FACSAria III ou Fusion (BD Biosciences) pour enrichir une population avec une expression uniforme de la GFP basée sur l’intensité de la fluorescence.
    REMARQUE : L’expression du rapporteur de la GFP dans les cellules HeLa α peut être validée par microscopie à fluorescence à cellules fixes ou immunotransfert avec des anticorps anti-GFP (voir également la Figure 2C).

6. Absorption de VHH-mCherry par les cellules cultivées pour l’imagerie de cellules vivantes

REMARQUE : Toutes les procédures de culture cellulaire sont effectuées dans des conditions stériles à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire avant la microscopie à cellules vivantes.

1. 6.1Dans un flux laminaire stérile, ensemencer environ 50 000 à 110 000 cellules HeLa exprimant de manière stable des constructions rapporteures CDMPR ou TfR marquées à la GFP dans chaque puits d’une lame de chambre ibiTreat à 4 puits de μ. Utiliser 700 μL de milieu de culture complet contenant des antibiotiques (DMEM à haute teneur en glucose, sans rouge de phénol), complété par 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline/streptomycine, 2 mM de l-glutamine et 1,5 μg/mL de puromycine.
2. Incuber les cellules pendant 13 à 15 h à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂ pour permettre une bonne adhérence et prolifération. Les cellules devraient atteindre environ 80 % de confluence le lendemain.
3. Le jour de l’imagerie, juste avant l’expérience, remplacez doucement le milieu de chaque puits par 350 μL de milieu complet frais sans rouge de phénol.
4. En parallèle, préparer une solution de travail VHH-mCherry à une concentration finale de 2,5 μg/mL (environ 50 nM) dans un milieu préchauffé et sans rouge de phénol. Maintenir la solution à 37 °C jusqu’à utilisation.
5. Après avoir initialisé le système automatisé d’imagerie de cellules vivantes (par exemple, FEI MORE ou Nikon Ti2 X-Light V3), préchauffez la chambre d’incubation du microscope à 37 °C avec 5 % de CO₂ avant de transférer la chambre de microscopie ibidi sur le microscope et de configurer les paramètres d’acquisition comme suit.
   1. Choisissez le U PlanS Apo 100x NA 1.4 et ajoutez la chambre de microscopie ibidi sur la platine du microscope.
   2. Configurez deux canaux avec la longueur d’onde d’excitation appropriée et des filtres d’émission passe-bande unique pour EGFP (ex : 470/20 nm, em : 517/20 nm) et mCherry (ex : 550/15 nm, em : 590/20 nm).
   3. Choisissez un temps d’exposition court et une faible intensité d’éclairage pour éviter le photoblanchiment (par exemple, 50 ms et 5 % de puissance pour EGFP, 160 ms et 25 % pour mCherry). Il est important que les valeurs choisies soient maintenues constantes pour toutes les expériences.
   4. Par condition (=bien), stockez les coordonnées de 10 champs de vision différents avec 3-4 cellules au foyer dans une liste de points.
   5. Imagez chaque position de cette liste de points une fois avec un seul instantané. Voici les images de référence avant l’ajout de VHH-mCherry.
   6. Pour initier l’absorption endocytaire, ajoutez doucement 350 μL de la solution VHH-mCherry préchauffée dans chaque puits, en assurant une perturbation minimale de la monocouche cellulaire. Poursuivre l’incubation à 37 °C avec 5 % de CO₂.
   7. Imagez chaque point de la liste de points à plusieurs reprises dans une expérience en accéléré pendant 100 images avec un retard de 36 s entre les images à 37 °C avec 5 % de CO₂.
   8. Pour diminuer le photoblanchiment, ordonnez l’acquisition des canaux pour imager d’abord mCherry, puis EGFP.
   9. Pour augmenter le débit, ordonnez à l’acquisition d’acquérir d’abord toutes les positions de manière séquentielle et répétez cette opération pour chaque point temporel.

7. Analyse d’images de l’absorption endocytaire VHH-mCherry

1. Prétraitement des images post-acquisition et extraction des données aux Fidji.
   1. Chargez l’image time-lapse à l’aide du plugin d’importation Bio-Formats avec l’option de division des canaux activée.
   2. Corrigez la dérive latérale à l’aide du plug-in MultiStackReg. Utilisez le canal EGFP comme référence et appliquez également la transformation au canal mCherry.
   3. Pour chaque cellule, dessinez une région d’intérêt (ROI) à l’aide de l’outil Polygone (par exemple, autour de la région périnucléaire) et ajoutez-la au gestionnaire de ROI.
   4. Pour les deux canaux, mesurez l’intensité moyenne dans tous les ROI et points temporels à l’aide de la fonction Multi mesure du gestionnaire de ROI et enregistrez le tableau résultant sous forme de fichier texte.
   5. Ouvrez l’image de référence correspondante et répétez la mesure pour chaque retour sur investissement.
2. Analyse des données pour déterminer les courbes d’absorption endocytaire
   1. Ouvrez le fichier texte et soustrayez chaque numéro d’image par 1 de sorte qu’ils commencent à 0, puis multipliez chaque numéro d’image par le délai entre les images en s (c’est-à-dire 36).
   2. Pour chaque ROI, soustrayez l’intensité moyenne de l’image de référence dans le canal VHH-mCherry de chaque image de l’image time-lapse correspondante dans le canal VHH-mCherry afin de supprimer l’autofluorescence et l’arrière-plan.
   3. Pour chaque image et ROI, divisez l’intensité VHH-mCherry soustraite de l’arrière-plan par l’intensité moyenne des canaux EGFP pour tenir compte des fluctuations d’intensité au sein du ROI autre que VHH-mCherry, par exemple, par mouvement de Golgi, contraction cellulaire, dérive z ou instabilités d’éclairage.
   4. Normalisez la courbe résultante à son propre maximum.
   5. Sélectionnez une plage d’images pour exclure tout artefact au début (c’est-à-dire l’ajout de médias) ou à la fin (c’est-à-dire la dérive, le blanchiment) du time-lapse.
   6. Ajustez les données de la courbe avec une seule fonction de décroissance exponentielle qui modélise un processus cinétique du premier ordre :
      
      où I(t) est l’intensité normalisée à l’instant t, et t₀ tient compte du délai entre l’addition VHH-mCherry et le début de l’enregistrement. À partir de la constante de vitesse k, calculer la demi-vie τ_1/2 du processus comme suit :
      
      REMARQUE : Lors de la réalisation d’une expérience avec plusieurs champs de vision (FOV) imageux ultérieurement par point temporel, chaque t0 correspondant peut être légèrement différent, mais il doit augmenter jusqu’à des valeurs plus élevées d’un FOV à l’autre.
   7. Répétez la procédure pour tous les jeux de données et indiquez les valeurs de demi-vie dans des boîtes à moustaches.

Résultats

Pour étudier le trafic de protéines rétrogrades vers divers compartiments intracellulaires, nous avons récemment mis au point un outil basé sur des nanocorps anti-GFP pour marquer et suivre les protéines de fusion recombinantes à la surface cellulaire¹⁷. Ici, nous décrivons la production bactérienne de tels nanocorps dérivés, et démontrons leur utilité dans le suivi de l’absorption endocytaire par l’imagerie de cellules vivantes. En combinaison avec un rapporteur fluorescent résident de Golgi, ce protocole offre une plate-forme robuste pour étudier quantitativement le transport rétrograde de protéines cargo sélectionnées vers le réseau trans-Golgi (TGN) en temps réel.

Nous avons généré une collection de nanocorps anti-GFP fonctionnalisés distincts partageant une architecture modulaire commune, en utilisant des techniques de clonage moléculaire standard¹⁷. Bien que l’étude actuelle se concentre sur la variante fluorescente VHH-mCherry, nous incluons également des nanocorps dérivés supplémentaires pour illustrer la polyvalence de cet ensemble d’outils et mettre en évidence leur potentiel pour de futures applications. Notre construction la plus basique, VHH-std (std pour standard), comprend le domaine VHH, les épitopes T7 et HA pour la détection basée sur les anticorps, un marqueur C-terminal hexahistidine (His₆) pour la purification et une séquence de peptide accepteur de biotine (BAP) pour permettre la biotinylation enzymatique et les tests pulldown basés sur la streptavidine de haute affinité (Figure 1A). À partir de cette conception de base, divers dérivés de nanocorps ont été développés pour faciliter l’étude du trafic endocytaire et rétrograde par l’analyse biochimique, l’imagerie de cellules fixes et vivantes et la microscopie électronique.

Pour l’imagerie de cellules vivantes du transport endocytaire, nous avons conçu un nanocorps fluorescent anti-GFP incorporant un fluorophore avec des spectres d’excitation et d’émission distincts de ceux de la GFP, assurant ainsi une séparation spectrale optimale lors de la microscopie à fluorescence. Sur la base de ses propriétés de repliement supérieures chez E. coli induites par l’IPTG et de ses propriétés photophysiques bien caractérisées, nous avons sélectionné mCherry comme marqueur fluorescent de choix. D’autres fluorophores décalés vers le rouge, tels que la protéine fluorescente rouge monomère (mRFP), seraient également des alternatives appropriées en principe, mais mCherry s’est avéré particulièrement robuste et efficace dans ce système.

Quel est le potentiel d’autres nanocorps fonctionnalisés que VHH-mCherry ? Pour étudier le trafic de protéines de la membrane plasmique vers le réseau trans-Golgi (TGN), nous avons exploité la localisation spécifique du compartiment des TPST, qui résident exclusivement dans le TGN et les citernes trans-Golgi. À cette fin, nous avons modifié VHH-std avec un motif de sulfatation tyrosine en tandem (2xTS) dérivé de la procholécystokinine²⁹ du rat, permettant ainsi une lecture biochimique de l’arrivée de la cargaison dans ces compartiments. Alors que la fusion de VHH-std à mCherry permet de visualiser directement le transport rétrograde par imagerie fixe ou sur cellules vivantes, la fonctionnalisation avec des peroxydases telles que APEX2³⁰ permet une localisation ultrastructurale par microscopie électronique, une ablation cytochimique ciblée ou des tests de biotinylation basés sur la proximité. De plus, l’incorporation d’un site de clivage de la protéase d’un virus de gravure du tabac (TEV) dans l’échafaudage du nanocorps fournit un moyen biochimique de distinguer les nanocorps internalisés et liés à la surface (Figure 1A). Nous avons précédemment utilisé la construction VHH-tev pour surveiller la cinétique de recyclage de l’EGFP-CDMPR et du TfR-EGFP¹⁷ liés aux nanocorps. La réapparition des récepteurs marqués par les nanocorps à la surface cellulaire pourrait être facilement détectée en appliquant de la protéase TEV recombinante de manière extracellulaire, entraînant une perte spécifique de la cassette d’épitopes C-terminal du nanocorps. De même, l’inclusion d’un site de clivage TEV dans le nanocorps VHH-mCherry fonctionnalisé ici permet une évaluation dynamique du recyclage du rapporteur EGFP par imagerie de cellules vivantes. La fonctionnalisation avec des domaines protéiques alternatifs - tels que des fluorophores supplémentaires, des marqueurs enzymatiques ou des motifs de séquence pour la modification post-traductionnelle - peut être facilement réalisée en sous-clonant les inserts souhaités dans le squelette VHH-std par les sites de restriction SpeI et EcoRI. Toutes les constructions de nanocorps fonctionnalisés anti-GFP utilisées dans l’étude originale¹⁷ ont été déposées auprès d’Addgene pour une distribution publique.

En utilisant le protocole décrit ci-dessus, toutes les variantes de nanocorps illustrées ici ont été purifiées à haut rendement et pureté (Figure 1B). Seule la fusion mCherry a montré un écrêtage protéolytique mineur des domaines protéiques après purification (Figure 1B, voie 5). Les deux produits de dégradation observés correspondent très probablement aux domaines VHH et mCherry individuels, comme déduit de leurs poids moléculaires apparents et vérifié par détection immunoblot spécifique de l’épitope (figure 1C). En l’absence de BirA co-exprimé, VHH-mCherry se rétablissait généralement à des rendements d’environ 20 mg par préparation. D’après notre expérience, la co-expression de BirA réduit systématiquement le rendement des nanocorps d’environ 1/3^à 1/2. La biotinylation a été assez complète car les nanocorps d’un mélange 1:1 avec de la BSA ont été entièrement récupérés par la streptavidine-agarose (Figure 1D).

Pour évaluer l’adéquation de cette boîte à outils de nanocorps pour l’étude du transport endocytaire, nous avons généré des lignées cellulaires HeLa stables exprimant des protéines réceptrices de surface marquées à l’EGFP avec des voies de trafic intracellulaire distinctes. Il s’agit notamment du TfR, qui circule entre la membrane plasmique et les endosomes précoces (tri et recyclage) ; TGN46, qui circule entre la membrane plasmique et le TGN par des endosomes précoces ; et les deux MPR, qui font la navette entre le TGN, la membrane plasmique et les endosomes précoces et tardifs¹⁷. L’EGFP a été fusionné au domaine extracellulaire de chaque récepteur - plus précisément, inséré entre le peptide signal et la séquence du récepteur pour CDMPR, CIMPR et TGN46 - et à l’extrémité C-terminale de TfR. Cette conception a préservé les domaines cytoplasmiques natifs, garantissant que tous les signaux de tri connus restaient intacts et que l’étiquette EGFP était accessible pour la liaison par des nanocorps extracellulaires anti-GFP (Figure 1E). Pour CIMPR, dont le domaine extracellulaire est inhabituellement grand, une version tronquée a été utilisée, conformément aux études précédentes démontrant qu’une telle troncature préserve le comportement normal de trafic^31,32.

Des lignées cellulaires stables ont été établies par transduction rétrovirale, suivie d’un tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour isoler des populations cellulaires homogènes avec des niveaux d’expression modérés et comparables. Il convient de noter que l’EGFP-CDMPR est apparu de manière constante sous la forme d’une double bande dans les immunotransferts, similaire à son homologue endogène³³, ce qui indique une glycosylation hétérogène. Pour évaluer si les protéines de fusion EGFP récapitulent les profils de localisation et d’expression à l’état d’équilibre des protéines endogènes, les cellules exprimant de manière stable ont été co-cultivées avec des cellules HeLa parentales et analysées par microscopie à fluorescence confocale (Figure 2B). Le signal EGFP reflétait fidèlement la distribution des protéines endogènes correspondantes. Comme prévu, CDMPR, CIMPR et leurs versions marquées EGFP se sont localisées principalement dans la région périnucléaire - reflétant le TGN et les compartiments endosomaux tardifs - avec un marquage supplémentaire dans les endosomes périphériques. Les TGN46 endogènes et marqués EGFP ont été trouvés presque exclusivement dans le TGN périnucléaire, tandis que TfR et TfR-EGFP ont montré la distribution précoce caractéristique des endosomes, avec un tri périphérique proéminent et des endosomes de recyclage périnucléaire. Bien que les anticorps utilisés aient détecté à la fois les formes endogènes et marquées EGFP (à l’exception de CIMPR), l’intensité globale de la coloration n’a pas été significativement augmentée dans les cellules exprimant les protéines de fusion, ce qui suggère que les constructions EGFP n’étaient pas substantiellement surexprimées. Nous avons inclus EGFP-TGN46 et EGFP-CIMPR dans la figure 2B pour une comparaison directe avec EGFP-CDMPR et TfR-EGFP. Les protocoles utilisés pour la fixation cellulaire et l’imagerie par microscopie à fluorescence sont décrits dans des études antérieures^17,19.

À l’aide de VHH-mCherry, le transport endocytaire des protéines rapporteures marquées à l’EGFP peut être surveillé par imagerie de cellules vivantes. Pour cela, nous avons utilisé comme exemples des cellules exprimant EGFP-CDMPR et TfR-EGFP. Les cellules ont été imagées au fil du temps à l’aide d’un microscope fluorescent à champ large inversé lors de l’ajout de VHH-mCherry au milieu (Vidéo 1 et Vidéo 2). La figure 3 montre des images fixes à différents moments de l’image. L’absorption a été quantifiée en mesurant le signal dans le canal mCherry, en soustrayant le bruit de fond d’autofluorescence et en normalisant le signal EGFP pour éliminer les fluctuations dues au mouvement des compartiments marqués ou aux petits décalages potentiels dans le plan focal. La fluorescence de VHH-mCherry dans le milieu à 25 nM était négligeable et n’a pas interféré avec les mesures. L’analyse du transport des rapporteurs de la surface cellulaire vers leurs compartiments intracellulaires, jusqu’à la distribution à l’état d’équilibre, a donné les mêmes résultats cinétiques que les expériences biochimiques montrées à la figure 2 de la publication précédente¹⁷, avec des demi-vies apparentes d’absorption de ~9 min pour EGFP-CDMPR et de ~4 min pour TfR-EGFP, et une saturation après ~43 min et ~20 min, respectivement. Ces valeurs étaient comparables aux valeurs obtenues à partir d’expériences d’absorption biochimique à l’aide d’essais d’immunoblotting¹⁷. En principe, la cinétique du transport rétrograde dans les régions subcellulaires d’intérêt, telles que la région périnucléaire de la plus forte concentration de MPR, peut également être analysée. Cependant, la région périnucléaire contient non seulement Golgi/TGN, mais est également enrichie en endosomes tardifs et en endosomes de recyclage. La cinétique de l’absorption des nanocorps dans la région périnucléaire n’est pas suffisamment spécifique pour analyser le transport rétrograde vers un organite défini. Pour évaluer de manière plus fiable le transport de la membrane plasmique vers le TGN, une autre protéine fluorescente, une protéine transmembranaire résidente du TGN, doit être co-exprimée de manière stable avec la protéine rapporteure de la GFP, de manière à ce qu’il n’y ait pas de chevauchement spectral des propriétés des fluorophores. L’utilisation de ce marqueur supplémentaire permet de détecter la VHH-mCherry importée d’un rapporteur, analogue à la sulfatation de la tyrosine médiée par les TPST, comme documenté précédemment¹⁹.

Figure 1 : Conception et production de nanocorps dérivés pour le suivi des protéines de surface cellulaire marquées à l’EGFP. (A) Vue d’ensemble schématique des nanocorps dérivés. La construction standard du nanocorps comprend un domaine VHH spécifique à la GFP, des marqueurs d’épitopes T7 et HA, un peptide accepteur de biotine (BAP) et un marqueur d’hexahistidine C-terminal (His₆) pour la purification. D’autres variantes de nanocorps incluent des modifications avec des sites de sulfatation de tyrosine en tandem (2xTS), la peroxydase APEX2 modifiée ou la protéine fluorescente mCherry. La barre d’échelle indique la longueur des acides aminés (aa). (B) Des nanocorps exprimés par des bactéries et purifiés par affinité (20-50 μg) ont été analysés par gradient SDS-PAGE et visualisés par coloration de Coomassie. Les étalons de poids moléculaire (en kDa) sont indiqués à gauche. Un écrêtage protéolytique mineur n’a été observé que pour VHH-mCherry, se produisant probablement entre les domaines VHH et mCherry. (C) Analyse immunobuvable de préparations de nanocorps (10 ng) à l’aide d’anticorps dirigés contre les épitopes T7, HA ou His₆, ou détectés par streptavidine-HRP (SA-HRP) pour l’évaluation de la biotinylation. (D) L’étendue de la biotinylation des nanocorps a été évaluée en incubant des nanocorps selon un rapport de 1:1 avec la BSA, suivie d’une extraction de la streptavidine-agarose, d’une granulation et d’un lavage des billes. Des volumes égaux de surnageant (S) et de matériau lié aux billes (B) ont ensuite été analysés par SDS-PAGE et coloration Coomassie. La récupération quantitative du nanocorps dans la fraction liée aux billes indique une biotinylation complète. La présence de fragments VHH et mCherry dans la fraction liée suggère une dégradation partielle, probablement survenue lors de la préparation de l’échantillon pour l’analyse SDS-PAGE. La ligne blanche entre les voies 2 et 3 indique la suppression de deux voies non liées. Ce chiffre a été modifié au lieu de¹⁷. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Expression et localisation intracellulaire de récepteurs de fret marqués par EGFP marqués par fluorescence. (A) Représentation schématique des constructions de fusion EGFP. Les séquences dérivées des protéines transmembranaires sécrétoires sont représentées en noir, avec les peptides signaux N-terminaux et les domaines transmembranaires internes surlignés en jaune. La fraction EGFP est illustrée en vert. Des constructions complètes ont été générées pour CDMPR, TfR et TGN46, tandis qu’une variante tronquée bien caractérisée a été utilisée pour CIMPR afin de préserver le comportement normal du trafic. La barre d’échelle indique la longueur des acides aminés (aa). EGFP-CDMPR et TfR-EGFP ont été décrits précédemment¹⁷. (B) Pour évaluer la localisation subcellulaire, les cellules HeLa exprimant de manière stable les protéines de fusion EGFP ont été co-cultivées avec des cellules HeLa parentales et analysées par microscopie à fluorescence. La barre d’échelle représente 10 μm. (C) Les cellules HeLa exprimant de manière stable les protéines rapporteures marquées EGFP ont été lysées, et les extraits de protéines ont été soumis à SDS-PAGE suivi d’un immunotransfert à l’aide d’anticorps contre la GFP et l’actine. Les marqueurs de poids moléculaire (en kDa) sont indiqués à droite. Ce chiffre a été modifié au lieu de¹⁷. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Imagerie de cellules vivantes de la cinétique d’absorption endocytaire de nanocorps médiée par EGFP-CDMPR et TfR-EGFP. L’imagerie de cellules vivantes a été réalisée après l’ajout de 25 nM de VHH-mCherry à des cellules HeLa exprimant de manière stable (A) EGFP-CDMPR ou (B) TfR-EGFP dans un milieu complet sans rouge de phénol à 37 °C. Les cellules ont été imagées dans les canaux GFP et mCherry à l’aide d’un microscope à fluorescence semi-automatisé à grand champ à des intervalles de 36 s. Des images fixes fusionnées représentatives sont présentées, accompagnées de vues agrandies de la région périnucléaire (grossissement : 2,2x) dans les différents canaux ci-dessous. (Barres d’échelle, 10 μm.) Voir aussi les vidéos 1 et 2. L’analyse quantitative de la cinétique d’absorption des nanocorps dans (C) EGFP-CDMPR et (D) TfR-EGFP a été réalisée à l’aide de données provenant de trois expériences indépendantes, chacune capturant environ 40 cellules individuelles. Pour tenir compte du mouvement des organites et de la variabilité du plan focal, l’intensité de fluorescence de mCherry a été normalisée (norme) au signal GFP et tracée comme la moyenne ± SD dans toutes les cellules des trois expériences. Le signal d’absorption maximal moyen a été normalisé à 1. La cinétique d’absorption de chaque cellule a été ajustée individuellement à l’aide d’un modèle cinétique de premier ordre. Les lignes tracées représentent les courbes moyennées dérivées de la moyenne des constantes de vitesse correspondantes. Ce chiffre a été modifié au lieu de¹⁷. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1 : Imagerie de cellules vivantes de l’absorption de nanocorps mCherry par EGFP-CDMPR. Les cellules HeLa exprimant de manière stable EGFP-CDMPR ont été incubées à 37 °C dans un milieu complet contenant 25 nM de VHH-mCherry et imagées dans les canaux de fluorescence EGFP et mCherry à des intervalles de 36 s. Le rendu vidéo a été effectué à une vitesse de lecture de 5 images/s, ce qui correspond à une compression en temps réel de 3 min/s. Ce film a été modifié de¹⁷. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 2 : Imagerie de cellules vivantes de l’absorption de nanocorps mCherry par TfR-EGFP. Les cellules HeLa exprimant de manière stable TfR-EGFP ont été incubées à 37 °C dans un milieu complet complété par 25 nM de VHH-mCherry et imagées pour la fluorescence EGFP et mCherry à des intervalles de 36 s. Le rendu vidéo a été réalisé à 5 images/s, ce qui représente une cadence de 3 min/s. Ce film a été modifié de¹⁷. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Discussion

Les nanocorps représentent une classe émergente d’échafaudages de liaison aux protéines qui offrent de nombreux avantages par rapport aux anticorps conventionnels : ils sont petits, très stables, monomères, non réticulants, dépourvus de liaisons disulfure et peuvent être sélectionnés pour une liaison de haute affinité²⁴. Dans notre étude précédente, nous avons développé et appliqué des nanocorps fonctionnalisés produits par l’expression bactérienne pour marquer les protéines exposées à la surface et surveiller leur trafic intracellulaire vers divers compartiments, en mettant l’accent sur le transport rétrograde vers le réseau trans-Golgi (TGN)¹⁷. Nous avons utilisé un nanocorps anti-GFP pour assurer la polyvalence, permettant de cibler des protéines de fusion marquées avec des GFP extracellulaires, des YFP ou des mCerulean - des marqueurs fluorescents largement disponibles et souvent déjà caractérisés. La fonctionnalisation du nanocorps anti-GFP avec des motifs de sulfatation mCherry, APEX2 ou tyrosine nous a permis de visualiser l’absorption de cargaison par imagerie fixe et à cellules vivantes, de localiser les compartiments de transport rétrogrades au niveau ultrastructurel, d’effectuer une ablation ciblée des compartiments et d’évaluer quantitativement la cinétique de transport vers le TGN. L’une des limites de cette approche est la condition préalable à la modification génétique des lignées cellulaires cibles - soit par surexpression stable, soit par marquage endogène - avant que les nanocorps anti-GFP fonctionnalisés puissent être utilisés efficacement. Cependant, cette stratégie peut être facilement adaptée au répertoire croissant de nanocorps dirigés contre des protéines cibles endogènes non marquées générées par l’immunisation animale ou la sélection in vitro à partir de banques synthétiques de VHH à l’aide de technologies d’affichage de ribosomes ou de phages³⁴. De plus, des nanocorps ciblant des marqueurs d’épitopes couramment utilisés, tels que mCherry, V5 ou ALFA, ont été développés ces dernières années 35,36,37. Notamment, nous avons récemment utilisé un nanocorps anti-mCherry compétent en sulfatation pour étudier le trafic rétrograde de CDMPR dans les cellules HeLa appauvries en GGA2 par inactivation fonctionnelle rapide²⁸. Les petites étiquettes d’épitopes offrent l’avantage de préserver la conformation et la fonction natives de la protéine cible, car elles sont moins susceptibles d’interférer avec des domaines structurels critiques. Les nanocorps reconnaissant ces épitopes compacts (par exemple, ALFA, V5) peuvent être intégrés de manière transparente dans la boîte à outils fonctionnelle des nanocorps pour étendre leur utilité dans l’étude des mécanismes de trafic endocytaires et rétrogrades.

Dans la présente étude, nous démontrons l’application de VHH-mCherry dans des expériences d’imagerie de cellules vivantes. En utilisant EGFP-CDMPR et TfR-EGFP comme protéines rapporteures, nous avons pu visualiser l’absorption endocytaire spécifique du récepteur et sa progression vers une distribution à l’état d’équilibre. L’analyse quantitative du trafic de ces rapporteurs de la membrane plasmique vers leurs compartiments intracellulaires respectifs a révélé une cinétique compatible avec celles obtenues par les dosages biochimiques présentés à la figure 2 d’une étude précédente¹⁷. Nous avons constaté que la demi-vie apparente était considérablement plus longue pour EGFP-CDMPR (~9 min) que pour TfR-EGFP (~4 min), les signaux devenant saturés après environ 43 min et 20 min, respectivement. Ces résultats quantitatifs s’alignent bien avec les données publiées précédemment sur la dynamique du trafic MPR et TfR 38,39,40. Notamment, la construction VHH-mCherry a suscité une attention considérable de la part de la communauté des chercheurs, comme en témoignent les nombreuses demandes de distribution d’Addgene, et a déjà été mise en œuvre avec succès dans plusieurs études indépendantes 28,41,42,43,44.

Selon la configuration du microscope ou les exigences expérimentales, les nanocorps anti-GFP marqués mCherry ne sont pas toujours optimaux. Dans de tels cas, d’autres fluorophores ou variantes de protéines fluorescentes peuvent fournir des propriétés spectrales plus appropriées lorsqu’ils sont utilisés en combinaison avec des lignées cellulaires rapporteures de GFP. Pour y remédier, nous avons établi une bibliothèque de nanocorps fonctionnalisés incorporant une gamme variée de protéines fluorescentes, notamment mTagBFP2, mNeptune2.5, mCardinal2, TagRFP657 et iRFP670 (243764-68). Ces constructions de nanocorps supplémentaires seront mises à disposition par l’intermédiaire d’Addgene. L’utilisation de fluorophores spectralement distincts permet une séparation claire des signaux d’excitation et d’émission, facilitant ainsi une imagerie optimale en direct et en temps réel d’un maximum de trois canaux de fluorescence avec un chevauchement spectral minimal.

Bien que la surveillance de l’absorption endocytaire à l’état d’équilibre puisse sembler simple, le suivi du transport rétrograde des protéines vers le TGN présente un plus grand défi expérimental. En plus de VHH-mCherry et d’une protéine rapporteure marquée à la GFP, un marqueur résident TGN fluorescent ou conjugaisable à un colorant supplémentaire est nécessaire pour la visualisation et la quantification. Cependant, certaines protéines résidentes de Golgi présentent une fuite partielle à la surface cellulaire, qui peut être exacerbée par des perturbations des voies de trafic intracellulaires, telles que celles introduites par la manipulation expérimentale des composants de la machinerie de transport. TGN46, par exemple, est couramment utilisé comme marqueur résident de Golgi malgré son rôle fonctionnel en tant que récepteur de cargaison médiant le transport de surface de certaines cargaisons sécrétoires entre le TGN et la cellule^16,45. De même, des glycosyltransférases telles que la β-1,4-galactosyltransférase ont également été détectées au niveau de la membrane plasmique⁴¹. Bien que ces protéines puissent remonter à la surface, leur localisation prédominante à l’état d’équilibre reste dans le TGN. Le marquage de ces marqueurs avec une protéine fluorescente spectralement distincte ou un marqueur compatible avec un colorant (par exemple, SNAP, Halo, etc.) et leur co-expression stable avec un rapporteur transmembranaire marqué GFP permettrait une imagerie quantitative des cellules vivantes de l’arrivée de TGN. Cela pourrait être mesuré de manière analogue au flux de travail décrit ci-dessus, avec une quantification basée sur l’accumulation du signal mCherry dans le canal de fluorescence correspondant à la protéine de fusion résidente de Golgi. Les stratégies actuelles d’étude du trafic rétrograde dans les cellules fixes ou vivantes reposent souvent sur des constructions de récepteurs chimériques en combinaison avec des anticorps IgG (p. ex., CD8)^46,47. Cependant, le risque inhérent de réticulation dû à la bivalence des IgG conventionnelles lors du marquage de surface peut modifier de manière significative le destin intracellulaire de la protéine marquée, la redirigeant fréquemment vers une dégradation lysosomale après endocytose^48,49. En revanche, les nanocorps, en raison de leur nature monovalente et de leur stœchiométrie de liaison 1:1, n’induisent pas de réticulation, préservant ainsi les voies de trafic physiologiques de la protéine cible. Cela rend les approches basées sur les nanocorps particulièrement précieuses pour étudier la dynamique de transport rétrograde authentique sans introduire d’artefacts de routage artificiels.

La performance optimale de ce protocole pour l’imagerie de cellules vivantes nécessite un titrage minutieux de la concentration des nanocorps, car des quantités excessives entraînent une fluorescence de fond élevée à partir de nanocorps non liés dans le milieu. De plus, les différences dans les niveaux d’expression des lignées cellulaires rapporteures de la GFP doivent être prises en compte lors du titrage pour assurer une comparaison quantitative précise. Pour la production de nanocorps, l’induction à basse température chez E. coli est essentielle pour favoriser le bon repliement du domaine mCherry. Des températures d’induction plus élevées entraînent généralement des protéines mal repliées ou dégradées et ne sont donc pas recommandées.

Le succès de ce protocole dépend essentiellement de trois aspects clés : premièrement, l’expression à haut rendement et la pureté des constructions fonctionnelles de nanocorps pour assurer un marquage cohérent et un bruit de fond minimal ; deuxièmement, l’utilisation de lignées cellulaires bien caractérisées exprimant de manière stable des protéines rapporteures marquées à la GFP avec localisation à la surface cellulaire pour récapituler les voies de trafic physiologiques ; et troisièmement, la manipulation et la configuration optimales de l’installation de microscopie à fluorescence, y compris les paramètres d’imagerie et la séparation spectrale, afin de permettre une analyse quantitative et qualitative précise de la dynamique du transport de marchandises.

La méthode et le protocole présentés ici, centrés sur l’utilisation de nanocorps anti-GFP marqués par mCherry, permettent un suivi à la fois quantitatif et qualitatif des protéines cargo de la surface cellulaire aux compartiments endocytaires dans des cellules de mammifères en culture. Lorsqu’elle est co-exprimée avec un marqueur résident de Golgi marqué par fluorescence, cette approche permet d’analyser davantage les voies de transport rétrogrades. En tant que tel, cet outil fournit une stratégie puissante pour surveiller le trafic intracellulaire des protéines transmembranaires de surface cellulaire et des récepteurs qui étaient auparavant inaccessibles au marquage en raison de l’absence de ligands spécifiques ou de réactifs de liaison monomères compatibles.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps anti-GFP   ;	Sigma-Aldrich	118144600001	Le produit est distribué par Sigma-Aldrich, mais fabriqué par Roche
Antennes de culture cellulaire de 100 mm	TPP	TPP93100
Anticorps anti-actine	EMD Millipore  ;	MAB1501
Anticorps anti-HA	Du laboratoire	fabriqué à partir d’hybridome 12CA5
Anticorps anti-His6	Laboratoires Bethyl & nbsp ;	A190-114A
Anticorps anti-T7   ;	Laboratoires Bethyl & nbsp ;	A190-117A
BL21(DE3) Compétent   ;E. coli	ONÉ	C2527H
Chlorure de calcium dihydré	Merck Millipore	102382	dissous dans de l’eau stérile, le bouillon mesure 1 M
Carbénicilline sel disode	Applichem	A1491	dissous dans de l’eau stérile, le stock est de 100 mg/mL
Coomassie-R (bleu éclatant)	Sigma-Aldrich	B-0149
D-biotine	Sigma-Aldrich	B4501	dissous dans des naH2< stériles de 500 mM / sub>PO4 ou DMSO
Colonnes jetables PD10 de désalage	GE Healthcare	GE17-0851-01
DMEM GlutaMAX-I	Thermo Fisher Scientific	61965026
DMEM, glycémie élevée, pas de glutamine, pas de phénol rouge	Thermo Fisher Scientific	31053028
DNase I	Applichem	A3778	dissous dans de l’eau stérile
Dulbecco » s solution séline tamponnée phosphate (DPBS) sans Ca2+/Mg2+	Sigma-Aldrich	D8537
Sérum fœtal bovin (FBS)	Thermo Fisher Scientific	A5256701
Filtropur S, PES, Porengrö ; ß ; e : 0,45 & micro ; m	Sarstedt	83.1826
Réactif de transfection FuGENE HD	Proméga  ;	E2311
Goulottes en verre (n° 1.5H)	VWR	631-0153
HRP anti-souris de chèvre	Sigma-Aldrich	A-0168
HRP anti-lapins de chèvre	Sigma-Aldrich	A-0545
Son kit tampon	Cytvia	11003400
Ses chroniques GraviTrap	Cytvia	11003399
ibidi µ ;-Slide 4 well, ibiTreat	80426-IBI	ibidi
Isopropyl-&bêta ;-D-thiogalactopyranosïde (IPTG)	Applichem	A1008	dissous dans de l’eau stérile, le bouillon mesure 1 M
Sulfate de kanamycine	Applichem	A1493	dissous dans de l’eau stérile, le stock est de 100 mg/mL
L-glutamine	Applichem	A3704
Lysozyme  ;	Sigma-Aldrich	18037059001	Le produit est distribué par Sigma-Aldrich, mais fabriqué par Roche
Chlorure de magnésium hexahydraté	Merck Millipore	105833	dissous dans de l’eau stérile, le bouillon mesure 1 M
Mini-protéan TGX gels, 4-20 %, 15 puits	Bio-Rad	4561096
HeLa Kyoto modifié	Du laboratoire
NEB5-alpha Competent  ;E. coli	ONÉ	C2987U
NucleoBond Xtra Midi Plus, 10 préparations	Macherey-Nagel & nbsp ;	740412.1
Pénicilline/Streptomycine	Bioconcept & nbsp ;	4-01F00-H
Fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF)	Applichem	A0999.0025	dissous dans 40 % de DMSO, 60 % d’isopropanol, stock dans 500 mM
Lignée cellulaire Phoenix ampho	Laboratoire Nolan
Polybrene (bromure d’hexadiméthrine)	Sigma-Aldrich	H9268
Puromycine	Invivogen	ANT-PR-1
Chlorure de sodium & nbsp ;	Merck Millipore	106404	dissous dans de l’eau stérile, le stock fait 5 M
Pyruvate de sodium   ;	Thermo Fisher Scientific	11360039
Trans-Blot Turbo Pack, mini	Bio-Rad	1704158
Tryptone	Applichem	A1553
Extrait de levure & nbsp ;	Applichem	A1552