Ce protocole établit une définition objective de la suffisance du greffon basée sur la production urinaire quotidienne et les valeurs du panel de fonction rénale sérique afin de caractériser de manière reproductible et objective si le greffon est capable de soutenir l’homéostasie de manière indépendante sans recours à la dialyse dans les 7 premiers jours suivant la greffe.
Article de méthode
Un protocole standardisé d’auto-greffe rénale porcine pour étudier la fonction retardée des greffes
Dans cet article
Résumé
Résumé
La fonction retardée du greffon (DGF) est couramment définie comme la nécessité d’une dialyse dans les 7 jours suivant la greffe rénale ; Cependant, les définitions actuelles reposent souvent sur un jugement clinique subjectif et manquent de critères standardisés décrivant avec précision la suffisance des greffons. Cette incohérence entrave le diagnostic et la comparaison de recherches. Ce protocole fixe des seuils objectifs pour la DGF en utilisant des débits urinaires quantifiables et des valeurs de fonction rénale sérique afin de décrire objectivement la suffisance du greffon et la capacité indépendante à maintenir l’homéostasie. La recherche sur les modèles porcins est difficile en raison de l’absence de critères diagnostiques consensuels pour la DGF et de la difficulté à effectuer la dialyse sur de longues durées. Pour y remédier, nous introduisons un protocole clairement défini pour définir et induire la DGF dans l’auto-transplantation rénale porcine après 30 minutes d’ischémie chaude rénale isolée, simulant un procurement de type mort circulatoire (DCD). Nous décrivons la cathétérisation de Foley non invasive, l’accès veineux central et les méthodes de surveillance des lignes artérielles chez les porcines, permettant une mesure précise des sorties urinaires, des analyses quotidiennes et une surveillance intraopératoire. Ces techniques sont détaillées pour garantir la transparence et la reproductibilité, créant un critère standardisé pour les études sur le DGF chez le porc qui reprend le phénotype clinique.
Introduction
La liste d’attente pour une greffe de rein aux États-Unis dépasse 90 000 patients. En raison d’une pénurie de greffes, moins de 30 000 greffes de rein sont réalisées chaque année, tandis qu’une cohorte similaire de nouveaux patients s’ajoute à la listed’attente 1. Pour pallier cette pénurie croissante, des reins de DCD sous-optimaux causés par l’ischémie sont de plus en plus choisis. En fait, depuis 2023, 50 % des reins transplantés aux États-Unis proviennent de donneurs atteints de DCD. Les reins atteints de DCD sont associés à des taux élevés de retard de fonction greffière (DGF). La DGF est définie par la plupart comme une nécessité de dialyse dans les 7 jours suivant la greffe rénale. Bien que le DGF soit une insuffisance temporaire de greffe, il est associé à une augmentation des taux de rejet précoce et tardif des greffons, ainsi qu’à une survie médiane plus courte de 8 à 12 ans2. Étant principalement une définition clinique subjective, la DGF est difficile à étudier dans des modèles porcins en raison de l’absence d’une définition objective et standardisée et des défis liés à la dialyse à long terme chez les porcs. Dans ce travail, nous avons développé un protocole objectif et standardisé pour définir la suffisance greffière et induire le DGF dans l’auto-transplantation rénale porcine. En raison des similitudes prouvées par la xénotransplantation dans la fonction des reins porcins et humains, ce protocole est transférable à la transplantation de rein humain. L’auto-transplantation rénale porcine a été choisie pour ce modèle principalement en isolant l’effet de la lésion ischémie-reperfusion comme variable qui contrôle l’insuffisance précoce du greffon et neutralise la toxicité allo-immune ou immunosuppressive en tant que facteurs de confusion.
Définition de la fonction retardée du greffon : Pour surmonter les deux principaux défis : 1) définir objectivement la suffisance des greffons et 2) définir la nature temporaire du phénotype en l’absence de soutien dialysique comme pont vers la récupération fonctionnelle des greffons, nous avons utilisé les valeurs objectives de la production urinaire et des panneaux de fonction rénale pour définir la maladie. La standardisation de la réanimation volumique, des critères d’auto-transplantation ainsi que l’absence de compromission anastomotique (artère, veine ou uretère) excluent une cause anatomique permanente de l’insuffisance du greffon. Nous avons défini le retard de fonction des greffons chez l’auto-transplantation porcine comme : insuffisance temporaire précoce due à une anurie prolongée (<100 mL/jour) dépassant 3 jours, entraînant des niveaux variables de BUN, créatinine et accumulation de potassium jusqu’à atteindre un critère humain de K ≥ 8 mEq/L (risque élevé d’arythmie cardiaque et indication objective pour une dialyse urgente/urgente) en l’absence de compromission anastomotique. Sur la base de cette définition, un greffon fonctionnel produit suffisamment d’urine pour maintenir l’équilibre électrolytique et une baisse de la BUN et de la créatinine. Inversement, une greffe insuffisante ne produit pas assez d’urine pour excréter BUN et créatinine et provoque une hyperkaliémie potentiellement mortelle nécessitant la dialyse (ou une euthanasie humaine en son absence), en raison d’une lésion réversible par ischémie parenchymateuse et réponse, et non d’une atteinte ou d’un rejet anastomotique irréversible.
Protocole
Cette étude a été approuvée par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Duke (IACUC). Des porcs Yorkshire uniquement féminins (pour insertion non invasive de cathéter de Foley) pesant 40 à 50 kg (pour des diamètres ostiaux vasculaires rénaux et urétraux pratiques pour la canulation) sont utilisés dans ce modèle. Ce protocole pouvait être réalisé par une équipe de quatre personnes : un chirurgien, un assistant, un perfusionniste d’organes et un responsable d’étude (pour les échantillons, fournitures et données).
1. Jour postopératoire (POD) -1 (Prélèvement rénal)
- Anesthésie
- Prémédiquez les animaux par des injections intramusculaires (IM) de kétamine (22 mg/kg) et de midazolam (0,5 mg/kg).
REMARQUE : Commencer avec une dose relativement plus élevée de kétamine aide à réduire en toute sécurité le besoin d’isoflurane en cas d’opération. - Administrez l’isoflurane initialement par cône museau à 1-1,5 % (max 2,5 %) jusqu’à ce que la mâchoire et les voies respiratoires supérieures soient détendues pour permettre l’intubation. Réglez le volume de marée à 7-7,5 mL/kg et la vitesse de ventilation à 18-20 respirations par minute pour maintenir les niveaux physiologiques de saturation en oxygène et dePCO 2. Appliquez doucement une pommade pour les yeux et/ou fermez les paupières avec du ruban adhésif pour protéger les yeux contre les griffures ou le séchage.
- Prémédiquez les animaux par des injections intramusculaires (IM) de kétamine (22 mg/kg) et de midazolam (0,5 mg/kg).
- Emplacement de la ligne centrale en tunnel
- Placez une ligne centrale Hickman tunnelée à 9,6 Fr à un seul lumen sortant de la peau depuis l’arrière du porc entre les omoplates afin de permettre un prélèvement sanguin indolore à la demande, tout en leur permettant de s’allonger sur le côté avec un minimum de détresse et avec un faible risque de perturbation du cathéter de la ligne centrale (Figure 1).
- Après avoir préparé la peau, à l’aide d’un scalpel à 11 lames, effectuez trois incisions superficielles par coup de couteau à travers le derme jusqu’à la couche graisseuse sous-cutanée, entre les omoplats, à la nuque et à l’avant droit du cou.
- Utilisez le tunnel tissulaire pour créer un tunnel sous-cutané qui relie les trois incisions. En position couchée, passez le cathéter entre les omoplates jusqu’à la partie droite du cou.
- Pour insérer le cathéter de la ligne centrale dans la veine jugulaire externe droite (EJ), tournez le cochon en position de Trendelenburg allongée et utilisez une aiguille de 18 G pour aspirer l’EJ en utilisant la technique de triangulation anatomique de Flourney etMani 3. Enfilez un fil dans la lumière en utilisant la technique4 de Seldinger, utilisez l’introducteur décollant pour dilater le tractus, enfilez le cathéter Hickman dans la lumière de l’EJ, et fixez la ligne centrale à l’arrière. Après confirmation du retour sanguin, bloquez la ligne par héparine et répétez après chaqueutilisation 5. Si l’accès à la JE droite s’avère difficile, utilisez le tunneler tissulaire pour prolonger le tunnel sous-cutané à l’avant de la trachée et livrer le cathéter du côté gauche du cou pour l’insertion dans la EJ gauche.
- Placez une ligne centrale Hickman tunnelée à 9,6 Fr à un seul lumen sortant de la peau depuis l’arrière du porc entre les omoplates afin de permettre un prélèvement sanguin indolore à la demande, tout en leur permettant de s’allonger sur le côté avec un minimum de détresse et avec un faible risque de perturbation du cathéter de la ligne centrale (Figure 1).
- Placement de Foley (trois méthodes d’augmentation de l’envahissement en cas d’échec d’insertion)
- Approche manuelle
- Placez l’animal allongé sur la table d’opération. Préparez la peau autour de la voûte vaginale avec de la bétadine et inondez la voûte vaginale avec 10 mL de bétadine (pour diminuer la charge microbienne et le risque d’infection urinaire).
REMARQUE : Même complètement gonflés, les ballons de 5 mL ont tendance à glisser. - Insérez manuellement un cathéter de Foley lubrifié 12-14 Fr, rigidifié avec un fil, en cherchant l’ouverture urétrale à 4-5 cm de profondeur dans l’ouverture vaginale sur la paroi vaginale antérieure (ventrale).
- Placez l’animal allongé sur la table d’opération. Préparez la peau autour de la voûte vaginale avec de la bétadine et inondez la voûte vaginale avec 10 mL de bétadine (pour diminuer la charge microbienne et le risque d’infection urinaire).
- Approche par spéculum : Si la méthode manuelle échoue, utilisez un spéculum lubrifié pour visualiser l’ouverture urétrale à l’intérieur du vagin. Utilisez les longues pinces DeBakey avec une gaze stérile pour tamponner doucement la Betadine et insérez le cathéter Foley ballonnet 12-14 Fr, 10 mL, avec ou sans fil de rigidisation, sous visualisation directe. Gonflez le ballon seulement après avoir vérifié le retour d’urine.
- Approche chirurgicale : Si l’approche par spéculum (étape 1.3.2) échoue également, insérez chirurgicalement le cathéter de Foley sur un fil. Après laparotomie, insérez une aiguille de 18 g dans la vessie, insérez un fil de 0,035" d’environ 1 m de long dans l’urètre par la vessie, et passez le cathéter de Foley par-dessus jusqu’à la vessie et gonflez le ballonnet. Retirez le fil à travers le vagin (pour éviter une contamination abdominale) et refermez le petit trou de l’aiguille dans la vessie avec une fermeture en 8 Prolene 6-0 en une seule couche. Suture le corps du Foley et un sac de collecte d’urine de 1 L à la peau du porc (Figure 1).
- Approche manuelle
- Médicaments de préincision
- Administrez la première dose quotidienne d’antiplaquettaires d’aspirine 81 mg par voie orale dans la poche de joues, suivie d’un antibiotique intra-injecteur ceftiofur depot, 1 g de céfazoline IV via voie centrale pour la prévention des SSI, de buprénorphine intranéogénique (0,005-0,01 mg/kg) pour le contrôle de la douleur, et commencez un total de 1 L de solution électrolytique équilibrée à un débit constant de 250 mL/h.
2. Auto-transplantation rénale de DCD porcin qui soutient la vie
- Prélèvement rénal
- Préparez et drapez la peau de l’abdomen. Réalisez une laparotomie médiane du xyphoïde au pubis.
REMARQUE : Il y a 1 à 2 grosses veines qui traversent la ligne médiane de façon sous-cutanée près du pubis et qui saignent abondamment si elles sont coupées mais sont facilement contrôlées par électro-cautéré. - Installez un écarteur Bookwalter (ou deux rétracteurs Balfour à 90°) avec quatre lames de la paroi corporelle maintenant chaque côté de la paroi abdominale vers le haut afin d’éviter les déversements intestinaux grêles hors de l’abdomen avec la compression veineuse et lymphatique ultérieure, ainsi que le gonflement de l’intestin.
- Utiliser deux serviettes chirurgicales chaudes humidifiées au sérum physiologique pour rétracter l’intestin vers le côté gauche de l’abdomen et remplacer les écarteurs au-dessus afin d’exposer doucement le rétropéritoine droit contenant le rein droit.
REMARQUE : Un certain degré de position Trendelenburg (tête baissée) peut également aider à la rétraction intestinale. - Ouvrez le péritoine postérieur sur le côté latéral du rein (pour éviter de blesser l’uretère droit avant de le visualiser). Disséquez l’uretère droit du péritoine postérieur et de l’artère rénale droite, puis divisez-le entre deux liens de soie 2-0 au pôle inférieur du rein droit. Laissez une queue de suture plus longue sur l’uretère restant pour faciliter l’identification pendant l’implantation (24 heures plus tard). Laisser le reste de l’uretère recouvert de sa paroi péritonéale pour réduire les cicatrices et la nécessité d’une dissection extensive lors de la seconde opération d’implant.
REMARQUE : Faites bien attention à ne pas blesser les deux veines lombaires qui rejoignent la VCI immédiatement sous le décollage de l’artère rénale droite de l’aorte (anatomie spécifique au porc différente de l’anatomie rétropéritonéale humaine). Attacher et diviser ces veines lombaires est aussi une option sûre. - Disséquer l’artère rénale en la détachant de la veine rénale et le long de son parcours sous la VCI jusqu’à son origine aortique afin d’obtenir la longueur artérielle maximale disponible. Compressez brièvement la VVI et roulez-la vers le rétropéritoine gauche pour exposer l’origine de l’artère rénale droite qui circule en dessous après son décollage de l’aorte abdominale.
REMARQUE : Chez les porcs, il y a généralement 1 à 2 ganglions lymphatiques associés à l’artère rénale qui l’obscurcissent ; cependant, l’artère rénale devient bien squelettisée après la dissection et l’ablation de ces ganglions. - Disséquez la veine rénale droite en l’éloignant de la glande surrénale droite de manière crânienne. Pour obtenir quelques millimètres de dégagement entre la veine rénale droite et la glande surrénalienne, soulevez soigneusement la muqueuse péritonéale postérieure de la veine rénale droite jusqu’à ce que les plus grandes veines drainantes surrénales soient visibles entrant dans la VCI.
- Pour simuler le processus d’obtention du DCD, administrez 500 U/kg d’héparine via la ligne centrale et laissez-la circuler pendant 5 minutes, puis doublez l’artère rénale suivie de la veine rénale à leur origine (pour la longueur maximale) en utilisant des liens de soie 2-0 ou plus (les liens de soie 3-0 sont trop fins et cassants pour ce tissu complétant et glissent fréquemment) et commencez un chronomètre pendant 30 minutes d’in-situ Temps ischémique chaud rénal isolé. Pendant la période ischémique chaude, utilisez des ciseaux de ténotomie ou un électrocautérage en mode coupe pour squelettiser et séparer l’artère rénale et la veine l’une de l’autre afin de faciliter l’implantation ultérieure.
REMARQUE : Le squelettisage des vaisseaux in situ pendant la période ischémique chaude permet de contrôler les vaisseaux pour prévenir la perte de sang en cas de blessure vasculaire, tout en permettant aux vaisseaux remplis de sang de révéler de petites fuites vasculaires pouvant être réparées par des saignements provenant de la circulation rénale isolée liée pour simuler une lésion ischémique. - À la fin du temps ischémique chaud, divisez les vaisseaux et l’uretère et canulez l’artère rénale avec une canule droite de 3 mm et administrez 250 mL de solution Belzer glacée de l’Université du Wisconsin via l’artère rénale.
REMARQUE : Une canule droite de 5 mm est trop grande et pourrait entraîner des dommages intimes et la formation de volets. - Conservez le greffon par perfusion de machine non oxygénée par hypothermie pendant 24 heures. Irriguez l’abdomen avec 1 L de solution électrolytique équilibrée et fermez le fascia avec des sutures continues en boucle Prolene 1-0. Irriguez la plaie et fermez la peau avec des agrafes.
- Extubez le cochon, retournez dans son terrarium et récupérez de l’anesthésie pendant 24 heures. Pour contrôler la douleur, injectez la bupivacaïne (dosage basé sur le poids) par voie sous-cutanée sur les bords de la plaie et administrez de la buprénorphine à libération prolongée intrathésaire (dosage basé sur le poids).
REMARQUE : L’acétaminophène pouvait également être administré sans effet sur le GFR (contrairement aux AINS).
- Préparez et drapez la peau de l’abdomen. Réalisez une laparotomie médiane du xyphoïde au pubis.
- Implantation rénale
REMARQUE : L’implantation rénale se fait intrapéritonéalement après l’approche Starzl modifiée d’implant rénal directement sur l’aorte abdominale et une CVI avec anastomose uretère-ureter6. Le rein droit est explanté et réimplanté en position inférieure, inversé dans le rétropéritoine droit, selon la technique Simforoosh7. Le temps de la chirurgie de l’implant varie entre 3 et 5 heures, et le temps de couture de l’implant entre 20 et 40 minutes, selon le niveau de formation ou d’expertise et la complexité de l’anatomie.- Après 24 heures de récupération, prémédicamentez, intuberez, préparez et drapez à nouveau l’abdomen du porc en salle d’opération (Figure 2).
- Placement de la ligne artérielle (trois méthodes en cas d’échec d’insertion)
- Ligne artérielle auriculaire : Pour surveiller l’hémodynamique en peropération et guider la réanimation par fluide et presseur, surtout après la reperfusion, afin de soutenir l’animal à travers le syndrome de reperfusion sans provoquer une lésion rénale aiguë secondaire à faible débit (AK), placer une ligne artérielle angiocath de 22 G dans l’artère auriculaire par palpation du pouls de l’artère auriculaire sur la face postérieure de chaque oreille du porc.
- Ligne artérielle carotide : Si l’insertion auriculaire échoue, il faut également créer une incision médiane dans le cou jusqu’à la trachée. Disséquez le tissu conjonctif adjacent à la trachée et rétractez-le à l’aide d’un rétracteur Weitlaner ou d’un rétracteur auto-rétentrice Gelpi. Une fois visualisé, entourez l’artère carotide avec un cravate en soie 2-0. Placez une carotide cordiculaire percutanée 4 Fr selon la technique de Seldinger sans avoir besoin de dilatation artérielle. Attachez l’extrémité distale de la carotide et laissez un lien en soie 2-0 pour attacher l’extrémité proximale à la fin de l’opération une fois la ligne artérielle retirée, suivi d’une fermeture agrafée de la peau.
- Ligne artérielle fémorale. Sinon, une lignée fémorale peut être posée par voie percutanée ou par coupe.
REMARQUE : Une lignée fémorale sera temporairement rendue non fonctionnelle lors du pincement de l’aorte pour l’anastomose artérielle lors de l’implantation.
- Placement de la ligne artérielle (trois méthodes en cas d’échec d’insertion)
- Médicaments de préincision
- Administrez la deuxième dose quotidienne d’antiplaquettaires, aspirine 81 mg par voie orale dans la poche des joues, suivie d'1 g de céfazoline IV via une ligne centrale pour la prévention des SSI, de buprénorphine intra (0,005-0,01 mg/kg) pour le contrôle de la douleur, et commencez un total de 4 L de solution électrolytique équilibrée à un débit constant de 250 mL/h.
- Commencez une infusion constante de dopamine non titrable par la ligne centrale à 2 μg∙kg-1∙min-1 et une infusion de noradrénaline titrable jusqu’à un maximum de 0,4 μg∙kg-1∙min-1 pour une MAP cible de 80-100 mmHg.
REMARQUE : Le taux d’administration de liquide peut être temporairement augmenté à 1 L/h ou plus via un sac pressurisé juste avant la reperfusion afin d’offrir un meilleur soutien hémodynamique si l’hypotension lors du syndrome de reperfusion est particulièrement difficile.
- Rouvrez l’abdomen en retirant les agrafes cutanées et en coupant les sutures fasciales, puis réintroduisez le rétracteur Bookwalter.
- Disséquez le revêtement péritonéal descendant du côlon sur la ligne médiane recouvrant l’aorte et la VCI (chez les porcs, le côlon descendant est relié via un revêtement péritonéal plus court à la ligne médiane recouvrant l’aorte et la VCI depuis les vaisseaux rénaux gauches jusqu’à l’artère mésentérique inférieure pour révéler l’aorte et la VCI dans le rétropéritoine (site d’insertion de greffe rénale)8).
REMARQUE : Prenez soin de ne diviser que l’attache péritonéale du côlon immédiatement au-dessus des grands vaisseaux et ne pas dévasculiser le côlon descendant en divisant les artères mésentériques supérieures et inférieures arquées qui courent plus près de la paroi du côlon.
Aucune hernie interne n’a été observée lors de cette manœuvre, comme en témoignent les nécropsies, qui ont révélé que cet espace s’était déjà cicatrisé et fermé spontanément au septième jour post-opératoire. - Disséquez l’aorte et la cavité intraveineuse de leur attache péritonéale latérale aux muscles psoas de façon bilatérale. Ensuite, disséquez l’aorte et la cavité intraveineuse l’une de l’autre jusqu’à ce que les artères et veines lombaires soient visualisées. Optionnel : permettre une élévation maximale et une exposition de la lumière de l’aorte dans la pince Satinsky lors de la couture, disséquer, attacher et diviser les 1 à 2 artères vertébrales et veines généralement présentes dans ce segment des grands vaisseaux (des vaisseaux rénaux gauches à l’artère mésentérique inférieure) de ce segment de l’aorte lombaire entre 2 à 0 liens de soie. Squelettisez la section lombaire de l’aorte à partir de son lourd revêtement adventitial pour la préparer à l’implantation.
REMARQUE : Aucune complication vertébrale n’a été observée avec cette manœuvre. - Administrez 100 U/kg d’héparine de façon systémique via la ligne centrale et laissez-la circuler pendant 5 minutes. Simultanément, demandez à l’équipe d’anesthésie d’augmenter temporairement la fréquence d’infusion équilibrée en solution électrolytique de 250 mL/h à 1 L/h et de commencer à titrer la noradrénaline si nécessaire jusqu’à un maximum de 0,4 μg∙kg-1∙min-1 pour obtenir une MAP de 80-100 mmHg en préparation du syndrome de reperfusion.
- Clampez la VCI avec une pince Satinsky à morsure latérale inclinée en caudal (pour ne pas interférer avec les mains du chirurgien de couture positionnées sur le côté gauche du porc) et créez une venotomie et aspirez/rinçez l’intérieur de la VCI.
- Retirez le rein de la glace ou de la perfusion machine et rincez-le avec 250 mL de solution électrolytique bien froide et équilibrée, puis amenez-le au champ opératoire, marquant le début du second temps ischémique chaud (couture).
- Retournez l’autogreffe du rein droit à l’envers (technique Simforoosh) de sorte que l’uretère soit orienté vers le haut, l’artère médiale, la veine latérale, et placée du côté droit de l’abdomen face à l’aorteinfra-rénale 7,9.
- Anastomose veineuse : Utilisez deux points de suture 6-0 Prolene à double bras pour effectuer une anastomose veineuse courante. Placez une pince bouledogue sur la veine rénale et retirez la pince Satinsky. Quel que soit le moment de la couture de la veine, gardez la pince Satinsky sur la VCI pendant 25 minutes standardisées afin de permettre une lésion ischémique standardisée de la greffe.
- Anastomose artérielle : Après la pince IVC de 25 minutes et la fixation de 5 minutes entre les vaisseaux, utilisez à nouveau la pince Satinsky pour pincer complètement l’aorte. Faites une incision en fente et élargissez-la avec un poinçon rond de 4,0 mm pour sécuriser une ouverture propre. Utilisez une suture Prolene 6-0 à double bras pour effectuer un parachutisme ou une anastomose artérielle de la guérison jusqu’aux orteils. De même, quelle que soit la rapidité de l’anastomose artérielle, maintenez la pince Satinksy pendant 25 minutes sur l’aorte pour standardiser un temps total de couture de 55 minutes.
REMARQUE : Le temps total ischémique chaud (30 minutes simulant le don et 55 minutes simulant la manipulation de l’implant) a conduit à l’induction du DGF. - Réperfusion de greffons : Après les 55 minutes standardisées de couture à chaud ischémique, retirez d’abord la pince bouledogue de la veine rénale, suivie de la pince Satinksy sur l’aorte, et vérifiez la repérotion du greffon et l’hémostasie. Maintenir une réanimation agressive de liquides et de noradrénaline pour atteindre une MAP de 80-100 mmHg pendant environ 1 heure après la réperfusion afin de soutenir l’animal à travers le syndrome de reperfusion.
REMARQUE : N’oubliez pas de contrôler les sites de biopsie à l’aiguille de 18 G — si réalisés — avec une pression et une électrocautération de surface coagulative élevée. - Anastomose de l’ureter : Squelettiser les uretères restants et les uretères greffiers en détachant 1 cm du tissu adipeux environnant. Spatulate de 1 cm de l’uretère de greffe et de l’uretère droit résiduelle. Utilisez deux sutures 6-0 Prolene (PDS à double bras pour planifier une survie à long terme afin de diminuer le risque de formation de calculs) pour les approcher. Passer un stent urétéral double-J de 7F x 24 cm sur l’anastomose fraîche et compléter l’anastomose par des sutures courantes.
- Néphrectomie controlatérale
- Pour permettre au rein transplanté d’être le rein vital, retirez le rein controlatéral (gauche).
- Fermeture abdominale
- Après vérification de l’hémostasie et des comptages, irriguez l’abdomen avec 1 L de solution électrolytique équilibrée et fermez le fascia avec du Prolène en boucle 1-0, suivi d’une irrigation cutanée et d’une fermeture à l’agrafeuse. Injectez 0,25 % de bupivacaïne dans la ligne de suture pour fournir une anesthésie locale et injectez une SQ à libération prolongée suffisante pour le contrôle de la douleur. Extubez le cochon et ramenez-le dans leur enclos séparé à l’aide de barrières en verre ou en plastique pour éviter qu’ils ne mordent les lignes centrales et les cathéters de Foley de l’autre.
- Après 24 heures de récupération, prémédicamentez, intuberez, préparez et drapez à nouveau l’abdomen du porc en salle d’opération (Figure 2).
- Soins postopératoires quotidiens
- Vérifiez les cochons lors des visites de QID principalement pour s’assurer que la poche de collecte d’urine ne se remplit pas trop, provoquant une obstruction postrénale iatrogène ainsi que des ruptures de vessie ou d’uretère.
- Le matin, administrez 81 mg d’aspirine antiplaquettaire oral, prélevez un échantillon sanguin de la ligne centrale et l’utilisez par hépatite, puis mesurez la production urinaire dans la poche et prélevez-la.
REMARQUE : Aucun autre traitement intraveineux ou médicament n’est indiqué, car les porcs retrouvent généralement leur appétit et leur fonction intestinale grâce à POD1.
- Sacrifice
- À la fin de l’étude sur POD7, ou plus tôt pour un point final humain, placez à nouveau le porc sous anesthésie endotrachéale générale et examinez le greffon par échographie pour vérifier l’intégrité anastomotique, puis rouvrez l’abdomen comme décrit précédemment.
- Examinez la greffe pour détecter des signes de perfusion et examinez la pétardité des trois anastomoses. Retirez la greffe avec les trois anastomoses intactes et spatulez-les sur toute leur longueur pour vérifier leur intégrité interne et leur perpétuité.
- Biopsie du parenchyme du rein avec un pistolet de biopsie de 18 G.
Résultats
Fonction immédiate versus retard de la greffe. Nous avons réalisé n = 5 autogreffes rénales porcines à 30 minutes DCD après 24 heures de préservation par machine hypothermique non oxygénée en utilisant (MAP = 40 mmHg) et suivi le phénotype de récupération et la fonction de la greffe durant la première semaine après la transplantation, en utilisant des échantillons sanguins quotidiens et une production totale d’urine. Nous avons observé deux phénotypes de récupération post-greffe. Le premier phénotype était une récupération/suffisance immédiate/précoce du greffon. Trois porcs sur cinq implantés avec les greffes simulées de DCD (60 %) ont retrouvé un retour de la production urinaire (production quotidienne > 500 mL/jour) au POD 2-3, permettant une homéostasie électrolytique continue sans intervention (dialyse, chélation du potassium ou déplacement intracellulaire médié par l’insuline) (Figure 3). Le deuxième phénotype était la fonction retardée du greffon (DGF), caractérisée par une anurie prolongée au-delà du POD 3, associée à l’accumulation de BUN sérique, de créatinine, et au développement d’hyponatrémie et d’hyperkaliémie, ce qui constituerait une indication clinique objective pour la dialyse. L’anurie et l’hyperkaliémie ont progressé pour provoquer des changements d’ECG (ondes T de pic) autour de K ≥ 8 mEq/L. Cela représentait une indication urgente pour la dialyse et a donc été traité comme un point final humain. Une fois ce critère atteint, une euthanasie sous anesthésie générale a été réalisée afin d’écarter d’autres causes d’insuffisance/échec du greffon due à une compromission anastomotique ou d’autres complications chirurgicales. En utilisant cette définition de la DGF, les reins du DCD porcin présentent 30 minutes d’ischémie tiède in situ , suivies de 24 heures de conservation de la machine hypothermique non oxygénée et de 55 minutes de temps de couture ischémique chaude ont développé une DGF à un taux de 40 % (deux porcs sur cinq). Ce taux de DGF reproduit le taux rapporté lors de la transplantation rénale deDCD chez l’humain 1.
Figure 1 : Pose de la ligne centrale en tunnel et du cathéter de Foley. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Auto-transplantation rénale du DCD porcin qui soutient la vie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Fonction du greffon retardée dans le modèle porcin. La différence de (A) production urinaire entre greffes à fonction immédiate et à fonction retardée ; (B) les niveaux de potassium entre greffon de fonction immédiate et retardée ; (C) niveaux quotidiens de créatinine sérique entre greffes immédiates et à fonction retardée. Toutes les figures sont représentées par Moyenne + SEM avec des valeurs rapportées comme LOCF et analysées par analyse à modèles mixtes. Abréviation : LOCF = dernière observation retenue. N=5 cochons par bras. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
Discussion
Un retard de fonction des greffes a un impact négatif sur le parcours clinique après une transplantation rénale. Dans le contexte post-transplantation précoce, elle est associée à une hospitalisation prolongée, à un taux plus élevé de procédures invasives et à un risque accru de rejet. À plus long terme, la DGF est également associée à une survie plus courte des greffons. La DGF est une manifestation d’une lésion ischémie-reperfusion sévère (I/RI), comme en témoigne sa prévalence plus élevée dans les greffes de DCD comparée aux DBD ou aux transplantations de rein sur donneur vivant. L’insuffisance rénale aiguë (AK) est secondaire à une nécrose tubulaire aiguë causée par une IRI et est considérée comme la raison la plus fréquente pour laquelle une allogreffe ne fonctionne pas immédiatement. Cliniquement, la DGF se définit par la nécessité de la dialyse dans la première semaine de la greffe. Dans les grands modèles animaux, la DGF a été difficile à définir et à étudier en raison de l’absence de définition standardisée de la suffisance des greffons et de l’impossibilité de réaliser la dialyse pour déterminer la nature temporaire de la maladie, la dialyse servant de pont vers la récupération fonctionnelle des greffes.
Dans ce protocole, un modèle porcin a été choisi car il est largement admis comme étant étroitement parallèle à la physiologie rénale humaine (comme l’a prouvé une xénotransplantation réussie récemment)10,11. L’auto-transplantation a été choisie pour éliminer la réponse allo-immune, le rejet, ainsi que la nécessité et les effets toxiques confondants des inhibiteurs de la calcineurine. La définition du DGF repose sur une anurie prolongée (<100 mL d’urine par jour) au-delà de POD3, entraînant de graves modifications de l’ECG associées à l’hyperkaliémie. La cathétérisation de Foley permet une collecte d’urine précise, ce qui ancre la définition du retard de la fonction et de la suffisance du greffon dans le résultat fonctionnel de la qualité et de la quantité urinaires. La prélèvement sanguin quotidien permet la surveillance quotidienne des paramètres traditionnels du bilan de la fonction rénale, fournissant une image complète de l’homéostasie électrolytique.
Nous pensons que l’établissement d’un modèle animal fiable et reproductible de la fonction retardée des greffes accélérerait l’étude des thérapies efficaces pour la fonction retardée des greffes et aboutirait finalement à une amélioration des résultats de la greffe. En résumé, ce protocole établit un modèle reproductible d’auto-transplantation rénale porcine qui permet une caractérisation objective de la fonction retardée du greffon en utilisant une production urinaire quantifiable et des paramètres biochimiques sériques après une lésion ischémique chaude contrôlée. En incorporant des conditions chirurgicales standardisées, une collecte d’urine non invasive et un suivi en série en laboratoire, cette approche offre un cadre pratique pour étudier la DGF en l’absence de dialyse et facilite la comparaison avec les phénotypes cliniquement pertinents des dysfonctions post-greffe 12,13,14,15.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Remerciements
Nous remercions le laboratoire de perfusion d’organes de Toronto (Top lab) pour avoir partagé son expertise lors de la formation sur la transplantation rénale porcine. Nous remercions également Michelle Mendiola Pla pour avoir partagé son expertise sur l’insertion de Foley porcine non invasive.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| insertion de Foley sur le dosi | |||
| 12 Père Foley | Collecte d’urine | ||
| Lubrifiant chirurgical | Insertion de foley | ||
| 1 L de poche d’urine | Collecte d’urine | ||
| Suture en nylon 2-0 | Sécurisation de la ligne de foley et de la ligne centrale | ||
| Spéculum & long débaquage & Lumière | Insertion de foley | ||
| Tubes d’échantillonnage d’urine (50 ml coniques) | Prélèvement d’urine | ||
| Cartouches CG8 + Chem 8 + Piccolo | Laboratoires quotidiens | ||
| insertion de la ligne centrale sujette au couché couché | |||
| 9,6 Fr Gouttière Hickman à un seul lumen | Laboratoires quotidiens | ||
| Lame 10 | Incisions par couteau pour insertion CVC | ||
| Capsule à verrouillage sans luer sur ligne centrale | |||
| Sac de solution physiologique (1L de solution saline + 10 fioles d’héparine) | Heplock CVC | ||
| S’explanter | |||
| Pack de laparotomie | |||
| Bovie | |||
| Poignées de lumière stériles | |||
| Pack d’éponge | |||
| Serviettes OR - blanches 17X23 pouces (4 par paquet) | |||
| 2-0 Cravates en soie | Contrôle vasculaire | ||
| 1 L Plasmalyte | Solution électrolytique équilibrée | ||
| Plateau pour instruments de laparotomie générale stérile | |||
| Solution physiologique tiède normale pour serviettes intestinaux humides | Manipulation intestinale | ||
| Boîte de gestion des aiguilles | |||
| Rétracteur Bookwalter | |||
| Backtable | |||
| Sacs pour organes stériles - 2 par rein | |||
| 1 L de sac cristalloïde pour la gadoue | |||
| Solution UW - 250 ml par rein | |||
| Tuyau à évacuation | |||
| Angiocath calibre 14 | |||
| Drape machine | |||
| Poids d’orgue (balance + bol + sac d’orgue stérile) | |||
| Perfusion mécanique | |||
| Machine à perfusion | Transporteur rénal Lifeport | ||
| Chambre d’orgue jetable | Transporteur rénal Lifeport | ||
| Solution de perfusion | Solution KPS-1 | ||
| < fort>Implant | |||
| Tube d’aspiration | |||
| Embout d’aspiration Yankauer | |||
| Succion | |||
| Rouleaux en caoutchouc | |||
| Perforateur aortique de 4 mm | Anastomose artérielle | ||
| Instruments de microchirurgie + pince | |||
| Fil guide de l’uretère | |||
| Stent d’uretère - 4,8 fr x 12 mm | Anastomose de l’uretère | ||
| Fermeture abdominale | |||
| 1 prolène bouclé | |||
| Bupivacaïne | |||
| Agrafeuses pour peau | |||
| Échantillons | |||
| Plateau d’échantillons | |||
| Pistolet à biopsie 14 G | |||
| Pots de biopsie NBF | |||
| Tubes d’Eppendorf | |||
| Tubes de sang verts à la surface | |||
| Coniques de 15 mL | |||
| Médicaments | |||
| Fiole de noradrénaline | |||
| Fiole de dopamine | |||
| 1 L plasmalyte | Solution électrolytique équilibrée | ||
| Comprimés d’aspirine 81 mg po à chaque jour | |||
| Fiole de céfazoline | |||
| Exceed | |||
| Unités d’héparine 10K |
Références
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- Flournoy, W. S., Mani, S. Percutaneous external jugular vein catheterization in piglets using a triangulation technique. Lab Anim. 43, 344-349 (2009).
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- Abraham, N., et al. Subnormothermic oxygenated machine perfusion (24 h) in DCD kidney transplantation. Transplant Direct. 10 (6), e1633(2024).
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Réimpressions et autorisations
