L’ubiquitination est un régulateur critique des fonctions intracellulaires des protéines. Ici, nous décrivons deux méthodes de lyse cellulaire pour détecter les niveaux d’ubiquitination des protéines du substrat dans les cellules de mammifères et comparons leur efficacité dans l’analyse des niveaux d’ubiquitination. La surexpression des protéines dans HEK293T cellules a été induite par transfection transitoire, et des protéines ubiquitinées ont été détectées par analyse western blot.
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Article de méthode
Stratégies comparatives pour la détection de l’ubiquitination dans les lysats cellulaires de mammifères en utilisant SMAD2/SMURF2 comme modèle
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’ubiquitination, une modification post-traductionnelle, est un régulateur critique de la fonction intracellulaire des protéines. L’ubiquitination module les fonctions des protéines en favorisant la dégradation protéosomale ou en modifiant la localisation subcellulaire via un signalement dépendant de la chaîne de l’ubiquitine. Ici, nous décrivons deux méthodes de lyse cellulaire pour détecter les niveaux d’ubiquitination de SMAD2 dans HEK293T cellules et comparons leur efficacité dans l’analyse des niveaux d’ubiquitination des protéines. La surexpression des protéines dans les cellules a été induite par transfection transitoire. Les plasmides (HA-Ub, FLAG-SMAD2 et MYC-SMURF2) et les réactifs de transfection ont été ajoutés séparément au milieu basal, mélangés, puis le mélange a été ajouté aux cellules. Avant la récolte, la MG132 a été ajoutée pour inhiber la dégradation protéosomale et améliorer l’accumulation ubiquitinée des protéines. La principale divergence entre les deux approches expérimentales réside dans leurs méthodes de lyse cellulaire — la méthode du bain de glace (réalisée à 4 °C) et la méthode de traitement thermique (impliquant l’incubation à 95 °C), qui affectent considérablement l’efficacité de la lyse des protéines. Après la lyse cellulaire, le lysat cellulaire, les billes d’agarose et l’anticorps FLAG ont été mélangés et incubés à 4 °C pendant la nuit. Les protéines ubiquitinées ont ensuite été détectées par analyse western blot. Avant la détection de protéines ubiquitinées, un anticorps à chaîne légère était utilisé pour l’incubation secondaire des anticorps. Ensuite, des bandes d’ubiquitination ont été détectées. Les résultats montrent que la méthode du bain de glace et la méthode de traitement thermique peuvent être utilisées pour détecter les niveaux d’ubiquitination, tandis que la méthode de traitement thermique peut faciliter la détection de l’ubiquitination de SMAD2. Cette étude décrit et compare deux méthodes de lyse cellulaire pour mesurer les niveaux d’ubiquitination dans les cellules de mammifères, en utilisant SMURF2/SMAD2 comme modèle, afin d’aider les chercheurs à sélectionner des méthodes plus appropriées pour détecter les niveaux d’ubiquitination des protéines du substrat.
Introduction
L’ubiquitination, une modification post-traductionnelle indispensable, est un régulateur critique des fonctions intracellulairesdes protéines 1. Le système ubiquitine-protéasome (UPS), qui médie la dégradation de plus de 80 % des protéines chez les eucaryotes, est composé d’ubiquitine (Ub), d’enzymes activatrices E1, d’enzymes conjuguantes E2, de ligases E3, d’enzymes déubiquitylantes (DUB) et du protéasome26S 26S. Ce système régule le renouvellement des protéines avec une grande spécificité, contrôlant ainsi les processus cellulaires essentiels tels que la progression du cyclecellulaire 3, la transduction du signal 4,5 et les réponses au stress 6,7. L’ubiquitination est un processus enzymatique en plusieurs étapes. E1 hydrolyse l’ATP en adénylate le terminal C de Ub, formant un intermédiaire Ub-AMP. Ensuite, l’Ub activé est transféré de l’E1 à la cystéine du site actif d’une enzyme conjuguante de l’E2, formant une liaison thioester. Enfin, une ligase E3 recrute à la fois le complexe E2-Ub et une protéine cible, catalysant le transfert d’Ub d’E2 vers un résidu de lysine sur le substrat8.
L’ubiquitine peut former diverses chaînes polyubiquitines par liaison à sept résidus de lysine (Lys6, Lys11, Lys27, Lys29, Lys33, Lys48, Lys63) ou Met1(M1)4. Chaque type de liaison dicte des résultats biologiques distincts : les chaînes liées à K48 ciblent principalement les protéines pour la dégradationprotéosomale 9, les chaînes liées à K63 régulent la signalisation et la réparation de l’ADN10,11, et les chaînes liées à M1 sont essentielles pour les réponses immunitairesinnées 12. L’ubiquitination et la déubiquitination sont des processus de modification post-translationnelle clés qui régissent divers événements cellulaires, allant de la dégradation des protéines à la transduction du signal. Par exemple, dans le cancer colorectal, une activation aberrante de l’ubiquitination médiée par MDM2 par p53 entraîne une dégradation excessive de p53, altérant sa capacité à induire l’arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose, entraînant ainsi la progression tumorale et la chimiorésistance13,14. Dans la lésion ischémie-reperfusion hépatique, OTUD1 stabilise NRF2 en retirant sa polyubiquitination liée à K48, atténuant ainsi les niveaux de stress oxydatifintracellulaire 15,16. Une gamme d’inhibiteurs du protéasome, tels que le bortézomib, le carfilzomib et l’ixazomib, ont progressivement intégré la pratique clinique pour des maladies telles que le myélomemultiple 17,18,19.
Actuellement, il existe de nombreuses méthodes pour détecter les protéines ubiquitinées, notamment le western blotting, les tests basés sur la radioactivité et les tests defluorescence 20. Cependant, en recherche scientifique, le western blot reste la méthode privilégiée pour la détection de l’ubiquitination des protéines en raison de son protocole relativement rapide et simple. Les méthodes traditionnelles pour détecter les protéines ubiquitinées sont similaires à la technologie de co-immunoprécipitation (co-IP) : elles utilisent un tampon de lyse pour incuber et lyser les granulés cellulaires à basse température afin de libérer des protéines, puis utilisent des anticorps pour détecter l’ubiquitination des protéines substrat21,22. Cependant, ce protocole expérimental nécessite souvent un grand nombre de cellules. De plus, comme la méthode de lyse relativement douce à basse température ne peut pas complètement perturber les interactions protéiques, cela augmente la probabilité de faux positifs lors de l’ubiquitination détectée. Le chauffage et l’utilisation du SDS peuvent perturber significativement la structure des protéines, induisant leur dénaturation complète, réduisant ainsi efficacement les faux positifs causés par les interactionsprotéine-protéine 23,24,25. De même, les cellules subissent une lyse suffisante lors du chauffage et du traitement SDS, libérant plus de protéines et, en conséquence, réduisant le nombre de cellules nécessaires à l’expérience. En résumé, la méthode du bain de glace et la méthode de traitement thermique lysent les cellules et détectent les niveaux d’ubiquitination des protéines substrat par incubation par anticorps. Cependant, la méthode de chauffage entraîne une plus grande lyse cellulaire et une dénaturation des protéines plus forte.
Le TGF-β joue un double rôle dans les processus physiopathologiques de diverses maladies 26,27. SMAD2 est un facteur de transcription critique en aval du TGF-β. L’ubiquitination de SMAD2 médiatisée par SMURF2 le vise pour une dégradation protéosomale, affinant ainsi l’intensité de signalisation duTGF-β 28. Cette étude décrit et compare deux méthodes de lyse cellulaire pour mesurer les niveaux d’ubiquitination chez les cellules de mammifères, en utilisant SMURF2/SMAD2 comme modèle. Ici, la surexpression protéique dans HEK293T cellules a été induite par transfection transitoire avec les plasmides HA-Ub, FLAG-SMAD2 et MYC-SMURF2. Les cellules ont été lysées selon la méthode du bain de glace et la méthode du traitement thermique, respectivement. Des protéines ubiquitinées ont été détectées par analyse Western blot. Nous avons constaté que la méthode du bain de glace et la méthode de traitement thermique peuvent être utilisées pour détecter les niveaux d’ubiquitination, et que la méthode de traitement thermique pourrait faciliter la détection de l’ubiquitination de SMAD2. Ce protocole offre une nouvelle alternative pour détecter les protéines ubiquitinées. De plus, pour certaines protéines substrat fortement associées à l’ubiquitination, la méthode de traitement thermique permet une meilleure efficacité de lyse des protéines, permettant ainsi une détection plus facile de l’ubiquitination.
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Protocole
1. Préparation du tampon de lyse et des réactifs
REMARQUE : Préparez tous les tampons aux concentrations indiquées. Suivez les instructions du fabricant pour les poudres réactivées afin d’éviter les écarts de concentration.
- Préparez un tampon de lyse contenant 20 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM de NaCl, 1 mM d’EDTA (pH 8,0) et 1 % de Triton X-100. Ajustez la concentration de NaCl entre 50 et 150 mM si nécessaire. Préparez tous les tampons avec du H₂O double distillé.
- Préparez la solution de travail en complétant le tampon de lyse avec un cocktail inhibiteur de protéase à 1 % (sans EDTA). Mélangez bien et laissez sur la glace jusqu’à utilisation.
- Préparez une FDS à 10 % en dissolvant 1 g de poudre SDS dans 10 mL de PBS. Mélangez jusqu’à ce que ce soit complètement dissous. Conserver à température ambiante.
- Préparez un tampon de charge protéique de 5× contenant 250 mM de Tris-HCl (pH 6,8), 10 % de SDS, 50 % de glycérol, 0,5 % de bleu de bromophénol et 5 % de β-mercaptoéthanol. Dissoudre les composants dans del’H2Odouble distillé. Mélanger soigneusement avant utilisation.
REMARQUE : Manipulez le SDS et le β-mercaptoéthanol dans une hotte à fumée tout en portant un équipement de protection approprié. Éliminer les matériaux contaminés conformément aux directives institutionnelles concernant les déchets chimiques.
2. Préparation des cellules
- Maintenir HEK293T cellules dans le DMEM à haute glycémie complété avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine. Incuber à 37 °C avec 5 % de CO₂ en conditions stériles. Cellules de passage à environ 90 % de confluence.
- Cellules de semence dans des plaques à 6 puits à 5 × 10⁵ cellules par puits. Concentrez les cellules de deux puits pour générer un échantillon.
- Préparez des mélanges de transfection pour représenter 10 % du volume total de culture et utilisez l’ubiquitination SMAD2 comme modèle expérimental. Combinez 1 μg de plasmide HA-Ub, 1 μg de plasmide FLAG-SMAD2 et 0,5 μg de plasmide vectoriel vide ou MYC-SMURF2 dans 100 μL de DMEM sans sérum. Dans un tube séparé, diluez 3,75 μL de réactif de transfection dans 100 μL de DMEM sans sérum. Ajoutez le mélange de réactifs goutte à goutte à la solution plasmidique, incubez pendant 15 minutes à température ambiante, puis distribuez uniformément sur les cellules.
- Remplacez le milieu de transfection après 6 à 8 heures par 2 mL de DMEM complet et frais par puits. Incubez les cellules pendant 48 heures.
- Traiter les cellules avec 5 μM de MG132 pendant 12 heures avant la prélèvement.
REMARQUE : Manipulez MG132 dans un meuble de biosécurité en portant des gants. Éliminer les matériaux contaminés conformément aux procédures de sécurité institutionnelles.
3. Collecte de cellules
- Prélève les cellules à 90-100 % de confluence (~3 × 10⁶ cellules). Aspirez le milieu et lavez chaque puits avec 1 mL de PBS prérefroidi. Supprimez complètement PBS.
- Ajoutez 1 mL de PBS à chaque puits et resuspendez doucement les cellules. Transférez la suspension dans un tube de 1,5 mL et posez-la sur glace.
- Centrifugez à 380 × g pendant 5 minutes à 4 °C. Retirez le surnageant et conservez la pastille.
4. Préparation des perles d’agarose
- Transférez 50 μL de billes d’agarose protéique A/G par échantillon dans un nouveau tube. Laver les billes 3 fois avec 1 mL de tampon de lyse. Centrifugez à 100 × g pendant 1 minute à 4 °C entre les lavages.
- Retirez le tampon résiduel sans déranger la pastille. Ajoutez 100 μL de solution active et 5 μL d’anticorps anti-FLAG. Incubez pendant 6 heures à 4 °C avec une rotation douce.
5. Lyse cellulaire
- Méthode du bain de glace
- Ajoutez 500 μL de solution de travail prérefroidie au pellet. Incubez sur glace pendant 30 minutes.
- Sonicate à 2 W en utilisant des cycles de 4 s allumé/4 secondes éteints pour cinq répétitions. Gardez les échantillons sur glace pendant la sonication. Retournez les échantillons dans la glace pour le reste de l’incubation.
REMARQUE : Pour les interactions protéiques faibles, réduisez la concentration de NaCl à 50-75 mM et omettez la sonication.
- Méthode de traitement thermique
- Ajoutez 45 μL de solution de travail au pellet. Ajoutez 5 μL de SDS à 10 % tout en mélangeant en continu.
- Vortex brièvement et chauffe à 95 °C jusqu’à ce que la suspension devienne transparente et complètement liquéfiée. Inversez par intermittence pour assurer une dénaturation uniforme.
- Ajoutez 450 μL de solution de travail. Sonicate à 2 W en utilisant des cycles de 4 s allumé/4 secondes éteint pour cinq répétitions tout en gardant les échantillons sur glace.
REMARQUE : Assurez-vous que la concentration finale de SDS reste <0,1 %. Confirmez la lyse complète en vérifiant la disparition des granulés visibles et la clarté uniforme de la solution.
6. Immunoprécipitation et détection d’ubiquitination
- La centrifugeuse lyse à 13 680 × g pendant 15 minutes à 4 °C. Transférez le surnageant dans un nouveau tube.
- Réservez 60 μL de lysat et ajoutez 15 μL de tampon de chargement à 5×. Chauffez à 95 °C pendant 15 minutes et étiquetez comme entrée.
- Ajouter 100 μL de billes couplées par anticorps au lysat restant (volume final 540 μL). Incubez à 4 °C pendant 8 à 12 heures avec rotation.
- Centrifugeuse perle à 100 × g pendant 1 minute à 4 °C et jette le surnageant. Laver les billes 3 fois avec un tampon de lyse. Ajoutez 75 μL de tampon de chargement SDS à 1× et chauffez à 95 °C pendant 15 minutes pour éluer les protéines. Étiquetez comme IP.
- Détecter les protéines ubiquitinées par western blot selon un protocole standard JoVE.
REMARQUE : Consultez le protocoleWestern Blot 29 pour des procédures détaillées de transfert et de détection. Des taches non recadrées sur toute la longueur avec marqueurs de poids moléculaire sont fournies dans le Fichier Supplémentaire 1.
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Résultats
En tant que « messager moléculaire » dans la voie de signalisation TGF-β, SMAD2, après avoir été phosphorylée par les récepteurs TGF-β, forme un complexe avec SMAD3 et SMAD4, transloce vers le noyau et initie la transcription des gènes cibles30 en aval. C’est donc une molécule clé reliant les signaux extracellulaires à l’expression génique intracellulaire. Sa dégradation est médiée par SMURF2, une ligase d’ubiquitine E3 qui catalyse la polyubiquitination de la pro...
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Discussion
Cette étude présente et compare deux protocoles détaillés de lyse protéique spécifiquement optimisés pour détecter l’ubiquitination du substrat médiée par la ligase E3. Pour assurer la détectabilité, nous avons utilisé une surexpression à base de plasmides (par exemple, marqués SMAD2, SMURF2 ou Ub) dans les cellules, ce qui a fourni des niveaux protéiques suffisants pour visualiser des signaux d’ubiquitination spécifiques, ce qui est essentiel pour valider les interactions ligase-substra...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Remerciements
Cette étude de recherche a été soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine, n° 82370647 (W.H.), n° 82170642 (J-X. Z), nos 81801923 (X-F. Z), nos 81670575 (J-X. Z), n° 81570570 (W.H.) et n° 81070355 (J-X. Z), et le programme de l’équipe académique de la Frontière des jeunes de HUST, Université des sciences et technologies de Huazhong (2018QYTD02). La Fondation ouverte du Hubei : Laboratoire clé de médecine régénérative et de recherche translationnelle pluridisciplinaire (2022zsyx003). Programme national clé de recherche et développement de Chine (2024YFA1107601).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Microtube de 1,5 mL | Servicebio | EP-150-M | |
| Plat cultivé traité à TC de 100 mm | Servicebio | CCD-100 | |
| Disque à 6 puits | Servicebio | CCP-6H | |
| Anticorps anti-FLAG | Proteintech | 20543-1-AP | dilution utilisée 1:200 pour IP 1:10000 pour WB |
| Anticorps anti-GAPDH | Proteintech | MA5-15738 | dilution utilisée 1:10000 |
| Anticorps anti-HA | Proteintech | 51064-2-AP | dilution utilisée 1:10000 |
| Anticorps anti-IgG | CST | #3900 | dilution utilisée 1:200 pour IP |
| Anticorps anti-MYC | Proteintech | 60003-2-IG | dilution utilisée 1:10000 |
| Anticorps anti-SMAD2 | CST | #5339 | dilution utilisée 1:200 pour IP 1:2000 pour WB |
| Bleu de bromophénol | Servicebio | GC307006-5g | |
| EDTA (pH=8,0) | Servicebio | G1207-1L | |
| FBS | ABW | ||
| Glycérol | Sinopharm | 10010618 | |
| Bain sec de chauffage/refroidissement | Guocheng | ||
| HEK293T cellules | ATCC | CRL-3216 | |
| DMEM à haute glycémie | Servicebio | G4515-500ML | |
| Chaîne légère IgG anti-souris conjuguée HRP & nbsp ; | Abclonal | AS062 | dilution utilisée 1:5000 |
| Chaîne légère IgG anti-Rabbit conjuguée HRP & nbsp ; | Abclonal | AS061 | dilution utilisée 1:10000 |
| Lipo8000 | Beyotime | C0533 | |
| MG132 | Aladdin | M421264 | |
| Microcentrifugeuse | Labgic | CF1524R | |
| Poudre de NaCl | Servicebio | GC102004 | |
| PBS ; | Servicebio | G4202-500ML | |
| pCMV-FLAG-SMAD2 | Pour l’expression des mammifères | ||
| pCMV-HA-Ub | Pour l’expression des mammifères | ||
| pCMV-MYC | Pour l’expression des mammifères | ||
| pCMV-MYC-SMURF2 | Pour l’expression des mammifères | ||
| Pénicilline-streptomycine | Servicebio | G4003-100ML | |
| Cocktail inhibiteur de protéase sans EDTA | TargetMol | C0001 | |
| Billes d’agarose protéiniques A/G | Beyotime | P2017 | |
| Membrane PVDF | Vayzme | E801 | |
| Poudre SDS | Solarbio | S8010-500g | |
| Système SDS-PAGE | Aervicebio | BVE4-BVT4 | |
| Sonics | Cellule d’Uibra | ||
| Poudre Tris-HCl | Biotopé | HST-0372 | |
| Triton X-100 | Servicebio | GC204003-100 ml | |
| Trypsine | Servicebio | G4021-100ML | |
| Mélangeur vortex | Généreusement offert par Vayzme | ||
| &beta ;-mercaptoéthanol | Aladdin | M301573 |
Références
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Réimpressions et autorisations
