L’ubiquitination est un régulateur critique des fonctions intracellulaires des protéines. Ici, nous décrivons deux méthodes de lyse cellulaire pour détecter les niveaux d’ubiquitination des protéines du substrat dans les cellules de mammifères et comparons leur efficacité dans l’analyse des niveaux d’ubiquitination. La surexpression des protéines dans HEK293T cellules a été induite par transfection transitoire, et des protéines ubiquitinées ont été détectées par analyse western blot.
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Article de méthode
Stratégies comparatives pour la détection de l’ubiquitination dans les lysats cellulaires de mammifères en utilisant SMAD2/SMURF2 comme modèle
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’ubiquitination, une modification post-traductionnelle, est un régulateur critique de la fonction intracellulaire des protéines. L’ubiquitination module les fonctions des protéines en favorisant la dégradation protéosomale ou en modifiant la localisation subcellulaire via un signalement dépendant de la chaîne de l’ubiquitine. Ici, nous décrivons deux méthodes de lyse cellulaire pour détecter les niveaux d’ubiquitination de SMAD2 dans HEK293T cellules et comparons leur efficacité dans l’analyse des niveaux d’ubiquitination des protéines. La surexpression des protéines dans les cellules a été induite par transfection transitoire. Les plasmides (HA-Ub, FLAG-SMAD2 et MYC-SMURF2) et les réactifs de transfection ont été ajoutés séparément au milieu basal, mélangés, puis le mélange a été ajouté aux cellules. Avant la récolte, la MG132 a été ajoutée pour inhiber la dégradation protéosomale et améliorer l’accumulation ubiquitinée des protéines. La principale divergence entre les deux approches expérimentales réside dans leurs méthodes de lyse cellulaire — la méthode du bain de glace (réalisée à 4 °C) et la méthode de traitement thermique (impliquant l’incubation à 95 °C), qui affectent considérablement l’efficacité de la lyse des protéines. Après la lyse cellulaire, le lysat cellulaire, les billes d’agarose et l’anticorps FLAG ont été mélangés et incubés à 4 °C pendant la nuit. Les protéines ubiquitinées ont ensuite été détectées par analyse western blot. Avant la détection de protéines ubiquitinées, un anticorps à chaîne légère était utilisé pour l’incubation secondaire des anticorps. Ensuite, des bandes d’ubiquitination ont été détectées. Les résultats montrent que la méthode du bain de glace et la méthode de traitement thermique peuvent être utilisées pour détecter les niveaux d’ubiquitination, tandis que la méthode de traitement thermique peut faciliter la détection de l’ubiquitination de SMAD2. Cette étude décrit et compare deux méthodes de lyse cellulaire pour mesurer les niveaux d’ubiquitination dans les cellules de mammifères, en utilisant SMURF2/SMAD2 comme modèle, afin d’aider les chercheurs à sélectionner des méthodes plus appropriées pour détecter les niveaux d’ubiquitination des protéines du substrat.
Introduction
L’ubiquitination, une modification post-traductionnelle indispensable, est un régulateur critique des fonctions intracellulairesdes protéines 1. Le système ubiquitine-protéasome (UPS), qui médie la dégradation de plus de 80 % des protéines chez les eucaryotes, est composé d’ubiquitine (Ub), d’enzymes activatrices E1, d’enzymes conjuguantes E2, de ligases E3, d’enzymes déubiquitylantes (DUB) et du protéasome26S 26S. Ce système régule le renouvellement des protéines avec une grande spécificité, contrôlant ainsi les processus cellulaires essentiels tels que la progression du cycle
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Protocole
1. Préparation du tampon de lyse et des réactifs
REMARQUE : Préparez tous les tampons aux concentrations indiquées. Suivez les instructions du fabricant pour les poudres réactivées afin d’éviter les écarts de concentration.
- Préparez un tampon de lyse contenant 20 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM de NaCl, 1 mM d’EDTA (pH 8,0) et 1 % de Triton X-100. Ajustez la concentration de NaCl entre 50 et 150 mM si nécessaire. Préparez tous les tampons avec du H₂O double distillé.
- Préparez la solution de travail en complétant le tampon de lyse avec un cocktail inhibiteur de protéase ....
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Résultats
En tant que « messager moléculaire » dans la voie de signalisation TGF-β, SMAD2, après avoir été phosphorylée par les récepteurs TGF-β, forme un complexe avec SMAD3 et SMAD4, transloce vers le noyau et initie la transcription des gènes cibles30 en aval. C’est donc une molécule clé reliant les signaux extracellulaires à l’expression génique intracellulaire. Sa dégradation est médiée par SMURF2, une ligase d’ubiquitine E3 qui catalyse la polyubiquitination de la pro.......
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Discussion
Cette étude présente et compare deux protocoles détaillés de lyse protéique spécifiquement optimisés pour détecter l’ubiquitination du substrat médiée par la ligase E3. Pour assurer la détectabilité, nous avons utilisé une surexpression à base de plasmides (par exemple, marqués SMAD2, SMURF2 ou Ub) dans les cellules, ce qui a fourni des niveaux protéiques suffisants pour visualiser des signaux d’ubiquitination spécifiques, ce qui est essentiel pour valider les interactions ligase-substra.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Remerciements
Cette étude de recherche a été soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine, n° 82370647 (W.H.), n° 82170642 (J-X. Z), nos 81801923 (X-F. Z), nos 81670575 (J-X. Z), n° 81570570 (W.H.) et n° 81070355 (J-X. Z), et le programme de l’équipe académique de la Frontière des jeunes de HUST, Université des sciences et technologies de Huazhong (2018QYTD02). La Fondation ouverte du Hubei : Laboratoire clé de médecine régénérative et de recherche translationnelle pluridisciplinaire (2022zsyx003). Programme national clé de recherche et développement de Chine (2024YFA1107601).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Microtube de 1,5 mL | Servicebio | EP-150-M | |
| Plat cultivé traité à TC de 100 mm | Servicebio | CCD-100 | |
| Disque à 6 puits | Servicebio | CCP-6H | |
| Anticorps anti-FLAG | Proteintech | 20543-1-AP | dilution utilisée 1:200 pour IP 1:10000 pour WB |
| Anticorps anti-GAPDH | Proteintech | MA5-15738 | dilution utilisée 1:10000 |
| Anticorps anti-HA | Proteintech | 51064-2-AP | dilution utilisée 1:10000 |
| Anticorps anti-IgG | CST | #3900 | dilution utilisée 1:200 pour IP |
| Anticorps anti-MYC | Proteintech | 60003-2-IG | dilution utilisée 1:10000 |
| Anticorps anti-SMAD2 | CST | #5339 | dilution utilisée 1:200 pour IP 1:2000 pour WB |
| Bleu de bromophénol | Servicebio | GC307006-5g | |
| EDTA (pH=8,0) | Servicebio | G1207-1L | |
| FBS | ABW | ||
| Glycérol | Sinopharm | 10010618 | |
| Bain sec de chauffage/refroidissement | Guocheng | ||
| HEK293T cellules | ATCC | CRL-3216 | |
| DMEM à haute glycémie | Servicebio | G4515-500ML | |
| Chaîne légère IgG anti-souris conjuguée HRP & nbsp ; | Abclonal | AS062 | dilution utilisée 1:5000 |
| Chaîne légère IgG anti-Rabbit conjuguée HRP & nbsp ; | Abclonal | AS061 | dilution utilisée 1:10000 |
| Lipo8000 | Beyotime | C0533 | |
| MG132 | Aladdin | M421264 | |
| Microcentrifugeuse | Labgic | CF1524R | |
| Poudre de NaCl | Servicebio | GC102004 | |
| PBS ; | Servicebio | G4202-500ML | |
| pCMV-FLAG-SMAD2 | Pour l’expression des mammifères | ||
| pCMV-HA-Ub | Pour l’expression des mammifères | ||
| pCMV-MYC | Pour l’expression des mammifères | ||
| pCMV-MYC-SMURF2 | Pour l’expression des mammifères | ||
| Pénicilline-streptomycine | Servicebio | G4003-100ML | |
| Cocktail inhibiteur de protéase sans EDTA | TargetMol | C0001 | |
| Billes d’agarose protéiniques A/G | Beyotime | P2017 | |
| Membrane PVDF | Vayzme | E801 | |
| Poudre SDS | Solarbio | S8010-500g | |
| Système SDS-PAGE | Aervicebio | BVE4-BVT4 | |
| Sonics | Cellule d’Uibra | ||
| Poudre Tris-HCl | Biotopé | HST-0372 | |
| Triton X-100 | Servicebio | GC204003-100 ml | |
| Trypsine | Servicebio | G4021-100ML | |
| Mélangeur vortex | Généreusement offert par Vayzme | ||
| &beta ;-mercaptoéthanol | Aladdin | M301573 |
Références
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nat Med. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Han, D., Wang, L., Jiang, S., Yang, Q. The ubiquitin-proteasome system in breast cancer. Trends Mol Med. 29 (8), 599-621 (2023).
- Fulcher, L. J., Batley, C., ....
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Réimpressions et autorisations
