Évaluation quantitative optimisée de la stabilité de l’ARN d’amélioration dans les cellules souches embryonnaires de souris

Summary

Ce protocole mesure quantitativement la stabilité et la demi-vie des ARN amplificateurs intergéniques et intragéniques dans les cellules souches embryonnaires de souris grâce au traitement à l’Actinomycine D, RT-qPCR et analyse de régression non linéaire. Des stratégies de normalisation spécifiques à la position sont intégrées pour modéliser avec précision la dynamique de désintégration de l’ARNe, de manière dépendante du contexte.

Abstract

Les ARN d’amélioration (ARNe) sont des transcrits non codants produits à partir de régions d’amplificateur actives en transcription et sont de plus en plus reconnus comme des régulateurs clés de l’expression génique. Malgré leur importance fonctionnelle, la stabilité et la dynamique de dégradation des ARNe, qui restent peu caractérisées, en particulier dans les cellules souches embryonnaires (ESC), où les programmes transcriptionnels sont très dynamiques et dépendants du contexte. Ce protocole présente une méthode quantitative pour évaluer la cinétique de désintégration et la demi-vie des ARNe-eRNA intergéniques et intragéniques dans les CES de souris. La transcription est inhibée grâce à l’actinomycine D, et l’ARN total est collecté à plusieurs moments définis. l’ADNcD est synthétisé à l’aide d’amorces hexamères aléatoires et d’oligo(dT) pour permettre la détection de transcrits polyadénylés et non polyadénylés. Pour les ARNe intergéniques, la normalisation est réalisée soit à l’aide d’un gène de maintien en vie, soit de la valeur Ct au temps 0 min. Pour les ARNe-eRNA intragéniques, une approche de normalisation double est employée afin de minimiser les interférences dues au chevauchement des pré-ARNm. Les courbes de désintégration sont analysées à l’aide d’un modèle de désintégration exponentielle monophasée, permettant une estimation précise de la demi-vie. Le protocole révèle que les ARNe-e, dans les mESC, présentent un renouvellement rapide, avec une demi-vie d’environ 2 à 3 minutes. Cette méthodologie fournit un cadre robuste et reproductible pour étudier la stabilité des ARNe, offrant un aperçu de l’activité des amplificateurs et de la dynamique de l’ARN dans les contextes des cellules souches pluripotentes.

Introduction

Les amplificateurs sont des éléments cis-régulateurs (CRE) qui régulent l’expression génique spécifique aux tissus et aux stimulus en servant de plateformes de liaison pour les facteurs de transcription et de^{co-régulateurs} 1,2,3,4,5,6. Bien que les amplificateurs puissent être situés éloignés de leurs gènes cibles au niveau du génome linéaire, les mécanismes de boucle de la chromatine permettent la proximité spatiale avec les promoteurs, facilitant ainsi la régulation transcriptionnelle. Les amplificateurs actifs sont transcrits bidirectionnellement par l’ARN polymérase II (Pol II), produisant de longs ARN non codants appelés ARN d’amplification (eRNA), qui ont généralement une longueur médiane^{d’environ 1 kb} 1,2,7,8,9. L’expression des eARN est fortement corrélée à l’activation des gènes cibles^voisins 10,11,12, et des études fonctionnelles ont constamment montré que la déplétion des eARN réduit la transcription de leurs gènes cibles, suggérant que les eARN agissent comme des régulateurs fonctionnels plutôt que comme des sous-produits ^{transcriptionnels} 13,14,15,16,17 . Malgré leur importance fonctionnelle, les protocoles expérimentaux pour détecter et quantifier de manière fiable les ARNe, restent limités.

Dans les cellules souches, l’activité des amplificateurs joue un rôle crucial dans le maintien de la pluripotence et la promotion des transitions^{développementales 18,19}. Les amplificateurs peuvent résider dans des régions intergéniques (intergéniques ou extragéniques) ou être intégrés dans les corps géniques en tant qu’amplificateurs^{intragéniques 8}. Bien que les amplificateurs intergéniques aient été largement étudiés dans divers types cellulaires, les amplificateurs intragéniques restent relativement peu explorés en raison de défis techniques, tels que le chevauchement transcriptionnel avec les pré-ARNm du gène de l’hôte et la présence de modifications des histones associées à l’allongement^{transcriptionnel 20,21}. Néanmoins, des études récentes ont montré que les amplificateurs intergéniques et intragéniques contribuent tous deux aux réseaux de régulation génique impliqués dans la pluripuissance^22,23 et la différenciation précoce²⁴ chez les ESC. Notamment, près de la moitié de tous les amplificateurs annotés sont^{intragéniques 20,25}, et leur activité varie selon les stades du développement, augmentant souvent dans les tissus^{différenciés} 8,26,27,28. Cependant, la prévalence et les rôles fonctionnels des amplificateurs intragéniques dans les ECE restent incomplètement compris. En particulier, alors que les ARNe-e-intergéniques sont transcrits entre les gènes, les ARNe-A-rN-Ig intragéniques sont transcrits à l’intérieur des corps géniques et peuvent chevaucher avec les transcrits pré-ARNm. Cette différence de position nécessite des approches analytiques distinctes lors de l’interprétation et de la quantification des ARNe intergéniques et intragéniques.

Contrairement aux ARNm, les ARNe, qui manquent généralement de queue poly(A) de 3′, ce qui entraîne une faible stabilité et une dégradation^rapide 1,2,7,8,9. Cette instabilité intrinsèque rend difficile l’analyse de l’expression de l’ARNe, notamment dans les expériences sur le cours du temps. Chez les neurones, il a été rapporté que les ARNe-k présentent une demi-vie aussi courte que 7,5 min¹⁷. Cependant, il reste incertain si cette instabilité est cohérente selon les types cellulaires, en particulier dans les ESC, où l’activité des amplificateurs et la transcription d’ARNe-M sont très spécifiques^{à chaque type cellulaire} 7,17,29,30. Les CES reposent sur des programmes dynamiques de régulation des gènes pour maintenir la pluripotence ou initier la différenciation, ce qui en fait un système unique pour examiner le renouvellement des^ARNe. Compte tenu des rapides variations transcriptionnelles des ESC, comprendre la désintégration de l’ARNe, dans ce contexte, peut révéler comment l’activité des amplificateurs est régulée^{temporellement 17}. De plus, les différences entre les ARNe intergéniques et intragéniques, telles que le chevauchement avec les transcriptes géniques de l’hôte, nécessitent des approches analytiques^{distinctes 20}. Malgré l’importance de ces questions, peu de méthodes standardisées existent pour mesurer la demi-vie des eRNA dans les ECC ou pour comparer la dynamique de désintégration des différents types d’eARN.

Cette étude présente un protocole quantitatif pour évaluer la stabilité et la demi-vie des ARNe, transcrits à partir d’amplificateurs intergéniques et intragéniques dans les mESC. L’inhibition transcriptionnelle est obtenue à l’aide de l’actinomycine D (ActD) à des intervalles de temps définis, suivie d’une analyse quantitative PCR en temps réel (RT-qPCR) et d’une régression non linéaire pour quantifier la désintégration de l’eARN. Pour traiter les différences de position entre les amplificateurs intergéniques et intragéniques, la méthode intègre des stratégies de normalisation distinctes, permettant une comparaison systématique et précise de la dynamique de dégradation de l’ARNe. Ce cadre analytique structuré fournit des informations précieuses sur le renouvellement de l’ARNe, dans les cellules souches pluripotentes.

Protocol

Toutes les expériences de cette étude ont été réalisées avec des cellules souches embryonnaires de souris (mESC ; E14Tg2A) qui n’ont pas été générées directement dans notre laboratoire mais ont été obtenues à partir d’une lignée cellulaire établie, également disponible commercialement via l’ATCC (CRL-1821). Par conséquent, le travail décrit dans cet article ne nécessite pas d’examen par le Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels (IACUC) à l’Université nationale de Chungnam. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Culture cellulaire de mESC

1. Pré-enduit les plaques de culture cellulaire à 6 puits contenant 0,1 % de gélatine (2 mL par puits). Faites couver les plaques à 37 °C pendant 10 minutes.
2. Aspirez la gélatine et lavez chaque puits une fois avec 1 mL de PBS. Stérilisez les plaques par irradiation UV pendant au moins 15 minutes.
3. Semez les mESC sur les plaques recouvertes de gélatine en utilisant les 2 mL complets de milieu de culture cellulaire (Tableau 1).
   REMARQUE : Ajouter le LIF fraîchement dans le milieu de culture à la concentration requise juste avant utilisation, en fonction du volume total du milieu nécessaire pour l’expérience.

Composants	Concentration finale	Volume utilisé
Le médium essentiel minimum (GMEM) de Glasgow	-	500 mL
Remplacement du sérum KnockOut™ (KOSR)	10%	50 mL
Pénicilline-streptomycine	0.50%	2,5 mL
Sérum fœtal bovin (FBS)	1%	5 mL
Pyruvate de sodium	0,1 mM / 1 %	5 mL
Solution d’acides aminés non essentiels du MEM (MnEA)	0,1 mM/ 1 %	5 mL
2-mercaptoéthanol	0,1 mM	910 uL
Facteur inhibiteur de la leucémie (LIF)	1000 U/mL	-

Tableau 1 : Composition du milieu de culture mESC. Les composants et leurs concentrations finales sont utilisés pour préparer le milieu de culture mESC. Les volumes typiques sont indiqués par 500 mL de support total.

4. Maintenir les cellules dans des conditions de culture standard à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO₂ (Figure 1A).

Figure 1 : Conception expérimentale pour l’analyse de stabilité de l’ARNe. (A) Schéma de l’expérience d’arrêt transcriptionnel. Les cellules ont été placées sur des plaques à 6 puits recouvertes de gélatine à 0,1 % et traitées avec actD (concentration finale : 5 μg/mL) aux moments indiqués (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min et 30 min) après la récolte. (B) Disposition du test RT-qPCR. L’ARN total a été transcrit inversement à l’aide d’amorces hexamères aléatoires ou d’oligo(dT). Des échantillons d’ADNc de chaque point temporel ont été analysés à l’aide de RT-qPCR pour les cibles indiquées : Tbp_mRNA, ARNe-e-intergénique et ARNe-e-intragénique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

2. Traitement à l’Actinomycine D (ActD)

1. Dissoudre actD dans DMSO pour préparer une solution d’origine à une concentration de 1 mg/mL³³.
   REMARQUE : Bien que l’Actinomycine D soit utilisée ici pour l’inhibition transcriptionnelle à court terme, des inhibiteurs alternatifs tels que le triptolide pourraient également être employés pour bloquer l’initiation de la transcription dans de futures études. Comme l’Actinomycine D et la DMSO sont toutes deux sensibles à la lumière, préparez la solution d’origine dans des microtubes ambrés, protégez-la de la lumière et conservez-la à -20 °C jusqu’à utilisation.
2. Deux jours après l’ensemencement des cellules (ou le jour de la récolte), ajoutez la solution de stock ActD au milieu de culture jusqu’à une concentration finale de 5 μg/mL³³. Prélever les échantillons à 0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 et 30 min après le traitement (Figure 1A).
   REMARQUE : Bien que la plupart des eRNA présentent une décroissance rapide dans la plage de 0 à 30 minutes, certains eARN peuvent présenter des demi-vies plus longues. Selon les caractéristiques du locus cible, un échantillonnage supplémentaire à des moments prolongés (par exemple, 1 h, 3 h ou 6 h) peut être inclus pour capturer plus précisément la cinétique de désintégration. Dans cette étude, l’Actinomycine D a été utilisée à une concentration de 5 μg/mL pour un blocage transcriptionnel à court terme (≤30 min) ; cependant, pour des incubations plus longues (>1 h), il est recommandé de réduire la concentration à 1 à 2 μg/mL afin de minimiser les réponses au stress cellulaire. Parce que le DMSO lui-même peut affecter l’activité transcriptionnelle, un contrôle uniquement DMSO doit également être inclus.

3. Extraction d’ARN et synthèse d’ADNc

1. Retirez le milieu de culture cellulaire par aspiration, et ajoutez 1 mL de réactif de trizol à chaque puits. Incubez les plaques sur un shaker pendant 10 minutes à température ambiante (RT)^34,35, puis transférez le lysat dans un nouveau tube de 1,5 mL.
   REMARQUE : Après le traitement au TriZol, les échantillons peuvent être conservés à -80 °C pendant jusqu’à une semaine avant l’extraction de l’ARN. Comme le réactif TRIzol contient du phénol et de l’isothiocyanate de guanidinium, qui sont hautement toxiques et corrosifs, manipulez-le avec beaucoup de soin. Tous les déchets de Trizol doivent être collectés dans un contenant désigné pour les solvants organiques afin d’être éliminés correctement.
2. Ajoutez 500 μL de chloroforme à chaque échantillon. Secouez vigoureusement les tubes et éclovez à la RT pendant 3 minutes.
3. Centrifugez les échantillons à 13 500 × g pendant 10 minutes à 4 °C.
4. Transférez soigneusement la phase aqueuse dans un nouveau tube de 1,5 mL contenant un volume égal d’isopropanol. Incubez le mélange à RT pendant 10 minutes pour augmenter la précipitation d’ARN.
   REMARQUE : Transférez soigneusement uniquement la phase aqueuse supérieure claire afin d’éviter toute contamination par l’interphase. Pour augmenter le rendement ARN, incubez les échantillons à -20 °C pendant 1 h à toute la nuit (O/N) après l’ajout d’isopropanol. Pour les échantillons à faible consommation, ajoutez du glycogène (10-20 μg/mL finaux) ou du GlycoBlue juste avant d’ajouter de l’isopropanol afin d’améliorer la visibilité des granulés d’ARN et l’efficacité de la récupération. L’isopropanol est hautement inflammable et potentiellement nocif pour la santé humaine ; L’inhalation de vapeurs ou le contact avec la peau ou les yeux peut provoquer irritation, maux de tête, vertiges ou dépression du système nerveux central. Manipulez avec prudence et rassemblez toutes les solutions restantes dans un contenant homologué pour des déchets de solvant organique afin de les éliminer correctement.
5. Centrifugez à nouveau les échantillons à 13 500 × g pendant 10 minutes à 4 °C et jetez le surnageant.
6. Lavez la granule d’ARN résultante avec 1 mL d’éthanol à 75 %. Centrifugez à 6 800 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
   REMARQUE : Inversez doucement le tube après l’ajout d’éthanol pour soulever la pellete.
7. Retirez soigneusement le surnageant et laissez sécher le pellet à l’air pendant 10 minutes à 42 °C. Resuspendez le granule séché dans de l’eau sans RNase et incubez à 55 °C pendant 10 minutes.
   REMARQUE : Lorsque la pureté de l’ARN est élevée, la granule blanche peut devenir translucide lors du séchage à l’air. Évitez de trop sécher le pellet plus de 10 minutes, car un séchage excessif peut réduire l’efficacité de la resuspension.
8. Mesurez la concentration et la pureté de l’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre NanoDrop.
9. Synthétiser de l’ADNcDNA à partir de μg d’ARN à l’aide du kit de synthèse d’ADNcDNA M-MLV, en suivant les instructions du fabricant (Tableau 2).

Composants	Volume utilisé
Tampon RT 10X M-MLV	2 uL
dNTP	2 uL
Amorce (Aléatoire / Olido dT)	1uL
M-MLV RT	1uL
Inhibiteur de la RNASE	0,5 uL
Échantillon d’ARN	2ug (Volume ajusté en fonction de la concentration d’échantillon d’ARN)
DW	Le volume est ajusté en fonction de la concentration d’échantillon d’ARN (pour constituer le volume final)
Total Volume	20 uL

Tableau 2 : Composition de la réaction de synthèse de l’ADNc (transcriptase inverse M-MLV). Volumes détaillés et réactifs utilisés pour la transcription inverse de 2 μg d’ARN total à l’aide du kit de synthèse d’ADNc M-MLV. Le volume de l’échantillon d’ARN a été ajusté en fonction de sa concentration, et une déformation de nucléase sans nucléase a été ajoutée pour porter le volume final de réaction à 20 μL.

10. Incubez la réaction d’ADNc à 37 °C pendant 2 heures, puis inactivez l’enzyme à 85 °C pendant 5 minutes.
    REMARQUE : Stockez l’ADNc synthétisé à -20 °C. La concentration typique d’ADNc est d’environ 100 ng/μL. Pour détecter les ARNe-e-intragéniques, synthétiser l’ADNc à partir du même échantillon d’ARN en utilisant à la fois des amorces hexamères aléatoires et des amorces oligo(dT).

4. Réaction en chaîne quantitative en temps réel (RT-qPCR)

1. Préparez un mélange réactionnel de 10 μL contenant 15 ng d’ADNc, 5 μL de mélange maître Power SYBR Green PCR, 5 pmol de chaque amorce, et de l’eau distillée (DW).
   REMARQUE : les loci d’ARNe-e-Books contiennent souvent ou sont adjacents à des séquences répétitives, nécessitant une conception minutieuse des amorces. Utilisez des séquences masquées à répétition pour restreindre les régions candidates et vérifier la spécificité des paires d’amorces à travers le génome à l’aide de BLAST. Lorsque possible, inclure les régions de contrôle proches pour exclure l’amplification^{non spécifique 36}.
2. Effectuer l’amplification à l’aide d’un système PCR en temps réel avec les conditions de cycle thermique suivantes : une étape initiale d’activation et de dénaturation à 50 °C pendant 2 minutes et 95 °C pendant 10 minutes, suivie de 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 15 secondes, et mesure de recuit, d’extension et de fluorescence à 60 °C pendant 1 min^{34, 37} (Tableau 3).

Étape	Pas	Température (°C)	Heure	Cycle
Hold Stage	Transcription inversée	50	2 min	1
	Dénaturation initiale	95	10 min	1
Étape PCR	Dénaturation	95	15 s	40
	Recuissage/Extension	60	1 min	40
Étape de la courbe de fusion	Dénaturation	95	15 s	1
	Recuit	60	1 min	1
	Dissociation (courbe de fusion)	95	15 s	1

Tableau 3 : Conditions de cycle thermique pour RT-qPCR. Résumé des conditions de température, de temps et de cycle pour la transcription inverse, la qPCR à 40 cycles (réaction de 10 μL) et l’analyse standard de la courbe de fusion.

3. Pour la quantification intragénique de l’eARN, analysez à la fois le Tbp (ou autre gène de contrôle/conservation) et la région d’amplificateur intragénique à l’aide d’ADNc synthétisé avec des amorces oligo(dT). Pour les ARNe intergéniques, utilisez uniquement de l’ADNc synthétisé avec des amorces hexamères aléatoires (Tableau 4 et Figure 1B).
   REMARQUE : Effectuer chaque échantillon dans des doublons techniques (deux puits) afin de permettre la moyenne lors de l’analyse des données.

Nom du gène	Sonde amorce	Séquence (5'-3')	Tailles d’amplicons
À suivre	En avant	TGACTCCTGGAATTCCCATC	122 BP
	Inverse	TTGCTGCTGCTGTCTTTGTT
Nsun2_mRNA	En avant	GGATGAAGCAGTGATCGCAG	93 pb
	Inverse	ATCCACTTCAGTCCTGGCAA
Pou5f1_mRNA	En avant	TCCCTACAGCAGATCACTCAC	80 pb
	Inverse	CGCCGGTTACAGAACCATAC
Sox2_mRNA	En avant	ACAGATGCAACCGATGCACC	105 pb
	Inverse	TGGAGTTGTACTGCAGGGCG
Nsun2_eRNA	En avant	CCTGAGAGGTGTTTGCTTTGT	110 pb
	Inverse	AGGTTAACACATCAGCCCCA
Pou5f1_eRNA	En avant	CACTTCTCTGGGGTCTCTGG	107 pb
	Inverse	CCAGGACAAGACAGCCATTG
Sox2_eRNA	En avant	AGTCAGCTACATGGGCAGAG	119 BP
	Inverse	CCCCTCTTCTCACCGTACAG
Nsun2_negative contrôle	En avant	CCCCGTGTTTAAGAGGAATGA	88 pb
	Inverse	ACTGAACAACCACTACTAGCA

Tableau 4 : Séquences d’amorces pour l’analyse RT-qPCR. Séquences d’amorce avant et arrière utilisées pour l’amplification spécifique de chaque gène cible dans les expériences RT-qPCR. Ces amorces ont été optimisées pour assurer une quantification précise de l’expression de l’ARNm et de l’ARNe.

5. Analyse des données de stabilité de l’ARNe ^{. 22}

1. Analysez toutes les données à l’aide de la méthode ΔCt, et normalisez les niveaux relatifs d’ARNe-eRNA par rapport à Tbp_mRNA (Fichier supplémentaire 1 et Figure 2A).
   REMARQUE : Si la différence de valeur de Ct entre deux réplications techniques dépasse 0,5, excluez les données de l’analyse ultérieure. Calculez les niveaux relatifs d’expression génique en utilisant la méthode ΔCt en soustrayant la valeur Ct du gène témoin (par exemple, Tbp_mRNA) de celle du gène cible (ΔCt = Control_Ct - Target_Ct). L’expression relative peut alors être calculée en 2^-ΔCt (fichier supplémentaire 2B).
2. Pour la quantification intragénique de l’eARN, normaliser les valeurs d’expression en divisant les valeurs de l’ADNc synthétisé à l’aide d’hexamères aléatoires par celles de l’ADNcDNA synthétisé à l’aide d’amorces oligo(dT).
   REMARQUE : Effectuer toutes les réactions qPCR en utilisant trois réplications biologiques indépendantes (n = 3).
3. Normalisez le niveau d’expression de chaque point temporel (obtenu viala méthode ΔCt) à la valeur de 0 min et tracez la courbe de désintégration.
   REMARQUE : Bien que ce protocole utilise un traitement court à l’Actinomycine D, une exposition prolongée aux inhibiteurs de la transcription (par exemple, ActD) peut également réduire l’expression génique de maintien de la maison. Pour une quantification plus précise, nous recommandons d’ajouter un ARN exogène à spik-in (par exemple, ERCC) à l’étape de lyse cellulaire afin de corriger les variations d’efficacité d’extraction d’ARN, d’efficacité de transcription inverse et de précision de pipetteur, permettant ainsi une normalisation plus cohérente entre les^{échantillons 38,39}.
4. Tracez les niveaux d’eRNA normalisés au fil du temps et ajustez-les à l’aide d’un modèle de régression non linéaire (désintégration exponentielle monophasique) dans GraphPad Prism (Fichier Supplémentaire 3).
5. Estimer la demi-vie des ARNe-e-ris à partir de réplications biologiques individuelles.
   1. Ouvrez GraphPad Prism et sélectionnez Créer > XY (Options : X = Nombres ; Y = Entrer et tracer une seule valeur Y pour chaque point).
   2. Entrez les points temporels (0, 5, 10, 15, 20 et 30 min) sous forme de valeurs sur l’axe X.
   3. Listez les noms d’échantillons sur l’axe Y (Groupe) et entrez la valeur de données correspondante pour chaque moment temporel.
   4. Sélectionnez Analyser > régression et courbes > régression non linéaire (ajustement de courbe).
   5. Dans l’onglet Exponentiel , sélectionnez le modèle de désintégration monophasée .
   6. Dans la feuille Tableau vers les résultats , calculez la moyenne et l’écart-type des valeurs de demi-vie pour chaque échantillon à l’aide d’Excel ou d’un logiciel similaire. Tracez les valeurs résultantes.
6. Ajustez les courbes de désintégration avec des intervalles de confiance à 95 %
   1. Ouvrez GraphPad Prism et sélectionnez Créer > XY (Options : X = Nombres ; Y = Entrer 3 valeurs réplicatives dans des sous-colonnes côte à côte).
   2. Entrez les points temporels (0, 5, 10, 15, 20 et 30 min) sous forme de valeurs sur l’axe X.
   3. Listez les noms des échantillons sur l’axe Y (Groupe) et entrez les trois valeurs réplicatives pour chaque échantillon d’ARNe dans la fiche technique correspondante.
   4. Sélectionnez Analyser > régression et courbes > régression non linéaire (ajustement de courbe).
   5. Dans l’onglet Exponentiel , sélectionnez le modèle de désintégration monophasée pour analyse.
   6. Dans la feuille Tableau à Résultats, extraire les valeurs de l’intervalle de confiance (IC) à 95 % obtenues à partir de l’analyse des échantillons tripliqués.
      REMARQUE : Utilisez l’équation de désintégration suivante : Y = (Y₀ - Plateau) • ^e-kt + Plateau, où Y est le niveau relatif d’ARNe au temps t, Y₀ est le niveau initial de l’ARNe, et k est la constante de désintégration. Ne fixez pas le plateau à zéro lors de l’ajustement de la courbe d’ARNe, car des études antérieures montrent que l’eARN peut persister et ne pas se dégrader complètement au fil du^{temps 17,40}. Cependant, fixez le plateau à zéro lors de l’analyse de la désintégration de l’ARNm, en suivant les protocoles précédents^41,42. Permettez à GraphPad Prism de calculer automatiquement la demi-vie de l’ARNe (t₁/₂) en utilisant la formule : t_1/2 = In(2)/k. Entrer le temps en min ; Rapporter les valeurs de demi-vie résultantes en minimum.

Results

Pour évaluer la stabilité de l’ARN après un arrêt transcriptionnel, les mESC ont été traités avec actD, et l’ARN total a été collecté à des moments définis (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min et 30 min). Après la synthèse de cDNA, la RT-qPCR a été réalisée pour quantifier l’ARNe-e-intragénique de Nsun2 et Sox2, l’ARNe-e-intergénique de Pou5f1, ainsi que leurs ARNm correspondants. Ces données ont été utilisées pour générer des ...

Discussion

Ce protocole décrit une méthode fiable et reproductible pour mesurer la stabilité de l’ARNe-e-M dans les mESC. Des étapes expérimentales cruciales, incluant la culture cellulaire, le traitement à l’actinomycine D, l’extraction d’ARN et la quantification RT-qPCR, sont clairement illustrées dans les figures et les fichiers complémentaires pour guider les utilisateurs tout au long du flux de travail. De plus, des procédures analytiques détaillées telles que la modélisation de régression non...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoéthanol	Gibco	21985023
Actinomycine D	Sigma-Aldrich	A9415
Chloroforme	Daejung Chemicals	2548-4105
DMSO	GenDEPOT	D2680
Sérum fœtal bovin (FBS)	Sigma-Aldrich	F0392
Gélatine	Sigma-Aldrich	G1890-100G
Glasgow s Médium Essentiel Minimum (GMEM)	Gibco	11710035
GraphPad Prism (version 9)	Logiciel GraphPad
Isopropanol	Daejung Chemicals	5035-4105
Remplacement du sérum KnockOut (KOSR)	Gibco,  ;	10828028
Facteur inhibiteur de la leucémie (LIF)	Merck	ESG1106
Solution d’acides aminés non essentiels du MEM (MnEA)	Welgene	LS005
Kit de synthèse d’ADNc M-MLV   ;	Enzynomique	EZ006S
OPTIZEN NanoQ Plus  ;	KLAB	01-QI685-M-16-C
Pénicilline-streptomycine	Welgene	LS202-02
Power SYBR-Green PCR master mix  ;	Biosystèmes appliqués	4368708
QuanStudio1 Système PCR en temps réel   ;	Biosystèmes appliqués	A40425
Pyruvate de sodium	Welgene	LS013
TRIzol  ;	Invitrogen	15596018