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Génie épigénétique des cellules K562 : stratégie épisomale à double vecteur pour la méthylation ciblée stable de l’ADN à l’aide des protéines de fusion dCas9-DNMT3A et -HDAC1

DOI :

10.3791/69328

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31 octobre 2025

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1Biology Laboratory, School of Science and Technology, Hellenic Open University, 2Division of Pharmacology and Biosciences, Department of Pharmacy, School of Health Sciences, University of Patras

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit un système non intégratif, épisomal, basé sur CRISPR/dCas9 pour l’édition épigénétique ciblée dans les cellules K562, combinant des effecteurs dCas9-DNMT3A et dCas9-HDAC1 avec des sgRNA spécifiques pour induire une méthylation de l’ADN spécifique au locus avec précision et des effets hors cible réduits.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’étude du rôle précis de la méthylation de l’ADN dans la régulation transcriptionnelle des gènes et le développement de thérapies ciblant des modèles spécifiques de méthylation génique présentent des défis importants en raison de la rareté des outils polyvalents capables d’induire des modifications épigénétiques spécifiques au site et à long terme pour moduler l’expression des gènes. L’étude visait à développer et à valider un système épisomique innovant pour faciliter la méthylation stable de l’ADN au niveau d’un locus génique ciblé, potentiellement utile à la fois pour la recherche épigénétique fondamentale et pour les applications thérapeutiques. Pour ce faire, la lignée cellulaire K562 a été co-transfectée avec deux vecteurs épisomaux distincts. Les deux types de vecteurs ont été modifiés pour exprimer des ARN guides (ARNg) ciblant une région non méthylée de 367 pb au sein de l’îlot CpG 326, situé en amont du gène ZBTB7A . Chaque vecteur a codé une forme désactivée d’endonucléase Cas9 (morte ou dCas9) fusionnée soit avec le domaine catalytique de l’ADN méthyltransférase DNMT3A (dCas-DNMT3A-CD), soit avec l’histone désacétylase pleine longueur HDAC1 (dCas-HDAC1). La séquence dCas comprenait deux signaux de localisation nucléaire (NLS) pour assurer l’importation nucléaire de la protéine. Cette cassette d’expression à double système favorise un état de chromatine potentiellement propice au silençage épigénétique à long terme, promettant des résultats épigénétiques robustes et durables. Cette approche intermédiaire de l’épigénome de l’hôte via l’utilisation de vecteurs épisomiques auto-réplicatifs offre plusieurs avantages : la maintenance et l’expression de vecteurs à faible nombre de copies tout au long de plusieurs divisions cellulaires sans intégration dans le génome de l’hôte, minimisant ainsi les effets hors cible et préservant l’intégrité du génome. Nous rapportons l’augmentation précise et significative de la méthylation de l’ADN au niveau de l’îlot 326 cible de ZBTB7A CpG. Les résultats confirment que les systèmes épisomaux CRISPR/dCas modifiés peuvent provoquer une méthylation de l’ADN durable et spécifique au site. Par conséquent, ce système est un outil de recherche précieux pour évaluer les effets fonctionnels des changements de méthylation ciblés et une plate-forme prometteuse pour développer de futurs traitements épigénétiques.

Introduction

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La régulation épigénétique, y compris la méthylation de l’ADN et les modifications des histones, joue un rôle central dans le contrôle de l’expression des gènes, de la différenciation cellulaire et de la stabilité du génome. La dérégulation de ces mécanismes est souvent impliquée - soit en tant que cause soit conséquence - dans divers états pathologiques, en particulier dans le cancer, les troubles neurologiques et les syndromes d’empreinte1,2,3. Notamment, en intervenant précisément dans le paysage épigénétique à des loci génomiques spécifiques à l’aide de la technologie CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), des niveaux de répression génique comparables à ceux observés dans les modèles d’inactivation de gènes peuvent être atteints, sans altérer la séquence d’ADN sous-jacente4. En conséquence, l’édition épigénétique ciblée est apparue comme une stratégie prometteuse pour disséquer les mécanismes de régulation des gènes et développer des thérapies de précision.

Les inhibiteurs de l’ADN méthyltransférase (DNMT) et les inhibiteurs de l’histone désacétylase (HDAC) sont des thérapies épigénétiques actuellement approuvées pour un usage clinique. Cependant, ces agents ciblent de manière non sélective les marqueurs épigénétiques du génome, modifiant les états globaux de la chromatine, provoquant des effets hors cible et une toxicité chez les patients5. Pour remédier aux limites des agents d’altération épigénétique traditionnels, des éditeurs épigénétiques programmables basés sur Cas9 catalytiquement mort (dCas9) fusionnés à des domaines effecteurs, tels que les ADN méthyltransférases (par exemple, DNMT3A), les déméthylases (par exemple, TET1), les histones acétyltransférases (par exemple, p300) ou les désacétylases (par exemple, HDAC3), ont été développés 6,7,8,9 . Le système effecteur dCas9 permet de modifier l’épigénome spécifique au locus guidé par une petite molécule d’ARN, connue sous le nom d’ARN monoguide (ARNsg), sans introduire de cassures double brin au niveau de la séquence cible. Des études récentes ont démontré leur utilisation dans la modification de l’expression des gènes, le remodelage de l’accessibilité de la chromatine et même la reprogrammation des phénotypes cellulaires 10,11,12.

Malgré des progrès rapides, les systèmes d’ingénierie épigénomique basés sur dCas9 continuent de faire face à certaines limitations. Le défi le plus courant est les effets hors cible dus à la non-spécificité des domaines effecteurs épigénétiques, en particulier avec une expression forte ou prolongée des outils de fusion dCas913,14. De plus, la grande taille des fusions dCas9 présente des défis importants en matière de livraison. La taille de la séquence Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9) est d’environ 4,2 kb15, ce qui est comparable à la capacité maximale des vecteurs de virus adéno-associés (AAV). Bien que les vecteurs lentiviraux aient une capacité relativement grande (~12-1 kb), permettant l’administration de la fusion complète de SpCas9 avec des effecteurs épigénétiques, ils conservent la possibilité d’une intégration génomique aléatoire, risquant de provoquer une mutagenèse insertionnelle et de limiter leurs applications cliniques16. D’autre part, les approches non virales telles que la transfection plasmidique souffrent d’une faible rétention dans les cellules en division. Les approches d’administration transitoires ou « it-and-run » excluent la possibilité d’intégration génomique, mais échouent souvent à soutenir les changements de méthylation à travers les divisions cellulaires, à moins qu’elles ne soient combinées avec des remodeleurs de la chromatine ou des effecteurs coopératifs 17,18,19.

Pour relever ces défis, nous avons utilisé un système de vecteurs épisomaux non intégratifs et auto-réplicatifs (pEPI-S/MAR) pour administrer des effecteurs épigénétiques fusionnés avec dCas9. Ce vecteur persiste extrachromosomiquement dans les cellules en division à un faible nombre de copies (~1-2 par cellule), permettant une expression soutenue mais modérée, afin de minimiser les fonctions indésirables associées à la surexpression20,21. L’élément S/MAR (S/MAR) de l’épisome interagit avec la matrice nucléaire, contribuant au maintien stable de l’épisome dans le noyau cellulaire pendant la divisioncellulaire 22,23. De plus, le système de vecteurs pEPI évite les risques associés à l’intégration virale et permet la livraison de constructions sans dépasser les limites d’emballage.

Des études récentes ont montré que les régions promotrices marquées par des modifications actives des histones, en particulier l’acétylation de H3K27 (H3K27ac), sont souvent résistantes à la méthylation de l’ADN modifiée. Il a été démontré que les approches combinatoires qui suppriment ou ajoutent des marques d’histones à l’aide d’enregistreurs ou d’effaceurs de modifications d’histones et introduisent simultanément la méthylation de l’ADN via DNMT3A augmentent la stabilité et la persistance de la répression génique, même dans les approches transitoires19,24. Sur la base de ces informations, nous avons émis l’hypothèse que la co-administration de dCas9-HDAC1 et dCas9-DNMT3A et le ciblage des zones génétiques voisines favoriseraient le remodelage de la chromatine et faciliteraient une méthylation plus efficace et durable au niveau des éléments régulateurs cibles.

Dans cette étude, nous avons cherché à concevoir et à construire un système capable de fournir une méthylation ciblée et stable de l’ADN à l’îlot CpG 326 de ZBTB7A, une région caractérisée par une faible méthylation endogène et des marques H3K27ac aberrantes dans les cellules K562. L’objectif de cette étude était de fournir deux constructions épisomiques codant pour dCas9 fusionnées à chacun des effecteurs épigénétiques distincts, ainsi que des ARNsg, ciblant la région régulatrice riche en CpG en amont du gène ZBTB7A en utilisant le système pEPI non intégratif, stable et à faible expression. Comme illustré sur la figure 1, la co-transfection des cellules K562 avec ces épisomes permet le double recrutement des complexes d’édition vers l’îlot CpG d’intérêt, où HDAC1 supprime l’acétylation locale des histones pour faciliter la méthylation ultérieure de l’ADN par DNMT3A, entraînant une modification épigénétique coordonnée et spécifique au site.

Le système décrit ici convient aux applications où l’administration virale n’est pas réalisable en raison de la taille de la construction, de problèmes de sécurité ou de limitations de coûts. Il prend en charge le clonage modulaire de différents ARNsg et fusions effectrices, ce qui le rend adaptable à une gamme de loci cibles. Il est actuellement le mieux adapté aux études in vitro ou précliniques dans des lignées cellulaires qui tolèrent la transfection plasmidique et la sélection d’antibiotiques. Dans notre mise en œuvre, l’administration épisomale dans les cellules K562 a été réalisée à l’aide de réactifs à base de lipofectamine et maintenue sous sélection G-418.

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Protocole

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1. Conception des ARNsg

  1. Identifiez l’îlot CpG souhaité ou les sites CpG régulateurs dans la région promotrice du gène d’intérêt à l’aide d’un navigateur génomique (par exemple, navigateur génomique UCSC). Ici, le design a été appliqué sur l’îlot CpG 326 (GRCh38) du gène ZBTB7A .
  2. Concevez des ARN guides uniques (ARNsg) à l’aide d’une plateforme de conception d’ARNg CRISPR en ligne [p. ex., l’outil Web CHOPCHOP (version 3)]. Lors de la conception d’ARNsg, suivez les recommandations ci-dessous pour garantir une activité élevée sur la cible et des effets hors cible minimaux :
    1. Sélectionnez la protéine SpCas9 comme endonucléase, en utilisant 5'-NGG-3' comme motif adjacent protospacer à l’extrémité 3' (PAM-3').
    2. Choisissez la longueur de l’ARNsg à 20 pb (en plus de la séquence PAM). Autoriser les correspondances hors cible avec seulement trois incohérences dans la séquence du protospacer.
    3. Lorsque vous choisissez de cibler une région spécifique du gène, choisissez l’option « Promoteur » et définissez la plage en amont (par exemple, de 1500 pb à 3000 pb en amont pour l’îlot CpG 326) pour positionner les ARNsg dans la région régulatrice.
    4. Utilisez des scores d’efficacité ciblés tels que ceux développés par Doench et al.25 pour évaluer l’activité de l’ARNsg.
  3. Lorsque vous choisissez des ARNsg à des fins expérimentales, tenez compte des critères suivants :
    1. Classez tous les ARNsg candidats en fonction de leur efficacité pour la région cible. Choisissez des ARNsg dans les 10 à 20 % supérieurs de l’efficacité prévue. Lors du choix, évitez les ARNsg présentant des mésappariements (MM0, MM1, MM2, MM3) sur des sites potentiellement hors cible.
    2. Choisissez des ARNsg qui ciblent des zones à l’origine non méthylées ou faiblement méthylées pour la répression transcriptionnelle à l’aide de dCas9-DNMTs. Pour la répression transcriptionnelle à l’aide de dCas9-HDACs, ciblez les régions fortement acétylées pour une efficacité accrue. Utilisez des bases de données en ligne (p. ex., ChIP-Atlas) pour confirmer la méthylation de l’ADN et les marques d’acétylation des histones dans les cellules K562 aux loci cibles.
    3. Utilisez plusieurs ARNsg pour couvrir les régions cibles supérieures à 100-200 bp26.
      REMARQUE : Les modifications épigénétiques (méthylation et désacétylation) influencent les régions en amont et en aval du site de liaison de l’ARNsg, et ces effets peuvent être limités à de courtes périodes génomiques.
    4. Choisissez des ARNsg dont la teneur en GC est comprise entre 40 % et 80 %.
      REMARQUE : La teneur en GC de l’ARNsg est importante, car une teneur plus élevée en GC améliore la stabilité de l’ARN et la liaison dCas.
    5. Évitez les ARNsg contenant des tronçons de quatre thymidines (Ts) ou plus et choisissez des ARNsg avec des nucléotides d’adénine ou de thymine situés à quatre bases en amont du site PAM.
      REMARQUE : Quatre T ou plus peuvent entraîner une terminaison prématurée de la transcription. Les ARNsg dont A ou T sont situés à quatre bases en amont du site PAM peuvent présenter une liaison dCas plus forte.
    6. Vérifiez et évitez les ARNsg à forte auto-complémentarité pour minimiser le risque de formation de structures secondaires.
    7. Finaliser la sélection de quelques séquences d’ARNsg.
      REMARQUE : Quatre ARNsg ont été conçus pour couvrir l’îlot CpG 326. Les séquences cibles de l’ARNsg 1-4 et les positions cibles sur l’îlot CpG 326 sont présentées dans le tableau supplémentaire 1.
  4. Transformer la séquence d’ARNsg de son choix (à l’exclusion du triplet PAM) en son complément inverse. Ajoutez GATCG à l’extrémité 5' de la séquence avant et G à son extrémité 3', et AAAAC à l’extrémité 5' de la séquence complémentaire inverse et C à son extrémité 3'. Commandez les deux oligonucléotides finaux pour chaque ARNsg auprès d’un fournisseur commercial d’oligonucléotides.

2. Clonage

REMARQUE : Cette section décrit l’adaptation du plasmide pEPI-1 pour générer des vecteurs épisomaux portant à la fois la fusion effectrice épigénétique dCas-dCas, et les cassettes d’expression de l’ARNg. Reportez-vous à la figure 2 pour une vue d’ensemble complète du flux de travail de clonage et de l’architecture vectorielle. Toutes les réactions de restriction et de ligature décrites ci-dessous ont été effectuées conformément aux protocoles recommandés par le fabricant pour chaque enzyme et réactif utilisé, et les spécifications de réaction sont énumérées en détail dans le tableau supplémentaire 2.

  1. Digérer le plasmide pEPI-1 à l’aide d’AgeI et de BspEI, qui flanquent la séquence codante eGFP (enhanced green fluorescent protein). Après la digestion par restriction, émousser les surplombs résultants à l’aide du fragment de Klenow de l’ADN polymérase I. Liguer le squelette plasmidique à extrémité émoussée à l’aide de l’ADN ligase T4 pour générer le vecteur supprimé de l’eGFP.
    REMARQUE : La délétion du gène eGFP est effectuée pour réduire la taille globale du vecteur. Une taille de vecteur plus grande peut limiter les étapes de clonage et de transfection en aval.
  2. Obtenir les séquences codantes pour le domaine catalytique (CD) du gène DNMT3A et la longueur entière du gène HDAC1 . Ajouter un codon d’arrêt à l’extrémité 3' (en aval) de chaque séquence de codage. Ajouter les sites de restriction BglII (5') et AseI (3') flanquant les séquences.
  3. Digérer le vecteur pEPI-1 supprimé par eGFP avec BglII et AseI. Séparément, digérer les séquences codantes DNMT3A(CD) et HDAC1 préparées avec les mêmes enzymes. Effectuez deux réactions de ligature indépendantes :
    1. Comparez le fragment DNMT3A(CD) dans le vecteur digéré pour générer la construction pEPI-1-DNMT3A.
    2. Lister le fragment HDAC1 dans le vecteur digéré pour générer la construction pEPI-1-HDAC1.
      REMARQUE : Les sites BglII et AseI placent les inserts en aval du promoteur du pCMV et en amont de l’élément S/MAR pour une expression optimale.
  4. Transformer Escherichia coli chimiquement compétent (p. ex., NEB 5-alpha Competent E. coli, High Efficiency) avec les produits de ligature de chaque vecteur séparément. Placez les cellules transformées sur une gélose LB contenant de la kanamycine (50 μg/mL) et incubez toute la nuit à 37 °C. Sélectionnez les colonies positives et isolez l’ADN plasmidique à l’aide de la méthode miniprep à ébullition rapide27,28.
  5. Obtenez la séquence codant pour le SpCas9 catalytiquement mort (dCas9). Introduisez les éléments suivants dans l’ordre spécifié :
    1. À l’extrémité 5' : site de restriction Asci, séquence de consensus de Kozak et codon de départ (ATG).
    2. À l’extrémité 3' : NLS, éventuellement un HA-tag, suivi d’un site de restriction BamHI.
  6. Digérer les vecteurs pEPI-1-DNMT3A et pEPI-1-HDAC1 avec AscI et BamHI. Effectuez la même digestion sur l’insert dCas9. Lister le fragment dCas9 dans chaque vecteur respectif.
    REMARQUE : Les sites AscI/BamHI garantissent que dCas9 est inséré en amont de DNMT3A ou HDAC1, directement en aval du promoteur du pCMV. Assurez-vous qu’un court linker ou quelques nucléotides sont présents entre dCas9 et l’effecteur épigénétique pour maintenir le cadre de lecture correct.
  7. Transformer les produits finaux de ligature en souches d’E. coli compétentes à haut rendement avec un contrôle strict de l’expression plasmidique (p. ex., NEB 5-alpha F’Iq Competent E. coli, High Efficiency). Sélectionnez les transformants sur les plaques de kanamycine. Préparez de l’ADN plasmidique de haute qualité à partir de clones positifs à l’aide de la méthode miniprep à ébullition rapide.
  8. Séquencez les constructions plasmidiques finales (pEPI-1-dCas9-DNMT3A et pEPI-1-dCas9-HDAC1) à l’aide du séquençage par nanopores pour confirmer l’assemblage correct de tous les composants, vérifiez le cadre de lecture à l’aide d’un outil de traduction en ligne (par exemple, l’outil de traduction Expasy 3.0) et vérifiez les mutations potentielles ou les événements de recombinaison à l’aide d’un outil d’alignement en ligne (par exemple, l’outil d’alignement BLAST).
    REMARQUE : Les vecteurs de grande taille sont plus sujets à la recombinaison et peuvent accumuler des mutations. Par conséquent, une validation approfondie des séquences est essentielle.
  9. Phosphoryler les groupes hydroxyles 5' des oligonucléotides d’ARNsg avant et inverse à l’aide de la polynucléotide kinase T4. Hybridez les deux brins complémentaires en chauffant le mélange à 90 °C pendant plusieurs minutes pour dénaturer les structures secondaires, puis laissez refroidir progressivement à température ambiante pendant la nuit pour un recuit complet en ADN double brin.
  10. Digérer le vecteur d’expression de l’ARNsg pGuide sélectionné avec BamHI et Esp3I. Liférez le fragment d’ARNsg double brin recuit dans le vecteur linéarisé à l’aide de l’ADN ligase T4.
  11. À l’aide d’amorces PCR spécifiques (tableau supplémentaire 3), amplifier la cassette d’expression complète de l’ARNg comprenant (1) le promoteur U6, (2) la séquence clonée de l’ARNsg et (3) l’échafaudage de l’ARNg. Utilisez une ADN polymérase haute fidélité qui ne génère pas de surplombs de 3' (c’est-à-dire une polymérase de relecture) pour garantir des produits PCR propres et émoussés adaptés au clonage en aval.
  12. Répétez les étapes 2.9 à 2.11 pour chaque ARNg individuel conçu dans la section 1. Assurez-vous que chaque cassette d’ARNg est préparée et amplifiée séparément pour préserver la spécificité de la cible.
  13. Digérer les vecteurs pEPI-1-dCas9-DNMT3A et pEPI-1-dCas9-HDAC1 avec SacII. Émoussez les extrémités collantes à l’aide du fragment de Klenow de l’ADN polymérase I. Clonez les cassettes d’échafaudage du promoteur U6-ARNsg précédemment amplifiées dans ces vecteurs à l’aide de la ligase T4.
    REMARQUE : Plusieurs combinaisons ARNg-effecteurs épigénétiques (par exemple, sgRNA1-dCas9-DNMT3A, sgRNA2-dCas9-HDAC1, etc.) ont été construites au cours de la phase expérimentale. Cependant, seules deux combinaisons sélectionnées ont été retenues pour les expériences présentées dans les sections suivantes.
  14. Transformer les produits finaux de ligature en souches d’E. coli compétentes à haute efficacité avec un contrôle strict de l’expression plasmidique. Sélectionnez les transformants sur les plaques de kanamycine. Préparez de l’ADN plasmidique de haute qualité à partir de clones positifs à l’aide de la méthode miniprep à ébullition rapide.
  15. Séquencez les constructions plasmidiques finales à l’aide du séquençage des nanopores, vérifiez le cadre de lecture et vérifiez les mutations potentielles ou les événements de recombinaison.

3. Culture cellulaire et transfection

  1. Maintenir les cellules K562 dans les flacons de culture T-75 à 37 °C, dans des conditions de 5 % de CO2 et d’humidité. Utilisez le milieu modifié Eagle de Dulbecco (DMEM) complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), une solution de pénicilline/streptomycine (Pen/Streptomycine) à 1× de sante.
  2. Préparez les plasmides pour la transfection :
    1. Utilisez 8 μg d’ADN plasmidique total par transfection, donc 4 μg de chaque plasmide pour une co-transfection de deux plasmides. Quantifiez l’ADN à l’aide de l’absorbance à 260 nm, puis diluez la quantité requise dans 90 μL d’eau ultra-pure.
    2. Ajouter 10 μL de solution d’acétate de sodium 3 M et 2,5 volumes d’éthanol à 100 % à l’ADN dilué.
    3. Bien mélanger et incuber à -20 °C pendant la nuit pour précipiter l’ADN.
      REMARQUE : Lors de la co-transfection de deux plasmides avec des combinaisons distinctes d’ARNg et d’effecteurs épigénétiques (par exemple, gRNA1-dCas9-DNMT3A et gRNA2-dCas9-HDAC1), il est recommandé de combiner les deux plasmides dans le même tube de précipitation afin de simplifier la manipulation des procédures en aval.
    4. Le lendemain, centrifuger les tubes de précipitation d’ADN à 11 000 × g pendant 15 min à 4 °C.
      REMARQUE : Effectuez toutes les étapes subséquentes dans des conditions stériles dans une enceinte de biosécurité, car cette étape impliquera également la manipulation de cellules vivantes.
    5. Jetez soigneusement le surnageant. Ajoutez 500 μL d’éthanol à 70 % pour laver la pastille. Centrifugeuse à 11 000 × g pendant 5 min à 4 °C.
    6. Retirez complètement le surnageant d’éthanol. Laissez les granulés sécher à l’air libre jusqu’à ce qu’il ne reste plus d’éthanol visible.
    7. Remettez complètement en suspension la pastille d’ADN séchée dans 50 μL de DMEM. Maintenir la solution de plasmide-DMEM à 4 °C jusqu’à l’utilisation.
    8. Exécutez 400 ng de l’ADN épisomal préparé (environ 2,5 μL de la solution remise en suspension) sur un gel d’agarose à 1 % pour vérifier le succès de la purification et l’intégrité de l’ADN avant la transfection.
  3. Préparez les cellules :
    1. Récoltez les cellules K562 d’un flacon T-75 lorsque les cultures atteignent une confluence de 50 à 60 % pour assurer l’efficacité de la transfection.
    2. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Transférez un volume contenant 2 × 105 cellules dans une boîte de culture de 35 mm contenant 900 μL de DMEM sans FBS ni antibiotiques.
      REMARQUE : Utilisez du DMEM sans sérum pour toutes les étapes de la procédure de transfection. Ne reprendre les conditions de culture du milieu complet qu’après la fin de la période d’incubation de transfection.
    3. Placez la boîte dans l’incubateur (37 °C, 5 % CO2) pour maintenir les cellules prêtes pour la transfection.
  4. Utilisez un kit de transfection à base de lipofectamine pour l’administration du plasmide. Suivez les instructions du fabricant pour le kit spécifique utilisé, en ajustant les volumes si nécessaire.
    1. Ajouter 3 μL de réactif P3000 (fourni dans le kit de transfection) à la solution de plasmide-DMEM préparée. Mélangez doucement et incubez le mélange de réactifs plasmid-P3000 à température ambiante pendant 5 min.
    2. Ajouter 5 μL de réactif Lipofectamine 3000 (fourni dans le kit de transfection) avec suffisamment de DMEM pour atteindre un volume de réaction total de 100 μL. Incuber à température ambiante pendant 15 min.
    3. Ajouter la totalité du mélange de transfection de 100 μL dans la boîte de 35 mm contenant les cellules. Secouez doucement la plaque pour disperser le mélange, puis remettez le plat dans l’incubateur.
  5. 24 h après la transfection, ajouter 3 ml de milieu complet (DMEM complété par 10 % de FBS et 1× Pen/Strep) dans chaque boîte de 35 mm pour initier la prolifération des cellules transfectées. 72 heures après la transfection, commencer la procédure de sélection en ajoutant l’antibiotique G-418 à une concentration finale de 1 mg/mL.
  6. Une fois que la sélection est correctement établie et que le nombre total de cellules dépasse 1 × 106, procéder à l’isolement des clones uniques (Figure 3A) à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) :
    1. Récoltez les cellules par centrifugation à 300 × g pendant 6 min à 25 °C. Laver une fois avec 1× solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS, pH ~7,4) et centrifuger à nouveau dans les mêmes conditions.
    2. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1× PBS et déterminer la concentration cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre. Diluer la suspension à 1 × 106 cellules/mL, en assurant une remise en suspension complète.
    3. Configurez le FCS plus court en mode unicellulaire (garantit 1 cellule par gouttelette), en utilisant une plaque traitée par culture tissulaire à 96 puits comme dispositif de collecte. Ajustez les paramètres du logiciel si nécessaire, en fonction de l’instrument utilisé (Figure 3B).
    4. Gate la population primaire en fonction de la taille attendue (FSC) et de la granularité (SSC). Exclure les débris (FSC/SSC faible) et les matériaux très granulaires ou morts (SSC élevé). Utilisez les diagrammes à points FSC-A et FSC-H ou SSC-A et SSC-H pour les singuets de porte.
    5. Préremplissez la plaque de 96 puits avec 100 μL de milieu complet contenant 1 mg/mL de G-418 par puits. Réchauffez la plaque dans l’incubateur avant de la trier.
    6. Effectuez le tri en mode cellule unique, en maintenant un taux de tri inférieur à 300 événements/seconde pour améliorer la précision du tri.
    7. Après le tri, inspectez les puits au microscope pour confirmer une cellule par puits. Placez la plaque dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2.
  7. Permettez aux clones unicellulaires de se développer individuellement dans la plaque de 96 puits. Une fois la croissance clonale établie, réduire la concentration de G-418 à 400 μg/mL pour maintenir la sélection.
  8. Transférez séquentiellement les clones en bonne croissance sur des plaques à 12 puits, puis dans des flacons T-25 et enfin T-75 selon les besoins, jusqu’à ce que chaque clone atteigne ~1 × 106 cellules.
  9. Collectez les granulés à double cellule à intervalles réguliers. Conservez une pastille à -20 °C pour l’extraction de l’ADN génomique. De plus, conservez une pastille homogénéisée dans 500 μL de réactif Trizol à -20 °C pour l’extraction de l’ARN et la synthèse de l’ADNc.
    ATTENTION : Le réactif Trizol doit être manipulé avec prudence en raison de sa toxicité et de sa nature corrosive dans une hotte chimique tout en portant un équipement de protection individuelle, et les matériaux contaminés doivent être étiquetés pour l’élimination des déchets dangereux.
  10. Extraire l’ADN génomique de clones sélectionnés à l’aide de l’extraction traditionnelle au phénol-chloroforme, suivie d’une précipitation à l’éthanol.
    ATTENTION : Le phénol :chloroforme est toxique et corrosif, et doit être manipulé dans une hotte chimique tout en portant un équipement de protection individuelle. Éliminer les déchets contenant du phénol et du chloroforme comme des déchets chimiques dangereux.
  11. Assurez-vous que l’ADN est entièrement remis en suspension dans de l’eau exempte de nucléases ou un tampon TE. Mesurez la concentration et la pureté de l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre avant de passer aux applications en aval.
    REMARQUE : Cet ADN sera utilisé dans des expériences en aval telles que la PCR et le pyroséquençage pour évaluer l’efficacité de l’édition épigénétique.
  12. Extraire l’ARN total des cuillers cellulaires à l’aide du réactif Trizol, suivi d’une précipitation d’isopropanol29. Manipulez les échantillons d’ARN avec prudence en vous assurant que les réactifs et les produits jetables sont exempts de RNase et en maintenant les échantillons à 4 °C pendant la procédure.
    REMARQUE : L’ARN total sera utilisé pour la synthèse de l’ADNc à l’aide d’un kit de transcription inverse.

4. PCR pour confirmer la présence des deux épisomes dans les clones

  1. Récoltez environ 5 × 105 cellules de chaque clone de culture, après avoir soigneusement remis les cellules en suspension. Centrifugeuse à 7 000 x g pendant 3 min à 25 °C. Jeter le milieu surnageant.
  2. Laver la cellule en la remettant en suspension dans 1× PBS. Centrifugez à nouveau dans les mêmes conditions.
  3. Jetez le surnageant en laissant un petit volume, juste au-dessus du niveau des granulés. Utilisez 1 μL de suspension cellulaire directement comme modèle pour la PCR.
  4. Vous pouvez également utiliser 200 ng d’ADN génomique purifié extrait des clones transfectés.
    REMARQUE : La PCR directe à partir de cellules lavées fournit une méthode de dépistage rapide, mais peut donner des résultats variables. Pour une spécificité et une sensibilité plus élevées, utilisez de l’ADN génomique purifié comme matrice.
  5. Préparez le mélange maître PCR conformément au tableau 1.
  6. Utilisez deux séries d’amorces, avec une amorce directe commune ciblant la séquence dCas9 et des amorces inverses distinctes spécifiques à chaque vecteur effecteur épigénétique (tableau supplémentaire 3).
  7. Suivez les conditions de cyclisme présentées dans le tableau 2.
  8. Exécutez des produits de PCR sur gel d’agarose ou analysez-les par électrophorèse capillaire pour vérifier les tailles de produit : 230 pb pour le vecteur contenant DNMT3A et 205 pb pour le vecteur contenant HDAC1 (Figure 3C). Inclure un témoin positif (mélange des deux plasmides à une concentration de 10 à 20 ng) pour confirmer les tailles de bande attendues et valider l’efficacité de la PCR. Incluez un contrôle sans modèle (NTC).
RéactifConcentration/quantité finale
10× Tampon1×
Apprêt avant1 μΜ
Amorces inversées0,5 μM
ADN200 ng
Polymérase1,25 U
dNTP200 μM chacun
Eau, sans nucléasesà 50 μL

Tableau 1 : Mélange de réaction PCR pour la vérification des épisomes.

PasTempérature, °CHeureNombre de cycles
Dénaturation initiale953 minutes1
Dénaturation9530 secondes30
Recuit5830 secondes
Extension721 minute
Prolongation finale72Durée : 5 minutes1

Tableau 2 : Conditions de cycle PCR pour la vérification des épisomes.

5. Analyse ciblée du pyroséquençage

  1. Traitez l’ADNg (1,5 μg) extrait de clones transfectés avec un kit de conversion au bisulfite selon les instructions du fabricant.
  2. Amorces de conception flanquant les sites CpG dans la zone réglementaire ciblée par les constructions. Utilisez un outil de conception d’apprêt au bisulfite dédié. Suivez ces directives de conception :
    1. Convertissez l’îlot CpG ou la région réglementaire du site CpG en version convertie au bisulfite.
    2. Concevoir une amorce directe et inverse pour l’amplification par PCR de l’ADN converti au bisulfite. Inclure une étiquette à la biotine sur un apprêt (généralement l’inverse) pour l’immobilisation sur des billes enrobées de streptavidine.
    3. Concevoir une amorce de séquençage (18-25 pb) interne au produit de PCR, en amont du premier CpG d’intérêt. En tant que région cible, sélectionnez une fenêtre de 100 pb en amont ou en aval du site de liaison de l’ARNsg pour évaluer les modifications épigénétiques locales potentielles.
    4. Évitez les sites CpG dans les séquences d’amorces pour assurer une amplification non biaisée.
    5. Choisissez une paire d’amorces avec un score logiciel Assay Design supérieur à 75 % et une note de qualité « élevée » (bleu), ce qui indique que l’analyse logicielle n’a identifié aucun problème ou préoccupation.
      REMARQUE : Pour les séquences d’amorces conçues pour cibler l’îlot CpG 326, consulter le tableau supplémentaire 3. Les amorces ont été conçues pour se lier dans les régions flanquant les sites de liaison de l’ARNsg1 et de l’ARN2, permettant le séquençage des sites CpG entourant les loci ciblés.
  3. Configurez une réaction PCR à l’aide d’une ADN polymérase à démarrage à chaud haute fidélité optimisée pour les matrices de bisulfite.
  4. Procédure de pyroséquençage :
    1. Lier des produits de PCR biotinylés à des billes de sépharose enrobées de streptavidine et isoler l’ADN simple brin à l’aide d’un poste de travail de pyroséquençage.
    2. Ajoutez l’amorce de séquençage à l’ADN simple brin dans le tampon de recuit. Chauffer le mélange à 80 °C pendant 2 min, puis le laisser refroidir progressivement à température ambiante.
    3. Effectuez des réactions de séquençage à l’aide de l’instrument de pyroséquençage et de l’ordre de distribution défini lors de la conception de l’amorce.
  5. Analyse des données :
    1. Utilisez un logiciel de pyroséquençage dédié pour quantifier le pourcentage de méthylation sur chaque site CpG.
    2. Comparez les niveaux de méthylation entre les clones transfectés et non transfectés. Évaluez l’efficacité de l’édition (Figure 3D). Envisagez d’effectuer un test t bilatéral non apparié pour comparer les niveaux de méthylation entre les témoins non traités et chaque clone transfecté à chaque site CpG individuel.

6. Synthèse de l’ADNc et PCR numérique pour l’analyse de l’expression de dCas

  1. Préparez l’ARN total (1 100 ng par réaction) extrait de clones transfectés dans 12 μL d’eau exempte de RNase. Conservez les échantillons sur de la glace.
  2. Assemblez le mélange d’élimination de l’ADN génomique sur de la glace : Mélangez 2 μL de tampon d’effacement de l’ADNg, un échantillon d’ARN contenant 1 100 ng d’ARN total et de l’eau exempte de RNase jusqu’à un volume final de 14 μL. Incuber pendant 2 min à 42 °C, puis placer sur de la glace.
  3. Préparez le mélange maître de transcription inverse sur de la glace : mélangez 4 μL de tampon RT avec 1 μL d’amorces RT, et ajoutez 1 μL de transcriptase inverse.
  4. Combinez 14 μL de mélange d’élimination de l’ADN génomique avec 6 μL de mélange maître de transcription inverse pour obtenir un volume de réaction total de 20 μL. Mélangez doucement et incubez à 42 °C pendant 15 min. Inactiver la transcriptase inverse en chauffant à 95 °C pendant 3 min.
    REMARQUE : Conservez l’ADNc à -20 °C jusqu’à nouvel ordre.
  5. Diluez l’ADNc de tous les échantillons 1:1 avec de l’eau sans nucléase. Utilisez l’ADNc dilué pour l’analyse PCR numérique en aval, à l’aide d’un système de PCR numérique avec des amorces spécifiques au dCas (tableau supplémentaire 3) :
    1. Préparez le mélange principal 4× et le mélange réactionnel conformément au tableau 3. Ajoutez de l’ADNc dilué au mélange et pipetez doucement pour assurer un mélange complet.
      REMARQUE : Configurez des réactions au moins en double pour tous les clones. Inclure un témoin négatif (ADNc provenant de cellules K562 non traitées) et un NTC.
    2. Chargez 9 μL du mélange réactionnel dans chaque puits de la plaque PCR. Configurez le système PCR en utilisant les conditions de cycle présentées dans le tableau 4.
    3. Sélectionnez le canal de colorant FAM pour la détection et démarrez l’exécution.
    4. Une fois terminé, récupérez les échantillons et analysez les données.
      REMARQUE : La PCR numérique rapporte les résultats sous forme de copies par μL de réaction.
    5. Multipliez la valeur rapportée (copies/μL) par le volume de réaction (10 μL) pour obtenir le nombre total de copies par réaction. Divisez cette valeur par la quantité d’ADNc dans la réaction pour obtenir des copies par NGNc (équivalent à l’entrée d’ARN ng).
      REMARQUE : Si le protocole exact est suivi, chaque échantillon commence avec 1 100 ng d’ARN dans une réaction RT de 20 μL (55 ng/μL). Après dilution 1:1, la concentration de travail est de 27,5 ng/μL, et comme 1 μL est ajouté à chaque réaction PCR, cela correspond à 27,5 ng d’ADNc (équivalent ARN) par réaction.
Mixage maître (4×)
RéactifConcentration/quantité finale
25× SYBR Colorant vert2×
5× Mélange PCR numérique4×
Eau, sans nucléasesà 100 μL
Mélange réactionnel
RéactifConcentration/quantité finale
4× Mixage principal1×
Apprêt avant1 μΜ
Amorce inversée1 μΜ
ADNc (dilué)1 μL
Eau, sans nucléasesà 10 μL

Tableau 3 : 4× Master mix et mélange réactionnel pour l’analyse PCR numérique de l’expression de dCas.

PasTempérature, °CHeureNombre de cycles
Dénaturation initiale96Durée : 10 minutes1
Dénaturation965 secondes40
Recuit/Extension6015 s

Tableau 4 : Conditions de cyclage de la PCR numérique.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour déterminer si nos outils d’édition épigénétique ciblés pourraient induire des changements de méthylation de l’ADN spécifiques au site au niveau de l’îlot 326 de CpG de ZBTB7A , nous avons d’abord généré des vecteurs épisomiques codant pour dCas9 fusionné à DNMT3A(CD) ou HDAC1, ainsi que divers ARNsg conçus avec des sites cibles au sein de l’îlot 326 de CpG. Nous avons d’abord co-transfecté des cellules K562 avec des combinaisons de ces plasmides afin d’évaluer si l’administ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’une des étapes les plus critiques de ce protocole est la conception d’ARNsg hautement spécifiques. Les effets hors cible sont une limitation connue des systèmes d’édition épigénétique basés sur CRISPR, qui peuvent souvent résulter de l’infidélité de liaison à dCas9, ainsi que de l’activité non spécifique des domaines effecteurs. Pour minimiser cela, les ARNsg doivent être conçus à l’aide d’outils bioinformatiques qui optimisent l’activité élevée sur la cible et la liaison hors cible

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier ou non financier concurrent.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Irene Dereki et Vasiliki Chondrou sont soutenues par une bourse de trois ans (subvention n° 80706) du Compte spécial des fonds de recherche (ELKE) de l’Université ouverte hellénique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Mix Master PCR numérique Absolute Q DNA (5x)Biosystèmes appliquésA52490
AgeI-HF  ;NEBR3552
ASCINEBR0558
ASEINEBR0526
BamHI-HFNEBR3136
Trieur de cellules mélodique BD FACSBD
BglllNEBR0144
BspEINEBR0540
Mélange de solution désoxynucléotide (dNTP) (10 mM chacun)NEBN0447
DMEM Glucose élevé avec glutamine stable, avec milieu pyruvate de sodiumBiowestL0103
ADN polymérase I, gros fragment (Klenow)NEBM0210
DNMT3A (CD), séquences HDAC1IDT
DreamTaq DNA Polymerase   ;Thermo ScientificEP0712
EpiTectQiagen59104Kit de conversion de bisulfite & nbsp ;
Kit Epitect BisulfiteQiagen59104
Esp3INEBR0734
Sérum fœtal bovinGibcoA5256701
Antibiotique sélectif à la génétiqueine (sulfate G418)Gibco11811031
Kit de transfection Lipofectamine 3000InvitrogenL3000015
NEB® ;   ; 5-alpha Competent  ;E. coli  ; (Haute efficacité)NEBC2987I
NEB® ;   ; 5-alpha F’Iq  ; Competent  ;E. coli  ; (Haute efficacité)NEBC2992H
Tissu nucléospin   ;Macherey-Nagel740952.50
PBS, solution 10x pH 7,4LonzaBE17-517Q
Solution de pénicilline-streptycine 100xBiowestL0022
Vecteur pGuideOriGene TechnologiesGE100042
Phénol : Chloroforme : Alcool isoamylique 25:24:1 Saturé de 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTASigma-AldrichP2069
Amorces, sgRNA & nbsp ;Eurofins
Conception du test PyroMark & nbsp ;QiagenVersion 2.0Outil de conception d’amorce bisulfite   ;
Réactifs PyroMark Gold Q24Qiagen970802
Kit PCR PyroMark   ;Qiagen978703
PyroMark Q24 MDxQiagenStation de travail de pyroséquençage   ;
PyroMark Q24 Logiciels   ;Qiagenv2.0.8Logiciel de pyroséquençage & nbsp ;
Q5 & reg ; ADN polymérase à haute fidélitéNEBM0491
Kit de transcription inversée QuantiTectQiagen205311
Kit de plaques QuantStudio Absolute Q MAP16Biosystèmes appliquésA52865Système PCR numérique   ;
Coloration en gel d’acides nucléiques verte I SYBR, concentration 10 000x en DMSOInvitrogenS7563
T4 DNA LigaseNEBM0202
T4 Polynucléotide kinaseNEBM0201
Réactif de TrizolInvitrogen15596026

Références

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