Isolation tissulaire de protoplast de haute qualité spécifique pour des analyses unicellulaires chez Arabidopsis

Résumé

Cette étude présente un protocole d’isolation renforcé des protoplastes pour les tissus racinaires, foliaires, tiges et florales d’Arabidopsis thaliana. Il utilise des étapes optimisées de digestion et de purification enzymatique pour minimiser les dommages cellulaires et les débris, augmentant ainsi le rendement et obtenant des protoplastes de haute qualité pour des méthodes unicellulaires, telles que le séquençage de l’ARN unicellulaire.

Résumé

Le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNAseq) est devenu un outil essentiel en biologie végétale pour obtenir des informations à haute résolution sur l’expression génique spécifique au type cellulaire, la dynamique du développement et les réponses spécifiques aux facteurs environnementaux des tissus. Un défi technique majeur dans l’application de scRNAseq aux plantes est l’isolation efficace et reproductible de cellules uniques viables sans paroi cellulaire, représentant l’hétérogénéité des tissus végétaux. L’isolation par protoplast, qui enzymatique la paroi cellulaire pour produire des cellules végétales vivantes uniques, est une approche largement utilisée à cette fin. Cependant, une isolation réussie des protoplastes nécessite une optimisation minutieuse afin de maintenir la viabilité cellulaire et de préserver les profils transcriptomiques spécifiques au type cellulaire. Ici, nous présentons un protocole robuste et reproductible pour isoler des protoplastes de haute qualité provenant de plusieurs tissus d’Arabidopsis thaliana , y compris ceux en surface (feuilles, tiges, fleurs) et les tissus racinaires. Ce protocole prend en compte les propriétés physiologiques uniques des types de tissus, optimisant les conditions de digestion enzymatiques et les étapes de purification afin d’assurer un rendement élevé et une représentation large de divers types cellulaires. Les protoplastes obtenus conviennent à des applications telles que scRNAseq, cytométrie en flux (FACS) et analyse de l’expression génique transitoire. Il permet la génération de suspensions unicellulaires à partir de plusieurs types de tissus. La méthode présentée soutient l’exploration de l’hétérogénéité cellulaire et améliore la fiabilité des approches unicellulaires dans la recherche sur les plantes.

Introduction

Le séquençage de l’ARN à cellule unique (scRNAseq) a révolutionné la biologie végétale en permettant l’analyse de l’expression génique à une résolution sans précédent. scRNAseq fournit des informations transcriptomiques sur l’hétérogénéité cellulaire, les trajectoires de développement et les réponses aux stimuli environnementaux à la résolution spécifique au type^{cellulaire 1,2,3}.

Contrairement aux systèmes animaux, la paroi cellulaire rigide des plantes et la complexité structurelle des tissus végétaux représentent des obstacles importants à l’isolation efficace des cellules individuelles pour l’analyse transcriptomique. Parmi les méthodes disponibles, l’ablation enzymatique de la paroi cellulaire pour produire des protoplastes est devenue une méthode largement utilisée, développée il y a plus de 60 ans ^4,5,6. Malgré son utilisation généralisée, l’isolation des protoplastes reste une procédure techniquement exigeante qui nécessite une optimisation spécifique aux tissus pour équilibrer le rendement cellulaire, la viabilité et un transcriptome stable. Des méthodes alternatives, telles que le séquençage de l’ARN à noyau unique (snRNA-seq), évitent la nécessité de digestion de la paroi cellulaire en isolant le^{noyau 7}. Cependant, cela se fait au prix de la perte d’informations sur les transcrits matures présents dans le cytoplasme. D’autres méthodes de dissociation physique, telles que la microdissection mécanique et assistée par laser, évitent la digestion enzymatique de la paroi cellulaire mais sont souvent susceptibles de contamination croisée et peuvent entraîner une viabilité cellulaire réduite et un débit limité ^8,9,10.

De nombreux atlas cellulaires végétaux ont été développés ces dernières années, en particulier pour Arabidopsis, fournissant des informations importantes sur les paysages transcriptomiques de divers^tissus 2,11,12,13,14,15,16,17,18 . Cependant, ces atlas sont principalement basés sur des plantes juvéniles ou en semis, se concentrant principalement sur les tissus racinaires ou foliaires. Les protocoles utilisés dans ces études nécessitent des processus d’optimisation pour les tissus plus anciens d’Arabidopsis, tels que les feuilles matures, les fleurs et les tiges. De plus, jusqu’à l’utilisation d’études de séquençage spécifiques au type cellulaire telles que scRNAseq ou Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) combinées au séquençage ARN, les changements du transcriptome causés par l’isolement du protoplaste n’étaient pas entièrement pris en^{compte 19}.

La méthode présentée ici s’appuie sur des efforts antérieurs tout en introduisant plusieurs améliorations cruciales : elle prend en compte la variabilité physiologique et anatomique entre les tissus végétaux en optimisant les concentrations tampons pour les tissus racinaires et hors sol (feuilles, tiges, fleurs) et intègre des étapes de purification douces pour minimiser les dommages cellulaires et améliorer la pureté des protoplastes. Comparée aux approches basées sur les noyaux, cette méthode a le potentiel de conserver le transcriptome de la cellule entière, permettant d’obtenir une information à plus haute résolution des molécules d’ARNm matures présentes dans le cytosol. Il est important de noter que la procédure permet une viabilité du protoplaste élevée, une hétérogénéité et des concentrations reproductibles à travers les tissus, allant d’environ 9,8 × 10³ cellules/mg dans les fleurs à 2,2 × 10² cellules/mg dans les feuilles.

L’objectif global de la méthode présentée est de présenter un protocole d’isolation robuste et reproductible, adapté à plusieurs tissus d’Arabidopsis thaliana, répondant à un besoin critique d’apports de haute qualité couvrant divers types cellulaires pour les études sur des cellules uniques végétales.

Protocole

Les réactifs et l’équipement utilisés pour cette étude sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation des tampons

1. Préparer le tampon d’isolation du protoplaste^17,18 selon le tableau 1 dans un tube centrifuge de 15 mL ; Tampon d’isolation de protoplaste racinaire pour tissus racinaire ou tampon d’isolation de protoplastes fleur/tige/feuille pour les tissus hors sol.
   REMARQUE : Quantité approximative de tampon d’isolation du protoplaste nécessaire pour cinq plantes à fleurs d’Arabidopsis thaliana récoltées (stade 11-12 avec bourgeons fermés) : Racine (~ 375 mg) : 7 mL, Feuille (~930 mg) : 5 mL, Tige (~215 mg) : 3 mL, Fleurs (~10 mg) : 2 mL.
2. Ajoutez 2 % (en poids ou en portée) de cellulase RS et 1 % (en mousse) de Macerozyme R10 frais avant d’utiliser le tampon d’isolation du protoplaste racine/feuille. Mélangez bien en appliquant le tampon d’isolation du protoplaste sur un rotateur jusqu’à ce que la poudre soit complètement dissoute (environ 10 minutes à 25 °C). Évitez de créer des bulles d’air et assurez-vous qu’il ne reste pas de grumas de poudre à l’intérieur du tampon.

2. Digestion des tissus

1. Filtrez le tampon d’isolation du protoplaste correspondant à travers un filtre de 0,2 μm avant utilisation. Utilisez une boîte de Petri de taille standard (100 mm x 15 mm) pour les feuilles et les racines, et une petite boîte de Petri (30 mm x 15 mm) pour de petites quantités de tissus comme les fleurs. Ajoutez quelques gouttes de tampon d’isolation protoplaste dans la boîte de Pétri avant de transférer les tissus.
2. Transférez le mouchoir concerné dans la boîte de Petri et coupez-le en petits morceaux par des coups verticaux à l’aide d’une lame de rasoir, aussi finement et rapidement que possible (Figure 1A).
   REMARQUE : Utilisez toujours différentes lames et pinces à épiler pour chaque échantillon afin d’éviter toute contamination croisée. Portez des gants de protection lors de la manipulation de la lame de rasoir.
3. Ajoutez le tampon d’isolation du protoplaste restant dans la boîte de Pétri correspondante pour immerger le tissu haché et incubez à 25 °C pendant 1 heure. Gardez les tissus hors sol sur le laboratoire (sans secousses) et transférez les tissus racinaires sur une plateforme oscillante orbitale (60 tr/min).

3. Filtration

1. Échantillon racinaire après l’incubation :
   1. À l’aide d’une pipette Pasteur, transférez les protoplastes de la boîte de Petri vers une passoire cellulaire de 40 μm placée sur un tube centrifuge ouvert pré-refroidi de 50 mL.
   2. Pour récolter les protoplastes restants, ajoutez exactement le même volume de solution W5 (2 mM pH 5,7 de MES, 154 mM de NaCl, 125 mM de_{CaCl 2}, 5 mM de KCl) dans la même boîte de Petri afin de collecter les protoplastes adhérés à la base de la boîte de Petri. Transférez les protoplastes resuspendus dans la solution W5 sur la même tamoire cellulaire de 40 μm placée sur un tube centrifuge ouvert pré-refroidi de 50 mL.
   3. Passez-le une seconde fois à travers un nouveau filtre cellulaire de 40 μm dans un nouveau tube centrifugeuse pré-refroidi de 50 mL. Dorénavant, gardez les échantillons sur la glace et soyez très délicat lors de la manipulation des protoplastes.
2. Échantillons en surface après l’incubation :
   1. À l’aide d’une pipette Pasteur, transférez les protoplastes de la boîte de Petri vers une tamoire cellulaire de 70 μm placée sur un tube centrifuge ouvert pré-refroidi de 50 mL.
   2. Pour récolter les protoplastes restants, ajoutez exactement le même volume de solution W5 (2 mM pH 5,7 de MES, 154 mM de NaCl, 125 mM de_{CaCl 2}, 5 mM de KCl) dans la même boîte de Petri afin de collecter les protoplastes adhérés à la base de la boîte de Pétri. Transférez les protoplastes resuspendus dans la solution W5 sur la même tamoire cellulaire de 70 μm placée sur un tube centrifuge ouvert pré-refroidi de 50 mL. Dorénavant, gardez les échantillons sur la glace et soyez très délicat avec les protoplastes.

4. Lavage et purification du Ficoll

1. Pré-refroidissez la centrifugeuse à 4 °C et collectez (pellets) les protoplastes pendant 5 minutes à 500 × g sans réglage de frein de la centrifugeuse.
2. Échantillon racinaire après centrifugation :
   1. Jetez le surnageant sans déranger la pellete de protoplaste.
   2. Resuspendez les protoplastes très délicatement dans un tampon de resuspension des racines pré-refroidi (4 °C) de 600-700 μL (parts égales de tampon d’isolation de protoplastes racinaires (sans enzymes) et de solution W5) à l’aide d’une pipette Pasteur ou d’une pipette Gilson de 1 mL avec une pointe coupée pour éviter le cisaillement.
   3. Transférez la suspension sur des tubes pré-refroidis de 1,5 mL (4 °C).
3. Échantillons hors sol après centrifugation :
   1. Jetez le surnageant sans déranger la pastille.
   2. Resuspendez le pellet très doucement dans un tampon de resuspension fleur/tige/feuille pré-refroidi (4 °C) de 600 à 700 μL (parts égales de tampon d’isolation fleur/tige/feuille, tampon d’isolation de protoplastes (sans enzymes) et solution W5) à l’aide d’une pipette Pasteur ou d’une pipette Gilson de 1 mL avec une pointe coupée pour éviter le cisaillement.
   3. Transférez la suspension sur des tubes pré-refroidis de 1,5 mL (4 °C).
   4. Préparez 300 μL de solution Ficoll PM 400 à 13,3 % (p/v) dans un tube de 1,5 mL. Mélangez et gardez au frais.
   5. Ajoutez lentement l’échantillon de protoplaste resuspendu (600-700 μL) sur la solution de Ficoll préparée sans toucher ni mélanger la couche de Ficoll.
   6. Centrifugeuse à 4 °C pendant 5 minutes à 700 × g avec un réglage de rupture zéro de la centrifugeuse.
   7. Collectez les protoplastes présents dans la couche intermédiaire (interface) ainsi que la phase supérieure (première couche) (Figure 1B). Faites attention à ne pas ramasser la troisième couche inférieure, qui contient Ficoll et les débris séparés. Conserver à 4 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.

5. Comptage et contrôle qualité

1. Utilisez 10 μL de la solution de protoplaste pour compter le nombre de protoplastes isolés avec un hémocytomètre de Neubauer.
   OPTIONNEL : Un colorant Evans Blue à 1 % (en v) peut être ajouté pour évaluer la viabilité des protoplastes (Figure 1C).
2. Diluez la solution du protoplaste à la concentration requise de protoplastes/mL à l’aide d’un tampon de resuspension pré-refroidi (4 °C) (expliqué à l’étape 4.2.2 pour la racine et à l’étape 4.3.2 pour les tissus hors sol) du tissu concerné.
3. Poursuivez l’expérience prévue aussi rapidement que possible, par exemple le séquençage d’ARN unicellulaire et/ou FACS^15,19.

Résultats

Les protocoles d’isolation des protoplastes mis en œuvre pour les tissus en surface et les racines permettent avec succès une digestion efficace de la paroi cellulaire et la libération de cellules uniques intactes de tous les tissus d’Arabidopsis thaliana. Parmi les types de tissus testés, qui comprenaient fleurs, tiges, feuilles et racines, le processus de digestion enzymatique a produit des protoplastes bien séparés avec un nombre minimal de groupes cellulaires non digérés (Figure 2A-D). Les analyses de colorant Evans Blue ont confirmé que les protoplastes présentant une morphologie sphérique avec des frontières lisses de membranes plasmiques sont des cellules viables (Figure 1C). Pour chaque type de tissu, les protoplastes sphériques ont été comptés. Les fleurs contenaient en moyenne 97 875 ± 7 531 (9 788 cellules/mg, n = 3), des tiges 119 025 ± 22 508 (550 cellules/mg, n = 4), des feuilles 210 483 ± 15 572 (225 cellules/mg, n = 3), et des racines 225 363 ± 52 561 (599 cellules/mg, n = 4).

Les suspensions de protoplastes présentaient une large répartition des tailles cellulaires et la présence de plastides verts ou pâles, reflétant la composition cellulaire hétérogène de chaque tissu prélevé (Figure 3A-D). Pour confirmer cela, une isolation du protoplaste avec une lignée de rapporteur YFP spécifique aux cellules compagnons transgéniques a été réalisée, et la suspension contenait de petits protoplastes viables avec un signal YFP représentant les cellules compagnes (Figure 3E). Cela souligne que le protocole d’isolement des protoplastes utilisé convient aux cellules vasculaires difficiles à isoler avec des parois cellulaires rigides.

Avec la méthode optimisée présentée, on peut isoler un grand nombre de protoplastes viables avec une quantité minimale de débris provenant de divers tissus de plantes adultes. Pour améliorer la purification des échantillons en surface, nous avons inclus une étape de nettoyage du coussin Ficoll pour éliminer les organites libérés et autres débris cellulaires des échantillons digérés tout en préservant la qualité du transcriptome (Figure 4).

Dans les bibliothèques d’ADNc scRNAseq générées à partir des protoplastes, des transcrits de maintien de l’air très expressés tels que ACTIN2 et des transcrits rares/peu exprimés comme le facteur de transcription du domaine homéo-domaine KNAT1, un marqueur spécifique aux cellules changeales et méristématiques, ainsi que les marqueurs cellulaires compagnons SUC2 et PARCL1, ont été détectés par des tests PCR d’ADNc spécifiques¹⁵ (Figure 5). Cela indique une représentation cellulaire large et une hétérogénéité de la population de protoplastes obtenue, ce qui a été confirmé davantage par l’analyse des données scRNAseq produites par cette^{méthode 15}.

Figure 1 : Flux de travail des étapes d’isolation des protoplastes. Six étapes principales sont présentées : (1) préparation du tampon, (2) digestion tissulaire, (3) filtration, (4) lavage et purification de Ficoll, (5) comptage et contrôle qualité, et (6) poursuite par des expériences en aval. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Images des étapes de préparation du protoplaste. (A) Image représentative de l’étape de coupe de l’échantillon de feuille (Étape 2.1). L’image du haut montre le tissu prélevé avec quelques gouttes de tampon dans une boîte de Petri de taille standard et une lame de rasoir pour le couper. L’image ci-dessous, à gauche, représente le tissu après quelques coups verticaux avec la lame de rasoir (voir la flèche). L’image ci-dessous, à droite, représente l’échantillon découpé, prêt pour l’étape suivante. (B) Image d’un coussin de Ficoll après centrifugation dans un tube de 1,5 mL (Étape 4.3.7). La flèche blanche indique la couche intermédiaire, qui contient des protoplastes. (C) Image représentative au microscope des protoplastes foliaires incubés dans le colorant Evans Blue. Barre d’échelle : 250 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Images microscopiques des protoplastes générés. Des images de protoplast de chaque type de tissu sont affichées. (a) fleur, (b) tige, (c) feuille, (d) racine. Barre d’échelle : 250 μm. (E) Images confocales du microscope d’une ligne de rapporteur YFP spécifique à une cellule compagne. La première image (à gauche) représente l’expression du rapporteur cellulaire compagnon YFP dans le vascularisation foliaire (couleur verte). La deuxième image (à droite) représente des protoplastes provenant de cellules exprimant le rapporteur YFP (signal vert). La couleur violet/bleue représente l’autofluorescence du chloroplaste. Barre d’échelle 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Images microscopiques des protoplastes foliaires avant (A) et après (B) nettoyage du coussin de Ficoll. Barres d’échelle : 250 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 5 : PCR de contrôle qualité des bibliothèques scRNAseq. Images représentatives en gel des PCR de contrôle qualité des bibliothèques d’ARNSEQ unicellulaires radicaux et de tissus au-dessus du sol. Gènes testésSUC2, PARCL, KNAT1, ACT2 (de A à D, respectivement), et pour chaque tissu : fleur, tige, feuille, racine de gauche à droite, respectivement. cDNA (+) est utilisé comme témoin positif, et l’eau comme témoin négatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Tampon Protoplasting Radiculaire	Tampon Protoplasting de fleurs/tiges/feuilles
600 mM de mannitol	400 mM Mannitol
2 mMMgCl 2	-
0,1 % de BSA	0,1 % de BSA
2 mM CaCl2	10 mM CaCl2
2 mM MES pH 5,7	20 mM MES pH 5,7
10 mM KCl	20 mM KCl
Ajustez le pH à 5,5 avec 1M Tris Base si nécessaire	Ajustez le pH à 5,5 avec 1M Tris Base si nécessaire

Tableau 1 : Compositions des tampons d’isolation du protopast. Des recettes de tampon d’isolation protoplast pour les tissus racinaires et hors sol (fleurs, tiges, feuilles) sont fournies.

Discussion

Ce protocole optimisé pour isoler les protoplastes de divers tissus d’Arabidopsis était conçu pour des applications scRNAseq, analysant l’ensemble du transcriptome présent dans le cytoplasme et les noyaux. L’optimisation spécifique aux tissus des tampons et des étapes supplémentaires pour la digestion et la purification ont permis d’obtenir des rendements robustes et reproductibles sur différents tissus. Plus précisément, les protoplastes de fleurs ont atteint en moyenne ~98 000 cellules par échantillon (~9 788 cellules par mg de tissu), les protoplastes souches ~119 000 cellules (~550 cellules par mg), les protoplastes foliaires ~210 500 cellules (~225 cellules par mg), et les protoplastes radicaux ~225 000 cellules (~599 cellules par mg), reflétant la diversité structurelle et physiologique de ces tissus.

Un raffinement clé de ce protocole fut l’utilisation d’un coussin à base de Ficoll au lieu des gradients/coussins à base de saccharose plus couramment utilisés pour la purification. Contrairement au saccharose, qui est absorbé par les cellules et a un effet majeur sur le transcriptome ^13,20,21, Ficoll est osmotiquement inerte et imperméable à la membrane, préservant ainsi l’intégrité de l’ARN lors de l’isolement²². Cette étape a également réduit le nombre d’organites libres, tels que les chloroplastes, provenant de cellules brisées et de débris cellulaires en suspension. La présence de ces débris peut interférer avec la formation des gouttelettes en obstruant les canaux des dispositifs microfluidiques ou en entraînant la présence de plus d’une cellule dans les gouttelettes formées, ce qui contribue à la contamination par l’ARN ambiant. Tous ces facteurs peuvent conduire à des conclusions erronées ou à des biais dans l’analyse des données scRNA-seq.

Il a été démontré que l’isolation des protoplastes peut modifier le transcriptome des cellules^végétales 2,15,16,19. Une stratégie clé de ce protocole pour minimiser cet artefact consiste à maintenir les protoplastes à 4 °C (sur glace) après la digestion enzymatique, ce qui ralentit l’activité métabolique et transcriptive et, par conséquent, réduit les changements transcriptionnels connus pour être associés à l’isolement des protoplastes. De plus, il est crucial de maintenir un temps de prélèvement des tissus cohérent entre les réplications et de l’aligner sur l’objectif de l’étude, car les variations de temps ont montré qu’elles influencent à la fois les gènes induits par les protoplastes et les transcrits régulés circadien détectés dans les ensembles de données^{scRNA-seq 15}.

Dans cette méthode, en plus de produire des cellules uniques avec un minimum de débris, un autre point très important était de maintenir l’hétérogénéité des tissus pour potentiellement représenter tous les types cellulaires. La diversité des suspensions de protoplastes a été confirmée par la détection de différentes morphologies de protoplastes, incluant des tailles diverses et la présence de signaux provenant de lignées de rapporteur spécifiques au type cellulaire au sein de la population obtenue (Figure 2). De plus, la population de protoplastes a été évaluée en détectant des transcrits rares et spécifiques au type cellulaire ainsi que des transcripts de maintenance dans des bibliothèques d’ADNc scRNA-seq à l’aide de la PCR (Figure 4). Cela incluait des gènes marqueurs rares du méristème apical de la pousse, et des marqueurs des cellules^{compagnes 15}. La capture réussie de ces transcripts confirme que la méthode présentée permet d’isoler divers types cellulaires avec une grande intégrité, en faisant un outil précieux pour faire progresser la recherche unicellulaire chez les plantes. En plus du scRNAseq, cette méthode peut également être utilisée pour la cytométrie en flux, l’analyse de l’expression génique transitoire et les tests de régénération végétale.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
RS  de la cellulase ;	Biochimie Duchefa	C8003
Modèle centrifugeuse 5810R	Eppendorf	5810000010
Ficoll PM 400  ;	Sigma-Aldrich	26873-85-8
Macerozyme R10	Biochimie Duchefa	M8002
Microcentrifugeuse modèle 5417R	Eppendorf	Arrêté
Puradisc 30 Filtre à seringue stérile, 0,2 & micro ; m	Cytiva	10462200	Appelé 0.2 & micro ; Filtre m dans le protocole
Filtre cellulaire stérile 40 & micro ; m Nylon Mesh  ;	Fisherbrand	22363547
Filtre cellulaire stérile 70 & micro ; m Nylon Mesh  ;	Fisherbrand	22363548