Surveillance de l’acide 2,4-dichlorophénoxyacétique dans les produits d’abeille par fluorescence de surface solide

Summary

Ce travail propose le développement d’une nouvelle méthodologie alternative aux techniques traditionnelles de contrôle et de surveillance de l’acide 2,4-dichlorophénoxycarboxy dans les échantillons de produits d’abeille du centre et du nord de l’Argentine.

Abstract

La santé des abeilles est essentielle à la production de miel et à la pollinisation des cultures. La production de miel peut être négativement affectée par l’utilisation d’herbicides, car les abeilles peuvent entrer en contact avec ces produits chimiques lors de la collecte de nectar et de pollen sur les plantes traitées, ce qui peut entraîner une contamination du miel par ces résidus toxiques. Bien que l’acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4-D) soit conçu pour contrôler les mauvaises herbes à larges feuilles, il peut atteindre les fleurs et contaminer la production des abeilles, ce qui peut potentiellement affecter leur santé et leur qualité de vie. Pour ces raisons, il est important d’analyser le miel périodiquement, afin de détecter la présence de résidus d’herbicides et, si nécessaire, de prendre des mesures correctives. Ce travail propose le développement d’une nouvelle méthodologie alternative aux techniques traditionnelles de contrôle et de surveillance du 2,4-D dans les échantillons de produits d’abeille du centre et du nord de l’Argentine. Les échantillons ont été conditionnés à pH = 7,0 en présence du tensioactif anionique dodécylsulfate de sodium (SDS), filtrant les systèmes à travers du papier filtre à bande bleue comme support solide avant la détermination par fluorescence en phase solide. Dans des conditions de fonctionnement optimales, des limites de détection et de quantification de 0,33 ng/L et 0,90 ng/L ont été atteintes, ainsi qu’une plage de linéarité de 0,90 x 10³ ng/L à 1,13 x 10³ ng/L. Parmi les avantages de cette nouvelle méthode figurent l’utilisation d’instruments peu coûteux et de solvants écologiques, une faible génération de déchets et, par conséquent, la protection de certains principes de la chimie verte.

Introduction

La santé des abeilles est essentielle à la production de miel et à la pollinisation des cultures. Une colonie en bonne santé dépend d’une gestion complète de la santé, incluant une nutrition adéquate, des mesures d’hygiène ainsi qu’une prévention et un traitement des maladies. La production de miel, si elle est réalisée de manière responsable, ne nuit pas aux abeilles, car les apiculteurs n’extraient qu’une petite partie du miel total, laissant des réserves pour la colonie ^1,2.

La production de miel peut être négativement affectée par l’utilisation d’herbicides, car les abeilles peuvent entrer en contact avec ces produits chimiques lors de la collecte de nectar et de pollen sur les plantes traitées, ce qui peut entraîner une contamination du miel par des résidus de pesticides. De plus, certains herbicides, comme le glyphosate, peuvent affecter directement le développement et le comportement des abeilles, réduisant leur capacité de recherche de nourriture et leur développement physiologique 3,4,5,6. Bien que l’herbicide acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4-D) ait été conçu pour contrôler les mauvaises herbes à feuilles larges, il peut atteindre les fleurs et contaminer le miel, ce qui peut potentiellement affecter la santé et la qualité du miel ^{des abeilles 7,8,9}.

Le commerce intérieur et international du miel et d’autres produits abeliques a connu une croissance significative et soutenue ces dernières années, comme en témoigne une production^{accrue 10, 11, 12}. Selon les données de l’Organisation des Nations Unies pour l’alimentation et l’agriculture (FAO), il existe cinq grands pays producteurs de miel dans le monde : la Chine, l’Argentine, la Turquie, les États-Unis et^{l’Ukraine 13}. La production apicole est d’une grande importance en Argentine et est en constante croissance grâce aux opportunités d’exportation qui se sont présentées ces dernières années. Les conditions environnementales de l’Argentine (climat, flore, etc.) et la technologie investie dans la production ont permis au pays de se positionner dans une position importante à l’échelle mondiale. En revanche, la présence de xénobiotiques constitue un sujet préoccupant et nécessite une surveillance, comme dans d’autres pays, car elle affecte à la fois la commercialisation du miel et la santé des consommateurs en raison de ses effets^{toxiques 14,15}.

Le 2,4-D est un herbicide systémique sélectif largement utilisé qui contrôle efficacement les mauvaises herbes à feuilles larges en agissant comme un auxin synthétique, provoquant leur croissance et leur mort incontrôlées. Il est utilisé en agriculture, en horticulture et en foresterie, et est particulièrement utile pour contrôler les mauvaises herbes dans des cultures telles que le blé, le maïs et le riz, car il ne nuit ni aux herbes ni aux^{céréales 16}. Le 2,4-D peut également être utilisé comme régulateur de croissance des plantes et est disponible en différentes formulations, y compris les sels d’amine et d’esters, pour convenir à une variété d’applications. Les fonctions 2,4-D sont influencées par la dose administrée et la susceptibilité de certaines espèces et types de^{tissus 17,18}. Par exemple, le contact avec le 2,4-D a été impliqué dans des effets reproductifs défavorables et des altérations génétiques significatives chez la souris, indiquant un effet^{génotoxique notable 19}.

Les abeilles domestiques, en tant que pollinisatrices clés et organismes modèles pour l’étude de l’eusocialité, de l’apprentissage et de la mémoire, sont très vulnérables à l’empoisonnement direct causé par les agrochimiques utilisés^{dans les champs 20}. L’application aérienne d’herbicides et d’insecticides pendant la floraison peut entraîner une mortalité significative chez les abeilles et réduire drastiquement la production de miel. Les mélanges de pesticides, même à des doses sub-létales, peuvent désorienter les abeilles en quête de nourriture, altère leur mémoire et diminuer l’efficacité de la recherche de nourriture. Cela affaiblit à son tour les colonies en réduisant la collecte de pollen et de nectar, entraînant des carences nutritionnelles. De plus, du 2,4-D a été détecté dans des échantillons de miel, et du pollen et du nectar contaminés peuvent être dispersés parmi les partenaires^{de ruche 21}.

Il est important d’analyser périodiquement le miel pour détecter la présence de résidus d’herbicides et, si nécessaire, de prendre des mesures correctives. Pour la détection et la quantification des contaminants alimentaires tels que les herbicides, dans ce cas particulier le 2,4-D, les méthodes instrumentales les plus couramment utilisées sont la chromatographie, à savoir la chromatographie liquide haute performance (HPLC), la chromatographie liquide par spectrométrie de masse tandem (LC-MS/MS) et la chromatographie en phase de phase (GC-MS/MS⁾22,23,24,25,26 . Cependant, les chercheurs présentent périodiquement de nouvelles méthodes de surveillance pour le 2,4-D qui offrent des avantages par rapport aux méthodes de quantification^{conventionnelles} 27,28,29, par exemple : utilisation d’instruments moins coûteux, simplicité opérationnelle, utilisation de moins de solvants, application à des échantillons plus complexes, et autres.

La fluorescence en phase solide est une technique polyvalente qui, en combinant la fluorescence moléculaire avec des méthodes d’extraction en phase solide, renforce la sensibilité déjà élevée inhérente à l’instrumentation de fluorescence. Il améliore également la plage de linéarité et la sélectivité en réduisant ou éliminant les effets^{matriciels 30,31}.

Dans cette recherche, une nouvelle méthodologie analytique pour surveiller et quantifier le 2,4-D est proposée et appliquée aux échantillons de miel et d’autres abeilles du centre et du nord de l’Argentine. Les échantillons contiennent des quantités inconnues de 2,4-D. Ce que l’on sait, ce sont les concentrations des niveaux super-ajoutés, qui correspondent à la concentration fournie par l’échantillon plus la concentration de 2,4-D que nous avons ajoutée. Cette dernière valeur est connue et nous permet de calculer la récupération. La nouvelle méthodologie repose sur la détermination directe de l’analyte à l’aide de la fluorescence en phase solide, démontrant de multiples avantages en termes d’économies d’instrumentation, de coûts d’exploitation réduits et d’une meilleure protection de l’environnement.

Protocol

Ce manuscrit ne contient aucune étude avec des participants humains ou des animaux réalisée par l’un des auteurs.

Appareils utilisés
Les mesures spectrofluorimétriques ont été effectuées à l’aide d’un spectrofluoromètre à base de PC équipé d’une lampe au xénon de 150 W. Un porte-échantillon était utilisé pour les mesures de fluorescence de surface solide (SSF). Les paramètres utilisés pour la quantification 2,4-D étaient les suivants : λ_em = 580 nm, en utilisant λ_ext = 555 nm (fentes 3-3), en utilisant un porte-échantillon solide.

Échantillonnage et traitement des échantillons
Cette étude sur la production d’échantillons de miel réalisés en 2025 a été menée dans les provinces de San Luis, San Juan, Jujuy et Salta, dans la région nord-centre de l’Argentine. Les échantillons analysés étaient : quatre miels multifloraux, deux miels de propolis, des bonbons au miel pur, et des fribons faits à partir d’un mélange de miel, de coca et de propolis, achetés auprès d’apiculteurs de la région. Les miels étudiés étaient frais, extraits des ruches en moins d’une semaine de production, afin d’éviter une possible dégradation du 2,4-D par différents mecanismes. Tous les échantillons ont été prélevés dans de nouveaux récipients stériles et immédiatement transportés au laboratoire. Ils étaient stockés à 4-8 °C dans un endroit sombre jusqu’à leur analyse. Le caramel solide était homogénéisé avec un mortier et un pilon ; son contenu était dilué dans 5 mL d’eau ultrapure, et 0,5 μL était prélevé de cette solution.

Méthodologie
Des aliquotes de 0,5 μL ou 1 μL de 2,4-D (1,23 ng/L et 3,49 ng/L), 100 μL d’échantillon, 250 μL de SDS (1 x ^10-4 mol/L) et 100 μL de tampon phosphate (1 x ^10-4 mol/L, pH=7) ont été ajoutés, et le volume du mélange a été atteint de 3 mL en ajoutant de l’eau double distillée. Le mélange était filtré à travers le support solide (filtre en papier ; voir le tableau des matériaux pour plus de détails). Les supports solides étaient séchés à température ambiante, puis la fluorescence solide de surface (SSF) était mesurée à λ_em = 580 nm, en utilisant λ_ext = 555 nm (fentes 3-3) avec un support solide d’échantillon.

Ce qui précède décrit la procédure générale de la méthodologie développée, dans laquelle chaque paramètre a été étudié et optimisé, comme indiqué dans la section Résultats.

Effet du pH et du tampon
L’optimisation du pH a été réalisée en ajustant les systèmes au pH étudié à l’aide d’acide chlorhydrique ou d’hydroxyde de sodium pour les amener à la valeur requise (pH testé par plage 5-7). Par la suite, une fois la plage de pH la plus appropriée pour obtenir un signal analytique approprié était obtenue, le tampon à utiliser était choisi.

Les tampons testés étaient le phosphate, le Tris et le borax, préparés à une concentration de 1 x ^10-4 mol/L. Leur volume était varié pour obtenir le meilleur signal d’intensité de fluorescence. Les résultats du seul phosphate tampon ayant amélioré l’intensité de fluorescence sont montrés, ainsi que sa concentration optimale respective. Ici, le tampon sélectionné était le phosphate, et le pH = 7.

Concentration de tensioactifs
L’utilisation de différents tensioactifs dans la fluorescence moléculaire offre des avantages qui améliorent la détermination de l’analyte étudié. Les milieux micellaires sont utilisés pour minimiser les interactions intermoléculaires entre l’analyte et les composants de la matrice échantillon. De plus, les propriétés photophysiques des solutés fluorescents peuvent être modifiées dans le milieu micellaire, améliorant ainsi la sensibilité à la fluorescence. L’effet de différents tensioactifs (SDS et HTAB) sur la quantification du 2,4-D à l’aide de la fluorescence de surface solide (SSF) a été étudié. Il a été constaté que le tensioactif anionique SDS, à une concentration de 8,3 x 10⁻⁶ mol/L, augmentait l’intensité de fluorescence de l’herbicide étudié.

Soutien solide
Étant donné que la configuration planaire est énergétiquement préférée à l’état de fluorescence excitée, la rétention de l’herbicide sur des supports solides a été explorée. Les systèmes étaient filtrés à travers différents types de membranes, notamment le nylon, l’acétate de cellulose, les esters mélangés et le papier filtre Blue-Ribbon. Les solutions filtrées étaient collectées dans des contenants séparés et propres, et les membranes séchées à température ambiante. Par la suite, les membranes ont été placées dans un support solide pour échantillons, et la fluorescence en phase solide (SSF) a été enregistrée. Une rétention adéquate et sélective a été observée sur du papier filtre, ce support a donc été sélectionné pour la détermination de la fluorescence en phase solide. Les solutions filtrées ont également été analysées par fluorescence moléculaire. L’absence du complexe 2,4-D était évidente, démontrant la conservation de l’herbicide sur le papier filtrant.

Étude de récupération
Le 2,4-D a été ajouté à un volume approprié de chaque échantillon étudié (0,5 μL utilisé pour les échantillons de miel et 1 μL pour les autres échantillons analysés), augmentant progressivement sa concentration à 1,23 ng/L et 3,49 ng/L. Les concentrations d’analytes ont été déterminées selon cette méthodologie, en moyenne de six réplications (n = 6).

Étude de précision
La répétabilité des méthodes et la précision intra-journalière ont été étudiées par des tests répétés d’échantillons (n = 6) contenant 1,23 ng/L et 3,49 ng/L de 2,4-D, puis par détermination du contenu analytique à l’aide de la méthodologie. De plus, la reproductibilité de la précision inter-jours a été évaluée sur 7 jours pour les mêmes systèmes.

Étude des interférences
Différentes quantités d’ions communs ont été ajoutées à la solution test contenant 3,49 ng/L de 2,4-D, et la méthodologie a été appliquée. Les interférences potentielles suivantes ont été testées :

Concentration du rapport interférent/2,4-D = 1000:1:00 pour Na⁺, K⁺, Cl^-, Fe³⁺, Cu²⁺, Cd²⁺, Sb³⁺, Mn²⁺, As³⁺, CO₃^2-, SO₄^2-, Ca²⁺, Mg²⁺, NO^3-, Ni²⁺, fructose, glucose, saccharose, maltose, 2,4,5-T, sulfometuron-méthyl, glyphosate et atrazine.

Concentration du rapport molaire interférent/2,4-D = 500:1:00 pour Zn²⁺, Co²⁺, Al³⁺, chlorsulfuron, bensulfuron-méthyl et triasulfuron.

Calcul des paramètres analytiques de qualité
Les paramètres de qualité analytique sont la limite de détection (LOD) et la limite de quantification (LOQ). Ces calculs ont été calculés en appliquant les étapes suivantes. Le bruit de fond a été mesuré en mesurant la réponse de 15 échantillons vierges (échantillons sans l’analyte) pour obtenir un ensemble de données de bruit de fond. L’écart-type du bruit a été calculé. Ceci est accepté comme une valeur LOD. Les limites de détection sont basées sur 3,3 fois les écarts-types de l’écart-type (N = 15). Les limites de quantification sont basées sur 10 fois les écarts-types de l’espace blanc (N = 15).

Results

Les résultats présentés ci-dessous indiquent comment l’étude de chacune des variables influençant la procédure générale, son optimisation et les conditions de travail optimales atteintes a été abordée étape par étape.

Caractérisation du spectre 2,4D
La caractérisation en 2,4-D a été réalisée par spectroscopie UV-Vis et fluorescence moléculaire, observant les maxima d’intensité fluorescente à λ_em = 580 nm, en utilisant λ_ext

Discussion

L’utilisation intensive d’herbicides a augmenté de façon exponentielle en Argentine et dans le reste du monde en raison de la nécessité de répondre à la demande alimentaire d’une population croissante. Si l’utilisation de ces produits est suivie de manière appropriée, rationnelle et périodique, cela ne compromettrait pas les bénéfices attendus ni n’aurait d’effets négatifs sur l’environnement dans son ensemble. Le 2,4-D a été largement utilisé dans le monde entier, et de nombreuses étude...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-D  ;	Sigma-Aldrich, St. Louis, États-Unis	49083
Acide acétique/acétate   ;	Usine chimique Mallinckrodt & nbsp ;
Papiers filtrants Blue Ribbon & nbsp ;	Sigma-Aldrich, St. Louis, États-Unis	WHA1001929	2-5 & mu ; m taille des pores et diamètre de 12,5 cm   ;
Membrane d’acétate de cellulose	Sigma-Aldrich, St. Louis, États-Unis		0,45 & mu ; m pore et 47 mm
Bromure d’hexadécyltriméthylammonium (HTAB) et nbsp ;	Sigma-Aldrich, St. Louis, États-Unis	H5882
acide chlorhydrique	Sigma-Aldrich, St. Louis, États-Unis	1.09063
Membranes immobilon (+)	Millipore, São Paulo, Brésil	HATF04700	0,45 & mu ; m pore et 47 mm
Membranes mixtes d’esters	Sigma-Aldrich, St. Louis, États-Unis		0,45 & mu ; m pore et 47 mm
Membranes en nylon & nbsp ;   ;	Millipore, São Paulo, Brésil	Z290793	0,45 & mu ; m pore et diamètre de 47 mm
pHmètre (Orion Extensible Ion Analyzer), et nbsp ;	Orion Research, Cambridge, MA, États-Unis	Modèle EA 94.
Dihydrophosphate de potassium   ;   ;	Biopack, Buenos Aires, Argentine & nbsp ;	2000168900
Acide phtalatique de potassium	Merk &Co., Inc
Dodécyle sulfate de sodium	Sigma-Aldrich, St. Louis, États-Unis	11667289001
Hydroxyde de sodium	Sigma-Aldrich, St. Louis, États-Unis	S2770
Tétraborate de sodium & nbsp ;	Sigma-Aldrich, St. Louis, États-Unis	221732
Spectrofluorimétrie	Shimadzu  ;	RF-5301  ;	équipée d’une lampe au xénon de 150 W et de cellules quartz de 1,00 cm
Tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane   ;	Sigma-Aldrich, St. Louis, États-Unis	77-86-1