Method Article

Visualisation de la dynamique spatio-temporelle des neurones du cortex somatosensoriel pendant l’électroacupuncture à l’aide de l’imagerie in vivo à deux photons

DOI:

10.3791/69340

⸱

January 16th, 2026

 ,  ,  , 
1Traditional Chinese Medicine, School of Medicine, Acupuncture Research Institute, Jianghan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole intègre des fenêtres crâniennes chez les souris transgéniques Thy1-GCaMP6f, l’électroacupuncture standardisée et l’imagerie à deux photons pour visualiser la dynamique de l’ensemble cortical à l’échelle de la milliseconde pendant la stimulation, révélant une plasticité spécifique à chaque couche.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole établit un cadre expérimental complet pour étudier la dynamique des circuits corticaux lors de la stimulation de l’EA (électroacupuncture). La méthodologie intègre trois éléments clés : l’implantation crânienne chronique de la fenêtre chez la souris transgénique Thy1-GCaMP6f, la stimulation standardisée de l’EA au point d’acupuncture ST36 utilisant des impulsions biphasiques à 2/100 Hz, et l’imagerie calcique à deux photons en haute résolution. Cette approche intégrée permet de visualiser en temps réel l’activité de l’ensemble neuronal dans le cortex somatosensoriel primaire (S1) avec une précision temporelle milliseconde, capturant des détails auparavant inaccessibles des réponses au niveau du réseau à la neuromodulation. La technique révèle avec succès des schémas d’activation spécifiques à chaque couche et des changements de plasticité longitudinale, fournissant des informations cruciales sur les mécanismes corticaux sous-jacents aux effets de l’EA. En surmontant les limitations spatiotemporelles fondamentales inhérentes à l’IRMf conventionnelle et aux techniques électrophysiologiques, cette plateforme haute résolution offre des capacités analytiques sans précédent pour cartographier les circuits neuronaux dynamiques. La conception robuste du protocole et ses résultats reproductibles le rendent particulièrement précieux pour optimiser les thérapies de neuromodulation ciblées et faire progresser notre compréhension de la plasticité au niveau des circuits en réponse à la stimulation périphérique.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’électroacupuncture, une adaptation moderne de l’acupuncture traditionnelle incorporant des courants électriques contrôlés appliqués via des aiguilles à des points d’acupuncture spécifiques, est reconnue pour moduler les circuits neuronaux impliqués dans le traitement de la douleur, le contrôle moteur et la fonction autonome. On pense que ses effets impliquent des cascades de signalisation complexes initiées par l’activation des nerfs sensoriels périphériques (principalement les fibres Aδ et C), conduisant à la libération de neurotransmetteurs (par exemple, opioïdes, sérotonine, GABA) et à une modulation subséquente aux niveaux spinal, cérébral etcortical 1,2. Les structures clés impliquées incluent les cortex somatosensoriels. Au sein du cortex S1, qui traite les informations tactiles et nociceptives, l’EA influence probablement à la fois les équilibres inhibiteurs-excitateurs locaux et la connectivité à longueportée 3,4. Cependant, la séquence temporelle précise d’activation/inhibition à travers différentes populations neuronales (par exemple, neurones pyramidaux, interneurones) et les couches au sein de S1 pendant et immédiatement après la stimulation de l’EA reste largement inexplorée en raison des contraintes méthodologiques mentionnéesprécédemment 5,6. Comprendre ces dynamiques en temps réel est crucial pour optimiser les paramètres d’EA et prédire les résultats thérapeutiques.

Les méthodes traditionnelles pour étudier les effets neuromodulateurs de l’électroacupuncture (AA) sur les circuits corticaux, telles que les études comportementales et les analyses post-mortem, offrent des informations précieuses mais ne permettent pas de capturer l’activité neuronale en temps réel avec une haute résolution spatiotemporale 7,8. Pour surmonter ces limitations, l’imagerie calcique à deux photons in vivo apparaît comme une alternative puissante, permettant une visualisation directe de la dynamique de l’ensemble neuronal lors de lastimulation 8,9. Cette technique offre des avantages sans précédent pour les études longitudinales chroniques, permettant aux chercheurs d’observer — avec une résolution cellulaire — l’activité rapide et répartie à travers les couches corticales chez des animaux éveillés et comportés. Contrairement à l’électrophysiologie aiguë, qui offre une haute résolution temporelle mais une couverture spatiale limitée, l’imagerie à deux photons facilite la surveillance à grande échelle de centaines voire de milliers de neurones simultanément dans un champ de vision défini 9,10. De plus, comparée à l’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf), qui excelle dans la couverture cérébrale globale mais fonctionne à des échelles temporelles plus lentes et manque de spécificité cellulaire, l’imagerie calcique à deux photons permet une détection fine de l’activité de populations neuronales spécifiques sur une échelle temporelle pertinente pour les processus synaptiques et au niveau descircuits 11,12. Ainsi, l’imagerie à deux photons est particulièrement positionnée pour combler un vide critique dans notre compréhension de la manière dont les stimuli d’EA périphérique sont traduits en schémas d’activation corticales spatio-temporellement précis, en particulier dans des régions telles que le cortex somatosensoriel primaire (S1). En tant que principal centre du traitement somatosensoriel (y compris les signaux des points d’acupuncture), et étant donné que l’EA module robustement son activité, S1 représente une porte stratégique pour étudier la dynamique des circuits corticaux induite par l’électroacupuncture.

La microscopie à balayage laser à deux photons (2PLSM) couplée à des indicateurs de calcium génétiquement codés (GECI), tels que GCaMP6, représente un outil révolutionnaire pour les neurosciences. Il permet l’imagerie chronique et haute résolution de l’activité neuronale in vivo avec une spécificité cellulaire etsubcellulaire 13. Les GECI fluorescent en proportion des transitoires calciques intracellulaires, servant de proxy fiable pour la déchargeneuronale 14. De manière cruciale, l’utilisation par 2PLSM de la lumière d’excitation proche infrarouge offre une pénétration de profondeur supérieure (des centaines de microns) par rapport à la microscopie conventionnelle, permettant de visualiser l’activité dans les couches corticales superficielles et même plus profondes (par exemple, L2/3, L4, L5). Sa section optique inhérente minimise la fluorescence floue et les dégâts photo, ce qui le rend idéal pour des études longitudinales sur des semaines ou desmois 15, 16, 17. Cette technologie représente une avancée révolutionnaire dans la recherche sur l’EA, avec le potentiel de transformer fondamentalement notre compréhension de celle-ci, offrant la possibilité de suivre la dynamique à l’échelle de la milliseconde de centaines voire milliers de neurones individuels simultanément dans un volume cortical défini pendant la stimulation.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les expériences ont utilisé des souris transgéniques Thy1-GCaMP6fâgées de 8 à 12 semaines. Toutes les procédures expérimentales et protocoles de soins aux animaux ont été menés conformément au Guide des National Institutes of Health (NIH) pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université des sciences et technologies de Huazhong (IACUC ; Numéro d’approbation du protocole : 3603). Tous les efforts ont été faits pour minimiser le nombre d’animaux utilisés et leur souffrance. Un schéma de la configuration expérimentale est présenté à la Figure 1.

1. Implantation crânienne chronique de la fenêtre

  1. Induction anesthésique et stabilisation stéréotaxique
    1. Initiez l’anesthésie en plaçant la souris Thy1-GCaMP6f âgée de 8 à 12 semaines dans une chambre d’induction alimentée en 4-5 % d’isoflurane (vol/vol) dans 100 % d’oxygène médical à un débit de 1 L/min.
    2. En cas de perte de réflexe de redressement (généralement en 2-3 minutes), transférez l’animal sur un tapis chauffant contrôlé par thermostat (maintenu à 37 °C) intégré dans un cadre stéréotaxique numérique.
    3. Fixez la souris à l’aide d’un cône nasal délivrant 1,5-2,0 % d’isoflurane pour l’entretien chirurgical. Appliquez une pommade ophtalmique (par exemple, la pommade Puralube Vet) sur les deux yeux pour éviter la dessiccation cornéenne.
    4. Insérez soigneusement des barres d’oreille non traumatiques dans le méat auditif externe, en assurant une position symétrique sans pression excessive pouvant causer des lésions tissulaires ou une rupture de la membranetympanique 19.
    5. Sécuriser le palais maxillaire à l’aide d’une pince nasale, en évitant ainsi une obstruction des voies respiratoires.
    6. Confirmez une anesthésie profonde en l’absence de réflexe de retrait des pédales, un pincement ferme de l’orteil et un rythme respiratoire stable et lent (80-120 respirations/min). Surveillez en continu la température centrale du corps à l’aide d’une sonde rectale et ajustez la bouillotte en conséquence.
    7. Administrez des analgésiques préventifs sous-cutanés (c.C.) (par exemple, Carprofène, 5 mg/kg) et un soutien liquide (sérum stérile, 0,5-1 mL de c.c.). Vérifiez les paramètres physiologiques stables (SpO₂ > 95 %, respiration régulière) tout au long de l’installation.
  2. Exposition chirurgicale du crâne
    1. Rasez méticuleusement le cuir chevelu dorsal à l’aide d’une tondeuse électrique, puis appliquez une crème dépilatoire chimique pour une épilation complète. Rincez soigneusement avec du sérum stérile.
    2. Effectuer des antisepsis séquentielles : frotter la peau exposée trois fois, en alternant entre des prélevés de povidone-iode (10 %) et des écouvillons à 70 % d’alcool isopropylique, en terminant par une solution de gluconate de chlorhexidine (2 %).
    3. À l’aide de ciseaux micro-disséquables stériles et de pinces fines (Dumont #5), effectuer une incision sagittale de la ligne médiane (~15-20 mm de long) à travers la peau et le tissu conjonctif sous-jacent, en commençant à ~2 mm derrière les yeux et s’étendant jusqu’à la jonction interpariétale-occipitale.
    4. Utilisez des pinces micro-hémostatiques ou une cautérisation bipolaire (réglage bas) pour contrôler les saignements capillaires le long des bords de l’incision. Rétractez doucement les lambes cutanées latéralement à l’aide de micro-rétracteurs courbés ou de sutures en soie 5-0 ancrées au drapeau environnant.
    5. Exposez tout le calvaire dorsal, y compris les os frontal, pariétal et interpariétal. À l’aide d’une micro-curette (#00), grattez méticuleusement le périoste – une membrane vasculaire fibreuse adhérente à la surface osseuse – sous forte grossissement (microscope chirurgical).
    6. Appliquez des coups doux et tangentiels pour éviter de creuser le crâne ou d’endommager les points de suture (bregma, lambda, sagittal, coronal). Obtenir une surface osseuse lisse et avasculaire, essentielle à une craniotomie précise et à la liaison adhésive qui en découle.
    7. Irriguez fréquemment le champ avec une solution stérile tiède (37 °C) à 0,9 % de solution saline pour éliminer la poussière osseuse et maintenir l’hydratation des tissus.
  3. Ciblage stéréotaxique de la région du membre postérieur S1
    1. À l’aide d’un bras manipulateur stéréotaxique de haute précision, placez la pointe d’un stylo chirurgical fin ou d’un micro-foret directement au-dessus du point de référence anatomique (l’intersection des points coronales et sagittals). Confirmez les coordonnées sous visualisation au microscope (10x).
    2. Ajustez le manipulateur pour déplacer précisément le marqueur antéropostérieur (AP) -1,5 mm (postérieur à la bregme) et médiolatéral (ML) +2,0 mm (hémisphère droit) par rapport à la ligne médiane (suture sagittale).
      REMARQUE : Cette localisation correspond à la zone de représentation du membre postérieur (S1HL) du cortex somatosensoriel primaire (S1).
    3. Gravez légèrement un petit réticule (<0,5 mm) sur la surface de l’os pariétal exposé à cette coordonnée, assurant ainsi une visibilité sans pénétrer l’os.
    4. Vérifier l’absence de vasculature majeure de surface traversant le site marqué ; si des vaisseaux importants sont présents, ajustez au minimum les coordonnées ML (±0,1-0,2 mm) pour les éviter, car les vaisseaux duraux peuvent saigner abondamment s’ils sont percés et entraver la clarté optique.
    5. Documentez les coordonnées finales ajustées.
  4. Exécution précise de craniotomie
    1. Centrez un point de biopsie stérile et jetable de 3 mm de diamètre précisément au-dessus de la coordonnée S1HL marquée. Appliquez une pression ferme et constante vers le bas tout en faisant tourner doucement le poinçon pour marquer complètement la couche osseuse corticale externe autour de la circonférence. Retirez le punch.
    2. À l’aide d’une perceuse micro-chirurgicale à grande vitesse (par exemple, avec une meule en carbure de 0,5 à 0,8 mm) fixée à un bras stéréotaxique sous irrigation constante à 0,9 % de solution saline (refroidissement et élimination des débris), on amincisse soigneusement l’os à l’intérieur du cercle marqué.
    3. Forez par courtes rafales en utilisant un mouvement léger et tangentiel de fraisage, progressant systématiquement de la périphérie vers le centre. Surveillez de près la translucidité osseuse sous grossissement.
    4. Cessez immédiatement le forage dès qu’on observe une apparition subtile de « rougissement » de la dure-mère sous-jacente, indiquant une épaisseur osseuse minimale (<50 μm). Passez à des micro-pinces fines (Dumont #5/45) et des microciseaux pour soulever et retirer méticuleusement les fragments d’os fins restants, en travaillant radialement vers l’extérieur à partir du centre.
    5. Préserver la dure-mère intacte – assurez-vous qu’elle soit translucide et brillante, sans déchirures ni saignements importants. Contrôlez immédiatement tout saignement dural mineur en appliquant une pression douce avec une mousse compressée stérile imbibée de solution physiologique ou de thrombine à 0,9 %.
    6. Irriguez abondamment la dure-mère exposée avec du liquide céphalorachidien artificiel (LCR) chaud et stérile ou une solution saline à 0,9 % pour éliminer tous les débris osseux. Éviter la dessiccation17,20.
  5. Implantation crânienne chronique de fenêtres et fixation tête-barre
    1. Préparez une gaine circulaire stérile de 3 mm de diamètre, épaisseur #1 (environ 150 μm). Éventuellement, enduire sa surface interne d’une fine couche d’élastomère de silicone pour une clarté optique et une adhérence réduite.
    2. Placez la gaine de couverture précisément sur la craniotomie à l’aide de pinces fines. Préparez un ciment dentaire à durcissement rapide et à durcissement léger (par exemple, Metabond ou Charisma) selon les instructions du fabricant.
    3. En travaillant rapidement (<90 s), appliquez une fine perle de ciment autour du périmètre de la toile de revêtement, directement sur la surface sèche et propre du crâne. Assurez-vous que le ciment scelle complètement le bord de la housse sans qu’il s’évasse en dessous sur la dura-mère.
    4. Durcez immédiatement le ciment à l’aide d’une lampe de durcissement dentaire (lumière bleue, 450 nm) pendant 20 à 30 secondes par quadrant. Renforcez le joint avec plusieurs couches d’un ciment dentaire acrylique auto-durcissement de 5 mL à durcissement plus lent (par exemple, Jet Repair Acrylic ou Paladur), en construisant un capuchon robuste et à profil bas (< 2 mm de hauteur) qui s’étend de plusieurs millimètres au-delà du bord de la craniotomie sur le crâne environnant.
    5. Insérer une barre de tête légère, en acier inoxydable ou en titane sur mesure (par exemple, de 15 à 20 mm de long avec ouverture centrale) dans le bouchon de ciment lors de sa phase initiale de durciment.
    6. Assurez-vous que la barre de tête est positionnée parallèlement à la suture sagittale et centrée au-dessus de la fenêtre, fournissant des points de fixation rigides et équilibrés pour une future retenue de tête sous le microscope sans entraver l’accès optique.
    7. Laissez le ciment durcir complètement (≥15 min). Vérifier l’hémostasie complète et la clarté desfenêtres 21.
  6. Récupération postopératoire et suivi
    1. Après le durcissement au ciment, libérez délicatement la souris des barres d’oreilles et de la pince nasale. Arrêtez l’isoflurane et administrez 100 % d’oxygène jusqu’à ce que la respiration spontanée reprenne complètement.
    2. Administrez la buprénorphine HCl (0,05-0,1 mg/kg s.c.) immédiatement après l’opération pour l’analgésie. Transférez l’animal dans une chambre de récupération préchauffée (30-32 °C), complétée en oxygène, tapissée d’une litière en papier propre.
    3. Surveillez en continu jusqu’à ce que la couche sternale et la marche complète soient rétablies (généralement 30 à 60 minutes). Administrez une seconde dose de carprofène (5 mg/kg de c.s.) 24 heures après l’opération. Fournissez une solution de Ringer lactée chauffée (1 mL de s.c.) pour soutenir l’hydratation si besoin.
    4. Héberger la souris seule dans une cage standard enrichie de matériau de nidification afin d’empêcher ses compagnons de cage d’endommager l’implant de tête. Maintenir les conditions environnementales (22-24 °C, 40-60 % d’humidité, cycle clair/obscurité de 12:12 h) avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’hydrogel.
    5. Surveillez la souris au moins deux fois par jour pendant 7 jours après l’opération pour détecter des signes de douleur/détresse (posture voûtée, piloérection, diminution de l’activité, perte de poids >15 %), infection (écoulement purulen, gonflement, rougeur), déficit neurologique ou relâchement de la barre de tête.
    6. Prévoyez une période minimale de récupération de ≥7 jours avant de commencer toute procédure expérimentale (imagerie ou EA) afin d’assurer la résolution de l’inflammation chirurgicale aiguë, le rétablissement du comportement normal et de la dégagement glymphatique, ainsi que la stabilisation de l’activité corticale de base. Peser l’animal quotidiennement pour suivre larécupération 22.

2. Stimulation par électroacupuncture

  1. Localisation anatomique précise du point d’acupuncture ST36
    1. Ciblez le point d’acupuncture ST36 (« Zusanli ») en vous basant sur des repères anatomiques établis dans le membre postérieur de la souris. Avant l’insertion de l’aiguille, palpez le tibia antérieur proximal pour identifier la tubérosité tibiale – la proéminence osseuse proéminente située juste à la distance de l’articulation du genou où s’insère le ligament rotulien.
    2. À l’aide d’un pied à coulisse fin ou d’un marqueur stérile, mesurez 2 mm latéral (vers la fibule) et 2 mm caudal (postérieur) par rapport au centre de la tubérosité tibiale. Cette localisation correspond au ventre musculaire antérieur du tibial, superficiel à la branche profonde du nerf péronier et proximal à la bifurcation de l’artère tibiale antérieure.
    3. Confirmez l’absence de vaisseaux sanguins superficiels majeurs sur le site par transillumination si nécessaire.
      REMARQUE : La précision est cruciale, car de légères déviations (>0,5 mm) peuvent modifier significativement les structures neuronales stimulées et les réponses corticales ultérieures dans S1. L’identification des points de repère doit être réalisée de manière cohérente par du personnel formé afin de minimiser la variabilité entreopérateurs 23,24.
      REMARQUE : Les méthodes pour assurer la stabilité de l’aiguille sont : (i) Après l’insertion et la fixation de l’aiguille, une période d’adaptation est accordée à la souris pour s’acclimater et réduire les difficultés initiales. (ii) La fréquence de vibration générée par le stimulateur d’électroacupuncture (par exemple, 2 Hz) est intrinsèquement faible en amplitude. De plus, les aiguilles fines utilisées (par exemple, Φ0,16 mm) possèdent une rigidité suffisante pour résister efficacement à cette vibration minimale. (iii) Tout au long de l’expérience, l’opérateur surveille en permanence la position de la pointe de l’aiguille. Les données des essais seront exclues si un déplacement significatif causé par le mouvement de l’animal est observé.
  2. Technique d’insertion stérile par aiguille
    1. Après désinfection cutanée (alternance entre 70 % d’éthanol et de chlorhexidine), insérez une aiguille d’acupuncture stérile en acier inoxydable à usage unique (diamètre nominal : 0,18 mm, équivalente à un calibre 36 ; longueur : 13 mm) perpendiculairement dans la peau à la coordonnée ST36 indiquée.
    2. Avancez l’aiguille progressivement à travers la peau, le tissu sous-cutané et jusqu’au muscle tibial antérieur sous-jacent en effectuant un mouvement rotatif fluide pour minimiser les traumatismes tissulaires.
      REMARQUE : La profondeur d’insertion de la cible est de 3 mm à partir de la surface de la peau. Cette profondeur assure un engagement optimal des afférents musculaires de type II/III (fibres Aδ) et des fibres potentiellement somatiques de petit diamètre sans risque de contact avec le tibia sous-jacent ou les faisceaux neurovasculaires profonds.
    3. Fixez fermement le moyeu de l’aiguille à l’aide d’un petit tampon adhésif stérile ou d’une pince personnalisée pour éviter le délogement lors de stimulations électriques ultérieures et de mouvements subtils potentiels des membres.
    4. Vérifiez la stabilité du placement de l’aiguille en observant une légère fasciculation musculaire locale et transitoire lors de l’insertion – un indicateur physiologique d’un bon positionnement intramusculaire.
    5. Maintenez une technique aseptique stricte tout au long du processus pour prévenir l’infection, en particulier dans les paradigmes de stimulationchronique 23.
  3. Paramétrisation et délivrance de la stimulation par électroacupuncture
    1. Reliez la poignée isolée de l’aiguille insérée au canal de sortie de l’anode (+) d’un stimulateur programmable d’électroacupuncture (par exemple, HANS Acupoint Nerve Stimulator, modèle LH202).
    2. Placez une électrode cathode de référence (-), généralement une petite plaque en acier inoxydable ou une électrode à clip recouverte de gel conducteur, sur la patte postérieure ipsilatérale (par exemple, surface plantaire près du talon).
    3. Assurez-vous de contacts sécurisés et d’impédance basse (<5 kΩ) sur les deux sites. Programmer le stimulateur pour délivrer des impulsions biphasiques à ondes carrées (phases positives/négatives équilibrées) afin de minimiser la polarisation des électrodes et les dommages tissulaires.
    4. Réglez le paradigme de stimulation en mode dispersion dense : des rafales alternées de 2 Hz (basse fréquence) pendant 3 secondes suivies de 100 Hz (haute fréquence) pendant 3 secondes.
      REMARQUE : Ce schéma de fréquence combiné (souvent noté 2/100 Hz) est empiriquement démontré comme augmentant la libération d’opioïdes endogènes (par exemple, β-endorphine, enképhaline) et de monomines (par exemple, sérotonine, noradrénaline) dans le SNC de manière plus efficace que les fréquences uniques seules.
    5. Ajustez progressivement l’intensité actuelle à partir de 0,1 mA jusqu’à ce qu’un léger spasme rythmique de la patte (flexion des doigts ou de la cheville) soit observé visuellement - généralement atteint entre 1,0 mA chez les souris adultes sous anesthésie légère. Ce seuil de contraction indique un recrutement suffisant des efférents moteurs et des afférentes de grand diamètre associés (fibres Aβ), confirmant l’activation physiologique sans provoquer de détresse ni de lutte vigoureuse. Maintenez cette intensité calibrée tout au long de la séance de stimulationde 20 minutes 25,26.
  4. Contrôles procéduraux critiques et surveillance physiologique
    1. Atténuation des artefacts de stimulation
      1. Séparez physiquement les câbles EA de l’équipement d’imagerie/headstage.
      2. Mettez en place une mise à la terre robuste : Connectez la borne de masse du stimulateur à une masse dédiée et assurez-vous que le cadre du microscope et la bouillotte pour animaux partagent un point de mise à la terre commun.
      3. Synchronisez temporellement les impulsions de stimulation avec le signal de blanking du microscope si possible, ou utilisez un traitement du signal post-hoc pour éliminer les artefacts électriques résiduels des traces de calcium.
    2. Stabilité physiologique
      1. Surveillez en continu la température corporelle centrale (maintenue à 37,0 ± 0,5 °C via un coussin chauffant contrôlé par rétroaction), la fréquence respiratoire (80-120 respirations/min) et la SpO₂ (>95 %) tout au long de la séance EAE de 20 minutes.
      2. Maintenir une anesthésie légère à l’isoflurane (1,0-1,5 %) pour l’immobilité lors de l’imagerie/stimulation combinée. Observez en permanence le tressaillement induit de la patte ; si elle diminue ou cesse, vérifiez le contact et l’impédance de l’aiguille, et ajustez légèrement l’intensité (≤0,1 mA par incréments) pour maintenir une activation motrice régulière et modérée.
      3. Interrompez immédiatement la stimulation si des signes de détresse (par exemple, tachypnée, lutte vigoureuse) apparaissent.
    3. Reproductibilité
      1. Utilisez le même type d’aiguille, profondeur d’insertion, modèle de stimulateur et méthode de calibration (seuil de traction de patte) pour tous les animaux et sessions. Documentez l’intensité finale de stimulation utilisée pour chaque sujet.
      2. Prévoyez une période de récupération minimale de 5 minutes après la stimulation avant de mettre fin à l’anesthésie ou d’effectuer des procédures supplémentaires27,28.

3. Imagerie à deux photons pendant l’EA

  1. Préparation animale, fixation de la tête et entretien physiologique
    1. Après ≥7 jours de récupération post-chirurgicale, fixez la tête de la souris Thy1-GCaMP6f à l’aide de la barre frontale implantée dans un appareil de fixation conçu sur mesure et amorti par les vibrations, monté sur une scène XY motorisée.
    2. Placez l’animal confortablement sur un tapis de course cylindrique à faible friction lubrifié à l’air, permettant un mouvement libre des membres postérieurs. Maintenir une anesthésie chirurgicale légère par administration de nez à 0,5-0,8 % d’isoflurane dans 100 % d’O₂. Ce niveau réduit d’isoflurane minimise la suppression de l’activité neuronale tout en assurant une mobilité suffisante pour l’imagerie haute résolution.
    3. Surveillez et enregistrez en continu la température corporelle centrale (maintenue à 37,0 ± 0,2 °C via une bouillotte contrôlée par rétroaction), la fréquence respiratoire (100-140 respirations/min) et la saturation périphérique en oxygène (SpO₂ > 95 %).
    4. Appliquez un gel ophtalmique pour éviter que la cornéenne ne sèche lors d’une imagerie prolongée. Assurez-vous que l’ipsilatéral du membre postérieur à la fenêtre crânienne S1HL soit accessible pour l’insertion de l’aiguille EA à ST36.
    5. Prévoyez 15 à 20 minutes pour la stabilisation physiologique après la fixation de la tête avant d’initierl’imagerie 29.
  2. Ciblage optique et optimisation pour l’imagerie des couches II/III
    1. Déterminez précisément le plan focal pour acquérir des signaux neuronaux de haute qualité. Suivez cette procédure de vérification.
      1. Réduisez la puissance du laser à un faible niveau (généralement 10-20 % de la puissance d’imagerie, par exemple 5-10 mW) pour éviter un photoblanchiment inutile et des dégâts photodégradés lors de la position de l’avion.
      2. En utilisant l’entraînement de l’axe Z du microscope à deux photons, déplacez lentement l’objectif par pas microniques. Commencez par la surface de la fenêtre crânienne et progressez plus profondément dans le tissu cérébral.
      3. En mode aperçu en direct , identifiez le plan focal à l’aide de ces indicateurs visuels décrits aux étapes 3.2.1.4 et 3.2.1.5.
      4. Pour le bon plan focal sur une couche de soma neuronale : Confirmez que l’image montre des structures ponctuées claires, lumineuses (somates neuronales) apparaissant rondes ou ovales avec un bon contraste de fond. Assurez-vous que les limites cellulaires sont nettes et présentent une apparence distincte de « poivre et de sel ».
      5. Pour un plan focal incorrect : si l’image apparaît floue ou homogène sans structures ponctuelles bien définies, reconnaissez que la mise au point se trouve dans une région dépourvue de somata. Si de grandes ombres vasculaires sombres et non structurées sont visibles, identifiez-les comme la couche des vaisseaux sanguins.
    2. Vérification de la référence de fluorescence appropriée
      1. Confirmez une base de fluorescence saine et stable avant d’appliquer tout stimulus expérimental afin d’assurer une interprétation valide des signaux calciques ultérieurs (ΔF/F). Exécutez les étapes 3.2.2.2-3.2.2.4.
      2. Ajustez la puissance du laser au niveau d’imagerie formel (par exemple, 30-50 mW).
      3. Acquérez des images pendant quelques secondes en mode aperçu rapide et basse résolution.
      4. Observez l’intensité moyenne de fluorescence affichée en temps réel (ou surveillez directement la luminosité de l’image). Vérifiez que le signal reste stable et ne montre aucun signe de photoblanchiment rapide avant de procéder à l’acquisition expérimentale des données.
    3. Centrer le champ visuel d’imagerie à l’intérieur de la fenêtre crânienne.
      1. Appliquez du gel ultrasonique ou de l’eau distillée entre l’objectif et le couloir pour le couplage en immersion. En utilisant un contraste à gradient Dodt infrarouge ou un éclairage par épifluorescence, identifiez la vascularisation de surface et alignez le champ de vision (FOV) pour éviter de grands vaisseaux de surface (diamètre >20 μm).
      2. Passez au mode d’excitation à deux photons à l’aide d’un laser Ti :Sapphir à impulsion femtoseconde accordable. Régler la longueur d’onde d’excitation à 920 nm – optimal pour exciter GCaMP6f (pic ~920 nm) tout en minimisant l’autofluorescence verte et les photodégâts par rapport aux longueurs d’onde plus courtes.
      3. Augmentez progressivement la puissance du laser (généralement 20-50 mW mesurée à l’échantillon) tout en focalisant à travers la dure-mère transparente vers la surface corticale (pia mater). Ajustez la position Z de l’objectif à l’aide d’un dispositif piézoélectrique de nano-focalisation pour atteindre une profondeur de 200 ± 10 μm sous la surface pial, correspondant à la couche corticale II/III.
      4. Confirmer la profondeur via la densité et la morphologie neuronales caractéristiques : une population dense de neurones pyramidaux somates petits à moyens (10-15 μm de diamètre) avec des dendrites apicales visibles.
      5. Optimiser la puissance du laser et les réglages de gain du tube photomultiplicateur (PMT) pour obtenir une fluorescence de base GCaMP6f forte (F0) sans saturation (intensité des pixels ~50-70 % du maximum du détecteur) et un fondminimal 30,31.
        REMARQUE : Lors de l’imagerie, la puissance moyenne de la lumière d’excitation de 920 nm a été maintenue précisément à 30-50 mW à l’objectif. Ce niveau de puissance a été validé par des expériences pilotes sur des tissus animaux soumis à des interventions chirurgicales identiques, garantissant une acquisition efficace du signal pendant des durées de balayage allant jusqu’à 25 minutes tout en minimisant les photodégâts et le photoblanchiment par fluorescence.
  3. Protocole d’acquisition à haute vitesse du calcium
    1. Configurez le scanner résonant pour l’acquisition de trames à grande vitesse :
      Taille de l’image : 512 × 512 pixels (champ de vision typique : ~450 × 450 μm, taille des pixels ~0,88 μm)
      Fréquence d’images par seconde : 7 images par seconde (fps) obtenue via un balayage bidirectionnel (~14 kHz de fréquence de ligne). Ce taux échantillonne adéquatement la cinétique de désintégration GCaMP6f (τ~500 ms) tout en équilibrant le rapport signal/bruit (SNR) et en minimisant le photoblanchiment.
      Temps de séjour des pixels : ~0,8 μs (optimisé pour le SNR à 7 Hz).
    2. Lancer l’acquisition en accéléré continu à l’aide d’un logiciel d’acquisition (par exemple, ScanImage, Prairie View). Enregistrez une période de base de 5 minutes avant le début de la stimulation de l’EA afin d’établir la dynamique de l’activité neuronale (F₀) avant le stimulus.
    3. À exactement t = 5 min, commencez la stimulation EA à ST36 pendant que l’imagerie continue sans interruption. Recueillez des données en continu pendant la période de stimulation EA, de 20 minutes. Durée totale du balayage = 25 min (1500 s, ~10 500 images).
    4. Les données sont enregistrées sous forme de pile multi-TIFF ou de format binaire propriétaire avec des horodatages intégrés synchronisés aux impulsions de déclenchement EA via un canal d’entrée TTL.
    5. Surveille la stabilité de puissance du laser et la dérive de mise au point (<2 μm) en temps réel ; Faites une pause brève pour refocalisation uniquement si une dérive significative se produit (par exemple, >5 μm), en notant le pointtemporel 32,33.
  4. Correction rigoureuse du mouvement et enregistrement spatial
    1. Après l’acquisition, traitez la pile d’imagerie brute à l’aide de NoRMCorre (Non-Rigid Motion Correction) dans MATLAB pour éliminer les artefacts spatiaux issus des micromouvements résiduels (par exemple, respiration, impulsion).
    2. D’abord, divisez la pile en zones spatiales qui se chevauchent (par exemple, 64 × 64 pixels, 50 % de chevauchement). Pour chaque correctif, calculez un modèle de référence en moyennant les trames à SNR élevé à partir de la période de référence.
    3. En utilisant la corrélation croisée basée sur Fourier, calculez les décalages translationnels X-Y pour chaque image relative au modèle. Appliquez ces décalages par interpolation par sous-pixel.
    4. Ensuite, traiter les déformations non rigides : modéliser les distorsions locales dans les patches à l’aide de transformations affines par morceaux (translation + cisaillement). Mettez à jour itérativement le modèle pour améliorer la précision des inscriptions. Paramètres clés :
      max_shift : 20 pixels (limite pour la traduction)
      max_dev : 3 pixels (déviation maximale non rigide)
      bin_width : 50 images (binning temporel pour les mises à jour des modèles)
    5. Visualisez l’efficacité de la correction en inspectant le graphique de corrélation image à image (devrait se stabiliser près de 1,0 après correction) et en générant une carte moyenne de différence de projection d’image (avant et après correction). Gardez la pile corrigée de mouvement pour l’analyse en aval. Cette étape est cruciale pour une analyse précise pixel par pixel des transitoires calciques, en particulier lors des mouvements subtils des membres induits par l’EA.

4. Analyse de la dynamique spatiotemporelle

La pile d’imagerie corrigée en mouvement subit une segmentation neuronale automatisée et une extraction de signaux via le pipeline Suite2p (v0.12.3) en Python. Les étapes clés du traitement incluent :

  1. Identification des empreintes spatiales
    1. Appliquer la factorisation matricielle non négative contrainte (CNMF) pour décomposer la pile en composantes spatiales.
    2. Initialiser les régions d’intérêt (ROI) en utilisant une approche basée sur la corrélation : fusionner les pixels avec une corrélation spatiale croisée > 0,7 et un SNR local > 4 en ROI candidats. Distinguer les ROI somatiques des dendrites/axones par la taille (diamètre 8-15 μm) et la circularité (seuil de compacité >0,6).
  2. Correction de la contamination par neuropil
    1. Pour chaque ROI, définissez un anneau neuropil concentrique (rayon interne : 1,5× rayon ROI, rayon externe : 2,5× rayon ROI).
    2. Calculez le coefficient de neuropil (r_neuropil) via la régression des moindres carrés :
      F_corrected(t) = F_raw(t) - 0,7 × F_neuropil(t)
      (Coefficient validé empiriquement pour les souris Thy1-GCaMP6f).
  3. Déconvolution du signal
    1. Inférez l’activité de pics à l’aide d’OASIS (déconvolution régularisée l₁) avec un modèle de bruit AR(2) pour estimer la probabilité de pic S(t) à partir des traces ΔF/F :
      ΔF/F(t) = k ⋅ S(t) + b + ε
      où 'k' est le noyau transitoire du calcium et ε est le bruit gaussienne.
  4. Contrôle qualité
    1. Excluez les ROI avec un SNR <3, un chevauchement spatial >30 % ou une corrélation neuropil >0,3. La vérification visuelle est réalisée via l’interface graphiqueSuite2p 34.
      Les opérations spécifiques et les éléments d’interface sont fournis dans le Fichier Supplémentaire 1. Le fichier TIFF corrigé de mouvement généré ci-dessus a été directement intégré au pipeline Suite2p. Bien que l’environnement intégré de Suite2p inclue sa propre correction rigide du mouvement, cette étape interne redondante a été désactivée puisqu’une correction non rigide plus précise était déjà appliquée. Les ROI neuronaux extraits automatiquement sont disponibles dans le Fichier Supplémentaire 2.

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Results

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Caractérisation structurelle du cortex S1 et de l’activité neuronale de base
Nous avons commencé par établir une base structurelle et fonctionnelle de haute fidélité pour nos expériences d’imagerie. L’analyse de morphologie tissulaire a révélé des différences structurelles discernables entre les préparations crâniennes à fenêtre non cappliquées (Figure 2A) et appliquées par la couche de couverture (Figure 2B)...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour combler le fossé critique dans l’observation en temps réel des effets corticaux de l’électroacupuncture (EA), nous présentons un protocole intégré complet combinant l’implantation crânienne chronique de fenêtre pour l’accès optique, la stimulation standardisée de l’EA et l’imagerie calcique longitudinale à deux photons ciblant le cortex somatosensoriel primaire (S1).

Ce protocole intégré offre plusieurs avantages distincts par rapport aux méthodes traditi...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 82405550). Nous remercions les membres du laboratoire Zhang pour leurs discussions utiles.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CarprofèneMCEN/A5 mg/kg pour l’analgésie
Cadre stéréotaxique numériquePropulsionKopf Modèle 1900
Stimulateur d’électroacupunctureHANS LH202 (impulsions biphasiques 2/100 Hz)N/AHANS LH202 (impulsions biphasiques 2/100 Hz)
IsofluranePropulsionR510-22-10Véhicule d’oxygène de qualité médicale, 100 %
Système de micro-foragePropulsionmeule en carbure de 0,5 mm, refroidie par solution saline
Povidone-iodeMCEHY-B2234Solution à 10 %
ScanImageScanImagehttps://scanimage.org/
Solution saline stérileBeyuntianST341-500ml0,9 % NaCl
Microscope chirurgicalZeisshttps://www.zeiss.com/meditec/en/products/surgical-microscopes.html10-40 et fois ; Grossissement
Souris transgéniques Thy1-GCaMP6fCygen55239788-12 semaines, mâle/femelle
Microscope à deux photonsNikon A1MPNikon A1MPLaser Ti :Sapphire (excitation 920 nm)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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