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Interférométrie de biocouches pour étudier la liaison des inhibiteurs de protéines membranaires : TACAN Mutant et GsMTx4 comme système modèle

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DOI :

10.3791/69348

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8 mai 2026

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1Department of Biochemistry and Pharmacology, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 2ARC Centre for Cryo-electron Microscopy of Membrane Proteins, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 3Melbourne Protein Characterization, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne

Dans cet article

Résumé

Ce manuscrit fournit un protocole détaillé pour optimiser et mener des expériences d’interférométrie bio-couche (BLI) afin d’étudier les interactions membrane-ligand protéine-ligand pour les protéines membraneuses solubilisées en détergent. En utilisant l’interaction entre le mutant TMEM120A M207A et l’inhibiteur peptidique GsMTx4 comme modèle, ce flux de travail décrit la préparation des protéines, la charge des biocapteurs et l’acquisition de données cinétiques.

Résumé

L’interférométrie à couche biologique (BLI) est une technique biophysique efficace qui permet une analyse quantitative en temps réel des interactions biomoléculaires. Bien qu’elles soient couramment utilisées pour les protéines solubles, leur application aux protéines membranaires reste difficile en raison de l’hydrophobie et de la dépendance aux détergents. Cette étude présente un protocole BLI optimisé pour caractériser les interactions entre la protéine membranaire solubilisée dans un détergent et l’inhibiteur peptidique.

En tant que système modèle, le peptide modificateur de gating Grammostola mécanotoxine 4 (GsMTx4) a été testé contre le mutant multifonctionnel de la protéine membranaire TMEM120A M207A. La variante TMEM120A marquée FLAG a été immobilisée sur des biocapteurs anti-FLAG — représentant une configuration basée sur des balises mais sans fluorescent ni enzymatiques — et exposée à des dilutions en série de GsMTx4 pour mesurer les taux d’association et de dissociation.

Le protocole intègre l’optimisation des détergents à l’aide de Lauryl Maltose Néopentyle Glycol (LMNG) et une caractérisation complémentaire par photométrie de masse et fluorimétrie différentielle à balayage (DSF). Ce flux de travail permet des mesures cinétiques fiables et est compatible avec le criblage à débit moyen. Cette approche peut être applicable à d’autres systèmes membranes protéine-ligand où la stabilité du détergent est maintenue. Dans l’ensemble, l’étude met en lumière des paramètres clés influençant l’efficacité de l’immobilisation et la délivrance des analytes, soutenant l’utilité potentielle de la BLI dans le profilage des inhibiteurs et les études mécanistes des interactions protéiques membranaires.

Introduction

Les protéines membranaires jouent un rôle central dans des processus physiologiques essentiels, notamment la transduction du signal, le transport d’ions et de métabolites, ainsi que l’organisation de la membrane. Compte tenu de leur implication dans la communication cellulaire et l’homéostasie, ils représentent une proportion importante des cibles médicamenteuses dans le développement clinique. Comprendre les interactions membrane-protéine-ligand est essentiel pour élucider la fonction et orienter la conception thérapeutique. Cependant, la nature amphipathique de ces protéines et leur dépendance aux environnements lipidiques posent des défis importants pour la purification, la stabilisation et la caractérisation biophysique.

La résonance plasmonique de surface (SPR) et la calorimétrie de titration isotherme (ITC) sont des techniques largement utilisées pour étudier la cinétique et la thermodynamique des interactions membrane-ligandprotéine-ligand 1,2. Lorsqu’elles sont correctement optimisées, les deux méthodes peuvent fournir des informations quantitatives détaillées, même pour des protéines membranaires solubilisées ou reconstituées dans un détergent. La thermophorèse à l’échelle microscopique (MST) a également été appliquée avec succès pour évaluer les affinités de liaison dans des conditions proches de la nativité, en particulier pour les protéines membranaires³. Néanmoins, ces approches peuvent être limitées par une consommation importante d’échantillons, des difficultés à maintenir la stabilité des protéines membranaires ou une compatibilité limitée avec certains systèmes de détergents.

L’Interférométrie à Biocouche (BLI) est une technique optique en temps réel qui permet la mesure quantitative des interactions biomoléculaires, y compris celles impliquant des protéines membranaires solubilisées en détergent ou amphipol. En plus des techniques biophysiques mentionnées précédemment, le BLI offre une plateforme efficace permettant la mesure directe de la cinétique de liaison, incluant les constantes d’association (k on), de dissociation (koff) et d’équilibre (KD), avec des concentrations d’échantillons plus faibles et une adaptation directe aux protéines membranaires solubilisées en détergent ou en nanodisques. Il est également notable que, comme toutes les technologies biophysiques, BLI présente ses propres limites, qui seront mentionnées dans la section Discussion.

Le BLI détecte les changements dans le motif d’interférence de la lumière blanche réfléchie par la pointe d’un biosenseur, avec des variations d’épaisseur optique correspondant à des événements de liaison biomoléculaire. Ces décalages (Δλ, en nm) sont enregistrés sous forme de capteurs, proportionnels à la masse liée à la surface du capteur. Le BLI a été largement appliqué aux interactions protéine-protéine et protéine-ligand (y compris peptides et petites molécules) et convient à des plages d’affinité allant des nanomolaires aumicromolaire 4. Sa flexibilité, sa faible consommation d’échantillons et sa configuration relativement simple en font un outil potentiellement avantageux pour étudier les protéines membranaires solubilisées en détergent 5,6,7.

Cette étude présente un protocole BLI pour caractériser l’interaction entre TMEM120A M207A, une protéine membranaire, et la mécanotoxine Grammostola 4 (GsMTx4), un inhibiteur peptidique. TMEM120A a été proposé comme un canal ionique mécanosensible impliqué dans la détection mécanique de ladouleur 8 ; cependant, son activité dans les canaux ioniques reste controversée. De nombreuses études ont signalé l’absence de courants mécanosensibles lorsque TMEM120A est exprimé dans des systèmes hétérologues tels que les cellules HEK293 ouCHO 1,9,10,11. À ce jour, plus de quatre études cryo-EM ont résolu la structure de TMEM120A à l’état fermé, et aucune conformation ouverte n’a étéobservée 1,9,10,11.

Les simulations de dynamique moléculaire et les analyses électrophysiologiques indiquent que la méthionine 207 (M207) chez les TMEM120A humaines sauvages pourrait agir comme une barrière de barrière au sein de la voie de conductionionique 11. La mutation de ce résidu en alanine (M207A) a montré qu’elle augmente la perméabilité ionique, probablement en modifiant le packing hélicicoïdal et en déplaçant les chaînes latérales hydrophobes telles que Phe223. Par conséquent, le mutant M207A a été sélectionné pour des études de liaison avec GsMTx4.

GsMTx4 est un peptide modificateur dérivé du venin d’araignée qui inhibe les canaux cationiques mécanosensibles. Il se compose d’une séquence de 32 acides aminés et a un poids moléculaire de 4 à 5 kDa, incluant les canaux piézo-piézo-TRP, principalement en interagissant avec la bicouche lipidique plutôt qu’en obstruant directement lepore 12,13. Des études antérieures ont démontré que GsMTx4 réduit l’activité TMEM120A dans les systèmes bicouchesartificiels 8. Dans les tests BLI, le mutant M207A TMEM120A a été immobilisé sur des biocapteurs anti-FLAG et exposé à des concentrations croissantes de GsMTx4, permettant de mesurer les taux d’association (kactivés) et de dissociation (kdésactivés).

Ce travail fournit un protocole détaillé pour l’optimisation des détergents et l’analyse cinétique utilisant l’interférométrie bio-couche (BLI). Bien que le BLI présente certaines limitations, telles que des artefacts potentiels liés à la surcharge des capteurs ou aux effets de transport de masse, ainsi qu’une adaptabilité réduite aux interactions rapides à taux d’association (kon), il s’agit d’une méthode utile pour étudier les interactions membrane protéine-ligand dans des conditions contrôlées de solubilisation dans un détergent. Le protocole convient aux systèmes ayant des affinités de liaison modérées à faibles (généralement dans la plage des nanomolaires aux micromolaires) et peut être adapté à d’autres cibles hydrophobes lorsque des contrôles et des conditions tampon appropriées sont appliqués.

Protocole

1. Purification des protéines et optimisation des échantillons

  1. Culture cellulaire et transfection
    1. Cultivez des cellules de suspension HEK293T/SF17 dans un milieu sans sérum complétés avec 20 mM de L-glutamine dans un incubateur secoué réglé à 120 tr/min, 37 °C, 80 % d’humidité et 8 % de CO₂. Maintenir les cellules en passant jusqu’au passage cinq ; permettent aux cellules d’atteindre une densité d’environ 5 × 10⁶ cellules/mL.
    2. Transfecter les cellules avec le plasmide TMEM120A M207A (N-terminal FLAG-Linker-3C-Linker-TMEM120A M207A) dans le vecteur pCDNA3.1 à l’aide d’un réactif de transfection commercial selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
    3. Les cellules transfectées par pellet par centrifugation à 5 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C. Conservez la granule à -80 °C jusqu’à la purification.
  2. Lyse cellulaire et solubilisation (Figure 1)
    1. Resuspendre un pellet de cellules de 30 mL dans un tampon de solubilisation contenant 100 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-piperazine-éthanassulfonique (HEPES), pH 7,8 ; 300 mM NaCl ; 0,5 % (p/v) ou 4,98 mM de néopenylglycol maltose lauryl (LMNG) ; 1x cocktail inhibiteur de protéase ; 50 μg de DNase I ; 10 % (v/v) de glycérol.
    2. Lysez les cellules par ultrasonication à 25 % d’amplitude en utilisant un cycle d’impulsion de 20 s allumé/20 s d’arrêt pendant 15 minutes, tout en gardant l’échantillon sur la glace pour éviter la surchauffe.
    3. Clarifiez le lysat par centrifugation à 25 800 × g pendant 45 minutes à 4 °C.
  3. Purification d’affinité utilisant de la résine anti-FLAG
    1. Équilibrer la résine anti-FLAG M2 avec un tampon d’équilibrage contenant 25 mM HEPES, pH 7,8 ; 200 mM NaCl ; 0,05 % (v/v) ou 0,4975 mM LMNG ; 10 % (v/v) de glycérol.
    2. Incubez le surnageant clarifié avec de la résine équilibrée pendant 2 heures à 4 °C sur un bascule.
    3. Lavez la résine 2 fois avec un tampon contenant 25 mM HEPES, pH 7,8 ; 150 mM NaCl ; 0,05 % (v/v) ou 0,4975 mM LMNG ; 10 % (v/v) de glycérol.
    4. Éluvez la protéine liée à l’aide d’un tampon d’élution contenant 25 mM HEPES, pH 7,8 ; 400 mM NaCl ; 0,001 % (v/v) ou 0,00995 mM LMNG ; 10 % (v/v) de glycérol ; 200 μg/mL peptide FLAG.
  4. Chromatographie par concentration et exclusion de taille (SEC)
    1. Concentrez la protéine élue à ~500 μL à l’aide d’une unité centrifuge de filtration avec une coupure de 30 kDa.
    2. Effectuer la SEC en utilisant la colonne d’exclusion de taille référencée équilibrée avec 25 mM HEPES, pH 7,8 ; 200 mM NaCl ; 0,00015 % (v/v) ou 0,00149 mM LMNG.
    3. Collectez et regroupez les fractions de pic correspondant à la protéine cible.
    4. Concentrez les fractions groupées jusqu’à ~3 mg/mL de concentration finale. Après purification d’affinité, confirmez que le monomère de la protéine TMEM120A M207A apparaît à environ 43 kDa sur SDS-PAGE (Figure 2A). Pour la CES, confirmez que la protéine purifiée dans le LMNG élue comme un pic monodispersé correspondant à environ 150 kDa, ce qui représente le dimère TMEM120A M207A ainsi que le détergent LMNG micelle (Figure 2B).
      REMARQUE : Parfois, la bande protéique monomère peut apparaître autour de 50 kDa, ce qui est courant pour les protéines membranaires solubilisées en détergent, car l’ébullition des échantillons de protéines membranaires n’est pas courante.

2. Analyse de stabilité thermique par fluorimétrie différentielle nano (NanoDSF)

  1. Diluez la protéine TMEM120A M207A purifiée à 0,15 mg/mL dans un tampon SEC (25 mM HEPES, pH 7,8, 200 mM NaCl, 0,00015 % LMNG).
  2. Chargez 10 μL de chaque échantillon dans des capillaires à haute sensibilité.
  3. Effectuez le test de décalage thermique sur un instrument NanoDSF avec une rampe de température de 25 °C à 90 °C.
  4. Utilisez un logiciel compatible pour configurer l’analyse et effectuer une analyse automatisée.
  5. Confirmez qu’une seule courbe de transition thermique (Tm) est visible, indiquant un événement de déploiement coopératif (Figure 3).

3. Photométrie de masse pour la détermination de l’état oligomérique

  1. Préparer un échantillon dilué à 80 nM dans un tampon SEC (25 mM HEPES, pH 7,8, 200 mM NaCl, 0,00015 % LMNG).
  2. Placez l’échantillon dans des lames de masse compatibles avec la photométrie pré-nettoyées.
  3. Acquérir des données en utilisant des paramètres standards et calibrer selon des standards protéiques.
  4. Traiter les données avec un logiciel d’analyse pour générer des histogrammes de distribution de masse (Figure 4A-C).

4. Protocole d’interférométrie biocouche (BLI)

REMARQUE : Ce protocole décrit un test cinétique BLI conçu pour étudier les interactions entre TMEM120A M207A marqués FLAG et des ligands tels que GsMTx4, utilisant un format de microplaques à 384 puits. Bien que développé pour TMEM120A, le flux de travail peut être adapté à d’autres protéines membranaires. Toutes les expériences ont été menées à l’aide d’une plateforme d’interférométrie optique avec des sondes biosensores FLAG pour immobiliser des TMEM120A M207A marqués FLAG. Une microplaque noire de 384 puits était utilisée avec un tampon de chromatographie optimisée à exclusion de taille (SEC) contenant 25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015 % (v) LMNG et 0,0005 % Tween-20, pH 7,8. Tween-20 a été inclus pour minimiser la liaison non spécifique. La concentration en protéines a été maintenue à 250 nM, et tous les tests ont été réalisés en double afin d’assurer la reproductibilité.

  1. Considérations de conception du test
    1. Équilibrage de température
      1. Avant de commencer le test BLI, équilibrez tous les composants du test — y compris les tampons, les échantillons et les sondes biosensores — à température ambiante (environ 20-25 °C). Lors de l’acquisition des données, maintenir la température du test à 30 °C, ce qui est recommandé pour les analyses cinétiques afin d’optimiser la stabilité des protéines, la liaison des ligands et la reproductibilité.
        REMARQUE : Cette étape d’équilibrage assure des profils cinétiques cohérents et minimise les artefacts causés par les fluctuations de température pendant l’expérience. Prévoyez suffisamment de temps (au moins 10 à 15 minutes) pour que tous les réactifs et biocapteurs atteignent l’équilibre thermique avant de commencer l’analyse.
    2. Hydratation et régénération des capteurs
      1. Hydratez les nouveaux biocapteurs FLAG dans 250 μL de tampon compatible BLI (tampon SEC contenant 25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015 % en w/v LMNG, et 0,0005 % Tween-20, pH 7,8) dans la plaque Max pendant un minimum de 10 minutes avant utilisation.
        REMARQUE : Manipulez soigneusement les biocapteurs avec une pince propre et sans poussière pour éviter toute contamination, qui peut interférer avec l’acquisition du signal et entraîner des résultats irréguliers. Pour la réutilisation du capteur, effectuer la régénération à l’aide du tampon Q (0,3 M glycine, pH 3,8). Une hydratation et une régénération adéquates sont essentielles pour maintenir les performances et la reproductibilité des capteurs, en particulier lorsqu’on travaille avec des protéines membranaires solubilisées en détergent, sensibles aux conditions environnementales.
    3. Gestion des tampons
      1. Évitez les bulles d’air lors de la distribution de liquides, car elles peuvent interférer avec l’acquisition du signal optique.
    4. Composition et cohérence du tampon
      1. Utilisez un tampon qui minimise les interactions non spécifiques tout en préservant la fonction des protéines. Pour TMEM120A M207A, préparez le tampon contenant 25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015 % (p/v) LMNG, 0,0005 % (p/v) Tween 20, pH 7,8.
    5. Immobilisation des protéines
      1. Optimisez la charge des ligands pour atteindre une saturation du capteur de 50-80 %. Utilisez une concentration fixe de protéines à 250 nM, avec une durée de charge typique d’environ 120 s. Chargez TMEM120A M207A (250 nM) marqué FLAG sur le biocapteur pendant 120 s pour atteindre une saturation de 50 à 80 %.
      2. Confirmez que le signal du biocapteur atteint 50 à 80 % de la capacité maximale de liaison pendant la phase de chargement.
        REMARQUE : Des signaux inférieurs à 50 % peuvent indiquer une immobilisation insuffisante des protéines, tandis que des signaux supérieurs à 80 % peuvent introduire des limitations de transport de masse ou un obstacle stérique, compromettant potentiellement les mesures cinétiques.
      3. Pour évaluer les effets potentiels du transport de masse, réalisez une expérience témoin dans laquelle la concentration d’analyte (par exemple, 100 nM GsMTx4) est maintenue constante tout en variant les niveaux de charge de TMEM120A-M207A sur les biocapteurs FLAG (Figure supplémentaire S1).
        REMARQUE : Les mesures cinétiques ultérieures — y compris l’association, la dissociation, les ajustements de liaison globale et la détermination de kon et k off — n’étaient pas significativement différentes de celles obtenues dans l’essai principal. Ce résultat indique que TMEM120A charge dans la fourchette de 50-80 % n’introduit pas d’artefacts significatifs de transport de masse, confirmant que le niveau de charge des biocapteurs est approprié pour une analyse cinétique fiable.
    6. Estimation de KD
      1. Déterminer l’affinité de liaison (KD) en testant les concentrations d’analyte (GsMTx4) de 0 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 30 μM, 50 μM et 100 μM.
    7. Contrôles de signal en arrière-plan
      1. Inclure des contrôles appropriés pour soustraire avec précision les signaux de fond et garantir des mesures cinétiques fiables.
      2. Utilisez une sonde FLAG de référence pour prendre en compte les liaisons ou dérives non spécifiques pouvant survenir pendant l’essai.
        REMARQUE : Cette sonde de référence ne doit pas immobiliser la protéine cible et sert de référence pour corriger le signal obtenu des sondes contenant l’échantillon.
      3. Soustrayez le signal de référence du signal échantillon pour n’analyser que des interactions spécifiques entre TMEM120A M207A marqués FLAG et les analytes.
        REMARQUE : Vérifiez que la sonde FLAG de référence montre un signal minimal tout au long de l’essai. Une base stable et faible indique une liaison non spécifique négligeable. Si le signal de référence fluctue ou augmente, réévaluez la composition du tampon, la manipulation des sondes ou la préparation de l’échantillon afin de réduire les interactions non spécifiques avant de procéder à l’analyse cinétique.
  2. Configuration des paramètres de base de l’analyse de l’analyse cinétique
    1. Réglez la fréquence d’acquisition des données à 5 Hz pour collecter 5 points de données/s (recommandé pour tous les tests cinétiques).
    2. Sélectionnez la plaque à 384 puits comme format de plaque.
    3. Régler la vitesse du vibrateur à 1 000 tr/ min et la température entre ambiante et 30 °C (30 °C utilisé dans cette expérience pour des résultats cinétiques optimaux).
  3. Configurez la configuration des plaques.
    1. Accédez à l’onglet Configuration des plaques et définissez les affectations de puits pour la plaque à 384 puits et la plaque Max.
    2. Attribuez des fonctions de puits sur la plaque à 384 puits.
      REMARQUE : Les symboles et annotations utilisés pour la plaque à 384 puits et la plaque Max sont résumés dans le tableau supplémentaire S1.
      1. Étiquetez les puits selon leur rôle : tampon, protéine (chargement), ligand (échantillon).
      2. Annoter les puits de charge protéique avec une concentration (par exemple, 250 nM) pour les essais cinétiques.
        REMARQUE : Un étiquetage précis est essentiel pour calculer kon et kd (voir Figure supplémentaire S2A).
    3. Configurez la carte de la plaque maximale (plaque sonde).
      1. Attribuez des sondes biosensores aux puits appropriés.
      2. Si la régénération de la sonde est prévue, attribuez des puits pour des tampons de régénération et de neutralisation. Étiquetez clairement ces puits dans le logiciel afin d’assurer une automatisation adéquate lors de la régénération (voir Tableau Supplémentaire S2).
        REMARQUE : Le tampon de test comprenait 25 mM HEPES (pH 7,8), 200 mM de NaCl, 0,00015 % (p/v) LMNG, et 0,0005 % (v/v) Tween-20. L’étape de régénération des sondes biosensores anti-FLAG a été réalisée à l’aide d’un tampon Q contenant 0,3 % de glycine (pH 3,8), suivie d’une étape de neutralisation avec le tampon de test (25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015 % LMNG, et 0,0005 % Tween-20, pH 7,8).
  4. Sélectionnez l’onglet Étapes de l’essai .
    1. Naviguez dans l’onglet Étapes du test pour configurer le flux de travail du test cinétique. Spécifier les positions des puits pour chaque phase du test, y compris la base de base, la charge en protéines, l’association et la dissociation (voir Figure supplémentaire S3).
    2. Sélectionnez le type d’étape approprié dans le menu déroulant. Assurez-vous que les étapes d’association et de dissociation sont correctement étiquetées pour une analyse cinétique précise.
    3. Entrez la durée de chaque étape en secondes pour définir les temps d’exposition de toutes les phases d’interaction.
      1. Fixez la durée de base des étapes pour permettre l’équilibrage des capteurs avant la charge des protéines (60 s).
      2. Fixez la durée de l’étape de charge protéique pour atteindre les niveaux d’immobilisation désirés des ligands de (60 s) (Figure 5).
      3. Fixer la durée de l’étape d’association pour permettre une liaison suffisante à l’analyte (300 s) (Figure 5).
      4. Fixez la durée de l’étape de dissociation pour capturer adéquatement la cinétique de déliaison de l’analyte (600 s) (Figure 5).
    4. Réglez la vitesse du vibrateur (RPM) pour chaque étape afin de maintenir un mélange constant et une qualité optimale des données (1 000 RPM).
  5. Aligner et filtrer étape (voir Figure supplémentaire S4 et Figure supplémentaire S5)
    1. Effectuer la correction brute des données en ajustant la plage de données selon les besoins afin de supprimer les artefacts des étapes cinétiques.
    2. Pour aligner l’axe Y, alignez les données au début de l’étape d’association en sélectionnant Association sous Type d’étape aligné et en activant l’option Commencer .
    3. Activez l’option de correction Interstep pour maintenir la continuité entre les étapes lors des essais cinétiques standards.
    4. Filtrage : Appliquer un lissage des données pour réduire le bruit du signal sans déformer les tendances. Sélectionnez Traité pour comparer les données lissées avec les signaux bruts.
  6. Fixez une étape de référence (voir Figure supplémentaire S6).
    1. Désignez une sonde de référence en sélectionnant la sonde de référence et cliquez sur le bouton Ref. Sonde .
    2. Sélectionnez les sondes d’échantillon en cliquant sur les numéros de colonne correspondants pour les sondes d’échantillon.
    3. Pour définir la fonction de soustraction, ouvrez l’Éditeur de formules, cliquez sur Modifier la formule, et définissez la fonction de soustraction pour supprimer l’arrière-plan.
    4. Examiner la vue de table pour confirmer que la soustraction de référence a été correctement appliquée.
  7. Étape d’ajustement de la fixation
    1. Naviguez jusqu’à l’onglet Ajustement et définissez les paramètres d’analyse (Figure supplémentaire S7).
    2. Sélection des données : Inclure à la fois les phases d’association et de dissociation pour l’ajustement cinétique local. Excluez manuellement les valeurs aberrantes s’ils présentent un mauvais ajustement de courbe ou un signal erratique.
    3. Sélection du modèle de liaison : Choisissez le modèle de liaison 1:1 pour qu’il ajuste aux données, sauf si un comportement complexe est observé. Examiner les superpositions de courbe et les résidus pour valider la pertinence du modèle.
    4. Stratégie d’ajustement : Sélectionnez l’une des stratégies d’ajustement suivantes en fonction de la qualité des données et des objectifs expérimentaux :
      1. Local : Convient individuellement à chaque concentration d’analyte, permettant une évaluation indépendante des cinétiques d’association et de dissociation.
      2. Global : Ajuste simultanément toutes les concentrations d’analytes en utilisant un ensemble unique de paramètres cinétiques, fournissant un modèle global pour le jeu de données.
      3. Complet : Correspond à la fois aux phases d’association et de dissociation à l’échelle mondiale, dans toutes les concentrations.
      4. Partiel : Ne correspond qu’à la phase d’association, ignorant la dissociation.
        REMARQUE : Les données BLI ont été analysées à l’aide d’un modèle de liaison de Langmuir 1:1 avec un ajustement local et complet. L’ajustement local garantit que chaque concentration d’analyte est traitée indépendamment, fournissant une représentation précise de la cinétique d’association tout en minimisant les artefacts liés à l’hétérogénéité lors de la phase de dissociation. Cette approche évite le surajustement dans les régions aux signaux variables ou instables, permettant une estimation plus fiable des paramètres cinétiques (kallumé et kéteint) (Tableau 1 et Tableau 2).
  8. Analyse cinétique
    1. Revue des courbes ajustées et des résidus : Examinez les courbes ajustées et les résidus correspondants afin d’évaluer la qualité et la validité du modèle. Confirmez que les résidus sont répartis aléatoirement autour de zéro sans déviations systématiques (voir la Figure 4E pour les résidus représentatifs).
    2. Exclusion des données mal ajustées : Supprimer les concentrations d’analytes qui présentent des signaux plats, bruyants ou autrement peu fiables afin d’améliorer la précision globale du modèle.
      REMARQUE : Par exemple, la concentration de 10 μM a été exclue de l’ajustement en raison du chevauchement avec le jeu de données de 5 μM, ce qui pourrait fausser l’estimation des paramètres cinétiques (voir Figure 6A,B).

Résultats

Le mutant TMEM120 M207A a été exprimé dans des cellules de suspension HEK293SF-17 à l’aide d’un vecteur pCDNA3.1 codant pour une étiquette FLAG N-terminale Figure 1. La transfection transitoire a permis l’expression de protéines recombinantes. Après la récolte cellulaire, les protéines membranaires ont été solubilisées dans du néopentyle glycol à 0,5 % de lauryl maltose, un détergent non ionique adapté au maintien de la solubilité des protéines membranaires.

La fraction solubilisée a été soumise à une purification d’affinité à l’aide de résine anti-FLAG M2. La résine a été lavée avec un tampon contenant 0,01 % de LMNG pour éliminer les protéines non spécifiquement liées, et TMEM120 M207A a été élué dans un tampon contenant 0,001 % de LMNG. L’élution a été concentrée à l’aide de filtres centrifuges avec des seuils moléculaires de 30 kDa ou 100 kDa, selon le rendement de l’échantillon. Une purification supplémentaire a été réalisée par chromatographie par exclusion de taille (SEC). La dernière étape SEC a été réalisée dans un tampon contenant 0,00015 % de LMNG, produisant un profil d’élution monodispersée compatible avec une préparation protéique homogène et stable, adaptée à des analyses structurales et fonctionnelles ultérieures (Figure 2B).

L’optimisation et la caractérisation biophysique des TMEM120 M207A marqués FLAG sont résumées à la Figure 2. L’expression et la purification ont été confirmées par SDS-PAGE, qui a montré une seule bande à environ 50 kDa. La migration observée était légèrement supérieure au poids moléculaire attendu de la forme monomérique (Figure 2A), probablement due à l’échantillon non bouilli avant l’électrophorèse. Le chromatogramme SEC a montré un seul pic symétrique éluant à un volume correspondant à une masse moléculaire apparente d’environ 150 kDa dans 0,00015 % (v/v) LMNG (Figure 2B), cohérent avec le dimère M207A TMEM120A chez les micelles détergents LMNG. Ce comportement d’élution présente une population de protéines homogène et monodispersée, ce qui la rend adaptée à la caractérisation biophysique en aval.

Les propriétés des micelles détergentes du LMNG dans les conditions expérimentales de tampon ont été analysées à l’aide de photométrie de masse. Des mesures ont été effectuées dans un tampon SEC avec des concentrations variables de LMNG en l’absence de protéines afin d’évaluer la contribution des micelles détergentes à la masse moléculaire claire. À 0,001 % (p/v) de GNM, une concentration supérieure à la concentration critique de micelles (CMC), le pic prédominant a été détecté à environ 69 kDa, correspondant à des micelles LMNG seules sans aucune protéine associée (Figure 4A). Lorsque la concentration de LMNG a été réduite à 0,0001 % (p/v), en dessous de la CMC, l’espèce principale est passée à ~48 kDa, indiquant la présence de petits agrégats résiduels de LMNG ou d’assemblages sous-micellaires sans protéine (Figure 4B). Plus loin (Figure 4C), TMEM120A M207A a été dilué dans un tampon SEC contenant différentes concentrations de LMNG afin d’évaluer son état oligomérique par photométrie de masse. À 0,00001 % de LMNG (~20 fois en dessous du CMC, magenta), un pic prédominant a été observé à environ 42 kDa, correspondant au monomère de TMEM120A M207A. À 0,00015 % de LMNG (~10 fois en dessous du CMC, bleu), la population principale à ~86 kDa indiquait la présence de dimères. Augmenter la concentration de LMNG à 0,001 % (~2 fois au-dessus du CMC, orange) a donné une espèce majeure ~150 kDa, cohérente avec les complexes protéine-détergent. À 0,002 % de LMNG (~4 fois au-dessus du CMC, vert), une large distribution centrée autour de 180 kDa a été détectée, représentant des assemblages associés à la micelle plus grands ou des oligomères d’ordre supérieur. Ces résultats démontrent que la concentration de LMNG dans le tampon SEC influence fortement l’état oligomérique clair de TMEM120A M207A, avec un équilibre monomère-dimère observé sous la CMC et la formation du complexe détergent-protéine prédominant au-CMC.

La stabilité thermodynamique de TMEM120A M207A collecté à partir du pic principal SEC et maintenu dans le tampon SEC (25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015 % (p/v) LMNG, pH 7,8) a été évaluée par analyse de dénaturation thermique. La protéine présentait un point d’inflexion d’environ 46 °C, correspondant à sa température de fusion (Tm) dans ces conditions solubilisées dans le détergent. Cette valeur de Tm indique une stabilité thermique modérée, suggérant que TMEM120A M207A conserve une conformation correctement repliée au sein des micelles LMNG mais peut commencer à se déployer ou à s’agréger à des températures plus élevées.

L’interférométrie de biocouche (BLI) montre une affinité de liaison μM de TMEM120A M207A à GsMTx4T. Les traces de la Figure 5 illustrent cinq étapes expérimentales : (1) la référence de base, (2) la charge d’échantillons de TMEM120A M207A, (3) la base pour supprimer la liaison non spécifique et l’excès TMEM120A M207A, (4) l’association, et (5) la dissociation. Le décalage de longueur d’onde (nm) est tracé dans le temps pour l’augmentation des concentrations de GsMTx4 (0, 5, 10, 20, 30, 50 et 100 μM) interagissant avec TMEM120A M207A immobilisée.

Lors de la ligne de base initiale (étape 1), le signal restait stable, confirmant l’équilibre du capteur dans le tampon. TMEM120A charge M207A (étape 2) produisait une augmentation caractéristique du signal, correspondant à ~50-80 % de saturation de la sonde à travers les capteurs. La phase de charge a montré une réponse légèrement courbée plutôt qu’un plateau marqué, reflétant peut-être une limitation partielle du transport de masse, où TMEM120A diffusion de M207A vers la surface du capteur est plus lente que le taux de liaison — un effet courant chez les protéines solubilisées en membrane ou en détergent qui peut influencer la couverture apparente de surface.

L’étape de base suivante (étape 3) a effectivement supprimé TMEM120A M207A non reliée ou faiblement attachée. Pendant la phase d’association (étape 4), l’augmentation des concentrations de GsMTx4 a entraîné des hausses claires et dépendantes de la concentration du décalage de longueur d’onde. Pendant la dissociation (étape 5), le biocapteur a été placé dans un tampon SEC contenant la LMNG à ~10 fois en dessous du CMC. Les 5 à 10 premières secondes de dissociation ont montré une diminution rapide du signal, probablement une libération rapide de GsMTx4 à partir de sites facilement accessibles, suivie d’une désintégration plus lente qui pourrait refléter des complexes M207A-GsMTx4 plus stables TMEM120A avec une cinétique de dissociation lente. Les signaux de la sonde de référence sont restés plats tout au long de l’expérience, indiquant une liaison non spécifique minimale. Dans l’ensemble, ces données démontrent des interactions spécifiques TMEM120A M207A-GsMTx4 ; Cependant, la cinétique observée doit être interprétée avec prudence en raison de l’environnement du détergent et des effets potentiels du transport de masse.

Les sensorgrammes d’association et de dissociation des données traitées après soustraction de la sonde de référence (Figure 6A) ont montré des réponses dépendantes de la concentration pour GsMTx4 dans la plage de 5 à 100 μM. L’augmentation des concentrations de ligands a produit des décalages de longueur d’onde progressivement plus élevés, suivis d’une diminution progressive et lente durant la phase de dissociation de 200 s. Le jeu de données de 10 μM a été exclu de l’ajustement en raison du chevauchement avec la trace de 5 μM, ce qui a amélioré la qualité globale du modèle.

L’analyse cinétique a été réalisée à l’aide d’un modèle d’association-dissociation de Langmuir 1:1 avec une stratégie locale d’ajustement complet, dans laquelle les concentrations individuelles d’analytes étaient ajustées indépendamment dans un cadre cinétique partagé (Figure 6B). Les courbes ajustées (rouge) étaient en bon accord avec les traces expérimentales, fournissant une constante de dissociation estimée (KD) dans la gamme micromolaire basse. L’analyse résiduelle (Figure 6C) n’a pas révélé de déviations systématiques majeures, indiquant que le modèle appliqué était approprié pour l’ensemble de données. Des différences mineures observées lors de la phase d’association précoce peuvent refléter des limitations du transport de masse ou les effets de l’environnement micelle détergent. D’autres exemples de courbes d’association et de dissociation ajustées, de graphiques résiduels et de statistiques d’ajustement sur plusieurs réplications de test et positions de sonde sont présentés dans la Figure Supplemental S8.

Dans les données brutes (Figure 5), les 5 à 10 premiers s de dissociation ont montré une diminution rapide du signal, probablement une libération rapide de GsMTx4 à partir de sites facilement accessibles, suivie d’une désintégration plus lente qui pourrait refléter des complexes M207A-GsMTx4 plus s TMEM120A tables avec une cinétique de dissociation lente. Ainsi, dans le tableau 2, les 100 premiers s de dissociation ont été retirés de l’ajustement. L’absence de déviation systématique indique un bon ajustement du modèle local 1:1 de Langmuir pour TMEM120A M207A à toutes les concentrations testées (Figure 7).

L’analyse cinétique de la liaison de GsMTx4 à TMEM120A M207A a révélé des comportements d’association et de dissociation dépendants de la concentration sur la plage des ligads de 5 à 100 μM (Tableau 1). Les constantes de taux d’association observées (kon) ont légèrement augmenté avec l’augmentation de la concentration de GsMTx4, allant d’environ 1,0 × 10⁻⁶ à 3,2 × 10-6 1/M·s, tandis que les constantes estimées du taux de dissociation (k off) sont restées proches de zéro dans l’erreur expérimentale, suggérant une phase de dissociation lente ou négligeable dans les conditions testées. Les constantes de dissociation d’équilibre calculées (Kd) se situaient dans la plage micromolaire basse à moyenne (~0,8-3,3 μM), ce qui correspond à une interaction d’affinité modérée. L’ajustement local complet utilisant un modèle de liaison 1:1 de Langmuir a permis d’obtenir des ajustements de haute qualité sur toutes les concentrations de GsMTx4, avec des coefficients de corrélation supérieurs à 0,99 et de faibles valeurs relatives χ2 pour les phases d’association et de dissociation (Tableau 1). Les constantes de dissociation d’équilibre calculées étaient cohérentes à travers les concentrations et les réplications, avec des valeurs de KD dans la gamme micromolaire basse (~1-2 μM), indiquant une liaison modérée mais spécifique entre TMEM120A M207A et GsMTx4.

Les ensembles de données réplicés à chaque concentration ont montré une reproductibilité, comme l’indiquent des coefficients de corrélation élevés (R² > 0,99) pour les ajustements d’association et de dissociation. Les valeurs de χ² totales et relatives étaient faibles et comparables entre les répliques, ce qui soutient davantage la robustesse du modèle de liaison de Langmuir 1:1 appliqué dans l’analyse. À des concentrations plus élevées de ligands (≥50 μM), des valeurs de ksur et de KD légèrement augmentées ont été observées, ce qui peut refléter des effets mineurs du transport de masse ou une hétérogénéité locale de surface plutôt que de véritables changements d’affinité. La consistance cinétique entre plusieurs réplications et positions de sonde est illustrée davantage dans la Figure Supplémentaire S9.

Les profils cinétiques démontrent que GsMTx4 interagit de manière spécifique et stable avec TMEM120A M207A, formant des complexes relativement stables caractérisés par une dissociation lente et une affinité de liaison micromolaire.

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Figure 1 : Flux de travail de purification de TMEM120A mutant M207A exprimé dans les cellules de suspension HEK293SF-17. Aperçu schématique de la procédure de purification des protéines. TMEM120A M207A a été exprimée à partir de plasmides pCDNA3.1 dans HEK293SF-17 cellules. Les cellules ont été solubilisées dans 0,5 % de LMNG, suivies d’une purification d’affinité à l’aide de résine anti-FLAG M2. La résine a été lavée avec un tampon contenant 0,01 % de LMNG pour éliminer les protéines non spécifiquement liées. TMEM120A M207A a été élué dans un tampon contenant 0,001 % de GNLM. L’éluate a été concentré à l’aide de filtres de coupure de 100 kDa ou 30 kDa et purifié par chromatographie d’exclusion de taille dans un tampon contenant 0,00015 % de LMNG. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 2 : Chromatographie d’exclusion de taille et PAGE SDS de TMEM120A purifiée M207A Dans la détergente LMNG (A) SDS-PAGE de TMEM120A M207A marquée FLAG purifiée par chromatographie d’exclusion de taille. La bande protéique apparaît à ~50 kDa dans la voie 1, correspondant au monomère attendu. (B) Profil SEC de TMEM120A purifié M207A sur une colonne SEC dans un tampon SEC (25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015 % LMNG, pH 7,8). L’élution protéique indique une espèce monodispersée prédominante adaptée aux tests biophysiques en aval. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 3 : Fluorimétrie différentielle à balayage de TMEM120A purifiée M207A dans LMNG. La DSF révèle un point d’inflexion thermodynamique à 46 °C, indiquant la stabilité thermique de la protéine dans les conditions tampons testées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 4 : caractérisation du TMEM120A purifié M207A dans un détergent LMNG utilisant la technique de photométrie de masse. (A,B) Photométrie de masse du tampon SEC avec des concentrations variables de LMNG. À 0,001 % de LMNG (au-dessus de la concentration critique de micelles, CMC), le poids moléculaire apparent est de ~69 kDa, correspondant principalement aux micelles LMNG. À 0,0001 % de LMNG (dix fois en dessous du CMC), le pic apparaît à ~48 kDa. (C) Analyse par photométrie de masse des effets dépendants de la concentration du GNM sur TMEM120A oligomérisation. TMEM120A en 0,00001 % LMNG (~20 fois en dessous du CMC, magenta) présente une population principale d’environ 42 kDa (monomère). Chez 0,00015 % de LMNG (~10 fois en dessous de CMC, bleu), une population de ~86 kDa est observée, cohérente avec le dimère. Chez 0,001 % de LMNG (~2 fois au-dessus de CMC, orange), une espèce majeure à ~150 kDa correspond à des complexes protéine-détergent. Dans 0,002 % de LMNG (~4 fois au-dessus de CMC, vert), une large distribution centrée à ~180 kDa indique des assemblages associés à la micelle plus grands ou des oligomères d’ordre supérieur. Ces résultats démontrent que la concentration de GNL influence fortement l’état oligomérique apparent de la TMEM120A, avec un équilibre monomère-dimère observé sous la CMC et la formation du complexe protéine-détergent prédominant au-dessus de la CMC. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 5 : Données brutes issues d’un logiciel montrant TMEM120A interactions M207A-GsMTx4. L’interférométrie de la biocouche démontre que TMEM120A (M207A) se lie à l’inhibiteur des canaux mécanosensibles GsMTx4 avec une affinité micromolaire. La figure montre les données brutes de réponse BLI obtenues à partir du logiciel Gator Prime, délimitant les cinq phases clés de l’analyse : (1) Base initiale, durant laquelle le signal est resté stable ; (2) immobilisation protéique (chargement), entraînant une augmentation d’environ 1,5 nm du décalage de longueur d’onde ; (3) Deuxième base, permettant l’élimination de protéines non liées ou faiblement associées ; (4) phase d’association (liaison au ligand), où l’augmentation des concentrations de GsMTx4 produisait une réponse montée jusqu’à ~5,5 nm en 300 s ; et (5) phase de dissociation (libération de ligand), montrant une décroissance progressive du signal sur 600 s. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 6 : Cinétique de liaison de TMEM120A M207A avec le peptide GsMTx4. (A) Sendégrammes d’association et de dissociation de TMEM120A M207A interagissant avec GsMTx4 à cinq concentrations : 5 μM, 20 μM, 30 μM, 50 μM et 100 μM. L’ensemble de données de 10 μM a été exclu de l’ajustement en raison du chevauchement avec la courbe de 5 μM, ce qui a amélioré l’ajustement global du modèle. Des lignes rouges verticales pointillées indiquent le début et la fin de la phase de dissociation. (B) L’ajustement des capteurs-capteurs a été réalisé à l’aide d’un modèle de dissociation associative 1:1 de Langmuir Local Full Fitting. Les courbes rouges représentent le modèle ajusté, tandis que les traces expérimentales correspondent aux données mesurées d’association et de dissociation pour chaque concentration de GsMTx4 (deux réplications par condition). (C) Des graphiques résiduels montrant la divergence entre les données expérimentales et le modèle ajusté pour les phases d’association et de dissociation, confirmant la qualité de l’ajustement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 7 : Diagrammes résiduels correspondant aux courbes de liaison ajustées montrées. Chaque graphique représente les résidus (différence entre les données expérimentales et le modèle ajusté) pour une seule concentration de GsMTx4 : 5 μM, 20 μM, 30 μM, 50 μM et 100 μM. Les résidus sont affichés comme une déviation de décalage (nm) en fonction du temps (s), montrant une distribution aléatoire autour de zéro à travers les phases d’association et de dissociation. L’absence de déviation systématique indique un bon ajustement du modèle Langmuir 1:1 à ajustement local complet pour TMEM120A M207A à toutes les concentrations testées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Tableau 1 : Résumé des paramètres cinétiques pour TMEM120A liaison M207A à GsMTx4. Les paramètres cinétiques ont été obtenus à partir d’un ajustement Local Full à l’aide d’un modèle de liaison 1:1 de Langmuir. L’association (k activée), la dissociation (kéteinte), les constantes de débit observées (kobs) et les constantes de dissociation d’équilibre (K D) sont rapportées pour chaque concentration de GsMTx4 et se répliquent. La qualité d’ajustement a été évaluée à l’aide des valeurs R² et χ² pour les phases complète, d’association et de dissociation. Pour toutes les concentrations, les ajustements ont montré des coefficients de corrélation élevés (R² > 0,99) et de faibles valeurs relatives de χ², indiquant une performance fiable du modèle. Notes : M Conc. indique la concentration de GsMTx4 (μM). kOBS représente la constante de débit observée reflétant les processus combinés d’association et de dissociation. Les erreurs signalées pour kobs, kon et koff reflètent une incertitude d’ajustement. Les valeurs R² indiquent la bienveillance pour les phases complète, d’association et de dissociation. Les valeurs relatives de χ² représentent des métriques de bonté d’ajustement normalisées, tandis que les valeurs absolues de χ² indiquent un écart résiduel entre les données observées et les données ajustées. Abréviations : kon = constante de taux d’association (1/M·s) ; koff, = constante du taux de dissociation (1/s) ; kobs = constante de débit observée (1/s) ; KD = constante de dissociation à l’équilibre ; Rmax = réponse maximale ; Réquation = réponse d’équilibre. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Paramètres de traitement et résidus de l’ajustement cinétique. Paramètres de traitement : début d’association, 0 s ; Fin de l’association, 300 s ; début de dissociation, 100 s ; fin de dissociation, 300 s. Valeur minimale R², 0,9 ; valeur maximale χ², 8. Étape d’alignement : fin d’un pas (indice = 1, moyenne = 0). La correction inter-pas a été appliquée pendant la phase d’association. Moyenne de l’association, 50 ; Moyenne de dissociation, 0. Le lissage Savitzky-Golay a été désactivé. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Figure complémentaire S1 : Expérience d’optimisation pour charger différentes concentrations de TMEM120A protéine M207A sur des sondes anti-FLAG avec une concentration fixe (100 nM) du peptide GsMTx4. (A) capteurs BLI bruts montrant les cinq étapes de la mesure cinétique : (1) base dans le tampon SEC ou tampon d’essai (25 mM HEPES, pH 7,8 ; 200 mM NaCl ; 0,00015 % (v/v) LMNG ; 0,0005 % (v/v) Tween-20) ; (2) le chargement de quatre concentrations différentes de TMEM120A M207A sur la sonde FLAG, avec la sonde de référence (orange) utilisée comme témoin négatif pour confirmer l’absence de liaison non spécifique ; (3) au pas de la ligne de fond ; (4) la phase d’association, et (5) la phase de dissociation. (B) Le modèle de liaison global 1:1 s’adapte aux quatre concentrations TMEM120A de M207A interagissant avec le peptide GsMTx4 de 100 nM. (C) Graphiques résiduels pour les phases d’association et de dissociation, montrant des écarts minimes par rapport au modèle ajusté (<0,05 nm). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2 : Configuration des plaques et de l’essai. (A) Conception de plaque pour une plaque à 384 puits, où différents paramètres peuvent être attribués. Les échantillons correspondent au ligand (GsMTx4) à différentes concentrations. Les puits orange indiquent TMEM120 protéine M207A à 250 nM. Les puits représentent des réplications protéiques à 250 nM, et le même tampon a été utilisé pour les étapes de base, d’association et de dissociation. (B) Vue de la plaque maximale montrant quatre sondes biocapteurs anti-FLAG : une sonde de référence et trois sondes pour les réplications protéiques. Toutes les sondes étaient pré-mouillées dans le tampon d’essai, régénérées dans le tampon Q, et neutralisées dans le tampon d’essai. Le même tampon a été utilisé tout au long des étapes de base, d’association et de dissociation. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S3 : Cycles de mise en place des essais, incluant la base de départ, la charge en protéines, la deuxième base, l’association et la dissociation. Abréviations : B = tampon ; L = charge ; 0, 5, 10, 20, 30, 50 et 100 = concentrations de GsMTx4 en μM. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S4 : Nouveau flux de travail d’analyse cinétique (K). Sélectionnez l’icône Expérience , qui offre un aperçu de tous les tests réalisés au sein d’une seule expérience. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S5 : Nouveau flux de travail d’analyse cinétique (K).Aligner et filtrer , où les données brutes pour les phases d’association et de dissociation peuvent être examinées et analysées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S6 : Nouveau flux de travail d’analyse cinétique (K).Icône de référence définie , utilisée pour sélectionner le capteur de référence approprié pour la soustraction en arrière-plan et l’interprétation précise des données. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S7 : Étapes d’ajustement de liaison dans le flux de travail d’analyse cinétique. Paramètres d’ajustement cinétique utilisés pour analyser les données d’interaction de liaison. Le modèle suppose une interaction 1:1 avec un seul site de liaison de ligand. Le type d’ajustement est réglé sur Local, ajustant chaque courbe de concentration indépendamment plutôt que globalement. L’option Full Fitting avec Full Stitch activée inclut l’ensemble des courbes continues d’association et de dissociation. Les fenêtres temporelles pour les phases d’association et de dissociation sont fixées de 0 à 300 s et de 0 à 200 s, respectivement. En arrière-plan, le graphique d’ajustement de liaison, le graphique résiduel et les courbes individuelles des essais illustrent la qualité de l’ajustement et la variabilité expérimentale. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S8 : Étapes d’ajustement de liaison dans le flux de travail d’analyse cinétique. Graphique d’ajustement de liaison montrant les phases d’association et de dissociation entre plusieurs réplications de test et positions de la sonde (C1 et D1). Le graphique résiduel ci-dessous évalue la qualité de l’ajustement, les résidus indiquant les différences entre les données expérimentales et le modèle ajusté ; Des valeurs proches de zéro reflètent un bon ajustement. Le tableau ci-joint résume les statistiques d’ajustement, incluant les valeurs de R² complet, d’association R², de dissociation R² et de chi-carré (X²) pour chaque réplication. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S9 : Étapes d’ajustement de liaison dans le flux de travail de l’analyse cinétique. Analyse cinétique des interactions de liaison à partir de multiples réplications et positions de la sonde (C1 et D1). Le décalage de la réponse du capteur (nm) sur le temps (s) affiche les phases d’association et de dissociation, chaque courbe étant codée par couleur selon le test et la position de la sonde. La ligne rouge verticale pointillée marque la transition entre les phases d’association (0-300 s) et de dissociation. Ci-dessous, le tableau indique les paramètres cinétiques dérivés de l’ajustement 1:1 du modèle de liaison, incluant la concentration de l’analyte (M Conc.), la constante de taux d’association (kactivée), la constante de taux de dissociation (koff), les erreurs et la constante de dissociation à l’équilibre (KD). La qualité d’ajustement constante soutient la robustesse des mesures cinétiques. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire S1 : Tableau illustrant les symboles utilisés à la fois dans la plaque à 384 puits et dans la plaque Max. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire S2 : Paramètres cinétiques obtenus pour les quatre concentrations de TMEM120A M207A chargées sur les biocapteurs FLAG interagissant avec le peptide GsMTx4 de 100 nM, en utilisant des valeurs fixes de kon et koff. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La caractérisation des interactions membranaires entre protéines reste difficile en raison de la nécessité d’une purification méticuleuse des protéines, d’une optimisation soigneuse de la concentration de détergent et d’une conception précise des essais. Cette étude présente un flux de travail détaillé pour TMEM120A M207A, illustrant à la fois la purification et l’analyse cinétique utilisant GsMTx4 avec interférométrie de biocouches (BLI).

Étapes critiques et optimisation :
L’une des étapes critiques importantes était la concentration en détergent, identifiée comme un déterminant majeur de la stabilité des protéines. Le processus de purification impliquait la solubilisation cellulaire avec un tampon contenant 0,5 % de GNL, suivie d’un lavage séquentiel avec 0,005 % de GNL, d’une élution avec 0,001 % de GNL, et d’une chromatographie finale par exclusion de taille (SEC) dans un tampon contenant 0,00015 % de GNLM. Cette stratégie de détergent, basée sur la faible concentration critique de micelles (CMC) et le taux de ralentissement de la LMNG, a amélioré la stabilité de la protéine dans les micelles lors de la purification. Le tampon SEC contenait un détergent à une concentration dix fois inférieure à celle du CMC de LMNG (0,001 %), minimisant ainsi son impact sur les tests biophysiques en aval. L’homogénéité des protéines et l’absence d’agrégation ont été confirmées par spectrométrie de masse et analyse de stabilité thermique. Les figures 2, 3 et 4 illustrent l’optimisation réussie de la purification et de la stabilisation des protéines dans les concentrations de détergents sub-CMC.

L’immobilisation des protéines sur le biocapteur a été soigneusement contrôlée pour atteindre une saturation de 50 à 80 % de la sonde. Un niveau de charge de 50 à 80 % peut introduire une certaine limitation du transport de masse ; cependant, cette plage a été choisie pour fournir une puissance de signal adéquate dans le système BLI, où les sondes se déplaçaient entre les puits pendant l’analyse. Atteindre ce niveau d’immobilisation des ligands a permis de maintenir une qualité de signal constante, bien que de tels niveaux de charge présentent à la fois des avantages et des limites potentielles. L’inclusion d’une sonde de référence était cruciale pour les expériences BLI.

Une expérience témoin supplémentaire dans laquelle quatre niveaux différents de TMEM120A immobilisés ont été testés avec une seule concentration de peptide (100 nM). Ces données sont désormais incluses dans le manuscrit révisé (Figure supplémentaire S1). L’augmentation de la quantité de protéine immobilisée produisait des signaux de charge plus élevés, mais dans tous les cas, le décalage restait inférieur à 1 nm par rapport à la ligne de base (Figure supplémentaire S1A). Nous avons rapporté les courbes d’association ajustée et de dissociation à l’aide d’un modèle global de liaison 1:1, et nous avons également inclus les graphiques résiduels, qui montrent de petites différences non significatives entre les données ajustées et expérimentales.

Dans les principaux essais cinétiques (analyte 5-100 μM), les constantes de taux ajustées montraient les tendances attendues dépendantes de la concentration. Les valeurs de koff variaient d’environ 1,48 × 10⁻⁴ à 1,43× 10⁻³ s⁻¹, tandis que les valeurs k variaient de 1,12 × 10² à 1,26 × 10¹ M⁻¹s⁻¹. Ces changements graduels à travers la série de concentrations sont cohérents avec une association normale dépendante de l’analyte et un comportement de dissociation.

Dans l’expérience témoin, où différents niveaux de charge de sonde ont été testés à une seule concentration d’analyte (100 nM), les quatre traces ont donné des constantes cinétiques très similaires. Les valeurs dek off étaient constamment de 1,42 × 10⁻¹ s⁻¹, et les valeursk sur étaient constamment de 2,76 × 10³ M⁻¹s⁻¹ sur tous les niveaux de chargement. Ce manque de variation suggère que ni les phases d’association ni de dissociation n’ont été affectées par la densité de sonde, les limitations du transport de masse ou la reliaison des analytes.

On s’attend également à ce que la dissociation à 100 nM apparaisse plus rapide dans l’expérience témoin. La concentration d’analyte de 100 nM est environ un ordre de grandeur en dessous de KD, et à des concentrations bien inférieures à KD , le complexe est moins stable et l’occupation effective est faible. Dans de telles conditions, la dissociation progresse plus rapidement car l’affinité de liaison est plus faible à faibles concentrations d’analytes, et la réassociation durant la phase de dissociation est minimale. Ce comportement correspond à ce qui est généralement observé lorsque la concentration d’analyte est sensiblement inférieure à KD.

Pris ensemble, la cohérence des paramètres cinétiques à travers les charges de la sonde et le comportement attendu à de faibles concentrations d’analytes soutiennent l’idée que les constantes de vitesse observées reflètent de véritables propriétés de liaison plutôt que des artefacts issus de charges de surface ou d’effets de transport de masse.

Cinétique de liaison et interprétation :
L’analyse cinétique a été réalisée à l’aide d’un modèle d’association-dissociation de Langmuir 1:1 avec une stratégie locale d’ajustement complet, dans laquelle les concentrations individuelles d’analytes étaient ajustées indépendamment dans un cadre cinétique partagé (Figure 6B). Cette approche a été choisie plutôt que l’ajustement global traditionnel car certains ensembles de données, en particulier à des concentrations plus faibles de ligands, présentaient de légers chevauchements ou des déviations précoces probablement causées par des limitations de transport de masse et des effets des micelles détergents sur la diffusion des protéines. L’ajustement global suppose que toutes les traces suivent strictement le même comportement cinétique, qui peut être compromis lorsque l’accessibilité de surface ou le microenvironnement local diffère légèrement entre les concentrations. L’ajustement complet local permettait de modéliser chaque concentration d’analyte indépendamment tout en maintenant un cadre cinétique cohérent, garantissant que les paramètres dérivés reflétaient fidèlement le comportement à chaque concentration. Les courbes ajustées (rouge) correspondaient étroitement aux traces expérimentales, donnant une constante de dissociation estimée (KD) dans la gamme des micromolaires basses. L’analyse des résidus (Figure 6C) n’a pas révélé de déviations systématiques majeures, ce qui confirme l’adéquation du modèle à ces interactions de protéines membranaires solubilisées en détergent.

TMEM120A M207A et GsMTx4 ont montré des valeurs de KD dans la gamme micromolaire basse (∼0,8-3,3 μM). Le taux d’association (kon) a augmenté modestement avec la concentration de ligands, tandis que le taux de dissociation (koff) est resté très lent, indiquant une formation stable du complexe. La décroissance rapide initiale du signal durant les 5 à 10 premières secondes de dissociation reflétait probablement des sites de liaison facilement accessibles, tandis que la phase plus lente représentait des interactions plus stables (Figure 6A). Ces observations soulignent l’importance de sélectionner soigneusement les fenêtres de dissociation et de prendre en compte les limites du transport de masse lors de l’analyse des protéines membranaires solubilisées dans un détergent (Tableau 2).

Limitations et dépannage :
Plusieurs limitations doivent être prises en compte pour les protéines membranaires solubilisées dans un détergent comme TMEM120A M207A. Des effets de transport de masse peuvent survenir lors de la phase d’association précoce, car la protéine peut diffuser lentement vers la surface du biocapteur, ce qui peut légèrement déformer les mesures cinétiques. La surcharge des capteurs est possible si la saturation des sondes dépasse la plage recommandée de 50-80 %, limitant potentiellement la précision de l’analyse cinétique globale et affectant les valeurs de kon et koff. Les effets dépendants du détergent peuvent influencer la stabilité des protéines, l’état oligomérique ou l’accessibilité à la surface, en particulier à des concentrations supérieures ou proches de la CMC. D’autres facteurs incluent une dérive mineure de la ligne de base, une liaison non spécifique et des difficultés à capturer la cinétique d’une dissociation très lente.

Beaucoup de ces problèmes peuvent être atténués par de simples ajustements : réduire la charge en protéines pour éviter la sursaturation, optimiser la composition des tampons, et inclure des sondes de référence pour corriger la dérive de base ou les signaux non spécifiques. Dans cette étude, le tampon SEC contenant 0,00015 % de LMNG et de faibles concentrations de Tween-20 a efficacement minimisé la liaison non spécifique tout en maintenant la stabilité des protéines. Sélectionner soigneusement la fenêtre de dissociation pour l’ajustement cinétique, ainsi que les mesures de réplication et l’analyse des résidus, était également important pour confirmer la fiabilité des paramètres cinétiques. Ces stratégies améliorent généralement la reproductibilité et contribuent à générer des données plus robustes et interprétables. Un ajustement complet local a été utilisé en remplacement de l’ajustement global pour tenir compte des différences mineures entre les traces à chaque concentration de ligands, garantissant que les paramètres cinétiques reflètent fidèlement le comportement de chaque ensemble de données.

BLI et autres techniques biophysiques :
Comparée à la résonance plasmonique de surface (SPR) et à la calorimétrie par titration isotherme (ITC), l’interférométrie des biocouches (BLI) offre plusieurs avantages pratiques pour analyser les interactions membrane-ligand protéine-ligand. Comme SPR et ITC, le BLI peut fournir des informations détaillées sur les interactions de liaison, y compris les taux d’association (kon), les taux de dissociation (koff) et les constantes de dissociation d’équilibre (K D), sans nécessiter de systèmes microfluidiques complexes nide concentration élevée de protéines14. Le format à puits ouverts, dip-and-read, permet un échange rapide de tampons et un traitement parallèle de plusieurs échantillons, permettant un débit expérimental plus élevé. Contrairement à l’ITC, qui nécessite de grandes quantités de protéines hautement pures et fournit des données thermodynamiques, le BLI peut mesurer à la fois les taux de formation et de dissociation du complexe à partir d’une concentration minimale d’échantillon dans les nanomolaires. Le BLI est également compatible avec des tampons contenant des détergents ou des lipides, ce qui le rend adapté aux protéines membranaires à faible rendement ou instables, difficiles à étudier avec d’autres méthodes biophysiques. Malgré ces avantages, des techniques complémentaires telles que la SPR ou l’ITC restent utiles pour confirmer la consistance thermodynamique et la vérification croisée des paramètres de liaison dans des conditions sans détergent et en conditions de détergent, mais nécessitent une forte concentration en protéines3.

Orientations futures :
Ce flux de travail peut être étendu à l’étude d’autres protéines membranaires, des interactions protéine-lipide ou au dépistage de modulateurs de petites molécules. Combiner le BLI avec des approches orthogonales telles que la photométrie de masse, la caractérisation structurelle ou la cryo-EM pourrait fournir des informations plus détaillées sur l’oligomérisation, la stœchiométrie et les mécanismes de liaison. Une optimisation supplémentaire peut également permettre l’analyse de ligands à haute affinité, d’interactions multivalentes ou de complexes dans des environnements lipidiques plus natifs.

En conclusion, un contrôle attentif de l’immobilisation des protéines, de la concentration de détergent et des conditions tampons permet à BLI de générer des données cinétiques fiables et reproductibles pour TMEM120A M207A et d’autres protéines membranaires complexes similaires. Bien que des limites inhérentes existent, la méthode offre une base solide pour étudier les interactions protéine-ligand spécifiques et modérées dans des conditions expérimentales bien définies.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Nous remercions sincèrement la plateforme de recherche de l’Université de Melbourne, la Melbourne Protein Characterisation (MPC) Facility, pour son soutien dans la purification et la caractérisation des protéines. La recherche a été soutenue par la subvention Ideas Grant du National Health and Medical Research Council (NHMRC) (2020/GNT2000934 à I.R.) et par l’Australian Research Council (Centres de formation à la transformation industrielle, IC200100052 à I.R. et M.M.).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
384-well black microplateGreiner Bio-One781906BLI
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 30 kDa MWCOSigma-AldrichUFC903008Purification
Anti-FLAG probeGator Bio160036BLI
ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigma-AldrichA2220-10MLPurification
BioRenderBioRenderhttps://biorender.comFigure 1 creation 
Bovine Serum AlbuminSigma-Aldrich9048-46-8Mass photometry
CD 293 Medium (1x)Thermofisher11913019Cell culture
Centrifuge 5920 R: Large Capacity and High PerformanceEppendorfNAPurification
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailMerck11836170001Purification
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma-Aldrich9003-98-9Purification
ExpiFectamine 293 Transfection KitThermofisherA14524Transfection
Gator Bio softwareGator BioNABLI
Gator PlusGator BioNABLI
GlutaMAX SupplementThermofisher35050061Cell culture
GsMTx4 trifluoroacetateSigma-AldrichSML3140-1MGBLI
HEK293T/SF17 cells adapted to suspension growthATCCATCC CRL11268Cell culture
LMNG (Lauryl maltose neopentyl glycol)ThermofisherA50940Purification
Max PlateGator Bio130062BLI
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Sigma-Aldrich11359061001Purification
Prometheus High Sensitivity CapillariesNano TemperPR-C006Thermodynamic stability
Prometheus PantaNano TemperNAThermodynamic stability
Q Buffer (0.3% Glycine pH 3.8)Gator Bio120010BLI
Qsonica Q500 Sonicator Ultrasonic Cell DisrupterQsonicaNAPurification
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytivaGE28-9909-44Purification
Synthesized TMEM120A (M207A) gene cloned into pCDNA 3.1 plasmid with FLAG-3C-LinkerGenScript BiotechNAPlasmid
TWEEN 20Sigma-AldrichP1379-25MLBLI
Two MPRefeynNAMass photometry

Références

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  4. Ciesielski, G. L., Hytönen, V. P., Kaguni, L. S. Biolayer interferometry: a novel method to elucidate protein-protein and protein-DNA interactions in the mitochondrial DNA replisome. Methods Mol Biol. 1351, 223-231 (2016).
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  7. Egan, D., Slaybaugh, C., Wang, R. Getting started: kinetics assay using bio-layer interferometry. Gator Bio Technical Note. , (2023).
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Mots-clés

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