Article de méthode

Profilage électrophysiologique éveillé du cortex préfrontal ventromédial dans un modèle murin de dépression et de maladie de Parkinson

DOI :

10.3791/69366

⸱

30 décembre 2025

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Research of Barcelona (IIBB), Spanish National Research Council (CSIC), 2August Pi i Sunyer Biomedical Research Institute (IDIBAPS), 3Biomedical Research Networking Center for Mental Health (CIBERSAM), ISCIII, 4Human Anatomy and Embryology Department, Faculty of Medicine, University of Valencia

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En utilisant un modèle murin de type Parkinson (MP) qui surexprime la forme mutante A53T de l’alpha-synucléine humaine (h-α-Syn) dans le noyau dorsal du raphé (DR), nous avons développé une méthode d’enregistrement électrophysiologique pour étudier le rôle du circuit du cortex préfrontal ventromédial (vmPFC)-DR dans les troubles dépressifs/anxieux chez la MP.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bien que la maladie de Parkinson (MP) soit principalement connue comme un trouble moteur, les symptômes non moteurs apparaissent souvent avant les déficits moteurs et influencent significativement la progression de la maladie, étant cruciale à tous les stades de la maladie. Parmi celles-ci, la dépression et l’anxiété sont les symptômes les plus fréquents et entraînent une charge symptomatique plus élevée chez les femmes que chez les hommes. Des altérations du système sérotoninergique (5-HT) sont fréquemment associées à des troubles de l’humeur, et des accumulations de α-synucléine (α-Syn) ont été observées dans les noyaux 5-HT raphé (RN) de patients atteints de la maladie de Parkinson (MP) et de dépression. Comprendre les circuits neuronaux sous-jacents à ces symptômes non moteurs est donc crucial.

Ici, nous présentons un protocole amélioré pour étudier le rôle du circuit du cortex préfrontal ventromédial (vmPFC)-noyau dorsal du raphé (DR) dans les troubles de l’humeur associés à la MP, en utilisant un modèle murin féminin surexprimant la forme mutante A53T de la α-syn humaine (h-α-syn) chez la RD. Notre méthode permet une évaluation à haute résolution de l’activité neuronale dans les cortex infralimbique (IL) et pré-limbique (PL) dans des conditions basales et lors du conditionnement aversif et de l’extinction. En utilisant un paradigme de conditionnement sensoriel ton-lumière chez des souris éveillées et tête fixe, nous employons des sondes électrophysiologiques multicanaux pour enregistrer les réponses neuronales. Les expériences ont été menées dans des couloirs de réalité virtuelle, combinant un tapis roulant cylindrique avec un affichage visuel à double écran pour maintenir l’engagement comportemental tout en assurant un contrôle précis des stimuli sensoriels et la stabilité de l’enregistrement.

Ce protocole s’appuie sur l’implication établie des cortex IL et PL dans le conditionnement de la peur et l’extinction, et fournit un cadre solide pour examiner l’activité neuronale dynamique dans les circuits impliqués dans des comportements dépressifs et anxieux chez la MP. En permettant des mesures comportementales et électrophysiologiques simultanées dans des conditions contrôlées, cette approche offre un outil puissant pour élucider les mécanismes neurobiologiques des symptômes non moteurs dans la MP et pour tester les interventions potentielles.

Introduction

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La maladie de Parkinson (MP) est un trouble moteur, mais les symptômes non moteurs sont connus pour précéder les manifestations motrices et sont critiques à tous les stades de la maladie1, 2, 3 et 4. Parmi ceux-ci, la dépression et l’anxiété sont les symptômes neuropsychiatriques les plus répandus, affectant gravement la qualité de vie des patients atteints de MP et entraînant une charge symptomatique plus élevée chez les femmes que chezles hommes. Malgré cela, ils sont souvent sous-diagnostiqués et maltraités 6. Pour toutes ces raisons, il est essentiel de comprendre la neurobiologie et les circuits impliqués dans les symptômes neuropsychiatriques de la MP afin de stratifier les patients et de leur offrir des soins plus personnalisés.

Bien que l’étiologie de la MP reste partiellement incertaine, plusieurs caractéristiques neuropathologiques clés ont été identifiées. La maladie se caractérise par la dégénérescence progressive et la perte des neurones et fibres dopaminergiques (DA) dans le système nigrostriatal, entraînant les déficits moteurs prototypiques associés à la 7,8. Une autre caractéristique de la MP est la présence de corps de Lewy (LB) et de neurites de Lewy — inclusions intracellulaires formées par des agrégats protéiques fibrillaires — composées principalement de la protéine α-synucléine (α-Syn)9,10. Les études de neuroimagerie révèlent également que d’autres systèmes de neurotransmetteurs sont affectés — même avant l’implication de l’DA — parmi eux, le système sérotonergique (5-HT) 11,12,13. Des modifications du système sérotoninergique (5-HT) sont couramment associées à des troubles de l’humeur, et des dépôts de α-synucléine (α-Syn) ont été détectés dans les noyaux 5-HT du raphé (RN) chez des personnes diagnostiquées avec la maladie de Parkinson (MP) et une dépression14.

Le noyau dorsal du raphé (DR) est le plus grand noyau 5-HT chez le RN15, jouant un rôle crucial dans la régulation émotionnelle, la perception, la récompense, l’agressivité et les interactions sociales. Par conséquent, le dysfonctionnement en RD est associé à des troubles neuropsychiatriques tels que le stress, l’anxiété et la dépression15,16. À ce stade, il est important de souligner la forte connexion fonctionnelle et anatomique bidirectionnelle entre la RD et le cortex préfrontal (CPF), une région cérébrale essentielle aux fonctions cérébrales d’ordre supérieur. Alors que les régions plus dorsales de la CPF sont liées aux fonctions cognitives, les zones plus ventromédianes (vmPFC) jouent un rôle fondamental dans la régulation émotionnelle, le contrôle de l’action, la mémoire et la prise dedécision 17,18. Par conséquent, la vmPFC et la DR influencent significativement l’humeur, et une activité modifiée dans ce circuit est associée à des symptômesdépressifs 18. De plus, l’accumulation de formes agrégées de α-Syn dans les neurones 5-HT chez l’infirmière autorisée a été démontrée induire des phénotypes anxieux etdépressifs 19,20,21.

En utilisant un modèle murin féminin avec un phénotype dépressif surexprimant la forme mutante A53T de la α-syn humaine (h-α-syn) dans la RD via un vecteur viral adéno-associé (AAV), nous avons développé une méthode d’enregistrement électrophysiologique. Cette méthode vise à étudier le rôle du circuit vmPFC-DR dans les troubles dépressifs/anxieux chez les troubles de la MP. Cette approche consiste à évaluer l’activité neuronale des cortex infralimbique (IL) et pré-limbique (PL) chez des souris éveillées via des enregistrements à une unité et à potentiel de champ local (LFP). Cela se fait à l’aide d’une sonde multicanale en conjonction avec un coureur de réalité virtuelle. Reconnaissant l’implication des cortex PL et IL dans le conditionnement aversif, nous mesurons également leur activité durant un tel paradigme afin d’évaluer leur fonction dans des situations stressantes. Il est crucial de comprendre que le PL génère principalement des réponses conditionnées, tandis que le cortex IL joue un rôle clé dans l’extinction de cesréponses 22,23.

Le protocole suivant décrit les étapes pour implanter une barre de tête et enregistrer de manière aiguë l’activité électrique des cortex PL et IL in vivo. Nous y parvenons grâce à un couloir de réalité virtuelle, qui combine un tapis roulant cylindrique pour souris fixées à tête avec un affichage visuel à double écran. Le protocole est structuré en quatre étapes principales : (1) chirurgie d’implantation de barre de tête, (2) habituation, (3) enregistrement et acquisition du signal, et (4) analyse des données : tri des pics et prétraitement des données.

Trois semaines après avoir induit la surexpression de h-α-syn dans le système 5-HT du cerveau, les souris subissent la chirurgie d’implantation de la barre de tête, qui permet une fixation ultérieure de la tête. Après une période de récupération d’une semaine, les souris sont habituées pendant 4 jours à la fois à l’expérimentateur et au tapis roulant et au système de fixation de la tête. Le jour de l’enregistrement, cette configuration sert à enregistrer l’activité neuronale des cortex PL et IL sous conditions de base et lors du conditionnement aversif. Les données neuronales brutes sont traitées par tri automatique de pointes avec Kilosort4 suivies d’une curation manuelle en Phy2, afin d’extraire des clusters d’une unité de haute qualité pour une analyse ultérieure (Figure 1).

Le protocole d’enregistrement vmPFC multicanal éveillé et fixé proposé offre plusieurs avantages par rapport aux alternatives classiques telles que les préparations anesthésiées ou ex vivo et les enregistrements sans fil chez les animaux en mouvement libre. Contrairement aux approches anesthésiées ou ex vivo, cette méthode permet d’évaluer l’activité des vmPFC sous stimulation visuelle et auditive contrôlée dans un environnement de réalité virtuelle, ce qui est essentiel pour mettre en œuvre les paradigmes de conditionnementaversif 24,25. Contrairement aux enregistrements en mouvement libre, la configuration tête fixe offre un contrôle expérimental précis des entrées sensorielles et des contingences de tâche, réduisant ainsi la variabilité et permettant des structures d’essai cohérentes. De plus, la fixation de la tête réduit le risque de désengagement de tâche observé dans des paradigmes en mouvement libre, en particulier sous stimulation aversive, tout en permettant des enregistrements multicanaux stables et à haut rendement26.

D’un point de vue pratique, ce protocole exige que les animaux soient habitués à la fixation de la tête et à la course sur tapis roulant, mais il bénéficie de systèmes de fixation de tête relativement abordables et disponibles dans le commerce, intégrant des tapis de course cylindriques. Cela rend cette approche accessible aux petits laboratoires, car les sondes peuvent être réutilisées plusieurs fois (jusqu’à ~10 insertions), réduisant considérablement les coûts par rapport aux implants en mouvement libre chronique. Par conséquent, cette méthode offre un équilibre entre contrôle expérimental, pertinence comportementale et rentabilité. Un autre facteur à considérer est la mise en œuvre du paradigme de conditionnement aversif. Dans cette étude, nous avons utilisé un plan expérimental basé sur l’aversion naturelle des rongeurs à la lumière : 10 tonalités auditives (stimuli conditionnés) ont chacune été suivies d’une brève exposition à une lumière intense (stimulus non conditionné). Bien que ce schéma soit moins stressant que d’autres méthodes classiques de conditionnement, comme celles impliquant des chocs électriques, il constitue un facteur de stress réel plus similaire.

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Protocole

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Toutes les expériences ont été réalisées avec des témoins correspondant à l’âge, et les procédures animales ont été conçues conformément aux règles des 3R ; réalisée conformément aux directives éthiques définies dans la directive européenne 2010/63 (22 septembre 2010), la législation espagnole (RD 1201/2005, L.32/2007 et L.6/2013) et approuvée par la Generalitat Valenciana (ES462500001003 ; réf. 2023-VSC-PA-0073), ainsi que par le Comité local de bioéthique de l’Université de Valence (réf. A20230214153605).

REMARQUE : Pour garantir la sécurité et prévenir toute contamination, tout au long de la procédure, portez un équipement de protection individuelle, y compris des gants et bottines jetables, une blouse de laboratoire, un masque et un filet à cheveux. Utilisez des systèmes de reprise vétérinaire pour l’élimination des résidus résultant de son utilisation, conformément aux réglementations locales et aux programmes nationaux de reprise applicables.

1. Génération de modèles de souris

REMARQUE : Les femelles adultes C57BL/6J (âgées de 9 semaines) ont été hébergées dans des conditions environnementales contrôlées (22 ± 1 °C ; cycle clair/obscur de 12 heures) avec un accès improvisé à la nourriture et à l’eau.

  1. Sous anesthésie isoflurane (4 % pour l’induction, 2 % pour l’entretien) dans la chambre d’anesthésie de la souris, on assigne aléatoirement les souris à recevoir des microinjections stéréotaxiques dans la DR (coordonnées relatives au bregma : antéropostérieur [AP] −4,5 mm, médiolatéral [ML] −1,0 mm, dorsoventral [DV] −3,2 mm ; angle d’injection : 20°) à l’aide d’un micro-injecteur automatisé à un débit de 0,4 μL/min, comme décritprécédemment 19,27,28.
  2. Assurez-vous que chaque souris reçoit un volume total de 0,6 μL soit d’un sérotype viral adéno-associé recombinant 1/2 (AAV1/2 ; concentration : 5,16 × 1012 gp/mL) codant pour la forme mutante A53T de la h-α-syn humaine, afin d’induire une surexpression dans les neurones 5-HT de la DR (n = 4), soit d’un vecteur vide AAV1/2 contenant de l’ADN empasseur non codant (AAV-EV), utilisé comme groupe de contrôle (n=5).
  3. Pour éviter le reflux, maintenez l’aiguille en place pendant 8 minutes supplémentaires avant de la retirer lentement à un rythme de 320-400 μm/min.
    REMARQUE : Pour des raisons de sécurité, assurez-vous que les systèmes de récupération fonctionnent correctement pour capter les vapeurs anesthésiques avant toute chirurgie stéréotaxique (sections 1 et 2). En cas de déversement d’isoflurane lors du remplissage du vaporisateur, nettoyez-le immédiatement avec un matériau inerte et absorbant, comme la sciure. Utilisez les systèmes de reprise vétérinaire pour l’élimination des filtres à isoflurane et de tout résidu résultant de son utilisation, conformément à la réglementation locale.

2. Chirurgie d’implantation de la barre de tête

REMARQUE : Effectuez la chirurgie d’implantation de la barre de tête en suivant les étapes ci-dessous, 3 semaines après avoir généré le modèle murin.

  1. Préparation préchirurgicale et anesthésie
    1. Anesthésiez l’animal avec de l’isoflurane (4 % pour l’induction, 1,5 à 2 % pour l’entretien) administré via un vaporisateur d’isoflurane.
    2. Placez la souris dans l’appareil stéréotaxique sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle tout au long de la procédure.
    3. Ouvrez doucement la bouche de la souris pour poser ses dents sur la barre de morsure et fixez le masque relié à un appareil stéréotaxique, afin d’assurer une administration continue d’isoflurane pour l’entretien de l’anesthésie.
    4. Appliquez des gouttes pour éviter les ulcères oculaires.
    5. Administrez une analgésie au moins 10 minutes avant l’incision du scalpel par injection sous-cutanée de butorphanol (5 mg/kg dans une solution saline).
    6. Appliquez de la lidocaïne régionale (0,03 mL dans chaque oreille, 4 mg/kg, ne pas dépasser les doses maximales de 7 mg/kg ou de la crème de lidocaïne/prilocaïne [25 mg/g de lidocaïne et 25 mg/g de prilocaïne]) sur l’oreille interne pour réduire l’inconfort causé par les barres d’oreilles.
  2. Positionnement stéréotaxique et préparation du crâne
    1. Placez les barrettes d’oreilles pour maintenir solidement la tête, assurant la symétrie et un minimum de mouvement.
    2. Ajustez la barre incisive pour amener le bregma et le lambda au même niveau horizontal, en vous assurant qu’ils sont bien sur la ligne médiane.
    3. Confirmez l’induction de l’anesthésie en vérifiant la perte de retrait des pédales, les réflexes palpébraux, la diminution du rythme respiratoire et l’absence de mouvement des moustaches.
    4. Assurez-vous que la souris est correctement positionnée dans le cadre stéréotaxique avec les barres d’oreilles soigneusement ajustées.
    5. Rasez la zone chirurgicale et désinfectez-la à l’aide d’une solution antiseptique (povidone-iode suivie d’éthanol à 70 %) pour minimiser le risque d’infection.
    6. Réalisez une incision médiane du cuir chevelu et rétractez doucement les tissus sous-jacents pour exposer le crâne tout en maintenant l’hémostasie. Assurez-vous que la peau est suffisamment ouverte pour visualiser les arêtes parietotemporales. Pour cela, placez quatre pinces fines bulldog sur le fascia sous la peau pour maximiser l’exposition.
    7. Nettoyez et séchez soigneusement le crâne exposé pour une vue dégagée des repères anatomiques (bregma et lambda).
    8. Niveler le crâne sur l’axe antéropostérieur en alignant la brème et la lambda dans le même plan horizontal.
    9. Nivelez le crâne dans l’axe médiolatéral en faisant correspondre la profondeur des deux arêtes pariétotemporales.
  3. Forage et pose d’implants
    1. Forer un trou de 1 mm de diamètre au-dessus du vmPFC aux coordonnées AP : +1,75 ; ML : −0,4 ; DV : +3,1 (Figure 2). Utilisez le bras stéréotaxique pour marquer les quatre sommets avec de l’encre afin de guider l’insertion de la sonde en silicium le jour de l’enregistrement. De plus, dessinez une croix en reliant les points décrits précédemment avec un scalpel et en appliquant une abondance d’encre afin qu’elle pénètre les incisions, assurant ainsi la stabilité des marques. Enlever tout excès d’encre avec un coton tige-coton humidifié à 70 % d’alcool.
    2. Percer deux trous supplémentaires dans la région postérieure du crâne, au-dessus du cervelet. Insérez un fil manuellement dans chaque trou pour référence future et mise à la terre (Figure 2), respectivement.
      1. Sinon, utilisez des vis en acier inoxydable (acier inoxydable A2, M1 × 2, ou 18-8 en acier inoxydable, 0,061 » de diamètre × 3/16 » de longueur) ou des cavaliers mâles en acier inoxydable. Quel que soit le choix, assurez-vous que l’élément qui fournit le contact électrique reste en contact direct avec la surface du cerveau sans exercer de pression pour éviter des dommages tissulaires, compromettre le bien-être animal ou nuire à la qualité de l’enregistrement.
    3. Créez des rainures peu profondes sur le crâne exposé avec un scalpel pour augmenter la surface et améliorer l’adhérence de l’implant.
    4. Appliquez une résine dentaire intermédiaire sur le crâne nettoyé et séché en deux couches successives : d’abord avec le mélange de base et catalyseur, en laissant sécher complètement, puis avec le mélange contenant de la poudre, assurant une couverture de toute la surface et des bords du crâne. Vérifiez avec une pince à épiler que la liaison adhésive entre le crâne et le futur ciment implant est complètement solidifiée avant de procéder.
    5. Placez une barre de tête en acier inoxydable entre le trou d’enregistrement du PFC et les trous de référence/mise à la terre (Figure 2). Alignez la barre de tête avec le bras stéréotaxique pour s’assurer qu’elle est complètement à niveau avec le crâne, maintenant ainsi des coordonnées stéréotaxiques précises lors de la fixation de la tête et de l’insertion ultérieure de la sonde en silicium.
    6. Fixez tous les composants métalliques au crâne à l’aide de ciment dentaire, en évitant soigneusement tout ciment d’entrer dans le trou d’enregistrement.
    7. Couvrez la craniotomie avec un silicone chirurgical bicomposant.
      REMARQUE : Si toutes les étapes sont suivies avec soin, l’implantation et la fonctionnalité ultérieure de la barre de tête devraient se dérouler sans complications, avec un taux de réussite estimé supérieur à 95 %.
  4. Soins postopératoires
    1. Surveillez attentivement la récupération de la souris après une opération cérébrale, afin de vous assurer que l’animal retrouve conscience, maintient sa température corporelle et ressent un soulagement de la douleur.
    2. Les souris d’intérieur individuellement dans des cages et les surveillent jusqu’à leur rétablissement complet.
    3. Administrez du butorphanol sous-cutané (5 mg/kg en solution saline) toutes les 12 heures pendant 3 jours après l’opération.
      REMARQUE : (CRITIQUE) Tout au long de la chirurgie, surveillez en permanence les signes vitaux (fréquence cardiaque et respiratoire, saturation en oxygène et tension artérielle). Appliquez des gouttes pour les yeux si nécessaire afin d’éviter la sécheresse ou les dommages cornéens.

3. Habituation

REMARQUE : Une fois que les souris ont récupéré leur poids avant la chirurgie (environ 5 à 7 jours après l’opération), commencez un protocole d’habituation de 4 jours pour s’habituer progressivement à l’expérience expérimentale.

  1. Jour 1 : Effectuez deux séances de manipulation de 10 minutes, avec une pause d’une heure entre les séances pour familiariser les souris avec l’expérimentateur. Touchez doucement la souris pendant qu’elle est sur l’avant-bras pour la familiariser avec l’expérimentateur.
  2. Jour 2 : Effectuez deux séances de manipulation de 5 minutes. Après chaque séance, tenez doucement les souris par la barre de tête à intervalles de 10 secondes pendant un total de 5 minutes.
  3. Jour 3 : Après une courte séance de manipulation, laissez les souris courir librement sur le tapis roulant pendant 7 minutes. Ensuite, fixez la tête et maintenez les souris en position tête fixe pendant 5 minutes.
  4. Jour 4 : Faites une séance de course sur tapis de course de 15 minutes avec la tête fixe.
    REMARQUE : (CRITIQUE) Les animaux présentant une perte de poids excessive, du travail de barbier, une diminution du comportement exploratoire ou une mobilité réduite, conformément aux directives établies sur le bien-être animal, doivent être retirés de l’étude. L’implant doit rester complètement stable. Tout déplacement nécessite l’exclusion de l’animal de l’étude, car il peut endommager la sonde multicanal lors de l’enregistrement et/ou entraîner des signaux instables et bruyants.

4. Préparation de la sonde

REMARQUE : Pour connecter la sonde aux adaptateurs (Figure 3A), suivez ces étapes :

  1. Connectez l’adaptateur/connecteur de sonde à l’adaptateur stéréo-taxique du bras.
  2. Associez 2 adaptateurs de tête d’étage (chacun Om32) à l’adaptateur de sonde (Figure 3A), en veillant à ce que l’orientation corresponde et en évitant une force excessive.
  3. Connectez la sonde à l’adaptateur (Figure 3B). Pour permettre des enregistrements simultanés depuis les régions IL et PL à 64 profondeurs distinctes, utilisez une sonde en silicium à un seul tige et 64 canaux (longueur du tige : 8 mm ; Épaisseur de la tige : 15 μm) (Figure 4A).
  4. Pour faciliter la localisation ultérieure de la sonde, recouvrez-la d’un colorant fluorescent ou de particules ferromagnétiques compatibles histologiquement, permettant une vérification post hoc du site d’enregistrement.
  5. Appliquez la teinture selon l’une des méthodes suivantes :
    1. Trempez toute la tige dans la solution.
    2. Libérez une petite goutte de la solution d’une micropipette sur la sonde et étalez-la le long de la tige.
    3. Utilisez un pinceau fin trempé dans la solution pour peindre l’arrière de la sonde.
    4. Pour les étapes 4.5.2 et 4.5.3, appliquez au moins trois coups pour assurer un revêtement approprié de la tige.
      REMARQUE : Les étapes 4.1 à 4.3 ne sont requises que lors de la première utilisation de la sonde, car elles peuvent être réutilisées sur plusieurs sessions d’enregistrement. Après les enregistrements, déconnectez les câbles de l’interface périphérique série (SPI) tout en maintenant la sonde connectée à l’adaptateur et les adaptateurs montés sur l’adaptateur stéréo-taxique.

5. Enregistrement et acquisition de signaux

  1. Surveillez le cycle œstral en utilisant un protocole non invasif basé sur la typologie cellulaire dans les frottis vaginaux afin de s’assurer que les femelles sont en phasediestrus 29,30.
  2. Fixez l’animal en position tête fixe sur un tapis roulant cylindrique intégré à un cadre stéréotaxique (Figure 4B). Assurez-vous que le tapis de course et le cadre sont correctement alignés pour assurer stabilité et comparabilité entre les sujets.
  3. Pour enregistrer et acquérir des signaux, suivez les étapes 5.3.1 à 5.3.15.
    1. Utilisez une loupe pour garantir que l’implant reste complètement immobile.
    2. Montez l’ensemble de la sonde — comprenant la sonde, les adaptateurs et les adaptateurs headstage — sur le bras adaptateur du cadre stéréotaxique.
    3. Connectez les câbles SPI, précédemment reliés à la carte d’acquisition, aux étages de tête (Figure 3B). Tenez un registre du câble SPI attaché à chaque étage de tête, car cette correspondance est essentielle pour préserver la disposition des électrodes lors du tri automatique des pointes ultérieur.
    4. Reliez le fil de masse de l’adaptateur de la sonde au pont mâle ipsilatéral de l’hémisphère enregistré, et le fil de référence au côté controlatéral. Appliquez une petite quantité d’étain à souder sur le fil intégré dans le cerveau, puis apliquez brièvement de la chaleur pour sécuriser la connexion. Évitez la chaleur excessive pour éviter d’endommager le tissu sous-jacent ou l’électronique adaptatrice.
    5. Placez une loupe pour visualiser le trou créé pour l’insertion de la sonde dans les cortets PL et IL. Assurez-vous que les repères d’encre restent clairement visibles en permanence afin de maintenir des coordonnées stéréotaxiques précises pendant la procédure.
    6. Guidez la sonde vers le centre du trou du VMFCP à l’aide du bras stéréotaxique et des repères pré-marqués.
    7. Placez soigneusement la sonde au centre de la craniotomie et touchez doucement la surface du cerveau. Appliquez une solution sérique tiède sur le tissu exposé pour éviter le dessèchement.
    8. Commencez à baisser la sonde à un rythme de 50 μm/min pendant 4 à 5 minutes pour minimiser l’inflammation des tissus. Assurez-vous que la tige de la sonde ne se plie pas lors de cette insertion initiale.
    9. Mesurez l’impédance des sites d’enregistrement et comparez les valeurs avec celles fournies par le fabricant. Cette évaluation initiale garantit que les premiers canaux accédant au cerveau n’ont pas été endommagés ou bloqués lors de l’insertion.
      REMARQUE : (CRITIQUE) Les impédances des électrodes doivent être comparées aux valeurs de référence du fabricant. Des écarts allant jusqu’à ~30 % sont généralement acceptables et ne compromettent pas les enregistrements. Des augmentations comprises entre 30 et 100 % peuvent encore être utilisables, mais il faut être prudentes et surveiller de près. Des changements dépassant 100 % indiquent souvent des dommages ou des blocages, et les sites concernés doivent être considérés comme peu fiables. Dans de tels cas, la sonde doit être nettoyée pour réduire l’impédance comme décrit précédemment. Si les impédances ne peuvent pas être restaurées à une plage acceptable, la sonde doit être écartée. Cependant, c’est finalement à l’expérimentateur de considérer combien de canaux peu fiables peuvent être tolérés avant de jeter la sonde ; Une norme couramment appliquée est qu’au maximum ~10 % des chaînes ne doivent être compromises.
    10. Continuez à baisser la sonde à un rythme de 50 μm/min tout en surveillant le signal en direct des canaux entrant dans le cerveau. Vérifiez que ces signaux ressemblent à ceux des canaux précédemment évalués afin de confirmer une insertion correcte.
    11. Avancez la sonde jusqu’à atteindre une profondeur de +3,1 mm DV, en maintenant la craniotomie hydratée en appliquant une solution sérique tiède tout au long de la descente.
    12. Retirez la loupe et éliminez toute autre source de bruit électrique dans la pièce.
    13. Remesurez l’impédance pour vérifier qu’aucun site d’enregistrement n’a été bloqué lors de l’abaissement de la sonde.
    14. Surveillez le signal de 4 à 5 canaux consécutifs en référence et attendez 90 à 120 minutes pour la stabilisation du signal de la sonde. Après cette période de stabilisation, vérifiez que la dérive du signal est minimale afin de garantir que le tri automatique des pics ultérieur puisse isoler de manière fiable les clusters d’une seule unité.
    15. Remesurer l’impédance avant de commencer l’acquisition des données afin de confirmer les conditions appropriées du site d’enregistrement et établir une mesure de base de l’impédance. Appliquez régulièrement du sérum physiologique tiède pour éviter que les tissus ne sèchent. Sauvegardez l’enregistrement sous forme de fichier binaire (par exemple, .dat ou .bin) pour faciliter le prétraitement ultérieur des données.
  4. Une fois stable, suivez les étapes 5.4.1-5.4.6.
    1. Enregistrez l’activité neuronale de base pendant 30 minutes (Figure 4C).
    2. Initiez le protocole de conditionnement aversif avec Arduino, 30 minutes après l’enregistrement de base. Il s’agit de 10 sons sonores (10 s/ton), délivrés une fois par minute pendant 10 minutes. Chaque tonalité est immédiatement suivie d’un stimulus lumineux de 10 s présenté via les écrans de labyrinthe en réalité virtuelle (Figure 4C).
    3. Enregistrez l’activité neuronale pendant 10 minutes sans aucun stimulus conditionnant.
    4. Enregistrer l’activité corticale PL et IL pendant le protocole d’extinction, dans lequel 10 tonalités auditives sont présentées sans le stimulus lumineux qui suit.
    5. Enregistrer l’activité neuronale pendant encore 10 minutes en l’absence de stimuli.
    6. Arrêtez l’enregistrement.
  5. Procédures post-enregistrement : Après avoir terminé la session d’enregistrement, suivez l’étape 5.5.1.
    1. Retrait de la sonde : Appliquer du sérum physiologique tiède et retirer soigneusement la sonde à un rythme de 100 à 150 μm/min tout en surveillant en continu les signaux de l’électrode afin d’éviter des dommages mécaniques à la sonde et l’étirement du tissu, qui pourrait compromettre une reconstruction histologique ultérieure.
    2. Une fois la sonde retirée du cerveau, faites immédiatement tremper la tige dans de l’eau distillée pendant 10 minutes pour éviter que les tissus attachés ne sèchent.
    3. Anesthésiez l’animal avec du pentobarbital sodique (100 mg/kg). Ensuite, à l’intérieur d’une hotte chimique, perfusez la souris transcardiquement avec 80 mL de solution saline (0,9 %), suivie de 80 mL de paraformoldéhyde dilué à 4 % dans du PB (0,1 M, pH 7,6).
      1. Pour éviter le paraformaldéhyde, les contacts et l’inhalation, utilisez un équipement de protection oculaire et faciale, des gants de protection chimique et un masque anti-poussière. À la fin de la perfusion, déposez le paraformoldéhyde restant dans un récipient pour les solvants non halogénés.
      2. En cas de déversement, humidifiez le matériau pour éviter la dispersion de la poussière et placez-le dans des contenants scellés. Nettoyez les zones et surfaces de travail contaminées avec de l’eau de Javel pour neutraliser le paraformaldéhyde.
    4. Retirez le cerveau, fixez la pose toute la nuit à 4 °C, puis conservez 30 % de saccharose dans du PB (0,1 M, pH 7,6) à 4 °C pour la cryoprotection. Obtenir des sections coronales de 30 μm à l’aide d’un microtome congelant, puis monter les tranches sur des lames en verre gélatinisé.
      REMARQUE : Ces sections seront utilisées pour confirmer la surexpression de la DR α-Syn par immunohistochimie comme précédemment19, 20, 21et la localisation de la sonde.
    5. Nettoyage par sonde : Immergez la région implantable de la sonde dans une solution enzymatique de détergent à 1 % dans de l’eau distillée pendant 1 heure.
    6. Faites tremper la tige de sonde dans de l’eau distillée pendant encore 10 minutes pour éliminer les résidus de détergent.
    7. Sécher pendant 20 à 30 minutes en position verticale. Après séchage, inspectez la sonde au microscope pour confirmer qu’aucun tissu ou débris ne reste sur les sites d’enregistrement. Si la sonde est complètement propre, trempez-la dans de l’alcool isopropylique de haute qualité pendant 1 minute et conservez-la dans sa boîte antistatique d’origine.

6. Analyse des données : tri des pics et prétraitement des données

REMARQUE : Pour analyser les enregistrements neuronaux extracellulaires et attribuer des pics individuels à des neurones spécifiques, utilisez l’algorithme de tri des pics Kilosort431 .

  1. Effectuez un tri automatique des pics avec Kilosort431. Dans l’interface graphique Kilosort4, sélectionnez le fichier d’enregistrement binaire et spécifiez la disposition de la sonde selon la feuille de configuration du fabricant. Effectuez le tri des pics en utilisant les paramètres par défaut, qui sont idéaux pour capturer les formes d’onde enregistrées dans les cortex IL et PL sans ajustements supplémentaires.
  2. Inspectez la sortie Kilosort avec Phy2 (kwikteam/phy) pour une curation manuelle supplémentaire. Intégrer des plugins développés par la communauté (petersenpeter/phy2-plugins ; jiumao2/PhyWaveformPlugin) pour ajouter des fonctionnalités supplémentaires à Phy2 et améliorer la qualité des données sélectionnées.
  3. Étiquetez comme bruit et écartez tout cluster avec une fréquence <0,05 Hz ou contenant moins de 500 pics.
  4. De plus, marquez les clusters suivants comme bruit :
    1. Marquez ceux qui affichent des auto-corrélographies triangulaires comme du bruit.
    2. Marquez celles dont les formes d’onde ne ressemblent pas à des pics comme du bruit.
    3. Marquez celles détectées sur un seul canal d’enregistrement ou sur tous les canaux avec une amplitude variable comme du bruit.
    4. Notez ceux présentant une forte périodicité dans leurs auto-corrélographies comme étant du bruit.
  5. Sélectionnez uniquement des groupes présentant des formes d’onde physiologiquement appropriées, des preuves d’une vallée réfractaire dans l’auto-corrélographie, des variations d’amplitude plausibles et des composantes principales clairement séparées.
  6. Nettoyez manuellement chaque cluster en appliquant la suppression des outliers basés sur la distance de Mahalanobis.
  7. Continuez à examiner les formes d’onde et les variations d’amplitude comme indicateurs clés de la validité du nettoyage manuel.
    REMARQUE : Une fois le tri des pics terminé, les schémas d’activité neuronale du vmPFC peuvent être analysés à l’aide des routines implémentées en Python.

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Résultats

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Les récents enregistrements de l’activité corticale PL et IL, utilisant le protocole expérimental détaillé, révèlent des résultats significatifs : la surexpression de h-α-Syn dans la DR, qui induit un phénotype anxieux chez les souris femelles, modifie également l’activité vmPFC ventromédiane. Grâce à une analyse basée sur Python, nous avons démontré que la surexpression de α-Syn dans les neurones 5-HT du noyau DR modifiait la dynamique de tir et l’organisation fonctionnelle du circuit vmPFC-DR, réduisant la distinction ...

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Discussion

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Ce protocole présente une méthodologie robuste pour l’évaluation électrophysiologique in vivo des cortex PL et IL chez des souris éveillées à tête fixe, utilisant un système de corridor en réalité virtuelle. L’importance de cette méthode réside dans sa capacité à étudier directement le circuit vmPFC-DR chez des souris éveillées et comportées au sein d’un modèle. Même si la fixation de la tête limite les mouvements des animaux et peut être stressante, elle offre un contrôle préci...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

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Ce travail a été financé par la bourse BBRF Young Investigator Grant 31547 (MSA) 2023, la subvention européenne MCIU/AEI/FEDER PID2022-141700OB-I00, MCIN/AEI/10. 13039/501100011033 (AB), AGAUR 2021-SGR-01358, Gouvernement de la Catalogne (AB), et PID2022-141733NB-I00 (VT). Nous tenons également à remercier le Réseau espagnol pour la recherche sur le stress, MCIN/AEI/10.13039/501100011033 et CB/07/09/0034 Centre for Biomedical Research in Mental Health Network (CIBERSAM). MSA bénéficie d’une bourse Margarita Salas (MS21-132) de l’Université de Valence (reclassification du système universitaire espagnol du Ministère des Universités du Gouvernement espagnol, financée par l’Union européenne, Next Generation UE).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AAV1/2-CMV/CBA-A53T humain aSyn-WPRE-BGH-polyARivière CharlesGD1001-RVA53T aSyn humain
AAV1/2-CMV/CBA-Null/Vide-WPRE-BGH-polyARivière CharlesGD1004-RVContrôle vectoriel vide
ADPT A64-Om32x2Cambridge NeuroTechOmnetics 2228Adaptateur
silicone chirurgical bicomposant & nbsp ;Instruments de précision mondiauxKWIK-SIL
Butorphanol  ;Torbugesic vétérinaire / cymit quí ; Mica67753-31-5
DuraLayReliance Dental Manufacturing / Kalma43640ciment dentaire   ;
Sonde multicanale H9Cambridge NeuroTechASSY-77 H9
Crème EMLA (Lidocaïne / pricolaïne)  ;Lirios Vañ ; ó ; Pharmacie Sempere679290
microinjecteur & nbsp ;Instrument de Précision MondialKDS-310-PLUS
MSS Isoflurane Vaporizer   ;Fournitures et services médicaux, Royaume-UniMSSVAP02  ;
Conseil d’acquisition Open EphysOpen EphysOEPS-9029Conseil d’acquisition ; L’Open Ephys Acquisition Board peut diffuser jusqu’à 512 canaux de données neuronales vers un ordinateur via USB
C& B MetaBond  ;ParkellS380-RDCiment adhésif rapide
Pentobarbital  ;Vetoquinol Dolethal / Merck Life Science, S.L.U.P-010-1MLBarbiturique
RHD 32 canaux & nbsp ; Tête d’afficheIntan Technologies#C3314adaptateur head-stage   ;
SiccafluidThea S.A. Laboratories / Lirios Vañ ; ó ; Pharmacie Sempere6515167Gel ophtalmique & nbsp ;
appareil stéréotaxique   ;Stoelting51730U
cadre stéréotaxiqueNarishigeSR-6N/SM-15R
Terg-a-zymeSigma AldrichZ273287Solution de nettoyage pour sondes

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mouse Model DepressionDorsal Raphe NucleusSerotonergic SystemAversive ConditioningFear ExtinctionMultichannel ElectrophysiologyVirtual Reality Mice

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