Localisation des récepteurs de la membrane plasmique et des récepteurs de l’acétylcholine nicotinique neuronale intracellulaire à l’aide de l’imagerie quantitative dans les cellules de mammifères

Résumé

Ce protocole décrit l’expression et la quantification des sous-unités neuronales des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine à l’aide de la lignée cellulaire Neuro-2a des mammifères. Les marqueurs fluorescents sensibles au pH et la microscopie confocale permettent une évaluation précise de la localisation des récepteurs à la membrane plasmique par rapport à celles exprimées dans les compartiments intracellulaires neutres en pH, facilitant ainsi l’étude du trafic et de la modulation pharmacologique du nAChR.

Résumé

La quantification des récepteurs neuronaux nicotiniques à l’acétylcholine (nAChR) exprimés sur la membrane plasmique des cellules mammifères est importante pour le développement de nouvelles thérapies sélectives par cible et pour l’étude des protéines chaperonnes qui modulent le trafic des récepteurs. Cette étude présente un ensemble robuste de méthodologies pour exprimer à la fois les nAChR homomériques et hétéromériques dans les cellules Neuro2a (N2a) de mammifères et pour quantifier leur localisation de surface versus intracellulaire à l’aide de marqueurs fluorescents sensibles au pH. pHuji et pHluorine superécliptique (SEP) sont des protéines sensibles au pH qui peuvent être modifiées pour marquer des protéines recombinantes, permettant de visualiser la distribution spatiale des sous-unités nAChR. Ces balises fluorescentes émettent à pH neutre mais sont trempées dans des environnements acides. Pour suivre la localisation relative interne par rapport à la membrane plasmique des sous-unités α7, α4 et β2 de nAChR, soit pHuji soit SEP est attaché à l’extrémité C de chaque construction ADN. Pour exprimer α7-pHuji avec son chaperon NACHO, ou (α4-SEP ; β2-pHuji) dans les cellules N2a, un réactif de transfection d’ADN à base de lipides est utilisé. Le réactif de transfection et l’ADN plasmidique sont incubés séparément dans un milieu sérique réduit à température ambiante, puis combinés pour former des complexes lipidique-ADN qui facilitent la délivrance des plasmides dans les cellules. Après l’incubation, les cellules sont imagées à l’aide de microscopie confocale à cellules vivantes, dans des conditions de pH élevé et bas ou en présence d’un ligand fluorescent sélectif pour sous-type. Les images sont analysées à l’aide de fluorescence cellulaire totale corrigée dans les canaux fluorophores concernés, fournissant des informations quantitatives sur la distribution des sous-unités nAChR marquées fluorescentement entre la membrane plasmique et les compartiments intracellulaires. L’imagerie confocale à cellules vivantes permet le suivi en temps réel de la localisation des sous-unités nAChR afin de distinguer les différences entre les populations internes et de récepteurs de surface. Une expression solide de α7-pHuji ou (α4-SEP ; β2-pHuji) par membrane plasmique robuste est obtenue en moins de 24 heures à 37 °C. Cette méthode peut être adaptée pour inclure des chaperones supplémentaires, des sous-unités auxiliaires ou des ligands fluorescents pour l’étude du trafic de nAChR, de la modulation pharmacologique et des altérations liées à la maladie dans l’expression de nAChR.

Introduction

Les récepteurs neuronaux de l’acétylcholine nicotinique (nAChR) sont des canaux ioniques transmembranaires dépendants du ligand, exprimés sur la membrane plasmique de nombreux types cellulaires, y compris les neurones, les cellules gliales et les cellules immunitaires. Ces récepteurs sont composés de α sous-unités (α2-α10) ou β (β2-β4) qui s’assemblent pour former des sous-types homomériques ou hétéromères, les nAChR α7 et α4β2 étant les plus abondantes dans le^{cerveau 1,2}. La dysrégulation de ces sous-types a été associée à la maladie d’Alzheimer, au trouble de l’usage de nicotine, à l’épilepsie hypermotrice liée au sommeil, à la maladie de Parkinson et au trouble dépressif majeur, entre autres troubles neurologiques et^{psychiatriques} 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Des méthodes rapides et fiables pour exprimer et quantifier les nAChR sont essentielles pour comprendre les mécanismes de la maladie et développer des thérapies sélectives par cible. Cependant, obtenir une expression solide de ces récepteurs par la membrane plasmique est souvent difficile et chronophage. La méthode décrite ici permet une forte expression de surface des nAChR dans environ 24 heures après la transfection d’ADN et peut être combinée avec des ligands ou des protéines chaperones qui modulent le trafic des récepteurs.

Plusieurs approches existent pour exprimer les nAChR, notamment la transfection transitoire d’ADN ou la génération de lignées cellulaires stables exprimant le sous-type désiré. Bien que la création de lignées cellulaires stables soit utile pour des études à long terme impliquant le même sous-type de récepteur, ce processus est laborieux et peut prendre plusieurs mois. Une fois établies, ces lignées cellulaires peuvent présenter une expression variable des récepteurs à travers les passages, une perte d’expression au fil du temps, ou un biais de sélection pour les clones ayant une fonction ou densité de^{récepteur sous-optimale 13}. Une réduction de la température d’incubation de 37 °C à 30 °C, l’ajout de chaperones moléculaires comme la nicotine, ou un temps d’incubation prolongé peuvent favoriser une expression de^surface 13,14,15. Ces limitations sont particulièrement marquées pour les nAChR hétéromères, qui nécessitent un assemblage et un trafic appropriés des sous-unités, ainsi que pour les études portant sur la régulation assistée par chaperones des récepteurs. Par conséquent, une validation régulière de l’expression des sous-types de récepteurs à travers les passages est nécessaire lorsqu’on travaille avec des lignées cellulaires stables exprimant la nAChR.

Souvent, les chercheurs s’intéressent aux variantes des sous-unités nAChR et aux sous-unités chaperonnes ou protéiques auxiliaires, et doivent donc exprimer une variété d’ADN en succession rapide pour permettre une flexibilité rapide dans leurs tests. L’expression transitoire des nAChR est avantageuse à cet égard car le processus peut être achevé rapidement, permettant au chercheur d’étudier plusieurs sous-types de récepteurs ou conditions expérimentales sans attendre des mois pour générer des lignées cellulaires stables. Un phénomène courant, même avec une expression transitoire, est que de nombreux nAChR restent à l’intérieur de la cellule 24 heures après l’induction à 37 °C, nécessitant des périodes d’incubation supplémentaires de > 48^{h 16,17}. Par exemple, sans la protéine chaperone résistante aux inhibiteurs de la cholinestérase (RIC)-3, seulement ~1 % des α7 nAChR sont exprimés sur la membrane plasmique des cellules SHE-P des^{mammifères 18}. Avec la co-expression de RIC-3, environ 20 % des α7 nAChR sont détectés à la surface. Bien que cela représente une amélioration, l’abondance totale des récepteurs reste faible. La co-expression de α7 nAChR avec NACHO peut encore améliorer l’expression de surface, bien que moins de 40 % de la population totale de récepteurs se transmette encore à la membrane^{plasmique 19}. Une autre approche consiste à incuber des cellules transfectées à 30 °C pour améliorer l’expression de la membrane^{plasmique 20,21}. Pour les α4β2 nAChRs, cette réduction de température entraîne une augmentation de la densité des récepteurs de surface par cinq fois sans augmentation correspondante de la protéine totale^{de la sous-unité 21}. Cependant, cette amélioration nécessite au moins une journée supplémentaire et une utilisation accrue des consommables, réactifs et instruments.

Les travaux présentés proposent un ensemble de méthodes optimisées pour exprimer et quantifier des sous-types spécifiques de nAChR dans les 24 heures suivant la transfection dans les cellules N2a de mammifères, atteignant environ 83 % pour α7, 77 % pour α4 et 56 % pour les sous-unités β2 localisées à la membrane plasmique. Dans le cas des α7 nAChR, l’expression de la membrane plasmique peut être quantifiée à l’aide de α-bungarotoxine marquée fluorescentement sélective α7 (αBTX) ou par marquage fluorescent recombinant. Pour marquer chaque sous-unité, les protéines fluorescentes sensibles au pH pHuji et pHluorine superécliptique (SEP)22,23,24 sont modifiées sur le C-terminal des sous-unités nAChR ^{individuelles 25,26}. pHuji et SEP sont des variantes sensibles au pH des protéines fluorescentes rouges et vertes, respectivement, qui fluorescent à pH 7,4 mais sont éteintes dans des conditions plus^{acides 27,28}. Comme la fluorescence SEP et pHuji est supprimée au pH < 6, tout signal intracellulaire observé reflète les fluorophores situés dans des compartiments neutres plutôt que sur la membrane plasmique. Il convient de noter que certains organites, comme l’appareil de Golgi, possèdent une lumière acide ; ainsi, les fluorophores attachés à la région C-terminale des sous-unités nAChR ne sont pas détectés pendant que les sous-unités transitent par la voie^{sécrétoire 29}. La différence entre la fluorescence totale au pH 7,5 et celle au pH < 6 représente le signal généré par les nAChR situés sur la membrane plasmique. La capture d’images à l’aide de la microscopie confocale à cellules vivantes offre une haute résolution spatiale, permettant une quantification précise de la localisation des sous-unités. De plus, réaliser toutes les expériences sur des cellules vivantes permet à chaque cellule de servir de contrôle indépendant, tenant compte de la variabilité de l’expression des protéines entre les cellules de chaque groupe^{de traitement 30}. Cette méthode peut être adaptée pour inclure des protéines chaperonées supplémentaires, telles que NACHO ou d’autres, afin d’étudier le trafic de nAChR. Parmi les autres applications figurent la modulation pharmacologique, l’intégration de sous-unités auxiliaires et l’analyse des changements associés à la maladie dans l’expression de nAChR.

Protocole

REMARQUE : La procédure suivante décrit les méthodes utilisées avec succès pour transfecter transitoirement la lignée cellulaire N2a avec les sous-unités nAChR (Figure 1). Une expression solide de la membrane plasmique est obtenue en moins de 24 heures, comme capturé par microscopie confocale à cellules vivantes.

Figure 1 : Présentation schématique des méthodes individuelles présentées dans le protocole. Les cellules sont cultivées jusqu’à être confluentes à 70 % à 80 % dans des plats d’imagerie. Les cellules sont ensuite traitées avec le réactif de transfection et le complexe d’ADN. (Haut) 24 heures plus tard, les cellules peuvent être traitées avec un ligand marqué fluorescentement pour marquer les sous-unités exprimées sur la membrane plasmique, puis imagées à l’aide d’un microscope confocal. (Bas) Alternativement, pour les gènes de sous-unités nAChR modifiés pour être marqués avec une protéine sensible au pH 24 h après la transfection, les cellules peuvent être imagées vivantes à l’aide d’un microscope confocal pour capturer la fluorescence totale des cellules. Le tampon d’imagerie pH 7,4 est alors remplacé par le tampon de trempe pH 5,5. Cela arrêtera la fluorescence des protéines sensibles au pH marquées aux sous-unités nAChR situées sur la membrane plasmique de la cellule, permettant uniquement aux sous-unités internes de rester fluorescentes. Les mêmes cellules sont à nouveau imagées. L’analyse d’image est réalisée à l’aide d’ImageJ pour quantifier l’expression des sous-unités internes et externes. Ces procédures peuvent être modifiées pour incorporer des chaperones et des protéines auxiliaires. Créé dans BioRender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

1. Transfection transitoire N2a nAChR

REMARQUE : La lignée cellulaire N2a a été choisie car elle présente un phénotype neuronal et une faible expression endogène des nAChR. Les gènes α7-pHuji, α4-SEP et β2-pHuji sont chacun hébergés individuellement dans le vecteur d’expression pcDNA3.1(+) chez les mammifères. La protéine chaperone NACHO est exprimée à partir de pREP9 (généreusement offerte par le Dr R. Loring, Université Northeastern). À chaque étape, utilisez des techniques stériles et travaillez à l’intérieur d’un cabinet de biosécurité. Portez une blouse de laboratoire propre, des lunettes de protection et des gants. Nettoyez tous les matériaux entrant ou sortant de l’armoire de biosécurité avec 70 % d’éthanol. Les étapes suivantes décrivent la transfection dans un plat à fond en verre de 35 mm recouvert de poly-D-lysine, adapté à l’imagerie. Les volumes peuvent être ajustés selon les besoins pour différents navires de culture.

1. Cultivez les cellules N2a dans un flacon de culture T25 (ou similaire) contenant le milieu essentiel minimum d’Eagle (EMEM) complété avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et, si nécessaire, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine. Incuber à 37 °C, 5 % de CO₂ jusqu’à ce que les cellules atteignent ~90 % de confluence. Visualisez avec un objectif de microscope optique 4x.
2. Surveillez la confluence quotidiennement à l’aide d’un microscope optique et remplacez le milieu de croissance tous les 1 à 2 jours pour maintenir des conditions optimales. Lorsque les cellules atteignent ~90 % de confluence, elles sont prêtes à être envoyées dans des plats d’imagerie.
3. Préchauffez tous les réactifs à 37 °C dans un bain-marie. Nettoyez l’armoire de biosécurité et tous les matériaux avec 70 % d’éthanol avant de commencer la procédure.
   ATTENTION : L’éthanol à 70 % est un liquide et une vapeur très inflammables qui peuvent provoquer une irritation oculaire sérieuse. Évitez la chaleur, les étincelles, les flammes ouvertes et d’autres sources d’allumage. Conservez dans un endroit bien ventilé avec des contenants bien fermés. Portez des gants de protection et des yeux et du visage lors de la manipulation. En cas de contact avec la peau ou les yeux, rincez immédiatement à l’eau et consultez un médecin si l’irritation persiste. Un désinfectant alternatif, comme une solution d’eau de Javel à 5 % à 10 %, peut être utilisé à la place.
4. Aspirez l’ancien milieu de la fiole et lavez les cellules avec 5 mL de PBS. Ajoutez 1 mL de trypsine à la fiole et faites doucement tourner. Incubez jusqu’à ce que les cellules se soulèvent (<5 min). Pour éviter la surdigestion, ajoutez immédiatement 4 mL de milieu de croissance EMEM et pipetez doucement pour créer une suspension unicellulaire.
5. À l’aide d’un hémocytomètre, déterminez la concentration cellulaire et calculez le volume requis de milieu de croissance EMEM afin d’ajuster la suspension afin que 1 mL contienne 0,5 à 2 cellules 10⁵.
6. Placez 1 mL de suspension à cellules par antenne de 35 mm et ajoutez suffisamment de milieu de croissance EMEM pour porter le volume total à 2 mL. Incuber toute la nuit à 37 °C, 5 % de CO₂. Les cellules sont prêtes à être transfectées à 70 % à 80 % de confluence.
7. Le jour de la transfection, préchauffez les réactifs à 37 °C, décongelez complètement les ADN de la sous-unité nAChR, puis amenez le réactif de transfection à température ambiante. Nettoyez tous les réactifs à 70 % d’éthanol avant de les placer dans l’armoire de biosécurité.
8. Pour exprimer α7 nAChR : Dans un tube de microcentrifuge, diluez 4 μg d’ADN plasmidique α7 (1 μg/μL) et 1 μg de NACHO (1 μg/μL) goutte par goutte dans un milieu sérique réduit (sans antibiotique) jusqu’à un volume final de 250 μL. Mélangez doucement en pipettant après ajout d’ADN.
   1. Pour exprimer α4β2 nAChRs : diluer 4 μg de chaque ADN sous-unitaire sur un total de 250 μL de milieu sérique réduit. Mélangez doucement en pipotette. Ajustez le rapport de chaque sous-unité pour optimiser l’expression des isoformes spécifiques des récepteurs.
   2. Pour exprimer α4β2 nAChR avec un plasmide supplémentaire, ajoutez des quantités égales de chaque ADN plasmidique. La protéine fluorescente bleue mTagBFP2³¹ dans pcDNA3.1(+) sert de plasmide témoin et peut être remplacée par n’importe quelle chaperone α4β2.
9. Mélangez doucement le réactif de transfection d’ADN avant utilisation. Dans un tube de microcentrifuge séparé, diluez 8 μL de réactif de transfection goutte à goutte dans 250 μL de milieu sérique réduit. Incubez pendant 5 minutes à température ambiante. Passez à l’étape suivante en 25 minutes.
10. Après 5 minutes, combinez les ADN dilués avec le réactif de transfection dilué (total = 500 μL) goutte à goutte. Mélangez doucement en pipettant et faites couper pendant 20 minutes à température ambiante. Les complexes ADN-lipides restent stables jusqu’à 6 heures.
11. Pendant la formation des complexes, retirez les plats de culture de l’incubateur et remplacez le milieu par 1 mL d’EMEM sans sérum (sans antibiotiques).
12. Ajouter 500 μL du complexe de réactif ADN-transfection goutte à goutte dans chaque plat (volume final = 1,5 mL). Mélangez doucement en balançant l’assiette pour assurer une répartition uniforme sur le plat, en particulier sur la surface du fond en verre. Incubez à 37 °C pendant 24 heures, puis remettez le milieu après 4 à 6 heures pour favoriser la santé cellulaire.

2. Marquage des cellules vivantes de nAChR α7 exprimées par membrane plasmique à l’aide d’Alexa Fluor 647 αBTX

REMARQUE : La procédure suivante est généralement réalisée 24 heures après la transfection. Protégez αBTX Alexa Fluor 647 (αBTX-AF647) de la lumière pour éviter la photodestruction du fluorophore.

1. Préchauffez tous les réactifs à 37 °C et décongelez la solution αBTX-AF647 (2,3 μM). Nettoyez avec 70 % d’éthanol et placez-le dans l’armoire de biosécurité.
2. Récupérez la plaque contenant les cellules transfectées avec des ADN α7 et NACHO dans l’incubateur, nettoyez l’extérieur avec 70 % d’éthanol, puis placez-la dans l’armoire de biosécurité.
3. Jetez l’ancien support par aspiration sous vide. Pour laver les cellules, ajoutez 2 mL de milieu de croissance EMEM frais.
4. Retirez le médium de lavage par aspiration sous vide. Ajoutez 2 mL de substrat EMEM dans les plats.
5. Remplacer la quantité appropriée de milieu par αBTX-AF647 pour obtenir une concentration finale de 80 nM. Incubez toute la nuit à 37 °C.
6. Le matin, préchauffez le PBS ou un médium d’imagerie préféré et nettoyez avec 70 % d’éthanol. Transférez dans l’armoire de biosécurité.
7. Retirez les cellules transfectées de l’incubateur, nettoyez-les et placez-les dans l’armoire de biosécurité.
8. Retirez l’ancien support contenant αBTX-AF647 et placez-le dans un contenant à déchets approprié.
9. Lavez les cellules avec 2 mL de PBS 3 fois, 10 min chacune à température ambiante. Les rinçages éliminent les ligands non liés et les débris, et le temps peut être adapté aux besoins du chercheur. Retirez le PBS après chaque lavage.
10. Ajoutez 2 mL de PBS ou un support d’imagerie préféré et procédez à l’imagerie des cellules à l’aide d’un microscope confocal.

3. Imagerie en cellules vivantes des nAChRs α7-pHuji totaux et internes

REMARQUE : La procédure suivante utilise un plasmide α7-pHuji pcDNA3.1 fabriqué en interne, co-transfecté avec la chaperonne NACHO. Un protocole similaire a été utilisé pour exprimer α4-SEP et β2-pHuji dans pcDNA3.1 avec le plasmide de contrôle mTagBFP2 pcDNA3.1, comme décrit dans la section Résultats. Protégez les échantillons de la lumière tout au long de la procédure afin d’éviter la photodestruction du fluorophore.

1. Préparez un tampon d’imagerie pH 7,4 (Tableau 1) et un tampon de trempe pH 5,5 (Tableau 2) comme décrit²³.
2. Préchauffer les réactifs à 37 °C, nettoyer avec 70 % d’éthanol, puis transférer dans l’armoire de biosécurité. Retirez les cellules transfectées de l’incubateur, nettoyez avec 70 % d’éthanol, puis placez-les dans l’armoire de biosécurité.
3. Retirez l’ancien substrat par aspiration. Rincez le plat avec 2 mL de PBS pendant 3 fois, 10 min chacun à température ambiante. Ajoutez 2 mL de tampon d’imagerie pH 7,4.
4. Apportez la plaque au microscope confocal. Insérez la plaque d’imagerie avec un tampon d’imagerie pH 7,4 dans le porte-lames et placez le support dans la chambre environnementale préchauffée du microscope confocal.
5. Connectez le tuyau de la pompe péristaltique au porte-vaisselle d’imagerie et fermez la chambre.
6. Ouvrez le logiciel d’imagerie et sélectionnez les lasers pour les fluorophores d’intérêt (pHuji 566/598 nm, α4-SEP 499/520 nm, β2-pHuji 568/603 nm, et mTagBFP2 359/461 nm).
7. Scannez la parabole pour localiser les cellules à l’imagerie avec un objectif 10x-60x. Augmentez le grossissement si désiré et ajustez la profondeur de mise au point si nécessaire.
8. Ajustez l’intensité du laser et la sensibilité du détecteur pour visualiser la fluorescence sans signal de fond. Ajustez l’ouverture pour augmenter le signal de fluorescence, si nécessaire.
9. Sélectionnez la résolution préférée et capturez l’image unique en utilisant l’objectif souhaité (par exemple, 60x).
10. Enregistrez l’emplacement sur la carte parabol pour relocaliser les mêmes cellules après le changement du tampon vers le tampon de trempe pH 5,5.
11. Répétez le processus d’imagerie pour plusieurs zones de la parabole, en enregistrant chaque nouvel emplacement. Utilisez les mêmes réglages de capture pour toutes les images (groupes expérimentaux et témoins) afin de permettre des comparaisons valides.
12. En ne reliant que la conduite de sortie à la pompe péristaltique, aspirez lentement le tampon pH 7,4 de la parabole vers un conteneur à déchets.
13. Lorsque la majeure partie du tampon est retirée (sans séchage des cellules), transférez la ligne d’entrée vers le tampon de trempe pH 5,5.
14. Allumez la pompe péristaltique pour ajouter lentement un tampon de pH 5,5 (1,5 mL/min) à la parabole, en veillant à ce que les cellules restent attachées.
15. Faites tourner la pompe pendant 20 minutes, en observant que le tampon entre et sort correctement de la parabole.
16. Éteignez la pompe et incubez les cellules avec le tampon de trempe pH 5,5 pendant 20 minutes supplémentaires pour permettre l’équilibre.
17. Pour répéter l’imagerie, chargez les emplacements enregistrés de la session précédente afin de revenir aux mêmes régions.
18. Confirmez que la profondeur et la position focales sont correctes, car elles peuvent se déplacer après échange de tampons.
19. Répétez l’imagerie à tous les endroits enregistrés en utilisant la condition de pH-quenché.

Réactif	Concentration (mM)
NaCl	135
KCl	5
MgCl2	1.8
HEPES	20
D-glucose	1
Ajustez la solution à pH 7,4

Tableau 1 : Recette d’imagerie du tampon. Les réactifs suivants ont été additionnés, et la solution a été ajustée au pH 7,4.

Réactif	Concentration (mM)
NaCl	135
KCl	5
MgCl2	0.4
CaCl2	1.8
MES	20
D-glucose	1
Ajustez la solution à pH 5,5

Tableau 2 : Recette de tampon de trempe. Les réactifs suivants ont été mélangés ensemble, et la solution résultante a été ajustée à un pH de 5,5.

4. Quantification de l’image

REMARQUE : Cette procédure explique comment analyser les images cellulaires en utilisant ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) et la méthode³² de la fluorescence cellulaire totale corrigée (CTCF).

1. Ouvrez ImageJ et ouvrez l’image à analyser. L’image apparaîtra sous forme de pile avec chaque canal capturé séparé dans la même image.
2. Naviguez jusqu’au canal Phase. Si l’image est trop lumineuse (ce qui est courant pour les zones vierges ou en arrière-plan), sélectionnez Processus > Améliorer le contraste, puis cliquez sur OK.
3. Avec l’outil loupe, zoomez (+) sur une cellule. À l’aide de l’outil de sélection à main levée, tracez le contour de la cellule dans le canal de phase.
4. Passez au canal fluorescent correspondant au fluorophore d’intérêt. Configurez les mesures souhaitées en sélectionnant Analyser > Ensemble de mesures. Assurez-vous que la Surface, la Valeur Grise Moyenne et la Densité Intégrée sont vérifiées.
5. Pour mesurer la région sélectionnée, choisissez Analyser > Mesure ou appuyez sur Commande + M (Mac) / Ctrl + M (Windows).
6. Prenez trois mesures de fond en traçant les zones vides près de la cellule. Répétez les étapes pour obtenir le nombre de cellules désiré.
7. Les données de mesure apparaîtront dans une fenêtre de résultats séparée dans ImageJ. Copiez-collez ces données dans Excel pour analyse.
8. Calculez la moyenne moyenne du fond à partir des trois mesures de fond.
9. Calculez la valeur CTCF pour chaque cellule à l’aide de la formule suivante :
   CTCF=Densité intégrée− (Surface de la cellule x Fluorescence moyenne de fond)
10. Répétez ce processus pour plusieurs cellules et images pour chaque groupe expérimental (et la condition du pH, si applicable). Exportez tous les résultats vers un logiciel d’analyse de données pour le traitement statistique.

Résultats

Suite aux procédures de transfection ci-dessus, les α7 nAChR et la protéine chaperone NACHO ont été co-exprimées dans les cellules N2a. Les cellules non transfectées et transfectées ont été marquées avec αBTX-AF647 24 heures après transfection d’ADN. Comme αBTX n’est pas perméable à la membrane, toute fluorescence détectée provient des récepteurs présents sur la membrane plasmique. Dans les figures 2A, A′, une faible coloration αBTX-AF647 a ...

Discussion

Les méthodologies présentées pour exprimer et quantifier les sous-unités de nAChR dans les cellules de N2a chez les mammifères répondent à des défis de longue date pour atteindre une expression rapide (~24 heures) et abondante de nAChR (> 60 %) dans la membrane plasmique pour des études de découverte, localisation et trafic de médicaments. Une force clé de cet ensemble de protocoles est son adaptabilité aux nAChR homomériques (α7) et hétéromériques (α4β2), et il est probablement applicab...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,25 % de Trypsine-EDTA (1X)  ;	Gibco	25200-056	Réactif de détachement cellulaire
Alpha-Bungarotoxine Alexa Fluor 647	Invitrogen	B35450	Conjugué alpha-bungarotoxine
Cabinet de biosécurité BSL-niveau 1 & nbsp ;	Nuaire	NU-425-400	Zone de travail en culture cellulaire stérile
Chlorure de calcium	Aventor/VWR	BDH9224	Composant tampon
D-(+)-glucose	MilliPore Sigma  ;	G8270	Composant tampon
EMEM avec L-glutamine	ATCC	30-2003	Milieu cellulaire
ADN sans endotoxines	Fabriqué maison avec des kits Zymo	non applicable	ADN nAChR destinés à être utilisés pour les transfections transitoires cellulaires
Tubes microcentrifuges sans endotoxines, 0,5 mL  ;	Aventor/VWR	89000-010	ADN et préparation de la transfection
Tubes microcentrifuges sans endotoxines, 1,5 mL  ;	Aventor/VWR	20170-038	ADN et préparation de la transfection
Sérum fœtal bovin	Aventor/VWR	97068-085	Supplément sérique
Fluoview FV10i	Olympe	FV10i	Confocal Microscope
Plats MatTek à fond en verre	MatTek	P35GC-0-10-C	Antennes d’imagerie
GraphPad Prism v. 10	GraphPad Prism	https://www.graphpad.com/features	Logiciels d’analyse de données
HEPES	MilliPore Sigma  ;	H3375	Composant tampon
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019	Réactif de transfection
Chlorure de magnésium hexahydraté	Thermosciences	413410025	Composant tampon
Hydrate MES	MilliPore Sigma  ;	M5287	Composant tampon
mTagBFP2-pBAD	AddGene  ;	54572	ADN témoin destiné à la transfection de transitoires cellulaires   ;
Cellules Neuro 2 A (N2a)	Collection de la culture de type américain	CCL-131	Cellules utilisées pour les transfections d’ADN et l’expression de nAChR
Opti-MEM	Gibco	31985-070	Milieu sérique réduit
Pénicilline/Streptomycine	Aventor/VWR	K952-100mL	Antibiotique
Pompe à péristalsis	Gilson	MiniPuls3	Le tampon change lors de l’imagerie   ;
Solution saline tamponnée phosphate	Qualité biologique	119-069-131	Tampon de sérum physiologique
Pipet Aid	Drummond & nbsp ;	140084	Transfert précis de liquide
Pointes de pipet (stériles et sans endotoxines, 1000 μL)	Rainin	30389216	Transfert précis de liquide
Pointes de pipet (stériles et sans endotoxines, 20 μL)	Rainin	30389229	Transfert précis de liquide
Pointes de pipet (stériles et sans endotoxines, 250 μL)	Rainin	30389246	Transfert précis de liquide
Pipettes, P10	Rainin & nbsp ;	L-10XLS	Transfert précis de liquide
Pipettes, P100	Rainin & nbsp ;	L-100XLS	Transfert précis de liquide
Pipettes, P1000	Rainin & nbsp ;	L-1000XLS	Transfert précis de liquide
Chlorure de potassium	MilliPore Sigma  ;	P3911	Composant tampon
Pipettes sérologiques (stériles et sans endotoxines, 10 ML)	Aventor/VWR	89130-898	Transfert précis de liquide
Pipettes sérologiques (stériles et sans endotoxines, 25 mL)	Aventor/VWR	89130-900	Transfert précis de liquide
Pipettes sérologiques (stériles et sans endotoxines, 5 mL)	Aventor/VWR	76201-710	Transfert précis de liquide
Pipettes sérologiques (stériles et sans endotoxines, 50 mL)	Aventor/VWR	75816-088	Transfert précis de liquide
Chlorure de sodium	Aventor/VWR	BDH9286	Composant tampon
Flasque de culture tissulaire	Faucon	353109	Culture des plats
Kit Maxiprep plasmide ZymoPure II	RECHERCHE SUR ZYMO	D4203-A + D4203-B	Production d’ADN sans endotoxines
&alpha ; 4-SEP  ;	Services de synthèse génétique ThermoFisher Scientific GeneArt & nbsp ;   ;	https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.html	Services personnalisés de synthèse génique
&alpha ; 7-pHuji	Twist Bioscience	https://www.twistbioscience.com/	Services personnalisés de synthèse génique
&bêta ; 2-pHuji	Services de synthèse génétique ThermoFisher Scientific GeneArt & nbsp ;   ;	https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.html	Services personnalisés de synthèse génique