ML385 atténue la progression maligne des cellules d’adénocarcinome pulmonaire induites par la silice par la voie de l’axe ROS/NRF2-autophagie

L’adénocarcinome pulmonaire est la principale cause de décès liés au cancer dans le monde, avec environ 2 millions de nouveaux cas et 1,76 million de décès chaque année¹. Ces dernières années, l’incidence de l’adénocarcinome pulmonaire chez les personnes qui n’ont jamais fumé a augmenté, ce qui peut être lié à des facteurs environnementaux tels que la pollution de l’air². La silice est un polluant environnemental courant et a été identifiée comme un facteur pathogène potentiel pour l’adénocarcinome pulmonaire^{humain 3}. La silice peut provoquer une inflammation chronique persistante, entraînant l’infiltration de macrophages, de lymphocytes et de neutrophiles, et la libération d’espèces réactives de l’oxygène et de facteurs inflammatoires⁴. Ce microenvironnement inflammatoire à long terme favorise l’apparition d’un adénocarcinome pulmonaire ^5,6. Bien que l’association entre l’exposition à la silice et l’adénocarcinome pulmonaire ait été confirmée, son mécanisme moléculaire spécifique n’a pas été entièrement élucidé.

Le facteur de transcription NRF2, codé par le gène NFE2L2, joue un rôle crucial en tant que régulateur principal dans le maintien de l’homéostasie redox cellulaire en réponse au stress oxydatif ^7,8. Dans des circonstances normales, NRF2 est marqué et dégradé par le complexe ubiquitine ligase KEAP1-CUL3. Sous la stimulation d’un stress oxydatif ou de substances électrophiles, l’activité de KEAP1 est inhibée, ce qui permet à NRF2 de s’accumuler de manière stable et de pénétrer dans le noyau, exerçant ainsi le rôle de défense et de régulation du noyau⁹. Néanmoins, une activation excessive de NRF2 dans le microenvironnement tumoral peut améliorer la glycolyse et la survie des cellules tumorales en arrêtant l’accumulation de ROS et en stimulant la résistance apoptotique^10,11. Des études ont prouvé que l’exposition à la silice peut entraîner une activation anormale de la voie de signalisation NRF2 ^12,13. Par conséquent, le ciblage de NRF2 peut être une stratégie efficace pour intervenir dans la progression maligne de l’adénocarcinome pulmonaire induit par la silice¹⁴.

Cette étude vise à clarifier si l’inhibiteur de NRF2 ML385 inhibe la progression maligne de l’adénocarcinome pulmonaire induite par la silice en régulant la voie de l’axe ROS/NRF2-autophagie. Nous avons établi un modèle murin induit par la silice pour reproduire les principales caractéristiques de la maladie et utilisé des méthodes expérimentales in vitro pour étudier l’interaction entre les macrophages et les cellules tumorales. Nous avons constaté que la silice induisait l’expression de molécules inflammatoires et immunitaires et favorisait davantage la formation de tumeurs par la voie de l’axe ROS/NRF2-autophagie. Lorsque l’inhibiteur de NRF2 (ML385) a été utilisé, l’effet promoteur de la silice sur la formation tumorale a ralenti, ce qui suggère que l’inhibiteur de NRF2 pourrait jouer un rôle dans le traitement des tumeurs pulmonaires induites par la silice.

Tous les blocs de donneurs ont été obtenus à partir d’échantillons pathologiques d’archives collectés entre 2016 et 2018 à l’hôpital populaire affilié Huai’an NO.1 de l’Université de médecine de Nanjing. Les échantillons ont été anonymisés avant d’être utilisés et traités conformément aux protocoles approuvés. Le comité d’éthique de l’hôpital populaire affilié Huai’an n° 1 de l’Université de médecine de Nanjing, KY-2024-250-01. L’élevage, l’élimination et l’utilisation de souris expérimentales respectent strictement le Règlement sur l’administration des animaux de laboratoire et les directives internationales.

Construction d’un modèle murin induit par la silice
Préparation des souris et de la suspension de silice : Élever des souris C57BL/6 mâles, âgées de 6 à 8 semaines, dans une salle d’animaux à température ambiante de 20-25 °C et un cycle de 12 h de lumière / 12 h d’obscurité. Pour préparer la suspension de poussière de silicium, 300 mg de poudre de poussière de silicium ont été pesés avec précision et mis en suspension dans 10 ml de solution saline stérile tamponnée au phosphate 1x. Par la suite, le mélange a été vigoureusement vortex et oscillé pendant 5 min, puis traité par ultrasons dans une machine à ultrasons à bain d’eau pendant 30 min pour assurer une dispersion uniforme des particules et empêcher l’agrégation. La concentration finale de cette suspension de réserve est de 30 mg/mL. Stérilisez-le en autoclave à 121 °C pendant 30 min. Avant chaque utilisation, il est nécessaire de vortex et d’agiter à nouveau pendant 2-3 min pour remettre en suspension les particules déposées.

Les souris ont inhalé une suspension de silice par le nez. La micropipette a été utilisée pour introduire lentement et goutte à goutte la solution dans la cavité nasale des souris. Les souris ont été divisées en 6 groupes avec 20 souris dans chaque groupe. Le volume d’inhalation de chaque groupe était de 10 μL, 30 μL, 50 μL, 70 μL, 90 μL et 200 μL, avec une concentration de 30 mg/mL, une fois par jour pendant 40 jours consécutifs. Lorsque vous perplexez, saisissez la peau derrière l’oreille de la souris avec le pouce et l’index de la main gauche, et fixez le corps et la queue de la souris avec les autres doigts. Assurez-vous que la souris est en position couchée avec la tête légèrement inclinée vers l’arrière pour permettre à la suspension d’être naturellement inhalée dans les voies respiratoires. Nous avons constaté qu’il n’y avait pas eu de décès après le deuxième jour d’inhalation de suspension de silice de 10 μL, 30 μL, 50 μL et 70 μL chez la souris, tandis qu’il y avait eu un événement de décès après le deuxième jour d’inhalation de suspension de silice de 90 μL et 200 μL chez la souris. Par conséquent, le volume maximal d’inhalation de silice chez la souris était de 70 μL par jour.

Lors de la manipulation de la silice cristalline, elle doit être effectuée dans une enceinte de biosécurité ou une hotte, et des masques N95, des lunettes anti-poussière, des gants en nitrile et des vêtements de protection doivent être portés tout au long du processus. Lors de la préparation de la suspension, les mouvements doivent être doux et une chambre de pesée doit être utilisée pour éviter la génération d’aérosols. Tous les déchets en contact avec la silice doivent être collectés dans des récipients scellés résistants à la perforation et éliminés conformément à la réglementation sur les déchets chimiques dangereux. Il est strictement interdit de le mélanger avec les ordures ménagères ou de le jeter dans les égouts. Les déchets biologiques, tels que les milieux de culture cellulaire, doivent être collectés dans des poubelles spéciales contenant des désinfectants et stérilisés sous haute pression. Les carcasses et les tissus d’animaux doivent être placés dans des sacs de déchets biologiques et stérilisés sous haute pression pour un traitement inoffensif.

Évaluer le succès du modèle murin induit par la silice. Évaluez les animaux à différents moments après l’inhalation de silice, à savoir les 3e, 14e et 40e jours. Les souris ont été placées dans des dispositifs d’euthanasie animaux professionnels, et le dioxyde de carbone a été introduit à un taux de remplissage de 30 % à 50 % de volume / min. Ils ont été exposés en permanence jusqu’à ce qu’ils cessent de respirer. Après confirmation du décès, des opérations ultérieures ont été effectuées. Le tissu pulmonaire a été enlevé. Le tissu pulmonaire a été fixé dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % à température ambiante pendant 48 h. Après fixation, le tissu a été déshydraté avec de l’alcool à gradient, rendu transparent avec du xylène, puis incorporé dans de la paraffine. Des coupes continues ont été réalisées à l’aide d’une machine à sectionner la paraffine d’une épaisseur de 4 à 5 μm pour la coloration histologique ultérieure et l’analyse immunohistochimique. Le tissu pulmonaire ne nécessite pas de traitement de décalcification. Un examen pathologique du tissu pulmonaire a été effectué pour évaluer la réussite de la génération de modèles. Les critères de succès de la construction du modèle de silicose étaient les suivants : inflammation pulmonaire importante, fibrose et apparition de nodules de silicose.

Analyse de l’infiltration de cellules immunitaires dans le modèle murin induit par la silice
Au 14e jour après l’inhalation de silice, les tissus pulmonaires de souris ont été colorés avec des marqueurs fluorescents contenant CD3e (taux de dilution de 1:200), CD8a (taux de dilution de 1:200), CD86 (taux de dilution de 1:200), F4/80 (taux de dilution de 1:200) et Nk1.1 (taux de dilution de 1:200) pour visualiser les cellules immunitaires. Fixer des coupes de cellules ou de tissus et bloquer avec 5 % d’albumine sérique bovine (BSA) pendant 1 h pour réduire la liaison non spécifique. Utilisez du sérum normal de la même espèce que l’anticorps bloquant, diluez le sérum avec du PBS dans un rapport de 1:10 et ajoutez 100 μL de sérum dilué dans l’échantillon. Ensuite, bloquez à température ambiante pendant 30 min pour permettre au sérum de bloquer les anticorps endogènes. Après le scellement, rincez doucement 2 fois avec du PBS. Les anticorps primaires contenant des anticorps CD3e (taux de dilution de 1:200), CD8a (taux de dilution de 1:200), CD86 (taux de dilution de 1:200), F4/80 (taux de dilution de 1:200) et Nk1.1 (taux de dilution de 1:200) ont été incubés pendant la nuit à 4 °C ou à température ambiante pendant 1 à 2 h. Après le lavage avec du PBS, l’anticorps secondaire fluorescent a été ajouté et incubé dans l’obscurité pendant 1 h.

Coloration Masson et analyse immunohistochimique
Les sections de paraffine ont été déparaffinées avec du xylène et hydratées avec de l’alcool à gradient, puis la récupération de l’antigène a été effectuée dans un tampon de citrate de sodium avec un pH de 6,0 par assainissement thermique à haute pression. Pour l’assainissement thermique à haute pression, placez les tranches de tissu trempées dans un tampon de réparation dans un four à micro-ondes à feu moyen pendant 8 à 12 minutes. L’activité endogène de la peroxydase a été bloquée avec une solution de peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 20 min, puis le site de liaison non spécifique a été bloqué avec de la BSA à 5 % à température ambiante pendant 30 min. Ajoutez les anticorps primaires NRF2 (1:200), CDK1 (1:400) et VDAC1 (1:500) et incubez pendant une nuit à 4 °C. Après avoir lavé 3 fois avec du PBS, ajoutez l’anticorps secondaire anti-lapin de chèvre marqué HRP (1:500) et incubez à température ambiante pendant 1 h. Des coupes de paraffine ont été soumises à une coloration DAB, à une contre-coloration à l’hématoxyline, à une transparence de déshydratation et à un scellement en gel neutre pour obtenir les résultats d’immunohistochimie moléculaire correspondants. Lorsque DAB est utilisé pour le développement des couleurs, le développement modéré des couleurs doit être jaune brunâtre à brun brunâtre et l’arrière-plan doit être clair. Le développement excessif (brun foncé) et insuffisant (jaune clair) nécessite une optimisation du temps de développement des couleurs.

Le degré de fibrose pulmonaire a été analysé de manière semi-quantitative à l’aide de la méthode de notation d’Ashcroft¹⁵ : des coupes colorées par Masson ont été observées sous un microscope à grossissement 100x, et le tissu pulmonaire a été divisé au hasard en 8 régions. Chaque région a été notée en fonction du degré de fibrose (0-8 points), le score final étant la moyenne de toutes les régions : 0 point (tissu pulmonaire normal), 1-2 points (fibrose légère), 3-4 points (fibrose modérée), 5-8 points (fibrose sévère).

Les résultats immunohistochimiques ont été analysés quantitativement à l’aide du logiciel Image. Cinq champs à fort grossissement ont été sélectionnés au hasard, et la valeur moyenne de densité optique (MOD) de chaque champ a été mesurée comme indicateur du niveau d’expression des protéines.

Examen de l’impact de la silice et du ML385 sur l’autophagie et les ROS dans les cellules RAW264.7
Les cellules RAW264.7 et A549 (fournies par l’Université des sciences et technologies d’Anhui) ont été cultivées à l’aide d’un milieu riche en glucose DMEM complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et une solution d’anticorps bispécifiques pénicilline-streptomycine à 1 %. Les cellules 1 x 10⁷ ont été cultivées uniformément dans un incubateur à température constante à 37 °C et 5 % de CO₂. 5 μL de suspension de silice à 30 mg/mL ont été ajoutés à 1 x 10⁵ cellules/mL de cellules RAW264.7. Après une incubation de 24 h, les cellules ont été rincées avec du PBS 3x, et l’autophagie et le stress oxydatif ont été détectés par les sondes ROS, LC3 et lysosomes. Dans le même temps, ML385¹⁶, un inhibiteur de NRF2, a été utilisé pour inhiber l’expression de NRF2 (concentration finale de ML385 : 5 mM/L). L’autophagie et le stress oxydatif ont été détectés selon les étapes expérimentales ci-dessus. Le stress oxydatif et le flux d’autophagie des deux groupes ont été analysés statistiquement.

Analyse immunohistochimique des expressions de VDAC1, CDK1, p62 et NRF2 dans le tissu de l’adénocarcinome pulmonaire
Les expressions de VDAC1, CDK1, p62 et NRF2 ont été vérifiées chez 30 patients. Des tissus présentant un adénocarcinome pulmonaire et des tissus sains adjacents ont été obtenus de l’hôpital populaire affilié Huai’an NO.1 de l’Université de médecine de Nanjing et ont été analysés par immunohistochimie (IHC). Les résultats de l’IHC et de la fibrose pulmonaire ont été analysés statistiquement. Collectez les données des patients en fonction des informations sur les patients dans le système hospitalier. Les étapes expérimentales spécifiques sont les suivantes : des sections de paraffine ont été déparaffinées avec du xylène et hydratées avec de l’alcool à gradient, puis l’assainissement de l’antigène a été effectué dans un tampon de citrate de sodium avec un pH de 6,0 par assainissement thermique à haute pression. L’activité endogène de la peroxydase a été bloquée avec une solution de peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 20 min, puis le site de liaison non spécifique a été bloqué avec de la BSA à 5 % à température ambiante pendant 30 min. Ajoutez les anticorps primaires NRF2 (1:200), CDK1 (1:400), p62 (1:500) et VDAC1 (1:500), et incubez pendant une nuit à 4 °C. Après avoir lavé 3 fois avec du PBS, ajoutez l’anticorps secondaire anti-lapin de chèvre marqué HRP (1:500) et incubez à température ambiante pendant 1 h. Développement de la couleur DAB, contre-coloration à l’hématoxyline, transparent déshydraté, étanchéité neutre de la gomme. Lorsque DAB est utilisé pour le développement des couleurs, le développement modéré des couleurs doit être jaune brunâtre à brun brunâtre et l’arrière-plan doit être clair. Le développement excessif (brun foncé) et insuffisant (jaune clair) nécessite une optimisation du temps de développement des couleurs.

Analyse de la migration cellulaire et de l’invasion
L’effet du ML385 et du surnageant issu de la co-incubation de la silice avec les cellules RAW264.7 sur la migration et l’invasion cellulaires après avoir été incubées avec la lignée cellulaire d’adénocarcinome pulmonaire A549 a été étudié. Le surnageant de cellules RAW264.7 co-cultivées avec de la silice pendant 24 h a été ajouté aux cellules A549. Les cellules ont été divisées en deux groupes : silice+ML385 et PBS. Le groupe silice : 5 μL de suspension de silice à 30 mg/mL ont été ajoutés à 1 x 10⁵ cellules/mL de cellules RAW264.7. Après une incubation de 24 h, prélever le surnageant cellulaire pour une utilisation ultérieure. Le groupe silice+ML385 : 5 μL de suspension de silice à 30 mg/mL et une concentration finale de 5 mM/L de ML385 ont été ajoutés à 1 x 10⁵ cellules/mL de cellules RAW264.7. Après une incubation de 24 h, prélever le surnageant cellulaire pour une utilisation ultérieure. Groupe PBS : 5 μL de PBS ont été ajoutés à 1 x 10⁵ cellules/mL de cellules RAW264.7. Après une incubation de 24 h, prélever le surnageant cellulaire pour une utilisation ultérieure. Au cours de l’essai de grattage, les cellules A549 ont d’abord été ensemencées dans des plaques de 12 puits à une densité de 5 x 10⁵ par puits. Après que les cellules aient atteint une fusion de 95 % à 100 %, des égratignures ont été faites sur les cellules monocouches à l’aide de la pointe d’une pipette stérile de 200 μL. Les cellules exfoliées ont été doucement lavées avec du PBS. Par la suite, les conditions de culture ont été modifiées pour inclure 1 % de milieu de base FBS et les surnageants de chaque groupe de traitement afin de maintenir la viabilité cellulaire pendant la période expérimentale de 7 jours. Des images de la même position ont été recueillies au microscope inversé à 0 h (jour 0) et au 7e jour (jour 7) après la rayure, respectivement. Enfin, la zone de l’égratignure a été analysée quantitativement, et le taux de fermeture de l’égratignure a été calculé à l’aide du logiciel ImageJ pour évaluer l’effet du surnageant de différents groupes de traitement sur la capacité de migration des cellules A549.

Dans le test d’invasion de pores de taille spécifique des cellules, une chambre à membrane en polycarbonate de 8 μm a été utilisée, la membrane de la chambre supérieure étant pré-recouverte de gel simulant l’environnement extracellulaire dilué dans un rapport de 1:8 pour construire une barrière à membrane basale. Les cellules A549 ont été remises en suspension dans une suspension obtenue en mélangeant un milieu sans sérum avec les surnageants de chaque groupe de traitement dans un rapport de 1:1, puis inoculées dans la chambre supérieure (2 x 10,⁴ cellules par chambre). Dans la chambre inférieure, une solution obtenue en mélangeant un milieu contenant 20 % de FBS avec les surnageants des groupes de traitement correspondants (groupe Silice + ML385, groupe Silice et groupe PBS) dans la même proportion a été ajoutée comme attractif chimique. Les surnageants des groupes de traitement correspondants ont été collectés par aspiration à l’aide d’un pistolet à pipette dans RAW264.7 Phagocytose cellulaire de la silice. Après que les cellules aient été incubées en continu à 37 °C et à 5 % de CO₂ pendant 7 jours, les cellules non invasives de la chambre supérieure ont été retirées avec des cotons-tiges, et les cellules qui avaient pénétré la membrane et atteint la chambre inférieure ont été fixées avec 4 % de paraformaldéhyde et colorées avec 0,1 % de violet cristallin. Enfin, le nombre de cellules invasives a été sélectionné au hasard dans 5 champs de vision par un microscope optique.

Analyse de l’impact de la silice et du ML385 sur l’apoptose des cellules A549 par cytométrie en flux
Préparation et regroupement des cellules : Des cellules A549 traitées avec les surnageants de chaque groupe de traitement (groupe PBS, groupe silice, groupe silice + groupe ML385) ont été collectées. Les cellules ont été lavées doucement 2 fois avec du PBS pré-refroidi, puis remises en suspension dans 1 tampon de liaison, et la densité cellulaire a été ajustée à 1 x 10⁶ cellules par tube/100 μL. Ensuite, 5 μL d’Annexine V-FITC et 5 μL de solution de coloration PI ont été ajoutés à la suspension cellulaire, doucement mélangés et incubés à température ambiante dans l’obscurité pendant 15 min. Après l’incubation, 400 μL de 1x tampon de liaison ont été ajoutés à chaque tube et immédiatement testés sur la machine. La détection a été effectuée à l’aide d’un cytomètre en flux. Excité par un laser de 488 nm, le signal de fluorescence d’Annexin V-FITC a été collecté via le canal FITC, et le signal de fluorescence de PI a été collecté via le canal PE. Avant l’expérience, des échantillons monocolorants étaient utilisés pour l’ajustement de la compensation de fluorescence afin d’éliminer le chevauchement spectral. Lors de l’analyse des données, délimitez d’abord la population cellulaire cible dans le nuage de points FSC-A/SSC-A et éliminez les fragments. Par la suite, les adhérences cellulaires ont été exclues à l’aide du nuage de points FSC-H/FSC-A ; Enfin, une porte a été mise en place pour distinguer les cellules vivantes, les cellules apoptotiques précoces, les cellules apoptotiques/nécrotiques tardives et les cellules endommagées mécaniquement. Les données ont été obtenues et analysées à l’aide du logiciel FlowJo V10.

Modèle de souris en silice
Dans la figure 1, les souris ont reçu de la silice par voie intranasale à une dose de 30 mg/mL et 70 μL pendant 40 jours consécutifs, ce qui a permis de s’assurer qu’aucun événement de décès ne s’est produit chez les souris et que le modèle murin de silice a pu être établi avec succès. Pendant ce temps, des souris gavage avec PBS ont été utilisées comme témoins négatifs. L’objectif était d’éliminer l’influence de l’opération et du solvant lui-même et de s’assurer que le phénotype était spécifiquement induit par la silice. La réplication réussie de ce modèle de lésion pulmonaire induite par la silice fournit une base in vivo nécessaire pour les recherches ultérieures sur le mécanisme de la progression maligne et l’intervention médicamenteuse.

Analyse de l’infiltration de cellules immunitaires dans les nodules de souris induites par la silice
Dans la figure 2, en détectant l’infiltration de cellules immunitaires dans les nodules de souris en silice, il a été constaté qu’il y avait un grand nombre d’infiltration de cellules immunitaires (cellules CD3e+, CD8a+, CD86+, F4/80+ et Nk1.1+) dans les nodules, qui étaient impliquées dans la formation et le développement de la maladie pulmonaire de silice. Cela indique que la silice induit un microenvironnement tumoral inflammatoire persistant, qui est un facteur clé de promotion de l’apparition et du développement de la tumeur, ainsi que la base physiopathologique de la participation de la voie ROS/NRF2.

Relation entre la fibrose pulmonaire induite par la silice et NRF2, CDK1 et VDAC1 chez la souris
En détectant l’expression de molécules immunitaires dans les nodules, il a été constaté que NRF2 (cible inhibitrice de ML385), CDK1 (lié au cycle cellulaire) et VDAC1 (impliqué dans le stress oxydatif mitochondrial) étaient fortement exprimés autour et à l’intérieur des nodules et étaient liés à la fibrose pulmonaire (Figure 3).

Impact de la silice et du ML385 sur l’autophagie et les ROS dans les cellules RAW264.7
Grâce à la co-culture de silice et de cellules RAW264.7, il a été constaté que la silice pouvait induire la production d’autophagosomes. Après 24 h de culture, la co-localisation de l’autophagosome et du lysosome a été réduite, le flux d’autophagie a été inhibé et la production de ROS a également été réduite. Lorsque ML385 (inhibiteur de NRF2 ) a été ajouté, la co-localisation de l’autophagosome et du lysosome a été améliorée, le flux d’autophagie a également été amélioré et le ROS a également été augmenté en conséquence (Figure 4).

Analyse des expressions de VDAC1, CDK1, p62 et NRF2 dans le tissu de l’adénocarcinome pulmonaire par IHC
Comme le montre la figure 5, NRF2 (une cible inhibitrice de ML385), CDK1 (liée au cycle cellulaire), VDAC1 (impliquée dans le stress oxydatif mitochondrial) et p62 (impliquée dans l’autophagie) sont fortement exprimées dans les tissus de l’adénocarcinome pulmonaire et présentent des différences significatives par rapport aux tissus adjacents.

Effet du ML385 et du surnageant de la co-incubation de la silice avec les cellules RAW264.7 sur la migration et l’invasion des cellules A549
La silice et le surnageant de culture cellulaire RAW264.7 peuvent favoriser la migration et la prolifération des cellules A549, tandis que ML385 peut inhiber considérablement ces processus (comme le montre la figure 6). Ce résultat indique que l’effet tumoral du microenvironnement des macrophages induit par la silice dépend de la voie NRF2 . L’inhibition de NRF2 peut bloquer efficacement cet effet de promotion tumorale, réduisant ainsi la progression maligne des cellules tumorales.

Impact de la silice et du ML385 sur l’apoptose des cellules A549
La figure 7 montre que la silice et le surnageant de culture cellulaire RAW264.7 ont un certain effet inhibiteur sur l’apoptose cellulaire A549, et que ML385 peut favoriser l’apoptose cellulaire A549.

Cette étude a révélé la voie mécaniste par laquelle l’exposition à la silice favorise la progression maligne de l’adénocarcinome pulmonaire à travers l’axe ROS/NRF2/autophagie en utilisant à la fois des méthodes in vivo et in vitro . Des expériences sur des animaux ont confirmé que les molécules clés de la voie de signalisation NRF2 sont significativement activées dans le microenvironnement de la fibrose pulmonaire induite par la silice. Des expériences cellulaires ont démontré que la silice inhibe directement le flux autophagique dans les macrophages et réduit les niveaux de ROS, et cet effet peut être spécifiquement inversé par l’inhibiteur de NRF2 ML385. Des études de mécanisme ont montré que les macrophages traités à la silice favorisent la migration, l’invasion et l’inhibition de l’apoptose des cellules de l’adénocarcinome pulmonaire en sécrétant des facteurs, et cet effet de promotion tumorale dépend entièrement de l’activation de la voie NRF2.

Disponibilité des données :
Les ensembles de données à l’appui de la conclusion de cet article sont inclus dans l’article.

Figure 1 : Construction d’un modèle de silice chez la souris. (A) Traiter les souris par inhalation nasale de silice (30 mg/mL) à différents volumes (10 μL, 30 μL, 50 μL, 70 μL, 90 μL et 200 μL). 20 souris par dose d’inhalation. (B) Courbe de survie de la souris. La quantité maximale inhalée est de 70 μL/jour. (C) Résultats d’observation de la coloration histopathologique pulmonaire de l’EH chez les souris du groupe silice et du groupe PBS le jour 3, le jour 14 et le jour 40. (D) Résultats statistiques du nombre de nodules pulmonaires observés chez les souris sous faible grossissement, test t, ***p <0,001, p = 0,004, t = 10,61 (jour 14), p = 0,0006, t = 10,02 (jour 40). N = 9. Les barres d’erreur affichent l’erreur standard. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Observation de l’infiltration de cellules immunitaires dans le tissu nodulaire de souris par coloration par fluorescence. Forte infiltration de cellules immunitaires (CD3e+, CD8a+, CD86+, F4/80+ et NK1.1+) dans les nodules pulmonaires induits par la silice chez la souris. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Analyse de la relation entre les expressions de NRF2, CDK1, VDAC1 et la fibrose induite par la silice par immunohistochimie (IHC) et coloration de Masson. (A) Les expressions de NRF2, CDK1 et VDAC1, et les résultats de la coloration de Masson. (B) Les résultats de l’IHC. (C) Une analyse statistique de la fibrose pulmonaire a été effectuée entre le groupe silice et le groupe PBS de souris. t-test, ***p <0,001, p =0,0002, t = 13,42 (NRF2), p = 0,0008, t = 9,247 (CDK1), p = 0,0009, t = 8,944 (VDAC1), p = 0,0003, t = 11,76 (fibrose pulmonaire). N = 9. Les barres d’erreur affichent l’erreur standard. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Effet de la silice sur l’autophagie dans les cellules RAW264.7 et effet régulateur de l’autophagie de l’inhibiteur de NRF2 ML385. (A) Après co-incubation de silice avec des cellules RAW264.7 pendant 24 h, la co-localisation des autophagosomes (LC3) et des lysosomes a diminué (Green). Cependant, lors de l’ajout de ML385, la co-localisation des autophagosomes et des lysosomes a augmenté (jaune). (B) Après avoir co-incubé de la silice avec des cellules RAW264.7 pendant 24 h, les ROS générés par le groupe silice ont diminué, mais ont augmenté après l’ajout de ML385. (C) Analyse statistique des ROS et du flux d’autophagie des deux groupes, test t, ***p <0,001, p =0,0005, t = 10,59 (ROS), p <0,0001, t = 17,08 (Autophagolysosome). N = 6. Les barres d’erreur affichent l’erreur standard. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Analyse immunohistochimique des expressions de VDAC1, CDK1, p62 et NRF2 dans le tissu de l’adénocarcinome pulmonaire humain. (A) Expressions différentielles (VDAC1, CDK1, p62 et NRF2) entre le tissu de l’adénocarcinome du poumon humain et le tissu non cancéreux adjacent. (B) Analyse statistique de l’expression différentielle entre 30 cas de cancer et les tissus non cancéreux adjacents de l’hôpital populaire affilié Huai’an NO.1 de l’Université de médecine de Nanjing, test t, ***p <0,001, p <0,0001, t = 8,322 (CDK1), p <0,0001, t = 16,4 (NRF2), p <0,0001, t = 15,47 (p62), p <0,0001, t = 17,75 (VDAC1). N = 30. Les barres d’erreur affichent l’erreur standard. (C) Analyse statistique de la fibrose dans le tissu de l’adénocarcinome pulmonaire et les tissus non cancéreux adjacents, test t, ***p <0,001, p = 0,0009, t = 8,854 (fibrose). N = 30. Les barres d’erreur affichent l’erreur standard. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Effet du ML385 et du surnageant issu de la co-incubation de la silice avec des cellules RAW264.7 sur la migration et l’invasion cellulaires après avoir été incubées avec la lignée cellulaire d’adénocarcinome pulmonaire A549. (A) Le grattage cellulaire se produit le jour 0 et le jour 7 après la co-incubation du surnageant et de ML385 avec les cellules A549. (B) Les résultats invasifs cellulaires le jour 7 après la co-incubation du surnageant et de ML385 avec les cellules A549. (C) Effectuer une analyse statistique des résultats de l’essai de rayure de cellule. *p <0,05, **p <0,01. t-test, p =0,0020, t = 22,43 (silice + ML385 contre silice), p = 0,0135, t = 8,510 (silice + ML385 contre PBS), p = 0,0143, t = 8,281 (silice contre PBS). N = 6. Les barres d’erreur affichent l’erreur standard. (D) Effectuer une analyse statistique des résultats des essais invasifs sur cellules. *p <0,05, **p <0,01, test t, p = 0,0097, t = 10,06 (silice + ML385 contre silice), p = 0,0472, t = 4,437 (silice + ML385 contre PBS), p = 0,0125, t = 8,857 (silice contre PBS). N = 6. Les barres d’erreur affichent l’erreur standard. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Analyse de l’impact de la silice et du ML385 sur l’apoptose des cellules A549 par cytométrie en flux. (A) Détecter les résultats d’apoptose des cellules A549 par cytométrie en flux. (B) Effectuer une analyse statistique sur le pourcentage de cellules apoptotiques. *p <0,05, **p <0,01, test t, p =0,0013, t = 27,29 (silice + ML385 contre silice), p = 0,0022, t = 6,973 (silice + ML385 contre PBS), p = 0,0048, t = 5,649 (silice contre PBS). N = 6. Les barres d’erreur affichent l’erreur standard. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.