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Imagerie de fluorescence quantitative de l'infection par l'alphavirus pour le criblage d'antiviraux

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DOI :

10.3791/69384

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14 août 2026

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1LOEWE Centre for Translational Biodiversity Genomics (LOEWE-TBG), 2Department of Pest and Vector Insect Control, Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources, 3Institute for Insect Biotechnology, Justus-Liebig University, 4BMFTR Junior Research Group in Infection Research "ASCRIBE", Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, un protocole robuste et adaptable pour la visualisation continue des infections par les alphavirus est présenté. Ce protocole offre une approche pour étudier la réplication des alphavirus et évaluer l'efficacité de composés antiviraux au niveau cellulaire, fondée sur l'imagerie par fluorescence.

Résumé

La microscopie à fluorescence offre une approche très sensible et polyvalente pour étudier l'infection par les alphavirus au niveau cellulaire. En combinant des virus marqués par fluorescence avec une analyse quantitative d'images, cette méthode permet une caractérisation spatiale et temporelle détaillée de la dynamique de l'infection, y compris la détection de différences subtiles dans les cinétiques de réplication et la propagation de cellule à cellule. Un objectif central de ce protocole est son application dans des tests de criblage antiviral. La quantification fondée sur l'image de l'intensité de fluorescence fournit un moyen robuste et reproductible d'évaluer l'efficacité de composés antiviraux, permettant une détection précoce et sensible des effets inhibiteurs dans les cellules infectées. Cela facilite l'identification de candidats antiviraux prometteurs et soutient l'évaluation de réponses dépendantes de la dose. L'approche convient également bien aux études comparatives de différentes souches ou mutants d'alphavirus, car les variations dans le comportement de réplication et les schémas de dissémination deviennent facilement apparentes. Sa flexibilité, sa compatibilité avec plusieurs lignées cellulaires et son intégration simple dans des plateformes d'imagerie automatisées rendent la méthode évolutive et adaptée à des campagnes de criblage à haut débit. Dans l'ensemble, ce protocole favorise la découverte et l'évaluation de stratégies antivirales. Étant donné que plusieurs alphavirus provoquent des maladies importantes chez l'humain et les animaux, qu'aucun traitement antiviral approuvé n'existe actuellement et que leur expansion géographique se poursuit avec l'émergence de foyers épidémiques, l'identification de nouveaux antiviraux demeure une priorité urgente. Par conséquent, ce flux de travail basé sur la fluorescence représente une contribution précieuse et opportune à la recherche moderne sur les alphavirus.

Introduction

Les alphavirus sont des virus à ARN (acide ribonucléique) monocaténaire à brin positif et enveloppés, appartenant à la famille des Togaviridae1,2,3. Ils sont principalement transmis par des moustiques et sont responsables d'une variété de maladies chez l'homme et les animaux. Le genre alphavirus comprend plusieurs virus d'importance médicale, tels que le virus du chikungunya (CHIKV), le virus Sindbis, le virus de l'encéphalite équine de l'Est et le virus de l'encéphalite équine vénézuélienne4,5. Ces agents pathogènes provoquent des symptômes allant de la fièvre et d'éruptions cutanées à des complications neurologiques graves6. De manière préoccupante, le CHIKV a récemment réémergé comme une importante menace pour la santé publique. Depuis le début de l'année 2025 seulement, plus de 220 000 cas ont été signalés dans 14 pays, entraînant au moins 80 décès7. Bien que le taux de mortalité soit faible, une proportion significative de personnes infectées développe des douleurs articulaires chroniques, pouvant entraîner un handicap à long terme et une réduction de la mobilité8. Pour concevoir des stratégies antivirales ciblées, une compréhension plus approfondie de la réplication des alphavirus et des interactions hôte-pathogène est essentielle. Par ailleurs, certains alphavirus, comme le virus de la forêt de Semliki (SFV), présentent une faible pathogénicité chez l'homme, malgré une forte similarité génétique et structurale avec des alphavirus plus virulents. Cela fait du SFV un modèle idéal pour l'étude des alphavirus sans présenter un risque élevé pour la santé humaine9,10,11.

Les dosages traditionnels tels que les dosages de plaques, le dosage infectieux 50 % sur culture cellulaire (TCID50) et l'analyse par réaction de polymérisation en chaîne quantitative (qPCR) sont utiles pour quantifier les titres viraux et l'expression génique, mais se limitent à des mesures ponctuelles et nécessitent la lyse ou la fixation des cellules. Par conséquent, ils ne permettent pas de capturer directement la dynamique de l'infection au sein des mêmes cellules au fil du temps12,13. Pour pallier ces limitations, l'imagerie fluorescente en temps réel offre une approche puissante et non destructive permettant de suivre la cinétique d'infection à plusieurs points temporels. L'utilisation de virus marqués par fluorescence, tels que le SFV étiqueté avec mCherry, permet de visualiser et de quantifier directement le signal du virus rapporteur et sa propagation dans des cellules vivantes14,15. Pour les expériences décrites ici, des lignées cellulaires couramment utilisées en recherche sur les arbovirus ont été employées. Les cellules U4.4, dérivées de larves d'Aedes albopictus, sont des cellules de moustique qui permettent une réplication efficace de nombreux arbovirus et facilitent l'étude des interactions vecteur-virus16,17. Parallèlement, les cellules BHK-21, une lignée cellulaire de type fibroblaste d'origine rénale de hamster nouveau-né, constituent un système hôte vertébré perméable fréquemment utilisé pour la propagation virale et les dosages en virologie moléculaire18.

Ce protocole décrit en détail le suivi de l'expression d'un marqueur viral et la caractérisation de composés antiviraux, en prenant comme exemple des inhibiteurs de la furine. La furine est une convertase de proprotéines présente chez de nombreux eucaryotes et joue un rôle clé dans l'activation des précurseurs de facteurs de croissance, d'hormones, de métalloprotéinases matricielles, de protéines plasmatiques et de récepteurs19,20. De nombreux alphavirus exploitent la furine pour cliver et activer leurs protéines de surface, une étape cruciale pour une réplication réussie20. Les inhibiteurs de la furine sont des composés conçus synthétiquement pour bloquer l'activité de la furine, réduisant ainsi la réplication virale21,22,23. Étant donné la disponibilité limitée de protocoles standardisés pour l'analyse automatisée d'infections par les alphavirus par microscopie à fluorescence utilisant un lecteur multimode d'imagerie cellulaire, un protocole détaillé est fourni pour la caractérisation de composés antiviraux dans des cellules aédiennes. Le protocole décrit les étapes de culture cellulaire, de production du virus, d'infection, de traitement par un composé antiviral (inhibiteur de la furine), d'imagerie par fluorescence et d'analyse d'images. Toutefois, les méthodes décrites ici peuvent être facilement adaptées à d'autres virus et à d'autres marqueurs fluorescents.

Protocole

1. Sécurité biologique

REMARQUE : Le virus de la forêt de Semliki (SFV-mCherry) recombinant marqué avec la mCherry utilisé dans ce protocole est génétiquement modifié24,25,26. L'insertion d'un gène rapporteur fluorescent le classe comme organisme génétiquement modifié, ce qui implique des exigences supplémentaires en matière de confinement et de réglementation. Les travaux impliquant d'autres alphavirus, en particulier des virus plus pathogènes tels que le CHIKV, peuvent nécessiter un confinement renforcé et des autorisations spécifiques.

  1. Nettoyer la hotte de sécurité biologique avec un désinfectant approprié et appliquer une irradiation UV pendant au moins 30 min avant et après les essais viraux.
  2. Jeter tous les matériaux contaminés conformément aux réglementations locales de biosécurité. Collecter les déchets solides et liquides séparément dans des récipients autoclavables et autoclaver avant élimination.

2. Préparation des composés antiviraux

REMARQUE : Les inhibiteurs de la furine MI-113027 (trans-4-(aminométhyl) cyclohexanecarboxyl-arginine-valine-arginine-4-amidinobenzylamide), MI-113127 (trans-4-(guanidinométhyl) cyclohexanecarboxyl-arginine-valine-arginine-4-amidinobenzylamide) et MI-114822,23 (4-(guanidinométhyl) phénylacétyl-arginine-tert.-leucine-arginine-4-amidinobenzylamide) utilisés dans cette étude sont des exemples de composés antiviraux sélectionnés pour être testés. L'inhibiteur de la furine MI-1148 a été utilisé comme témoin négatif dans le test de cytotoxicité et comme témoin positif dans le test antiviral.

  1. Dissoudre les composés antiviraux dans un solvant approprié. Lorsque possible, utiliser de l'eau stérile afin d'éviter les effets cytotoxiques. Le diméthylsulfoxyde ou le méthanol peuvent être utilisés jusqu'à 2 % (v/v). L'utilisation de solutions mères à 10 mM dans de l'eau stérile est recommandée.
  2. Conserver les solutions mères à -20 °C, selon la stabilité et la solubilité, sauf indication contraire du fabricant.

3. Culture cellulaire

  1. Incubez les cellules U4.4 dans le milieu Leibovitz L-15 supplémenté avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), 1 % d'acides aminés non essentiels MEM, 1 % de bouillon de tryptose phosphate, 1 % de glutamine et 1 % de pénicilline/streptomycine (Pen/Strep) (densité de semis : environ 1 × 106 cellules/flacon T25, volume de culture : 5 mL). Maintenez les cellules à 28 °C. Repiquez les cellules U4.4 à un ratio de 1:6 une fois par semaine, mais ajustez les densités de semis selon les besoins expérimentaux.
    REMARQUE : D'autres lignées cellulaires, telles que les cellules C6/36, sont également compatibles avec ce protocole. D'autres milieux et suppléments peuvent être utilisés selon les cas. L'ajout d'antibiotiques est facultatif et peut être omis.
  2. Incubez les cellules rénales de bébé hamster (BHK-21) dans le milieu de Dulbecco modifié (DMEM) supplémenté avec 10 % de FBS, 1 % de glutamine ou Équilibre statique, ΣFx=0, graphique, analyse d'équilibre des forces, diagramme de stabilité mécanique.‑alanyl‑Équilibre statique, ΣFx=0, graphique, analyse d'équilibre des forces, diagramme de stabilité mécanique.‑glutamine, et 1 % de Pen/Strep (densité de semis : environ 1 × 106 cellules/flacon T75, volume de culture : 10 mL). Maintenez les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO2. Repiquez les cellules à un ratio de 1:12 tous les 4 à 5 jours, en adaptant les densités de semis selon les besoins.
  3. Assurez-vous que les cellules restent saines et en prolifération active.

4. Production du virus

  1. Préparation des stocks de SFV-mCherry (SFV6-2SG-mCherry) dans des cellules BHK-21.
    1. Cultiver les cellules BHK-21 (densité de semis : environ 1 × 105 cellules/puits, volume de culture : 500 µL) dans une plaque de culture cellulaire transparente à 24 puits, dans les conditions décrites ci-dessus.
    2. Lorsque la confluence atteint environ 90 % (confluence cible : environ 2 × 105 cellules), transfecter les cellules BHK-21 avec le plasmide SFV6-2SG-mCherry en utilisant un réactif de transfection dans le milieu d'infection (DMEM supplémenté avec 1 % de pénicilline/streptomycine et 0,2 % d'albumine de sérum bovin). Pour cela, diluer 1 µL de réactif de transfection dans 25 µL de milieu à faible teneur en sérum.
    3. Dans un tube distinct, diluer 0,5 µg d'ADN plasmidique et 1 µL d'un additif exclusif dans 25 µL de milieu à faible teneur en sérum. Ajouter la solution d'ADN diluée à la solution contenant le réactif de transfection dilué et incuber pendant 15 min à température ambiante. Ensuite, ajouter 50 µL du complexe obtenu aux cellules.
      NOTA : D'autres réactifs de transfection peuvent être utilisés, à condition qu'ils soient compatibles avec la lignée cellulaire spécifique, et les instructions peuvent varier selon le réactif utilisé.
    4. À 48 h post-transfection, recueillir le surnageant contenant le virus à l’aide d’une pipette, aliquoter 250 µL par tube exempt d'ADN/ARN et stocker à -80 °C.
  2. Titration par essai de TCID50.
    1. Cultiver les cellules BHK-21 (densité de semis : environ 2 × 104 cellules/puits, volume de culture : 100 µL) dans une plaque de 96 puits noire de qualité pour imagerie, dans les conditions décrites ci-dessus.
    2. Dégeler un aliquot de virus, préparer des dilutions sérielles décimales de l'échantillon viral dans le milieu d'infection (15 µL d'échantillon viral + 135 µL de milieu d'infection), éliminer l'ancien milieu et ajouter 100 µL des dilutions aux cellules.
    3. Incuber les cellules pendant 1 h à 37 °C dans une étuve humide contenant 5 % de CO₂, puis remplacer l'inoculum par 100 µL de milieu d'infection frais.
    4. À 48 h post-infection (hpi), évaluer la réplication virale par mesure de fluorescence à l’aide d’un lecteur de plaques d'imagerie multimode (description détaillée dans la section 7) et déterminer l'effet cytopathogène provoqué par l'infection virale. Calculer la valeur de TCID50 selon la méthode de Reed-Muench28 et convertir en titres viraux estimés (PFU/mL) en utilisant l'approximation standard basée sur la loi de Poisson, selon laquelle 1 TCID50 correspond à 0,7 PFU.

5. Détermination de la cytotoxicité

  1. Cultiver les cellules U4.4 (densité de semis : environ 3 × 104 cellules/puits, volume de culture : 100 µL) dans une plaque de culture cellulaire transparente à 96 puits, dans les conditions décrites ci-dessus.
    NOTE : Les puits périphériques (lignes A et H ; colonnes 1 et 12) ont été ensemencés avec des cellules mais exclus de l'analyse expérimentale afin d'éviter les effets de bord, notamment une évaporation accrue.
  2. Lorsque la confluence atteint 90 % (confluence cible : environ 6 × 104 cellules), traiter les cellules avec 100, 50, 25 et 12,5 µM d'inhibiteurs de la furine MI-1130 et MI-1131, dans un volume total de 100 µL. Ajouter le MI-1148 (aux mêmes concentrations que le MI-1130 et le MI-1131), des cellules non traitées et des cellules traitées avec de l'eau comme témoins négatifs, ainsi que l'ionomycine (100 µM dans le test) comme témoin positif de cytotoxicité.
  3. Au bout de 48 h après le traitement (hpt), évaluer la viabilité cellulaire à l’aide d’un test luminescent fondé sur la quantification de l’ATP. Ajouter un volume égal de réactif luminescent dans chaque puits (1:1 par rapport au milieu de culture), agiter la plaque pendant 2 min pour assurer la lyse cellulaire, puis incuber 10 min à l’abri de la lumière avant de mesurer la luminescence.
    NOTE : D'autres tests de viabilité cellulaire fondés sur des principes de détection différents peuvent également être utilisés.
  4. Enregistrer la luminescence dans une plaque noire ou blanche à 96 puits à l’aide d’un lecteur multimode.

6. Infection virale et traitement avec un composé antiviral

  1. Cultiver les cellules U4.4 (densité de semis : environ 3 × 104 cellules/puits, volume de culture : 100 µL) dans une plaque 96 puits noire de qualité pour l'imagerie, dans les conditions décrites ci-dessus.
    NOTE : Les puits périphériques (lignes A et H ; colonnes 1 et 12) ont été ensemencés avec des cellules mais exclus de l'analyse expérimentale afin d'éviter les effets de bord, notamment une évaporation accrue.
  2. Infecter les cellules (confluence cible : environ 6 × 104 cellules) avec le SFV-mCherry à une multiplicité d'infection (MOI) de 0,01 dans du milieu L-15 non supplémenté, en utilisant un volume d'inoculation de 100 µL, puis incuber pendant 1 h à 28 °C.
    NOTE : Utiliser uniquement des stocks de virus rapporteurs de bas passage, en particulier lorsqu'on travaille avec des MOI très faibles et des infections sur plusieurs jours.
  3. Préparer des dilutions des inhibiteurs de la furine MI-1130, MI-1131 et MI-1148 à des concentrations finales de 100, 50, 25 et 12,5 µM dans une plaque 96 puits V-fond séparée, en utilisant du milieu L-15 supplémenté. Préparer 110 µL par puits afin de prévoir une marge de 10 %, puis transférer 100 µL (volume final) sur les cellules. Pour les témoins, utiliser des cellules infectées traitées avec le solvant des composés antiviraux et des cellules infectées sans ajout de composé comme témoin négatif. Des cellules non infectées et non traitées doivent également être ajoutées afin de mesurer la fluorescence de fond.
  4. À l'issue de la période d'infection de 1 h, retirer l'inoculum et transférer 100 µL des inhibiteurs de la furine dilués depuis les plaques V-fond vers les plaques noires de qualité pour l'imagerie.
  5. Incuber les cellules à 28 °C.

7. Imagerie par fluorescence en cellules vivantes, analyse quantitative des images et présentation des données

  1. Mesure de l'expression du gène rapporteur viral par microscopie de fluorescence (voir Figure supplémentaire 1, Figure supplémentaire 2, Figure supplémentaire 3, Figure supplémentaire 4, Figure supplémentaire 5, Figure supplémentaire 6 et Figure supplémentaire 7 pour la configuration du programme).
    1. Aux points temporels de 24 et 48 hpi, colorer les noyaux cellulaires en ajoutant 8 µL d'une solution de contre-coloration nucléaire perméante par puits. Incuber pendant 30 min à 28 °C.
      NOTE : L'infection peut être surveillée à plusieurs moments. Toutefois, les mesures effectuées 48 heures après l'infection fournissent le signal le plus intense (voir Figure supplémentaire 8) et permettent d'évaluer les effets antiviraux de manière plus fiable. Des lectures à 24 h ou à des temps intermédiaires sont possibles, mais prolonger l'incubation au-delà de 48 h augmente le risque de surconfluence cellulaire. Choisir une confluence cellulaire appropriée au début de l'expérience afin de s'assurer que les cellules ne deviennent pas surconfluentes au moment choisi pour la lecture. Cela permettra d'éviter toute obstruction d'un décompte cellulaire précis.
    2. Après l'incubation (et en complément du couvercle transparent), ajouter une feuille scellante transparente recouvrant le dessus de la plaque pour des raisons de sécurité.
      NOTE : Lors de l'utilisation d'un dispositif d'imagerie, il est essentiel de sélectionner le type de plaque approprié. L'éclairage, le temps d'intégration et les réglages de gain varient selon le gène rapporteur. Il est fortement recommandé de réaliser des mesures préliminaires afin de déterminer les paramètres optimaux. Les réglages initiaux d'éclairage, d'intégration et de gain utilisés pour établir le protocole dans les conditions données sont indiqués dans la Figure supplémentaire 2, où la configuration du programme est décrite en détail.
    3. Acquérir des images de chaque puits complet en utilisant le mode de juxtaposition d'images (quatre champs par puits en grossissement 4x) à l'aide du lecteur multimode.
    4. Mesurer l'intensité de fluorescence rouge en utilisant un cube de filtres Texas Red (Excitation : 586/15 nm ; Émission : 647/57 nm).
    5. Déterminer le nombre total de cellules à l'aide du canal DAPI avec les réglages suivants (Excitation : 377/50 nm ; Émission : 447/60 nm).
  2. Analyse quantitative des images (voir Tableau supplémentaire 1 pour les données brutes).
    NOTE : Pour les mesures de fluorescence, un lecteur d'imagerie de microplaque a été utilisé. Les paramètres détaillés utilisés pour ce dosage sont disponibles dans la Figure supplémentaire 2.
    1. Traiter les images à l'aide d'un logiciel d'imagerie approprié.
    2. Dans le panneau de réduction des données, sélectionner la juxtaposition d'images pour les canaux DAPI et Texas Red afin de créer une image unique par puits.
    3. Ajouter les statistiques d'image et sélectionner l'intensité totale sur le canal Texas Red juxtaposé. Appliquer un prétraitement d'image pour éliminer le bruit de fond du canal DAPI juxtaposé.
    4. Effectuer une analyse cellulaire sur le canal DAPI juxtaposé prétraité.
    5. Calculer l'intensité moyenne de fluorescence rouge par cellule en soustrayant la fluorescence moyenne des puits témoins non infectés et non traités de chaque puits traité, puis en divisant le résultat par le nombre total de cellules dans le puits correspondant.
  3. Résolution des problèmes
    1. Surveiller la stabilité du focus pendant la mesure, en particulier lors de longues acquisitions d'images ou lors de l'utilisation de plaques sensibles à la température.
    2. Activer la mise au point automatique et augmenter sa fréquence si un décalage du focus est observé. Réduire la vitesse d'acquisition ou laisser les plaques s'équilibrer à la température de l'appareil avant l'imagerie si le décalage persiste.
    3. Utiliser des plaques adaptées à l'imagerie afin d'assurer une qualité de signal constante pendant l'acquisition. Éviter les phénomènes de recouvrement et de surexposition en n'utilisant pas un éclairage excessif ni des temps d'intégration trop longs.
    4. Réduire l'intensité d'excitation, raccourcir le temps d'intégration ou diminuer le gain jusqu'à éviter la saturation du signal. Vérifier que les canaux des fluorophores sont bien séparés et ajuster les réglages des filtres si nécessaire.
      NOTE : Le recouvrement entre DAPI et mCherry est généralement faible, mais dépend du construct rapporteur utilisé (par exemple, GFP).
    5. Éviter une confluence excessive des cellules afin de maintenir une cinétique d'infection correcte et une sensibilité optimale du test. En cas de surconfluence, réduire le temps d'incubation avant la mesure.
    6. Surveiller les effets liés aux colorants sur la viabilité cellulaire et la qualité du signal, particulièrement à des concentrations élevées. Réduire la concentration du colorant ou raccourcir les temps d'incubation si une toxicité liée au colorant ou un fond saturé est observé.
    7. Préparer et conserver les colorants conformément aux recommandations du fabricant afin de maintenir la stabilité du signal.

Résultats

Dans ce travail, un protocole détaillé pour surveiller la propagation des alphavirus et évaluer des composés antiviraux (par exemple, des inhibiteurs de la furine) à l’aide de la microscopie à fluorescence dans un format de plaque multi-puits est présenté. Afin de démontrer la visualisation des effets inhibiteurs sur l’expression du marqueur viral, trois inhibiteurs de la furine synthétisés précédemment ont été sélectionnés pour être testés sur la lignée cellulaire aedine U4.4 : MI-1148, MI-1130 et MI-1131. Un aperçu du déroulement expérimental est illustré dans Figure 1.

Avant d'évaluer l'efficacité antivirale, il est essentiel d'analyser la cytotoxicité afin de s'assurer que toute réduction de la réplication virale n'est pas due à la mort cellulaire induite par le composé. Par conséquent, les cellules U4.4 ont été traitées à une confluence de 90 % avec les inhibiteurs aux concentrations de 100, 50, 25 ou 12,5 µM. Les cellules non traitées et celles traitées avec de l'eau (témoin solvant) ont servi de contrôles négatifs, tandis que l'ionomycine a été utilisée comme contrôle positif. La viabilité cellulaire a été évaluée 48 h après le traitement à l'aide d'un dosage luminescent fondé sur la quantification de l'ATP. Pour les inhibiteurs de la furine testés, aucune réduction significative de la viabilité cellulaire n'a été observée (Figure 2).

Étant donné l'absence de cytotoxicité, les composés ont ensuite été évalués pour leur activité antivirale. Pour ce faire, les cellules U4.4 ont été infectées par le SFV-mCherry pendant 1 h, puis traitées avec les mêmes inhibiteurs de la furine aux mêmes concentrations. Les cellules infectées non traitées et les cellules infectées traitées avec de l'eau ont servi de témoins négatifs pour l'activité antivirale, tandis que les cellules non infectées non traitées ont été utilisées pour évaluer la fluorescence de fond. À 48 h post-traitement, l'expression du marqueur viral a été quantifiée par microscopie de fluorescence. Avant l'acquisition des images, 8 µL d'une solution colorante nucléaire perméante aux cellules ont été ajoutés à chaque puits et incubés pendant 30 min afin de marquer les noyaux cellulaires. Le signal de fluorescence rouge correspondant à l'expression du marqueur viral et le nombre total de noyaux ont été quantifiés à partir des images de fluorescence traitées. Parmi les inhibiteurs testés, le MI-1148 a démontré une activité antivirale puissante, réduisant significativement l'expression du marqueur viral de manière dépendante de la dose (Figure 3). En revanche, le MI-1130 et le MI-1131 n'ont montré aucune inhibition observable de l'expression du marqueur viral à aucune des concentrations testées. Les données brutes et l'analyse du test antiviral sont fournies dans le Tableau supplémentaire 1.

Les résultats représentatifs démontrent que le protocole identifie de manière fiable les composés dotés d'une activité antivirale, comme en témoigne la forte réduction du signal du marqueur observée avec le composé MI-1148. En revanche, les inhibiteurs MI-1130 et MI-1131 n'ont pas diminué l'expression du marqueur, ce qui indique que leur inhibition puissante de la furine, reflétée par des constantes d'inhibition dans la gamme picomolaire, ne se traduit pas par une activité antivirale dans ces conditions (Figure 4). Ces résultats soulignent la capacité du test à distinguer les composés actifs des composés inactifs et à faciliter l'identification de structures directrices pertinentes et efficaces.

Processus de criblage antiviral ; culture cellulaire, infection virale, traitement par composés ; tableau d'analyse des données.
Figure 1 : Schéma du protocole expérimental. Vue schématique du protocole expérimental utilisé pour évaluer l'activité antivirale d'inhibiteurs de la furine dans la lignée cellulaire aedine U4.4. Le protocole comprend la préparation des composés, l'ensemencement des cellules, l'infection par le virus de la forêt de Semliki marqué avec mCherry, le traitement par les composés, la microscopie à fluorescence pour une visualisation en temps réel et la quantification de l'expression du rapporteur viral. Cette illustration a été créée avec BioRender. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Histogramme de viabilité cellulaire, comparaison de la concentration du médicament ; traitements par MI-1148, MI-1130, MI-1131.
Figure 2 : Effets cytotoxiques des inhibiteurs de la furine dans les cellules U4.4. À une confluence d’environ 90 %, les cellules U4.4 ont été traitées avec MI-1148, MI-1130 et MI-1131 à 100, 50, 25 et 12,5 µM. Les cellules non traitées et celles traitées avec de l’eau ont servi de témoins négatifs, tandis que l’ionomycine (100 µM) a été utilisée comme témoin positif. Après 48 heures de traitement, la viabilité cellulaire a été évaluée par quantification de l’ATP. Les données ont été normalisées par rapport au témoin non traité et exprimées en pourcentage (%). La viabilité cellulaire moyenne (n=3) est indiquée, et les barres d’erreur représentent le coefficient de variation. La ligne pointillée représente le seuil de cytotoxicité fixé à 80 %. n.d. = non détectable. La représentation des données a été réalisée avec GraphPad Prism v9.5.1. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Graphique en barres de l'intensité rouge des cellules en fonction de la concentration du médicament ; analyse statistique des composés de la série MI.
Figure 3 : Activité antivirale d'inhibiteurs de la furine contre le virus Semliki Forest (SFV) marqué avec mCherry dans la lignée cellulaire aedine U4.4. À environ 90 % de confluence, les cellules ont été infectées par le SFV-mCherry pendant 1 h, puis traitées avec les composés MI-1148, MI-1130 et MI-1131 aux concentrations de 100, 50, 25 et 12,5 µM. À 48 h post-traitement, l'expression du marqueur viral a été quantifiée par microscopie de fluorescence. Avant l'acquisition des images, 8 µL d'une solution de contre-coloration nucléaire perméante aux cellules ont été ajoutés à chaque puits et incubés pendant 30 min afin de colorer les noyaux cellulaires. Les images de fluorescence ont été acquises à l'aide d'un filtre Texas Red pour le signal viral et d'un filtre DAPI pour les noyaux. Une analyse d'image a été effectuée afin de quantifier l'intensité totale de fluorescence rouge (indiquant la réplication virale) ainsi que le nombre total de cellules par puits. Les données (n = 4) sont présentées sous forme d'intensité rouge totale par cellule (signal viral total / nombre total de cellules). Les barres d'erreur représentent l'écart-type. La significativité statistique par rapport au témoin infecté par le SFV a été évaluée à l'aide d'une ANOVA à un facteur et d'un test de comparaisons multiples de Dunnett : **** = P<0,0001 ; ns = P>0,05. La représentation des données et l'analyse statistique ont été réalisées à l'aide de GraphPad Prism v9.5.1. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Image de microscopie de cultures cellulaires infectées par le SFV à différentes concentrations, montrant les niveaux d'infection.
Figure 4 : Images de fluorescence représentatives montrant l'activité antivirale d'inhibiteurs de la furine contre le virus Semliki Forest (SFV) marqué avec mCherry dans la lignée cellulaire aedine U4.4. Les cellules, à environ 90 % de confluence, ont été infectées par le SFV-mCherry pendant 1 h, puis traitées avec MI-1148, MI-1130 et MI-1131 aux concentrations de 100, 50, 25 et 12,5 µM. Les cellules infectées non traitées et les cellules infectées traitées avec de l'eau ont servi de contrôles négatifs, tandis que les cellules non infectées non traitées ont été incluses comme contrôles de fond. Le signal du marqueur a été évalué 48 h après le traitement par microscopie à fluorescence en utilisant un filtre Texas Red pour détecter le signal mCherry. Échelle = 2000 µm. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Tableau supplémentaire 1 : Données brutes de l'intensité totale du signal viral et du nombre de cellules. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 1 : Étapes du protocole utilisées sur le lecteur d'images pour les résultats représentatifs. Premièrement, un ensemble de température (rouge) correspondant aux conditions de culture des cellules U4.4. Ensuite, trois étapes indépendantes d'acquisition d'images (orange) pour les mesures de DAPI, de Texas Red et de champ clair. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Paramètres d'image dans les étapes de la procédure utilisées sur le lecteur d'images pour les résultats représentatifs. Les premiers paramètres à modifier sont : l'agrandissement (4x) et la taille de l'image (Full WFOV). Il faut sélectionner le fluorophore à mesurer, puis ajuster en conséquence les paramètres d'illumination, de temps d'intégration et de gain. Enfin, il convient de choisir le montage d'images (2x2) et le recouvrement (30 µm x 30 µm). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure suplémentaire 3 : Étapes de réduction des données utilisées sur le lecteur d'images pour les résultats représentatifs. La première étape consiste en l'assemblage des images (en bleu) pour les canaux DAPI et Texas Red. Ensuite, l'analyse statistique des images (en violet) fournit la mesure de l'intensité totale. Puis, une étape de prétraitement de l'image (en vert) est nécessaire pour éliminer le bruit de fond du canal DAPI. Enfin, l'analyse cellulaire (en jaune) est effectuée sur l'image assemblée prétraitée du canal DAPI. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 4 supplémentaire : Assemblage d'images dans les étapes de réduction des données utilisées sur le lecteur d'images pour les résultats représentatifs. Le paramètre le plus pertinent est la réduction de la taille de l'image finale (80 %), car si elle est inférieure, cela affecte la résolution de l'image et, par conséquent, la mesure finale des paramètres. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 5 supplémentaire : Statistiques des images aux étapes de réduction des données utilisées sur le lecteur d'images pour les résultats représentatifs. Il est important de sélectionner le bon canal (Stitched : Fluorophore), de choisir un seuil minimal (2500), puis finalement le paramètre à mesurer (Intensité totale). Pour une mesure plus précise, un Image Plug peut être créé. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 6 : Prétraitement des images dans les étapes de réduction des données utilisées sur le lecteur d'images pour les résultats représentatifs. Le paramètre le plus pertinent est celui de la balle roulante (30 µm), qui privilégie des résultats fins. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 7 : Analyse cellulaire dans les étapes de réduction des données utilisées sur le lecteur d'images pour les résultats représentatifs. Il est important de choisir le canal qui contient l'image prétraitée. Choisissez de diviser les objets en contact et de combler les trous à l'aide de masques. Il est essentiel de sélectionner la plage correcte d'objets (5-50 µm). Enfin, pour des résultats plus précis, un module d'image peut être créé. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 8 : Activité antivirale d'inhibiteurs de la furine contre le virus de la forêt de Semliki (SFV) marqué avec mCherry dans la lignée cellulaire aedine U4.4. À environ 90 % de confluence, les cellules ont été infectées par le SFV-mCherry pendant 1 heure, puis traitées avec MI-1148, MI-1130 et MI-1131 à 100, 50, 25 et 12,5 µM. À 24 heures (barres rouges) et 48 heures (barres vertes) après le traitement, l'expression du marqueur viral a été quantifiée par microscopie de fluorescence. Les barres d'erreur représentent l'écart type (n = 4). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La capacité d'observer la réplication des alphavirus en temps réel offre une perspective séquentielle et cumulative sur les tests classiques à point final. Ce protocole d'imagerie en direct à multiples temps constitue un modèle utile pour l'étude des alphavirus, car il fournit une plateforme dynamique permettant d'observer la propagation virale.

La réussite de ce protocole dépend de plusieurs paramètres. Premièrement, il est important d'évaluer la cytotoxicité des composés avant tout essai antiviral afin d'éliminer les faux positifs dus à la mort cellulaire. Une fois l'évaluation des effets cytotoxiques réalisée, l'activité antivirale des composés peut être évaluée par la suite. Pour les composés testés, aucune cytotoxicité n'a été observée. MI-1130 et MI-1131 n'ont montré aucun impact significatif sur l'expression du rapporteur viral, tandis que MI-1148, utilisé comme témoin positif, l'a efficacement supprimée. Par ailleurs, le moment de l'infection par rapport au semis cellulaire est crucial. Les cellules doivent atteindre une confluence adéquate afin de garantir une infection reproductible sans surcroissance. Il est également important d'optimiser la multiplicité d'infection selon la lignée cellulaire afin d'observer une infection progressive sans compromettre la viabilité cellulaire. Enfin, la fréquence d'acquisition des images doit être soigneusement déterminée pour permettre la visualisation d'une expression progressive du rapporteur viral sans sauts importants. Pour la plupart des applications, l'acquisition d'images toutes les huit heures, par exemple, offre un bon équilibre entre détail temporel et intégrité de l'échantillon.

Le principal avantage de ce protocole réside dans son adaptabilité. Dans cette expérience, nous avons utilisé le SFV-mCherry et les cellules U4.4 afin de démontrer la surveillance de l'expression du marqueur rapporteur viral et son inhibition après traitement par des inhibiteurs de la furine. Toutefois, le protocole peut être optimisé pour l'analyse en fluorescence d'autres virus portant des marqueurs rapporteurs différents, tels que la GFP, ainsi que pour d'autres types cellulaires hôtes, incluant des cellules primaires et des lignées cellulaires différenciées. Bien que le protocole se concentre sur le traitement par composés après infection, le flux opératoire peut également être facilement adapté à des expériences d'ajout à différents moments, incluant un pré-traitement, un traitement simultané, un traitement immédiatement post-infection ou un traitement différé, afin d'approfondir l'étude du mécanisme d'action antiviral. Ce protocole a initialement été utilisé pour comparer le fonctionnement du système d'ARNi dans les cellules C6/36 et U4.414. Il a par la suite été étendu afin d'examiner comment l'ARN double brin ciblant directement le virus inhibe l'expression du marqueur rapporteur viral15.

Des difficultés potentielles peuvent survenir lors de l'utilisation de ce protocole. Les virus rapporteurs, bien qu'extrêmement utiles pour de nombreuses applications in vivo29 et in vitro30, peuvent également présenter une virulence réduite31 ainsi qu'une instabilité génétique des gènes rapporteurs32. Le détachement cellulaire causé par une surconfluence peut entraver une visualisation et une imagerie claires, affectant ainsi le décompte cellulaire. Une exposition prolongée à des colorants pour cellules vivantes (par exemple, l’Hoechst 33342 pour les noyaux) peut modifier le comportement ou la viabilité cellulaire15. De plus, les expériences impliquant des alphavirus hautement pathogènes, tels que le CHIKV, peuvent nécessiter des mesures de biosécurité renforcées ainsi que des adaptations du protocole correspondantes. En outre, une dérive du point de focalisation peut être observée dans certains cas en raison de la variabilité des plaques ainsi que de l'utilisation de plaques différentes. Par exemple, les signaux de fluorescence dans des plaques de culture cellulaire transparentes peuvent se propager d'un puits à un puits adjacent, et les plaques blanches peuvent provoquer une surexposition. Dans les deux cas, la précision de la mesure du signal fluorescent sera compromise.

Ce protocole présente plusieurs avantages par rapport aux essais virologiques classiques. Par exemple, les dosages par plaque et les dosages de TCID50 fournissent des données ponctuelles sur les titres viraux12. De plus, la qPCR permet une détection sensible de l'ARN viral, mais ne peut pas distinguer les virus réplication-compétents des particules virales non infectieuses ou des acides nucléiques résiduels. En revanche, ce type d'imagerie en fluorescence en temps réel permet une évaluation continue et non invasive de la progression virale, de sa dissémination et des effets d'un traitement au sein de la même population cellulaire, et ce, au fil du temps.

Au-delà de l'étude des inhibiteurs de la furine en tant que composés antiviraux, notre protocole peut être adapté à d'autres applications. Il convient particulièrement bien au criblage de médicaments antiviraux, permettant la quantification de réponses dépendantes de la dose à divers composés. Il fournit une plateforme pour l'étude des interactions hôte-pathogène, notamment le moment et la localisation de l'entrée virale, de la réplication et de la dissémination. Il peut être utilisé pour comparer des virus rapporteurs, différentes souches ou différents alphavirus. De plus, il peut être associé à des approches telles que l'extinction génique par ARNsi ou ARNdb. Ainsi, ce système peut aider à identifier et valider des cibles essentielles ainsi que des composés antiviraux impliqués dans la réplication virale. Toutefois, ce dosage basé sur la fluorescence constitue une approche de criblage initial plutôt qu'une méthode confirmatoire autonome ; des investigations supplémentaires, notamment des dosages avec des virus sauvages, seront nécessaires pour confirmer les résultats du criblage.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflit d'intérêts.

Remerciements

Nous remercions le professeur Dr Andres Merits, de l'Université de Tartu, en Estonie, et le professeur Dr Andreas Pichlmair, de l'Université technique de Munich, en Allemagne, pour avoir fourni le plasmide pCMV-SFV6-2SG-mCherry. Nous remercions le professeur Dr Stefanie Becker, de l'Université de médecine vétérinaire de Hanovre, en Allemagne, pour les cellules C6/36. Nous remercions le professeur Dr Torsten Steinmetzer, de l'Université de Marbourg, à Marbourg, en Allemagne, pour avoir fourni les inhibiteurs de la furine. Ce travail a été soutenu par le programme Landes-Offensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz du ministère hessois de l'Enseignement supérieur, de la Recherche et des Arts, par l'intermédiaire du centre LOEWE pour la génomique biodiversitaire translationnelle (LOEWE-TBG), avec le code de financement : LOEWE/1/10/519/03/03.001(0014)/52, et par le BMFTR (projet ASCRIBE, numéro de subvention 01KI2024).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Albumine bovine fraction V, pH 7,0SERVA Electrophoresis11930.03
BenchStable DMEMThermo Fisher ScientificA4192101
Céllules BHK-21CLS Cell Lines Service GmbH, Eppelheim, Allemagne603126
FLASQUE DE CULTURE CELLULAIRE, 50 mL, 25 cm2, PS, bouchon à vis avec filtre rouge, transparent, CELLSTAR, TC, stérileGreiner Bio-One690175
Microplaque de culture cellulaire, 24 puits, PS, fond F, (puits en cheminée), transparent, CELLSTAR, TC, couvercle avec anneaux anti-condensation, stérileGreiner Bio-One662160
Microplaque de culture cellulaire, 96 puits, PS, fond F, (puits en cheminée), µCLEAR, noir, CELLSTAR, TC, couvercle avec anneaux anti-condensation, stérileGreiner Bio-One655090
Microplaque de culture cellulaire, 96 puits, PS, fond F, (puits en cheminée), transparent, CELLSTAR, TC, couvercle avec anneaux anti-condensation, stérileGreiner Bio-One655180
Microplaque de culture cellulaire, 96 puits, PS, fond V, transparentGreiner Bio-One651101
Spatule à cellulesVWR734-2602
Test CellTiter-Glo de viabilité cellulaire luminescentPromegaG7573
Lecteur multimode d'imagerie cellulaire Cytation 5Biotek
Cube de filtres DAPI 1225100Biotekex : 377/50 nm ; ém : 447/60 nm
Milieu de Dulbecco modifié (DMEM GlutaMAX)Thermo Fisher ScientificA4192102
Sérum de veau fœtalFisher Scientific11550356
Inhibiteur de furine MI-1130Cette étude
Inhibiteur de furine MI-1131Cette étude
Inhibiteur de furine MI-1148Hardes et al. 2015.  https://doi.org/10.1002/cmdc.201500103 
Logiciel Gen5 PrimeBiotek
Sel de calcium d'ionomycine, 99 %Thermo Fisher ScientificJ60628
Milieu Leibovitz L-15, supplément GlutaMAX Thermo Fisher Scientific31415029
Réactif de transfection Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000001
Acides aminés non essentiels MEM (100x)Thermo Fisher Scientific11140050
Microplaque, PS, 96 puits, fond F, (puits en cheminée), noir, Fluotrac, liaison moyenneGreiner Bio-One655076
Réactif NucBlue Live ReadyProbes (Hoechst 33342)Thermo Fisher ScientificR37605
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985062
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
SFV6–2SG-mCherryProf. Dr. Andres Merits (Université de Tartu, Estonie) et Prof. Dr. Andreas Pichlmair (Université technique de Munich, Allemagne)
Cube de filtres Texas Red 1225102 Biotekex : 586/15 nm ; ém : 647/57 nm
Bouillon de tryptose phosphate Thermo Fisher Scientific18050039
Céllules U4.4Institut Friedrich-Loeffler, Institut fédéral de recherche pour la santé animale, Greifswald, Allemagne
Scelleur Viewseal, transparentGreiner Bio-One676070

Références

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