Génération d’un modèle à base d’organoïdes prostatiques de souris pour étudier les interactions hôte-pathogène

Résumé

Ce protocole décrit la génération d’un modèle murin à base d’organoïdes prostatiques cultivé en 2D. Elle comprend la dissociation organoïde, l’ensemencement cellulaire, la différenciation, l’évaluation de l’intégrité épithéliale et l’infection in vitro par Escherichia coli uropathogène. Le modèle offre une accessibilité apicale et convient à l’étude des interactions hôte-pathogène, surmontant ainsi les limites des systèmes organoïdes 3D traditionnels.

Résumé

Les hommes âgés sont fortement affectés par des maladies de la prostate, telles que l’hyperplasie bénigne de la prostate, la prostatite et le cancer de la prostate. Ensemble, ces affections contribuent de manière significative au fardeau sanitaire mondial et constituent une cause majeure de maladie chez les hommes. Les modèles organoïdes ont transformé la modélisation des maladies en permettant la réplication des caractéristiques clés de la structure et de la fonction épithéliales in vitro. Cependant, la structure lumineuse fermée des organoïdes limite l’accès expérimental à la surface apicale, entravant l’étude des interactions hôte-pathogène. Pour surmonter ces défis, nous avons créé un système de culture physiologiquement pertinent dans lequel des cellules dérivées d’organoïdes prostatiques de souris sont ensemencées sous forme de modèle bidimensionnel (2D). Cette approche conserve des caractéristiques épithéliales essentielles tout en offrant un accès direct à la surface apicale. Ce protocole étape par étape décrit la dissociation des organoïdes prostatiques de souris matures et les conditions optimales de semis pour soutenir l’attachement, la prolifération et la différenciation cellulaire. La microscopie à immunofluorescence a confirmé l’expression de marqueurs prostatiques spécifiques à la prostate dans le modèle à base d’organoïdes et a démontré une représentation précise de l’organisation cellulaire du tissu prostatique. Les mesures TEER, ainsi que la coloration par F-actine et jonction serrée, ont davantage confirmé la différenciation cellulaire et la formation de barrières. L’infection du modèle par Escherichia coli uropathogène (UPEC) a démontré son utilité dans l’étude des interactions hôte-pathogène. Ce modèle offre une plateforme précieuse pour étudier la biologie épithéliale de la prostate et les mécanismes des maladies, et il est particulièrement adapté pour étudier les interactions hôte-pathogène et évaluer les stratégies thérapeutiques potentielles.

Introduction

La glande prostatique est un petit organe situé sous la vessie, entourant l’urètre. C’est un organe essentiel du tube reproducteur masculin, et sa fonction principale est de produire le liquide prostatique. Ce liquide représente jusqu’à 30 % du plasma séminal, et il est essentiel pour nourrir et protéger le spermatozoïde durant son parcours à travers le tube reproducteur féminin¹. Les maladies de la prostate, telles que la prostatite, l’hyperplasie bénigne de la prostate et le cancer de la prostate, sont très répandues et représentent un fardeau important pour les soins de santé dans le monde^entier 2,3,4,5. Alors que l’hyperplasie bénigne de la prostate et le cancer de la prostate font l’objet d’études approfondies, la prostatite, et en particulier la prostatite bactérienne, restent relativement peu étudiées. La prostatite touche jusqu’à 16 % des hommes dans^{le monde 6,7}, les infections bactériennes représentant environ 10 % des cas. Malgré sa prévalence, la prostatite bactérienne reste encore mal comprise. Les souches d’Escherichia coli (E. coli), en particulier les urogrogénes E. coli (UPEC), sont la principale cause de prostatite^{bactérienne 8,9}.

La recherche sur les mécanismes moléculaires de l’infection prostatique reste limitée par l’absence de modèles in vitro physiologiquement pertinents. La plupart des études sur la maladie de la prostate se sont traditionnellement appuyées sur des lignées cellulaires ou des modèles animaux. En particulier, des lignées cellulaires cancéreuses ou transformées telles que LNCaP ou RWPE-1 ont été largement utilisées pour modéliser la maladie de la prostate et la réponse au^traitement 10,11,12,13. Cependant, ces modèles manquent de composition cellulaire et de complexité d’un épithélium prostatique sain ou cancéreux. De plus, de nombreuses autres études ont utilisé des modèles animaux (principalement des modèles murins) pour étudier différentes hypothèses concernant l’infection de la prostate, la réponse immunitaire, la croissance de tumeurs prostatiques et^{la métastase} 14,15,16,17. Bien que ces modèles aient été les plus avancés et informatifs jusqu’à présent, ils soulèvent généralement des préoccupations éthiques, nécessitent un temps et des ressources considérables, et peuvent être coûteux. Alternativement, les explants tissulaires ex vivo et les cultures cellulaires primaires ont également été utilisés pour des études à court terme sur les réponses tissulaires aux médicaments ou au développement^{cancéreux 18,19,20}. Cependant, ces modèles ont une durée de vie limitée, et la disponibilité de tissus humains frais est souvent restreinte.

Des cultures d’organoïdes tridimensionnelles (3D) dérivées de cellules souches adultes sont apparues comme une alternative prometteuse pour modéliser les tissus épithéliaux in vitro. Contrairement aux lignées cellulaires conventionnelles, les organoïdes conservent des caractéristiques clés de l’épithélium d’origine, telles que l’hétérogénéité cellulaire, l’architecture tissulaire spécifique et les caractéristiques^{fonctionnelles} 21,22,23. Contrairement aux cultures cellulaires primaires ou explants ex vivo, les cultures organoïdes peuvent être étendues et passées sur une longue période sans devenir sénescentes. Ces propriétés rendent les systèmes organoïdes particulièrement adaptés à l’étude des maladies et des interactions hôte-pathogène dans un contexte physiologiquement pertinent. Les organoïdes prostatiques ont été générés à partir de tissus humains sains et cancéreux, ainsi que de modèles murins, et principalement utilisés dans la recherche sur le cancer^{de la prostate 24,25,26}. Néanmoins, pour les études d’infection, la structure 3D des organoïdes représente un défi important, principalement en raison de l’accès limité à la surface cellulaire luminale. Traditionnellement, les organoïdes 3D intacts ont été infectés soit par microinjection de l’agent pathogène, soit en dissociant d’abord l’organoïde en fragments ou cellules uniques avant l’incubation avec le pathogène²³. Ici, la variabilité de taille et de structure 3D peut affecter la reproductibilité et le débit. En alternative, les organoïdes apical-out offrent un moyen de surmonter la limitation de l’inaccessibilité de la lumière. La culture des organoïdes en suspension, soit dans des plaques de culture tissulaire à très faible attachement, soit sur des surfaces recouvertes de tensioactifs non adhésifs, induit une inversion de la polarité organoïde. En conséquence, la surface apicale est orientée vers l’extérieur, permettant un accès direct aux études d’infection par les agents^{pathogènes 27,28}. Cependant, ces cultures ne peuvent pas être maintenues à long terme, et la variabilité de la taille des organoïdes et du nombre de cellules complique la détermination de la multiplicité des infections (MOI). De plus, les mécanismes sous-jacents à l’inversion de polarité et à ses effets sur les cellules organoïdes ne sont pas encore pleinement compris. Pour surmonter les limites des organoïdes comme modèles d’infection in vitro, des modèles organoïdes accessibles apiquement ont été développés à partir d’organoïdes provenant d’organoïdes tels que l’estomac, l’intestin ou^{le poumon 29,30,31}. De tels systèmes préservent les principales caractéristiques épithéliales et permettent une manipulation, une imagerie et une exposition contrôlée plus facilement aux agents pathogènes et/ou aux médicaments. Cependant, les conditions de culture qui permettent la différenciation cellulaire ne se traduisent pas toujours des cultures organoïdes vers les modèles de culture^{2D 31,32}.

Ici, nous décrivons un protocole pour générer un modèle épithélial prostatique accessible apiquement à l’aide d’organoïdes prostatiques de souris. Ce modèle avait été précédemment développé et validé dans notre laboratoire, où nous avons démontré sa forte ressemblance avec le tissu prostatique natif et sa pertinence pour les études de biologie des infections impliquant^{l’UPEC 32}. Le système imite étroitement la composition cellulaire et la polarité de l’épithélium de la prostate tout en offrant une meilleure accessibilité pour une manipulation expérimentale. De plus, nous démontrons son applicabilité à l’étude des interactions hôte-pathogène dans la prostate, offrant une alternative plus facile aux modèles in vivo et un système physiologiquement plus pertinent que les lignées cellulaires conventionnelles ou les modèles organoïdes 3D.

Protocole

Déclaration éthique : Toutes les procédures animales respectaient les directives de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Wurtzbourg et étaient approuvées selon les réglementations institutionnelles et gouvernementales pertinentes. Seules les souris WT euthanasiées dans notre institut par d’autres groupes de recherche à des fins indépendantes ont été utilisées dans cette étude. Aucun animal n’a été sacrifié spécifiquement pour ce travail, conformément aux principes des 3R (remplacement, réduction et affinement).

REMARQUE : Le protocole présenté ici est basé sur une étude antérieure publiée par les^{auteurs 32}. Toutes les étapes décrites ici doivent être effectuées dans un armoire de biosécurité stérile en utilisant les techniques aseptiques applicables et à l’aide d’un équipement de protection individuelle approprié. Les organoïdes prostatiques murines ont été générés à partir de souris C57BL/6 et maintenus en culture 3D, comme décrit^{précédemment 25,26}. Pour suivre les principes des 3R, des prostates de souris ont été données par l’établissement animalier à partir de souris WT naïves non traitées (d’au moins 6 mois) sacrifiées pour d’autres raisons. En résumé, les prostates de souris ont été hachées et digérées en deux étapes à l’aide de collagénase et d’enzyme TrypLE Express. Les cellules ont ensuite été ensemencées dans des gouttes de matrice extracellulaire (ECM) pour générer les organoïdes 3D. Un substrat de culture était ajouté à la culture et renouvelé tous les 3 jours. Les cultures organoïdes 3D étaient passées une fois par semaine et utilisées pour l’ensemencement 2D à partir du passage 3. Des organoïdes prostatiques de souris âgés d’une semaine ont été utilisés pour ensemencer le modèle à base d’organoïdes sur une surface 2D selon le protocole actuel. Le recouvrement des plaques de culture tissulaire avec des protéines ECM n’est pas nécessaire pour ce protocole.

1. Génération du modèle à base d’organoïdes prostatiques

1. Isolation des organoïdes 3D
   1. Aspirez le milieu à partir du nombre désiré d’organoïdes 3D à partir d’une plaque à 24 puits. Remplacez-le par 500 μL d’adDMEM/F12+/+ par puits (voir Tableau des matériaux).
   2. Utilisez une pipette P1000 pour perturber mécaniquement la chute de l’ECM. Collectez la suspension dans un tube conique de 15 mL. Ne collectez qu’un maximum de deux puits par tube.
   3. Rechargez avec adDMEM/F12+/+ jusqu’à 10 mL. Doucement, inversez le tube 3 à 4 fois pour mélanger. Centrifugez à 450 x g pendant 5 minutes à 4 °C.
2. Perturbation organoïde 3D en cellules uniques
   1. Aspirez le surnageant. Resuspendez le pellet dans 2 mL d’enzyme TrypLE Express préchauffée (37 °C), complétée par 10 μM RHOKi.
   2. Incubez dans un bain-marie à 37 °C pendant 15 minutes. Utilisez une pipette P1000 pour mélanger la suspension à cellules toutes les 5 minutes.
      REMARQUE : Vérifiez la suspension cellulaire sous un microscope inversé à l’aide d’un objectif 4x pour vérifier que les cellules sont majoritairement unilatérales. De petits amas de 2 à 3 cellules sont acceptables. En général, 15 minutes d’incubation suffisent, mais cela peut être prolongé si nécessaire.
   3. Ajoute 10 mL d’adDMEM/F12+/+. Doucement, inversez le tube 3 à 4 fois pour mélanger. Centrifugez à 450 x g pendant 5 minutes à 4 °C.
3. Suspension à cellule simple en plaques
   1. Aspirez le surnageant sans déranger la pastille. Resuspendez la granule cellulaire dans un milieu de culture complété avec 10 μM RHOKi (300 μL de milieu de culture par puits d’organoïdes 3D utilisés à l’étape 1.1.1).
      REMARQUE : Le milieu de culture est composé de : Advance Dulbecco’s Modified Eagle Medium/F12, 10 mmol L⁻¹ HEPES, 1x GlutaMAX, 1x B27, 1 mM N-acétylcystéine, 10 % de milieu conditionné Noggin, 10 % de R-spondine, 1 milieu conditionné, 50 ng·^mL-1 EGF, 1 nM 5α-dihydrotestostérone (DHT), 0,2 μM TGFβi, et 100 ng·^mL-1 Primocine ( voir Tableau des matériaux). Pour les expériences d’infection, utilisez un milieu de culture sans Primocine.
   2. Comptez le nombre de cellules dans la suspension à l’aide d’une chambre de comptage de Neubauer.
   3. Diluer la suspension cellulaire dans un milieu de culture complété avec 10 μM de RHOKi pour atteindre une concentration de 62 500 cellules·^mL-1. Utiliser 200 μL de suspension de cellules par puits pour ensemencer sur des plaques à 48 puits (culture tissulaire traitée par le fabricant, voir Tableau des matériaux) ou 300 μL par puits sur des lames μ chambrées (voir Tableau des matériaux). Placez la plaque dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C et 5 % de_CO2.
      REMARQUE : Chaque puits d’organoïdes 3D, utilisé à l’étape 1.1.1. En général donne environ 200 000 cellules.
   4. Après un jour, la plupart des cellules individuelles sont fixées à la surface 2D. Changez le milieu culturel tous les 2-3 jours. La confluence est atteinte en 7 jours.
      REMARQUE : Assurez-vous que RHOKi n’est ajouté que pour le semis initial et non pour les changements ultérieurs de substrat.
4. Différencier le modèle basé sur les organoïdes.
   REMARQUE : Suivez les étapes suivantes pour obtenir un modèle à base d’organoïdes différenciés enrichi par des cellules luminales.
   1. Ajoutez 10 nM de DHT à la suspension de la cellule (étape 1.3.3). Utilisez un substrat de culture complété par 10 nM de DHT pour les changements de milieu ultérieurs (tous les 2-3 jours).
      REMARQUE : Si aucune DHT n’est ajoutée à la suspension cellulaire (et les changements de milieu qui s’ensuivent), le modèle à base d’organoïdes sera enrichi en cellules basales.

2. Mesures de résistance électrique transépithéliale (TEER)

1. Semez la suspension des cellules organoïdes à une concentration de 62 500 cellules·^mL-1, en utilisant 300 μL (obtenu à l’étape 1.3.3) sur une diapositive PET μ 8 puits avec 40 électrodes par puits ( voir Tableau des matériaux). Ajouter 300 μL de milieu de culture, décrit dans 1.3.1, à l’un des puits sans cellules.
   REMARQUE : Le puits sans cellules est utilisé comme espace blanc pour les mesures.
2. Reliez la lame μ au système d’analyse cellulaire basé sur l’impédance (voir Tableau des matériaux) avec la station à 16 puits placée à l’intérieur d’un incubateur de culture tissulaire. Mesurez le TEER à 400 Hz pendant 7 jours. Changez le milieu culturel tous les 2-3 jours.

3. Coloration par immunofluorescence

REMARQUE : Pour cette méthode, assurez-vous que les cellules sont ensemencées dans des lames μ à chambre (voir Tableau des matériaux), compatibles avec les applications de microscopie haute résolution.

1. Au moment choisi, retirez le substrat et lavez les cellules 3 fois avec 1x PBS. Fixez les cellules avec du paraformodéhyde (PFA) à 4 % pendant 15 minutes à température ambiante (éviter l’exposition à la lumière).
   ATTENTION : Le paraformoldéhyde à 4 % peut provoquer une réaction allergique cutanée, des lésions oculaires graves et est suspecté de provoquer un cancer. Utilisez toujours un équipement de protection individuelle (EPI) approprié. Évitez l’inhalation de poussière, de vapeurs, de gaz, de brumes, de vapeurs ou de pulvérisations. Portez des gants de protection et assurez-vous que les vêtements contaminés restent dans le laboratoire jusqu’à ce qu’ils soient correctement décontaminés. Éliminez le contenu et les contenants par l’intermédiaire d’un centre d’élimination des déchets agréé.
2. Après fixation, lavez les cellules 3 fois avec 1 PBS (5 min chacun). Perméabiliser les cellules avec 0,5 % de Triton X-100 (voir Tableau des matériaux) pendant 15 minutes à température ambiante.
   ATTENTION : Le Triton X-100 provoque des irritations cutanées et de graves dommages oculaires. Il est très toxique pour la vie aquatique avec des effets durables et peut provoquer des perturbations endocriniennes de l’environnement. Lors de la manipulation, portez des gants de protection, des protections oculaires et faciales. Éliminez le contenu et les contenants par l’intermédiaire d’un centre d’élimination des déchets agréé. Évitez de les relâcher dans l’environnement.
3. Lavez les cellules deux fois avec 1 PBS (5 min chacun). Bloquez les cellules avec un tampon de blocage (1 % de BSA dans PBS, voir Tableau des matériaux) pendant 30 minutes à température ambiante.
4. Diluez les anticorps primaires dans le tampon bloquant (1 % de BSA dans 1x PBS) et incubez avec les cellules pendant la nuit à 4 °C sur une plateforme oscillante. Le lendemain, couver 1 h à température ambiante. (voir le tableau des matériaux pour les dilutions des anticorps).
   REMARQUE : Pour la coloration de la F-actine avec de la phalloïdine ou de la membrane plasmique avec CellMask ( voir Tableau des matériaux), sautez l’étape 3.4.
5. Lavez les cellules 3 fois avec 1 PBS (5 min chacun). Diluez les anticorps secondaires, la phalloïdine ou CellMask (voir le tableau des matériaux) dans un tampon de blocage (1 % de BSA dans 1x PBS) et incubez avec les cellules 1 heure à température ambiante.
6. Lavez les cellules 3 fois avec 1 PBS (5 min chacun). Incubez les cellules 15 minutes à température ambiante avec du Hoechst (voir Tableau des matériaux) dilué dans 1x PBS pour colorer les noyaux.
7. Lavez les cellules 3 fois avec 1 PBS (5 min chacun) et laissez les cellules avec 1x PBS. Conserver à 4 °C.
8. Imagez les lames de μ à chambre (voir Tableau des matériaux) dans une microscopie confocale à balayage laser ou un microscope à fluorescence.
   REMARQUE : Des images d’ensemble peuvent être obtenues à l’aide d’un objectif 20x sur un microscope à fluorescence pour évaluer l’efficacité globale et la distribution de l’infection. Des images à plus haute résolution ont été obtenues à l’aide d’un microscope confocal équipé d’un objectif d’immersion dans l’eau 40x pour visualiser des bactéries individuelles attachées ou internalisées dans les cellules épithéliales. Les fluorophores étaient excités à l’aide de lignes laser à 405, 499, 590 et 653 nm, selon les fluorophores utilisés. L’émission a été détectée avec des fenêtres d’émission réglées à 415 à 516 nm pour Hoechst, 509 à 573 nm pour GFP ou Alexa 488, 600 à 651 nm pour mcherry ou Alexa 594, et 663 à 720 nm pour Alexa 647. Les piles Z ont été acquises avec une taille de pas de 0,5 μm et couvrant toute l’épaisseur de la couche épithélienne. Les images étaient acquises à une résolution de 1024 par 1024 pixels, avec une fréquence de balayage de 400 Hz et une moyenne d’images fixée à 4, ce qui offre une bonne qualité d’image. La puissance du laser et le gain du détecteur ont été maintenus constants dans toutes les conditions au sein de la même expérience. Tous les paramètres d’imagerie, y compris la puissance du laser, le gain du détecteur, la vitesse de balayage et la moyenne, doivent être optimisés et ajustés selon les besoins du microscope confocal utilisé.

4. Infection bactérienne par E. coli uropathogène (UPEC)

REMARQUE : Veillez à utiliser un modèle à base d’organoïdes maintenu pendant 7 jours sans Primocine (voir Tableau des matériaux) pour les étapes suivantes.

La souche uropathogène d’E. coli UTI89, exprimant constitutivement une protéine mCherry à partir du plasmide pFPV-mCherry (résistante à l’ampicilline), a été utilisée dans cette étude.

ATTENTION : Lors de la manipulation d’agents pathogènes infectieux (niveau de biosécurité 2), portez des gants et une protection appropriée pour les yeux et le visage. Portez toujours une blouse de laboratoire entièrement boutonnée. Effectuer toutes les procédures au sein d’un cabinet de sécurité biologique certifié. Décontaminez les surfaces de travail et lavez-vous soigneusement les mains après avoir manipulé des matériaux biologiques. Collectez les déchets BSL-2 dans des contenants biohazard désignés adaptés à l’autoclavage. Décontaminez les déchets avant leur élimination par autoclavage ou autre méthode de décontamination appropriée.

1. Trois jours avant l’expérience d’infection, étirez la souche UPEC sur une plaque agar LB complétée avec l’antibiotique correspondant (ampicilline 100 μg·^mL-1 utilisée dans ce protocole) et incubez 16 à 24 heures à 37 °C.
   ATTENTION : Certains antibiotiques peuvent provoquer des réactions allergiques ou des irritations au contact et contribuer à la résistance aux antimicrobiens s’ils sont mal jetés. Préparez toujours et ajoutez les antibiotiques dans une armoire de sécurité biologique tout en portant un équipement de protection individuelle approprié (gants et protection oculaire). Éliminez les solutions contenant des antibiotiques sous forme de déchets chimiques via une installation agréée pour l’élimination des déchets.
2. Deux jours avant l’expérience d’infection, inoculez 3 mL de bouillon LB complétés avec l’antibiotique correspondant (ampicilline 100 μg·^mL-1) à l’aide d’une seule colonie UPEC de la plaque d’agar (étape 4.1). Incubez statiquement à 37 °C pendant 12 à 16 heures.
3. Un jour avant l’expérience d’infection, faites un vortex de la culture bactérienne de l’étape 4.2 et mesurez son OD₆₀₀. Calculez le volume de cette culture nécessaire pour inoculer 3 mL de bouillon LB complétés d’ampicilline (100 μg·^mL-1) pour un OD_{initial de 600} de 0,05 en utilisant la formule suivante : Volume (μL) = (0,05 * 3 000 μL) / OD_{mesuré 600}. Ajoutez le volume calculé de la culture à partir de l’étape 4.2. au bouillon LB frais et incuber statiquement à 37 °C pendant 24 heures.
   REMARQUE : Le OD₆₀₀ de la culture nocturne de l’étape 4.2 devrait se situer entre 1,7 et 2,2.
4. Le jour de l’infection, il faut manipuler la culture bactérienne à partir de l’étape 4.3 et mesurer son OD₆₀₀. Récoltez OD₆₀₀₁ de la culture, puis centrifugez à 12 000 x g pendant 2 minutes à température ambiante. Retirez le surnageant.
5. Resuspendez dans 1 mL de milieu organoïde sans primocine sans DHT. Diluez à un MOI de 100.
   REMARQUE : Chaque puits d’une plaque de 48 puits est considéré comme ayant environ 150 000 cellules au jour 7. Cette estimation a été obtenue en comptant les cellules bien avant l’infection à travers plusieurs expériences. Pour ajuster précisément le MOI, il est recommandé de semer un puits supplémentaire pour le comptage cellulaire avant l’infection. Pour déterminer le volume de suspension bactérienne requis (étape 4.4), multipliez le nombre de cellules par puits par le MOI afin d’obtenir le nombre total de bactéries nécessaires par puits, puis divisez ce nombre par la concentration bactérienne (8 × 10⁵ bactéries/μL) pour obtenir le volume en μL.
6. Remplacer le milieu de culture du modèle à base d’organoïdes par un milieu de culture contenant des bactéries. Ajustez le volume selon la surface de culture : utilisez 200 μL par puits pour les plaques à 48 puits et 300 μL par puits pour les lames de μ. Incubez pendant 1 heure dans un incubateur en culture cellulaire à 37 °C et 5 % de_CO2.
7. Après la période d’incubation, aspirez le milieu contenant des bactéries à partir du modèle organoïde. Lavez le puits 3 fois avec de l’adDMEM/F12+/+ pour éliminer les bactéries extracellulaires.
8. Ajoutez un milieu de culture contenant 50 μg·^mL-1 gentamicine pour tuer les bactéries extracellulaires. Incubez-le pendant 30 minutes.
   REMARQUE : La concentration de gentamicine peut devoir être ajustée en fonction de la souche bactérienne utilisée. Si une concentration supérieure à 50 μg·^mL-1 est recommandée, il est recommandé de vérifier la cytotoxicité cellulaire.
9. Retirez le médium et remplacez-le par un substrat frais complété avec 10 μg·^mL-1 gentamicine pendant le reste de l’infection.
   Traiter les cellules infectées pour la coloration par fluorescence, en suivant la section 3, ou pour la quantification par cytométrie en flux, en suivant la section 5.

5. Quantification de l’infection par cytométrie en flux

1. Aspirez le milieu de culture et lavez les cellules 3 fois avec 1x PBS. Utilisez 100 μL d’enzyme expresse de TrypLE pour détacher les cellules. Incubez pendant 5 à 10 minutes jusqu’à ce que toutes les cellules soient détachées.
   REMARQUE : Un puits provenant d’une plaque à 48 puits est suffisant par condition.
2. Récupérez la suspension de la cellule et transférez-la dans un puits d’une plaque à 96 puits (fond conique). Ajoutez 100 μL de tampon de cytomètre à flux (1x PBS, 10 % FBS, 5 mM EDTA) par-dessus pour inactiver l’enzyme TrypLE Express.
3. Centrifugez la plaque de 96 puits à 450 x g pendant 5 minutes à 4 °C. Retirez le surnageant et resuspendez la pellete dans 150 μL de tampon de cytomètre à débit.
4. Acquérir et quantifier les cellules infectées à l’aide du cytomètre en flux (voir Tableau des matériaux).
   REMARQUE : La cytométrie en flux a été réalisée à l’aide d’un laser d’excitation de 488 nm et d’un filtre d’émission de 615/20 nm pour la détection des cellules mCherry-positive. Les données ont été acquises à un débit élevé (66 μL·min⁻¹), collectant au moins 10 000 événements par échantillon et n’incluant que les événements avec des valeurs de hauteur de diffusion avant supérieures à 80 000. Les cellules infectées ont été identifiées sur la base de la fluorescence de mCherry par rapport à un contrôle non infecté (naïf), après exclusion de débris et de doublets. Un marqueur de viabilité (par exemple, iodure de propidium ou d’autres colorations vivantes/mortes) peut être inclus dans la stratégie de verrouillage pour évaluer la viabilité cellulaire. Cela peut être particulièrement utile lors du premier travail avec le modèle afin de s’assurer que la dissociation cellulaire n’affecte pas négativement les cellules.

Résultats

Ce protocole décrit la génération d’un modèle organoïde de l’épithélium de la prostate de la souris qui récapitule le type cellulaire et l’expression transcriptionnelle du compartiment épithélial du tissu natif. Ce modèle est généré à partir d’organoïdes 3D de cellules souches adultes issus de tissu prostatique de souris adulte. Ces cultures organoïdes sont ensuite maintenues en culture et traitées chaque semaine. Pour le modèle basé sur les organoïdes, la première étape du flux de travail (Figure 1A) commence par l’utilisation d’organoïdes 3D vieux de 7 jours. Cette période est nécessaire pour qu’ils atteignent une taille et une densité cellulaire appropriées pour un ensemencement ultérieur sur une surface 2D. Après le passage, de petits fragments d’organoïdes (Figure 1B, jour 0) ont été ensemencés dans la MCE et laissés croître. Au fil du temps, elles deviennent de grandes structures sphériques avec une lumière interne définie au jour 7 (Figure 1B). Après avoir dissocié les organoïdes âgés de 7 jours en cellules uniques, les cellules ont été ensemencées sur une plaque traitée en culture tissulaire (Figure 1C, jour 0) en utilisant le même milieu de culture que pour les cultures organoïdes 3D (1nM DHT) pour former une monocouche. Dès le premier jour, les cellules adhérées avaient commencé à proliférer. Au cours des jours suivants, la monocouche s’est étendue et a atteint la confluence entre le jour 3 et le jour 5, comme l’a observé la microscopie en champ clair (Figure 1C). Pour caractériser les changements morphologiques au fil du temps et surveiller le moment où le modèle à base d’organoïdes atteint la confluence, nous avons coloré la membrane plasmique avec CellMask et réalisé des images de fluorescence à plusieurs moments (Figure 1D).

Parce que la signalisation des récepteurs androgènes (RA) est un régulateur clé de la différenciation cellulaire dans la prostate, et que la modulation de la concentration de testostérone (ou DHT) dans le milieu de culture organoïde a permis de diriger la différenciation des cellules souches en cellules basales ou^{luminales 32}, nous avons ajusté les niveaux de DHT dans le milieu de culture pour favoriser l’enrichissement des cellules luminales (DHT 10 nM) ou des cellules basales (sans DHT, Contrôle ; Méthode1, Figure 2A). Comme le montre la Figure 2 (B-F), aucune différence majeure n’a été observée dans la croissance ou la confluence cellulaire. Comme prévu, dans la condition témoin (milieu de culture organoïde sans DHT), la plupart des cellules exprimaient de la cytokératine 5 (KRT5), un marqueur des cellules souches basales prostatiques (Figure 2B,E). En revanche, seules quelques cellules exprimaient de faibles niveaux de CD24a, un marqueur différencié des cellules prostatiques luminales (Figure 2B,F).

La supplémentation avec 1 nM de DHT, comme nous l’avons décrit^{précédemment avec 32}, a donné une population mixte comprenant à la fois des cellules basales et luminales. Cependant, l’expression de CD24a est restée faible, indiquant une différenciation incomplète en cellules luminales (Figure 2C,F³²). L’augmentation de la DHT à 10 nM favorisait la différenciation complète des cellules luminales tout en conservant certaines cellules basales après 7 jours de culture (Figure 2D-F). La différenciation des modèles basés sur les organoïdes peut également être évaluée par microscopie en champ clair. Bien que les différences entre les conditions ne soient pas très claires lorsque les cellules sont clairsemées (jour 0 - 5, Figure 1C, Figure supplémentaire 1A), la morphologie et l’apparence cellulaires deviennent distinctes et visibles entre les trois conditions de culture par microscopie de champ clair au jour 7 (Figure 1C, Figure supplémentaire 1A,B). En l’absence de DHT, les cellules apparaissaient plus plates et de forme plus irrégulière, tandis que dans la DHT à 10 nM, les cellules étaient étroitement compactées avec une disposition polygonale, rappelant une morphologie pavée (Figure supplémentaire 1B).

Notamment, les cultures organoïdes 3D subissent également des changements morphologiques lorsqu’elles sont cultivées à différentes concentrations de DHT. Plus précisément, une augmentation nette de la taille organoïde dépendante de la dose a été observée, les plus grands organoïdes se formant en présence de 10 nM de DHT (Figure 1B, Figure supplémentaire 2A,B). Ces résultats indiquent que la voie de l’AR est essentielle non seulement pour la différenciation cellulaire, mais aussi pour la modulation de la dynamique de croissance des organoïdes prostatiques de souris.

Pour évaluer l’intégrité épithéliale et la polarisation des modèles, nous avons réalisé des mesures de résistance électrique transépithéliale (TEER) dans le modèle à base d’organoïdes cultivé avec ou sans DHT de 10 nM. Les valeurs de TEER ont augmenté au fil du temps dans les deux conditions mais étaient nettement plus élevées en présence de 10 nM de DHT (Figure 3A), indiquant une fonction de barrière épithéliale améliorée. Ces résultats ont été confirmés par la coloration par phalloïdine des filaments d’actine, généralement organisés en anneau apical aux jonctions cellule-cellule des cellules épithéliales luminales de la prostate. Dans la condition DHT à 10 nM, l’anneau actinique semblait plus défini que le témoin, ce qui correspondait à une polarité cellulaire accrue et à une organisation épithéliale accrue (Figure 3B). De plus, l’immunocoloration pour zonula occludens 1 (ZO-1) a révélé une augmentation des jonctions serrées dans la condition DHT à 10 nM (Figure 3C), soutenant ainsi l’intégrité et la différenciation de la barrière épithéliale renforcée vers un phénotype luminal. Les projections orthogonales révèlent que les organoïdes cultivés avec 10 nM de DHT présentent une polarité épithéliale bien définie (Figure complémentaire 3A). Les cellules basales KRT5⁺ sont situées au fond, et les cellules luminales CD24a⁺ sont réparties le long de la couche épithéliale, montrant une intensité de coloration plus forte vers le côté apical. Cette architecture est similaire à celle observée dans le tissu prostatique de la souris (Figure complémentaire 3B). À noter, les données de l’Atlas des protéines humaines montrent que ces marqueurs ont une localisation comparable dans le tissu prostatique humain, avec des cellules basales KRT5⁺ sous-jacentes à une couche luminale CD24a⁺ (Figure supplémentaire 3C)³³. En revanche, les cellules cultivées sous contrôle ou en conditions DHT de 1 nM ne montrent pas de séparation spatiale claire entre les marqueurs basaux et luminaux, et la hauteur des cellules était bien inférieure à celle de la condition de 10 nM (Figure supplémentaire 3A). Cela indique que la supplémentation en DHT à 10 nM favorise la différenciation et la polarisation épithéliales dans le modèle 2D d’une manière comparable à l’épithélium prostatique natif. Puisque le modèle à base d’organoïdes cultivé avec 10 nM DHT ressemble étroitement à l’épithélium prostatique natif de la souris (Figure 2D, Figure supplémentaire 3A,B), il constitue une plateforme pertinente pour étudier les interactions hôte-pathogène. Pour démontrer l’applicabilité du modèle, nous avons utilisé des infections avec l’UPEC, en particulier la souche UTI89, l’une des souches UPEC les plus couramment utilisées dans le champ des voies génitourinaires, par exemple. Comme montré à la Figure 4A, les bactéries ont été cultivées dans un bouillon LB pendant 24 heures (comme décrit dans la Méthode 4) et incubées avec les cellules pendant une heure. Les bactéries extracellulaires étaient ensuite éliminées par la gentamicine pour quantifier l’invasion et la réplication intracellulaire. À l’infection du modèle à base d’organoïdes, l’UPEC a adhéré aux cellules épithéliales en grand nombre (0 hpi ; Figure 4B, panneau de gauche ; Figure 4C). Ensuite, et après le traitement à la gentamicine (1 hpi), le nombre de cellules UPEC-positives a significativement diminué, en raison de la mort des bactéries extracellulaires (Figure 4B, panneau central ; Figure 4C). À 24 hpi, le nombre de cellules infectées est resté inchangé (Figure 4C), cependant, l’imagerie par microscopie confocale a montré que les bactéries intracellulaires continuaient de se répliquer, formant des structures en forme de communauté, similaires à celles décrites précédemment dans l’épithélium de la vessie (Figure 4B, panneau droit). Les cellules infectées ont été identifiées par fluorescence mCherry en utilisant des contrôles non infectés (naïfs) comme référence, après exclusion de débris et de doublets (Figure supplémentaire 4).

Figure 1 : Aperçu du flux de travail et de l’évolution morphologique des organoïdes prostatiques et des modèles basés sur les organoïdes au fil du temps. (A) Représentation schématique du flux de travail expérimental (Méthode 1). (B) Images en champ clair montrant le développement morphologique des organoïdes prostatiques complétés par une DHT de 1 nM, capturée aux jours 0, 1, 3, 5 et 7 (de gauche à droite). Barre-échelle : 200 μm. (n = 3). (C) Images en champ clair du modèle à base d’organoïdes complétées par une DHT de 1 nM, capturées aux jours 0, 1, 3, 5 et 7 (de gauche à droite). Barre-échelle : 200 μm. (n = 3). (D) Images microscopiques d’immunofluorescence représentatives du modèle à base d’organoïdes, complétées avec 1 nM de DHT et colorées avec CellMask (rouge), aux jours 1, 3, 5 et 7 (de gauche à droite). Les noyaux ont été contre-colorés à l’aide de Hoechst 33342 (bleu). Barre d’échelle : 50 μm. (n = 3) Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : La DHT module la différenciation de la lignée dans le modèle à base d’organoïdes. (A) Représentation schématique des différentes conditions utilisées pour la différentiation. (B-D) Images microscopiques par immunofluorescence représentatives du modèle à base d’organoïdes cultivées pendant 7 jours en l’absence (Ctrl) ou en présence de (C) 1 nM ou (D) 10 nM de DHT. Des images ont été prises aux jours 1, 3, 5 et 7 (de gauche à droite). Les modèles à base d’organoïdes ont été colorés pour CD24a (marqueur cellulaire luminal, vert) et KRT5 (marqueur des cellules basales, magenta). Les noyaux ont été contre-colorés à l’aide de Hoechst 33342 (bleu). Barre-échelle : 50 μm. (n = 4). (E,F) Quantification d’image des cellules (E) KRT5⁺ et (F) CD24a⁺ dans le modèle à base d’organoïdes cultivé sans DHT (Ctrl), 1nM ou 10nM. Les données sont affichées en pourcentage de cellules positives par champ de vision. Test statistique : ANOVA unidirectionnelle avec le test post hoc de Tukey. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Le modèle à base d’organoïdes différencié avec une DHT de 10 nM présente une polarisation cellulaire plus élevée que le témoin. (A) Analyse TEER du modèle à base d’organoïdes cultivé pendant 7 jours en l’absence (Ctrl ; rose) et en présence de DHT (10 nM ; vert). Les barres d’erreur représentent SD (n = 3). Test statistique : ANOVA unidirectionnelle avec le test post hoc de Tukey. (B,C) Images microscopiques d’immunofluorescence représentatives du modèle à base d’organoïdes cultivées pendant 7 jours sans (Ctrl ; haut) ou avec 10 nM DHT (en bas) et colorées pour (B) F-actine (rouge) et (C) ZO-1 (rouge). Les noyaux ont été contre-colorés à l’aide de Hoechst 33342 (bleu). Barre d’échelle : 50 μm. (n = 3) Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Analyse de la dynamique des infections dans le modèle à base d’organoïdes. (A) Représentation schématique du protocole d’infection (section 4). (B) Images représentatives de microscopie immunofluorescence montrant le modèle organoïde infecté à 0, 1 et 24 h après l’infection (hpi ; de gauche à droite). L’UPEC est visualisée en rouge. Les noyaux ont été contre-colorés à l’aide de Hoechst 33342 (bleu). Barre-échelle : 50 μm. (n = 3). (C) Analyse par cytométrie en flux des cellules UPEC-positives (mCherry positives, cellules infectées) à 0, 1 et 24 hpi. La stratégie de barrage est présentée dans la Figure 4 supplémentaire. Les barres d’erreur représentent le SEM (n = 3). Test statistique : ANOVA unidirectionnelle avec le test post hoc de Tukey. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure supplémentaire 1 : Évolution morphologique du modèle basé sur les organoïdes au fil du temps. (A,B) Images en champ clair du modèle à base d’organoïdes en présence (A) absence (Ctrl) et (B) de 10 nM DHT, capturées aux jours 0, 1, 3, 5 et 7 (de gauche à droite). Barre d’échelle : 200 μm. (n = 3) Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : La concentration de DHT affecte la croissance organoïde prostatique 3D. (A) Images en champ clair du modèle à base d’organoïdes en l’absence (Ctrl ; haut) et en présence de 10 nM DHT (en bas), imagées aux jours 0, 1, 3, 5 et 7 (de gauche à droite). Barre-échelle : 200 μm. (n = 3). (B) Quantification de la taille organique 3D au jour 7 cultivée dans les trois conditions différentes : pas de DHT (Ctrl ; rose), 1 nM DHT (violet) et 10 nM DHT (vert). Test statistique : ANOVA unidirectionnelle avec le test post hoc de Tukey (n = 3). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure complémentaire 3 : Caractérisation de la morphologie organoïde prostatique et de la polarité épithéliale. (A) Projections orthogonales de piles z confocaux illustrant l’organisation épithéliale et la polarité apicale-basale sous différentes concentrations de DHT (Ctrl, 1 nM et 10 nM DHT). Les cellules basales ont été colorées pour KRT5 (magenta) et les cellules luminales pour CD24a (vert). Barre d’échelle : 50 μm.(B) Coloration immunofluorescence du tissu prostatique de souris embussé en OCT montrant des marqueurs épithéliaux basaux (KRT5, magenta) et luminaux (CD24a, vert). Les noyaux sont contre-colorés avec du DAPI (bleu). Barre d’échelle : 50 μm. En résumé, les morceaux de tissu de souris ont été fixés avec 4 % de PFA, déshydratés pendant la nuit avec 30 % de saccharose, et³² % d’OCT incrustés. Les lames ont ensuite été réhydratées dans le PBS pendant 10 minutes et immunocolorées après la section 3. (C) Analyse immunohistochimique de l’expression des protéines CD24a et KRT5 dans le tissu prostatique humain (le panel C a été extrait de la base de données The Human Protein Atlas (version 25.0 ; Human Protein Atlas proteinatlas.org), Uhlén, M. et al. (2015)³³, https://www.proteinatlas.org/ENSG00000186081-KRT5/tissue/prostate). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 4 complémentaire : Stratégie de contrôle de cytométrie en flux pour identifier les cellules infectées. Les cellules ont d’abord été verrouillées en fonction de la hauteur de diffusion latérale (SSC-H) versus la hauteur de diffusion avant (FSC-H) pour exclure les débris, suivies de la barrière sur SSC-H versus zone de diffusion latérale (SSC-A) pour sélectionner des cellules uniques. Les cellules mCherry-positives (infectées) ont ensuite été identifiées à l’aide de Comptages versus fluorescence PE-Texas Red-H (Histogramme). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Une gamme de maladies peut affecter la prostate, notamment l’hyperplasie bénigne de la prostate, la prostatite et le cancer de la prostate. Ces maladies sont très répandues et influencent significativement la qualité de vie des^{patients 2}. Malgré leur impact significatif sur les soins de santé, notre compréhension de ces maladies, en particulier des mécanismes sous-jacents et des réponses de l’hôte dans les affections non cancéreuses, reste limitée. Cela s’explique en grande partie par l’absence de modèles expérimentaux physiologiquement pertinents. D’une part, les lignées cellulaires immortalisées ne capturent pas la complexité ou le statut de différenciation de l’épithélium prostatique normal. En revanche, les modèles animaux, principalement les rongeurs, soulèvent des préoccupations éthiques et ne sont pas rentables. Une approche alternative consiste à utiliser des cellules primaires humaines ou des explants tissulaires dérivés du patient. Cependant, la disponibilité limitée de tissu prostatique frais limite leur large application. Ces limitations soulignent la nécessité d’autres systèmes in vitro qui soient physiologiquement pertinents, faciles à utiliser et expérimentalement gérables. Dans ce contexte, la technologie des organoïdes des cellules souches adultes a transformé la modélisation des maladies. Ces cultures 3D ont la capacité de s’auto-organiser, préservant l’identité épithéliale et la diversité cellulaire^{épithéliale} 23,34,35,36,37,38. Bien que leur architecture 3D ait permis des applications dans la recherche sur le cancer, les tests de médicaments et la médecine^{régénérative} 23,34,35,36,37,38,39,40,41, leur structure fermée, avec la surface apicale orientée vers l’intérieur, pose des défis pratiques pour l’accès expérimental, notamment en tant que in vitro Modèles d’infection. Les organoïdes apical-out répondent à cette limitation en inversant la polarité épithéliale, exposant la surface apicale pour des études d’infection^{directe 27,28}. Cependant, leur efficacité en tant que modèle d’infection peut être limitée par la variabilité de leur taille, une exposition inégale aux agents pathogènes et la fragilité lors d’une infection à long terme.

Ici, nous présentons un protocole pour générer un modèle organoïde de la prostate de souris qui récapitule la composition cellulaire épithéliale et le profil transcriptionnel de l’épithélium murin natif, tout en offrant un accès facile à la surface apicale. Optimisé dans nos travaux^{précédents 32}, ce modèle permet un contrôle précis des variables expérimentales clés, notamment la densité d’ensemencement, l’exposition uniforme aux stimuli, les ratios bactéries/cellules (MOI) définis et des paramètres d’imagerie à haut débit souvent difficiles à standardiser dans les systèmes organoïdes 3D conventionnels.

Conformément au principe des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) pour l’expérimentation^{animale 42}, les organoïdes utilisés comme source de cellules primaires pour ce modèle proviennent de souris naïves de type sauvage sacrifiées à des fins non liées, comme la reproduction. Les prostates sont obtenues grâce à des dons des installations animales voisines, réduisant ainsi le besoin de sacrifier des animaux supplémentaires spécifiquement pour ce protocole.

Une différenciation robuste et fiable des organoïdes et des modèles basés sur les organoïdes est essentielle pour reproduire fidèlement la composition cellulaire et les caractéristiques fonctionnelles des tissus natifs, garantissant leur pertinence en tant que modèles in vitro. La différenciation cellulaire au sein des organoïdes est fortement influencée par la composition spécifique du milieu de culture, y compris les concentrations précises de facteurs de croissance et d’agents pharmacologiques (c’est-à-dire les inhibiteurs de médicaments). La manipulation de ces facteurs permet une différenciation directe vers des lignées cellulaires spécifiques, comme le démontrent divers systèmes organoïdes. Par exemple, chez les organoïdes intestinaux, l’élimination de la WNT favorise la différenciation des entérocytes, qui peut être renforcée par l’interféron gamma (revu dans³⁸). La différenciation en cellules goblet peut être obtenue par la suppression de l’inhibiteur de p38 et de la nicotinamide ou par inhibition de Notch via DAPT/DBZ (révisé dans³⁸). Il a également été démontré que l’IGF-1 et le FGF-2 soutiennent une expansion à long terme des cultures enrichies par cellules^{sécrétrices 43}. De plus, l’IL-22 améliore la différenciation des cellules Paneth, et les cellules entéroendocrines apparaissent par l’inhibition de voies telles que Notch et BMP³⁸. De même, les organoïdes gastriques et les monocouches organoïdes présentent une différenciation vers les cellules pit lorsque la WNT est retirée du milieu de culture, tandis que l’ajout de nicotinamide au milieu dirige les cellules vers un phénotype des glandes (cellules du cou et ^principales)31,44,45.

Dans la prostate, le récepteur aux androgènes (RA) joue un rôle crucial dans le maintien de l’homéostasie^tissulaire 46,47,48,49. La testostérone, produite par les cellules de Leydig dans les testicules, est convertie en DHT dans les cellules épithéliales prostatales par la 5α-réductase. La DHT active la RA, qui dimérise, transloce vers le noyau et se lie aux éléments de réponse androgène pour réguler les gènes impliqués dans la différenciation cellulaire et l’homéostasie⁵⁰. Des études antérieures ont montré que la supplémentation de 1 nM dans des organoïdes prostataux de souris 3D est suffisante pour obtenir la différenciation cellulaire en cellules^{luminales 51}. D’autres ont également montré que la supplémentation en vitamine D (en particulier 1,25-dihydroxyvitamine D) favorisait la croissance des organoïdes prostatiques humains et accélérait la différenciation en inhibant l’activité canonique de la WNT et en supprimant le membre de la famille WNT^{DKK3 52}. Cependant, dans ces études, seuls des organoïdes 3D ont été utilisés. Nos travaux^{précédents 32} et d’autres⁵³ ont montré que la supplémentation en DHT à 10 nM dans des organoïdes 3D n’est pas suffisante pour obtenir une différenciation complète. En revanche, l’utilisation du modèle 2D décrit ici, c’est-à-dire l’ensemencement des cellules en 2D avec 10 nM de DHT, est suffisante pour différencier le modèle à un état similaire au tissu^{natif 32}. Pour comprendre cette différence entre les modèles 3D et 2D, des travaux supplémentaires seront nécessaires, mais cela pourrait s’expliquer par les différents indices mécano-physiques entre les systèmes ou par la présence de facteurs de croissance contenant des ECM dans le modèle 3D.

Trois principaux types de cellules épithéliales se trouvent dans le tissu prostatique adulte : les cellules luminales, basales et neuroendocrines. Parmi celles-ci, seules les cellules luminales et basales sont présentes dans tous les modèles organoïdes publiés à ce jour. L’absence de cellules neuroendocriniennes rares suggère que les protocoles organoïdes actuels pourraient ne pas être totalement optimisés. Entre les cellules luminales et basales, une population cellulaire intermédiaire prostatique a également été décrite comme un état de transition exprimant à la fois des marqueurs luminaux (c’est-à-dire CD24a) et basaux (c’est-à-dire SCA-1)^18,51. Cette sous-population se trouve souvent dans la région périurétrale de la prostate, c’est pourquoi elle est fréquemment appelée cellules luminales^{périurétrales 54}. Bien que cela ait été rapporté dans certains systèmes organoïdes 3D sous des conditions spécifiques de différenciation ou de^{signalisation 53,55}, nous n’observons pas de séparation claire entre les cellules luminales et intermédiaires dans notre^{système 32}. Une explication possible est que, lors de la génération d’organoïdes 3D, nous ne faisons pas de distinction entre les différentes régions prostataires et, pour éviter la contamination par les cellules urétrales, nous retirons le tissu directement adjacent à la connexion urétrale-prostate. Par conséquent, les cultures organoïdes issues de régions proximales ou adjacentes à l’urètre sont probablement plus capables de générer des cellules intermédiaires.

L’intégrité de la barrière est considérée comme une caractéristique d’un épithélium mature et différencié, fournissant une barrière protectrice contre les toxines et microbes atteignant le tissu sous-jacent. Les jonctions serrées (riches en protéines^{ZO-1 56}) jouent un rôle essentiel dans la régulation de la perméabilité paracellulaire et le maintien de l’intégrité de la barrière^{épithéliale 57}. À mesure que les cellules épithéliales se différencient, la maturation de ces jonctions intercellulaires renforce la barrière⁵⁸. Ainsi, l’évaluation de l’intégrité de la barrière est un indicateur important pour un modèle épithélial in vitro . Dans ce protocole, nous montrons trois méthodes complémentaires pour évaluer l’intégrité de la barrière : la mesure du TEER, l’immunocoloration ZO-1 et la coloration F-actine. Bien que les trois méthodes évaluent efficacement l’intégrité des barrières, elles diffèrent significativement par l’équipement et les ressources nécessaires. Les mesures TEER fournissent une valeur quantitative pouvant être suivie dans le temps, offrant une compréhension dynamique de la fonction de la barrière ; cependant, cette technique nécessite du matériel et des logiciels spécialisés qui ne sont pas toujours disponibles dans tous les laboratoires. En revanche, la coloration avec des anticorps anti-ZO-1 ou la phalloïdine est beaucoup plus gérable en termes de temps et de coût (par exemple, la coloration à la phalloïdine peut être effectuée en environ 3 heures - section 3).

Ce protocole décrit comment utiliser des organoïdes prostatiques de souris 3D pour générer un modèle 2D accessible apicalement. Plusieurs revues ont exposé les avantages et les inconvénients des organoïdes et des systèmes basés sur les organoïdes dans l’étude des interactions hôte-pathogène 23,36,59. Dans les études d’infection, il est crucial de considérer le site naturel d’interaction entre les agents pathogènes et l’épithélium de l’hôte. Dans la prostate, les cellules luminales sont généralement le premier point de contact, et l’accès à la surface apicale est donc essentiel pour modéliser avec précision la dynamique de l’infection. Dans les organoïdes prostatiques 3D conventionnels, la surface apicale fait face à la lumière organoïde et n’est pas directement accessible. Dans ces cas, l’exposition aux agents pathogènes peut être obtenue par microinjection, à faible débit et techniquement difficile, ou en perturbant les organoïdes, ce qui compromet la polarité épithéliale et entraîne des sites d’interaction^{non physiologiques 23}. En revanche, le modèle 2D accessible apiquement présenté dans ce protocole offre un accès direct à la surface luminale. Cela permet une exposition contrôlée et physiologiquement pertinente aux agents pathogènes, une régulation précise de l’IM, ainsi qu’une compatibilité avec des plateformes d’imagerie à haut débit, haute résolution ou à cellules vivantes. Ici, nous présentons l’utilisation de ce modèle comme système d’infection in vitro en utilisant la souche de référence UPEC UTI89, une référence largement utilisée représentant les principales espèces bactériennes responsables de la prostatite^{bactérienne 9}. Cependant, ce modèle peut être facilement adapté pour étudier d’autres agents pathogènes de la prostate tels qu’Enterococcus faecalis ou Pseudomonas aeruginosa, ce qui en fait une plateforme polyvalente pour la biologie des infections à la prostate.

La dissociation des organoïdes 3D est une étape cruciale pour l’établissement réussi du modèle basé sur les organoïdes. L’échec à dissocier complètement les organoïdes 3D, entraînant de gros fragments, peut altuer l’adhésion cellulaire à la surface de la culture, tandis qu’une exposition prolongée au réactif de dissociation plus de 30 minutes réduit la viabilité cellulaire. De plus, maintenir un intervalle de passage constant d’environ sept jours avant la dissociation et le sémiement est essentiel, car l’état physiologique des organoïdes influence fortement leur capacité à s’attacher et à se différencier. Une autre variable cruciale influençant le développement réussi du modèle à base d’organoïdes prostatiques est la densité d’ensemencement. La concentration de semis utilisée ici a été optimisée pour la différenciation sur 7 jours. Augmenter ou diminuer cette concentration entraînerait probablement des temps de différenciation différents. De plus, une resuspension cellulaire insuffisante avant le placage peut entraîner une répartition inégale des cellules entre les puits, entraînant des densités cellulaires variables qui, à leur tour, influencent à la fois la prolifération et la différenciation. De plus, comme dans d’autres modèles organoïdes, différents lots de MCE ou facteurs de croissance peuvent influencer la capacité de croissance et de différenciation. Il est donc important de vérifier que le modèle à base d’organoïdes conserve un phénotype cohérent après tout changement du numéro de lot ou de lot du facteur de croissance.

Une fois le modèle à base d’organoïdes établi, les paramètres d’infection doivent également être soigneusement optimisés. Différents MOI sont souvent nécessaires pour atteindre des niveaux d’infection robustes et reproductibles selon la souche bactérienne et le résultat choisi. Pour la souche UPEC UTI89 (utilisée ici et dans^{la version 32}) et pour plusieurs isolats^{de prostatite 32}, un MOI de 100 a suffi pour obtenir un nombre fiable de cellules infectées à travers les temps d’adhésion, d’invasion et de réplication. Cependant, si l’incubation des cellules avec des bactéries doit être prolongée au-delà d’une heure, un MOI plus faible doit être utilisé pour prévenir la surcroissance extracellulaire de l’UPEC dans le milieu et la toxicité subséquente pour les cellules. Dans ce protocole, l’infection a été évaluée à l’aide de deux méthodes : I) cytométrie en flux pour quantifier la proportion de cellules infectées, et II) microscopie confocale pour évaluer la localisation bactérienne. Cependant, plusieurs autres approches peuvent également être utilisées, telles que des tests d’unités formant des colonies pour mesurer la^{bactérie 32}, l’immunocoloration pour détecter l’hôte ou les marqueurs^{bactériens 32}, ou des analyses transcriptomiques pour profiler les réponses de l’hôte.

Bien que le modèle basé sur les organoïdes prostatiques fournisse un système physiologiquement pertinent, plusieurs limitations doivent être prises en compte lors de son application à la recherche sur les infections. Une contrainte majeure de ce modèle est l’absence de cellules immunitaires résidentes ou périphériques, ce qui limite sa capacité à capturer pleinement la réponse de l’hôte à l’infection (par exemple, le recrutement des cellules immunitaires ou l’élimination par le système immunitaire). D’autres composants essentiels absents du modèle incluent la vascularisation, le stroma et les nerfs, qui peuvent tous influencer les interactions hôte-pathogène. L’intégration d’autres types cellulaires, tels que les fibroblastes stromals, les cellules immunitaires et les cellules endothéliales, aiderait à recréer un microenvironnement tissulaire plus complet. Des systèmes avancés de co-culture ou des plateformes microfluidiques organes sur puce pourraient soutenir davantage des interactions cellulaires complexes et permettre des études dynamiques de l’infection. De plus, lors de l’utilisation d’organoïdes issus de modèles animaux, il faut prendre en compte les différences spécifiques à chaque espèce, notamment lors de l’étude de pathogènes humains. Bien que nos travaux^{précédents 32} aient montré que les résultats du modèle à base d’organoïdes prostatiques murins pouvaient être reproduits dans des tissus humains, la variation interespèces dans la régulation des gènes, l’expression des récepteurs ou les réponses hormonales pourrait encore limiter la pertinence directe du modèle pour la physiologie humaine. L’intégration d’organoïdes d’origine humaine, lorsque possible, renforcerait la valeur translationnelle en permettant l’étude des interactions et réponses pathogènes spécifiques à l’humain. Bien que ces ajouts puissent renforcer les modèles basés sur les organoïdes comme outils puissants pour étudier la biologie de la prostate, la pathogenèse des infections et le développement thérapeutique, le modèle purement épithélial que nous présentons offre un système simplifié et compartimenté. Cela permet une étude ciblée des interactions hôte-pathogène spécifiques à l’épithélium sans interférence d’autres composants tissulaires.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaques à 48 puits	Sarstedt	83.3923	Forme du bas : plat
5&alpha ;-Androstan-17&bêta ;-ol-3-one dihydrotestostérone	Sigma-Aldrich	A8380	Il était désigné comme DHT. Solution d’origine 10 & mu ; M en 100 % d’éthanol
Lame PET à 8 puits avec 40 électrodes par puits   ;	Biophysique appliquée	8W10E+	Diapositives utilisées pour les mesures TEER
Plaques à 96 puits	Sarstedt	82.1583	Forme du bas : conique
Advance Dulbecco » s Eagle moyen modifié/F12  ;	Thermo Fisher Scientific	12634028	Il a été désigné adDMEM/F12+/+ lorsqu’il est complété par 10 mmol L&minus ; 1 HEPES et 1x GlutaMAX
Ampiciline	Roth	K029.2  ;	Stock de concentration 100 mg/mL
Anticorps anti-CD24a	Proteintech	10600-1-AP	Anticorps primaire ; dilution 1:100 dans 1x PBS 1 % BSA
Anti-Cytokératine 5 Alexa Fluor 647 anticorps   ;	Abcam  ;	ab193895	Anticorps primaire ; dilution 1:100 dans 1x PBS 1 % BSA
anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488  ; anticorps	Invitrogen	A21441	Anticorps secondaire ; dilution 1:500 dans 1x PBS 1 % BSA
Anticorps polyclonal anti-ZO-1	Proteintech	21773-1-AP	Anticorps primaire ; dilution 1:750 dans 1x PBS 1 % BSA
B27, 50x	Thermo Fisher Scientific	12587010
Bovines Serumalbumine (BSA) Fraktion V, NZ-Origin	Roth	8076.3	Composant du tampon de blocage utilisé à 1 % dans 1x PBS
puits micro-Slide 8 chambrés	Ibidi	80806	Modification de surface : ibiTreat
Tube conique (15 mL)	Sigma Aldrich	T1943	Le fond plat est meilleur pour les petites granulés. & nbsp ;
Éthylènédiaminetétra-acétate 2H2O (EDTA) disodium	Roth  ;	8043.2	Fait maison : 93,0 g dans 400 mL d’H2O, ajuster le pH à 8,0, ajuster le volume avec H2O jusqu’à 500 mL ; 0,5 M EDTA ; composante du tampon du cytomètre à débit
Solution saline équilibrée de Dulbecco (DPBS)	Gibco	14190-144	PBS
ECHO Revolve Microscope & nbsp ;	ECHO
ECIS  ; Z-Theta -  ; Système d’analyse cellulaire basé sur l’impédance	Biophysique appliquée	ECIS  ; Z-Theta	Le système comprend : stations à 16 et/ou 96 puits ; module de contrôle externe ; PC portable ; logiciels de contrôle, d’acquisition et d’affichage ECIS ; module de champ élevé pour la migration et l’électroporation automatisées des cellules   ;
Sérum fœtal bovin (FBS) Supérieur	Sigma Aldrich	S0615	Composant du tampon du cytomètre en flux ; composant du milieu de culture de la lignée cellulaire 293T ; composante du milieu de culture HEK293T lignée cellulaire
Flash Phalloidin Red 594	Biolégende	424203	Dilution 1:250 dans 1x PBS 1 % BSA
Tampon de cytomètre en débit			1x PBS, 10 % FBS, 5 mM EDTA
Gentamicin  ;	Sigma Aldrich	G1272
GlutaMAX  ;	Thermo Fisher Scientific	35050-038	Dipeptide L-alanyl-L-glutamine, composant de l’adDMEM/F12+/+  ;
Densimètre cellulaire Harvard Biochrom Ultrospec 10	Fisher Scientific	10704417
Coloration rouge profond HCS CellMask	Technologies de vie	H32721	Dilution 1:1 000 dans 1x PBS 1 % BSA
HEK293T lignée cellulaire transfectée avec le vecteur d’expression Noggin-Fc de souris	Ligne cellulaire du Professeur Dr Clevers		Utilisé pour produire du Noggin ; milieu de culture : 500 ml DMEM, glycémie élevée, GlutaMAX, pyruvate (Gibco Life Technologies, 31966) + 50 ml FBS ; Farin et al. Gastroentérologie 143.6 (2012) : 1518-1529
HEPES  ;	Thermo Fisher Scientific	15630056	Composant d’adDMEM/F12+/+  ;
Hoechst 33342  ;	Technologies de vie	H3570	Dilution 1:5 000 dans 1x PBS
Facteur de croissance épidermique humain (EGF) & nbsp ;	Peprotech	AF-100-15	Stock de concentration 500 & micro ; g/mL
Boucles d’inoculation	Sarstedt	86.1567.010
Tubes d’inoculation	Sarstedt	62.515.006
Microscope confocal Leica Stellaris 5	Leica
Bouillon Luria Bertani (bouillon LB)	Roth  ;	X968.1
Matrigel	Corning	356231	Matrice extracellulaire (ECM)
N-acétylcystéine   ;	Sigma-Aldrich	A9165-25G	Stock de concentration 500 mM
Noggin CM
NovoCyte Quanteon  ;	Agilent		Cytomètre en flux
Paraformoldéhyde (PFA)	Sigma Aldrich	P6148	utilisé à 4 % dans 1x PBS, 4 % de saccharose
Primocin	Invivogen	Ant-pm-1
Q-VETTES semi-micro	Ratiolab	2712120
RHOKi (Y-27632)	AbMole	M1817	Inhibiteur RhoA/ROCK ; Stock de concentration 10 mM
R-spodin1 CM
R-Spondin1 exprimant la lignée cellulaire 293T	Sigma Aldrich	SCC111	Utilisé pour produire R-spo1 CM ; milieu de culture : 500 ml DMEM, glycémie élevée, GlutaMAX, pyruvate (Gibco Life Technologies, 31966) + 60 ml FBS  ;
TGF & beta ; i (A-83-01)	Tocris	2939	Inhibiteur ALK4/5/7 ; Stock de concentration 5 mM  ;
Triton X-100 & nbsp ;	Sigma Aldrich	T9284	utilisé à 0,5 % dilué dans PBS 1x
TrypLE Express Enzyme  ;	Gibco	12605028	Agent de dissociation enzymatique des cellules pour digérer les organoïdes prostatiques de souris en 3D
Souche uropathogène Escherichia coli souche UTI89	Souche WT du Prof. Dr Dobrindt		transformé avec pFPV-mCherry (addgène #20956)