Isolation standardisée et amorçage des cytokines des cellules stromales mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse murinienne pour une immunomodulation accrue

Résumé

Ici, nous démontrons un protocole pour isoler les cellules stromales mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse de souris, ainsi qu’une méthode d’amorçage des cytokines pour amplifier l’effet immunosuppresseur des BMSC sur les cellules immunitaires.

Résumé

Les cellules stromales mésenchymates (CMS) possèdent une forte fonction régénératrice et immunomodulatrice. Ces propriétés font des MSC des médicaments cellulaires puissants pour traiter de multiples troubles immunitaires. La moelle osseuse est la principale et la plus fréquemment utilisée source de CSM. Les études mécanistiques précliniques utilisant des modèles murins sont cruciales pour acquérir des connaissances sur les stratégies optimales d’administration de médicaments pour les CMB dans les essais cliniques chez l’homme. Ainsi, la standardisation du procédé de fabrication des MSC murins est également cruciale pour obtenir de meilleurs résultats thérapeutiques. Un objectif central de ce protocole est de démontrer comment l’amorçage contrôlé par interféron-gamma (IFN-γ) améliore les propriétés immunosuppressives intrinsèques des BMSC. Nous décrivons la génération de milieux conditionnés (MC) à partir de BMSC non traités ou pré-licenciés par IFN-γ et évaluons leur activité biologique à l’aide de macrophages péritonéaux primaires. Grâce à ELISA et au profilage cytométrique en flux, le protocole détaille comment le sécrétome dérivé du BMSC — en particulier lorsqu’il est amorcé à l’IFN-γ — favorise la polarisation anti-inflammatoire des macrophages caractérisée par une production élevée d’IL-10 et des marqueurs de surface associés à M2. Dans l’ensemble, ce protocole établit un cadre unifié pour produire des BMSC murins fonctionnellement cohérents et pour évaluer leur puissance immunomodulatrice. En réduisant la variabilité technique et en offrant une clarté visuelle et procédurale, il favorise une meilleure reproductibilité dans la recherche préclinique des MSC et facilite des stratégies optimisées de déploiement des MSC pour les études translationnelles.

Introduction

Les cellules stromales mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse (BMSC) ont de larges applications tant dans les études précliniques que cliniques. Leur faible immunogénicité, leur accessibilité facile et leur capacité de différenciation multilignée font des BMSC des candidats prometteurs pour une utilisation en milieu clinique comme les médicaments^{cellulaires 1,2,3}. Leurs propriétés immunosuppressives et régénératrices ont été largement exploitées dans des études cliniques pour traiter des troubles inflammatoires tels que la maladie greffe contre hôte (GVHD)⁴, la septicémie⁵ et la maladie inflammatoire de l’intestin (MII⁾⁶. La niche stromale de la moelle osseuse comprend une population cellulaire stromale hétérogène. Néanmoins, tous les CMS respectent les critères définis par la Société Internationale de Thérapie Cellulaire (ISCT), qui incluent : l’adhésion plastique, l’expression des récepteurs de surface — CD73, CD90 et CD105 chez l’humain, et les CD29, CD44 et CD90 chez la souris — sans expression de marqueurs hématopoïétiques ou endothéliaux — CD11b, CD14, CD19, CD34, CD45, CD79a, HLA-DR, et la capacité d’être adipogénique, condrogénique, ou différenciation^{ostéogénique 7}.

Les BMSC restent fonctionnelles grâce à la libération de facteurs paracrines collectivement appelés sécrétome, qui incluent les cytokines, les chimimokines, les facteurs de croissance, les vésicules extracellulaires et diverses autres molécules solubles et dépendantes du^{contact 8,9}. Le sécrétome des CMS module la niche en interagissant de manière bidirectionnelle avec des éléments du système immunitaire^{inné 10}. Les facteurs libérés lors des interactions entre les CMS et les macrophages peuvent orienter les macrophages vers un phénotype pro-inflammatoire ou^{anti-inflammatoire 11,12}. Inversement, l’état fonctionnel des CMS est également régulé par les cellules immunitaires locales — en particulier les macrophages — via des mécanismes de rétroaction¹¹. Cette diaphonie croisée MSC-macrophage est indispensable à la fonction immunosuppressive des MSC. Les MSC transférées adoptivement ne réduisent l’inflammation tissulaire que lorsque les macrophages sont présents, comme observé dans les modèles murins de colite. En revanche, l’interaction des CMS avec les lymphocytes B ou T en l’absence de macrophages est insuffisante pour exercer leurs effets^{thérapeutiques 13}.

Le premier essai clinique de phase III utilisant des BMSC allogéniques a été réalisé par Osiris Therapeutics aux États-Unis pour le traitement de la GVHD (NCT00366145)¹ réfractaire aux stéroïdes. Depuis, de nombreuses études précliniques et cliniques ont été menées, bien que le succès des essais cliniques n’ait pas répondu aux attentes fondées sur les résultats précliniques. Pour améliorer le taux de réussite des essais cliniques basés sur les MSC, l’optimisation des stratégies de déploiement des médicaments est essentielle. Comprendre la voie d’administration optimale, la dose cellulaire thérapeutique et l’état physiologique des cellules au point de prise en charge est crucial. Par exemple, dans un modèle murin de colite in vivo , des études ont montré que les MSC ou l’administration intraveineuse sont sous-optimales¹⁴.

Différentes approches, telles que la pré-licence des cytokines, la modification génétique ou le préconditionnement hypoxique, ont été largement étudiées pour améliorer la persistance in vivo et l’utilité thérapeutique des^{CMS 15}. Dans le modèle d’ischémie murine des membres postérieurs, le préconditionnement hypoxique (2 %_O2) a amélioré la capacité de prolifération et de migration des CMS grâce à une expression accrue de la protéine de choc thermique, la protéine régulée par le glucose de 78 kD (GRP78)¹⁶. La pré-licence d’IL-1β (Interleukin-1 bêta) augmente la capacité des CMS à utiliser des neutrophiles, monocytes, lymphocytes et éosinophiles¹⁷. Après une livraison in vivo, les MSC sont exposées à l’IFNγ dérivé des cellules T et NK activées, ce qui améliore la production d’indoléamine 2,3-dioxygénase (IDO) par les^{MSC 18}. L’IDO est un composant essentiel du sécrétome des MSC, qui réduit le taux de prolifération des lymphocytes T. Fait intéressant, la capacité immunosuppressive des CMS est réduite lorsqu’elles sont co-cultivées avec des lymphocytes T dérivés de la^{souris (}IFNγ-/- 19). Des études ont identifié que la pré-licence IFN-γ réduit le taux d’apoptose médiée par les cellules T dans les CSM^{cryopréservées 13,20}. L’amorçage IFNγ améliore le résultat thérapeutique des^{BMSC 13}. Toutes ces preuves indiquent collectivement le rôle indispensable de l’IFNγ dans la production de CSM immunosuppressives plus puissantes.

Pour déterminer la modalité de délivrance la plus efficace des MSC, des modèles animaux ont été largement utilisés pour leur accessibilité éthique. Afin de réduire la variabilité des résultats précliniques, il est crucial d’établir une méthode optimisée pour le processus de fabrication des MSC qui garantit un rendement élevé, une viabilité cellulaire et une cohérence élevés^{sur le long terme 21}. Le passage des MSC est une variable importante pouvant générer différents résultats thérapeutiques. Lors de la culture in vitro , le passage peut réguler la caractérisation et la puissance des MSC, et après un certain nombre de passages, les cellules deviennent²² sénescentes. Ainsi, dans toute étude clinique ou préclinique, il est crucial d’être cohérent avec l’utilisation du numéro de passage MSC. De même, la cohérence avec un protocole spécifique pour l’isolement des MSC est également un facteur clé pour atteindre la reproductibilité dans les résultats d’utilisation des MSC. Parmi de nombreuses approches, le tri cellulaire^{basé sur les anticorps 23}, la méthode^{de sélection négative 24}, la digestion^{enzymatique 25} sont des méthodes populaires d’isolation des CMS. Cependant, l’applicabilité de ces méthodes dépend de la source, car une utilisation inappropriée réduit le rendement, la puissance et la capacité de différenciation trilinéaire.

Ici, nous présentons un protocole standardisé pour l’isolement et la caractérisation des BMSC, en mettant l’accent sur le nombre de passages préféré, la technique de cryopréservation et la collecte de milieux de condition dérivés du BMSC. Nous fournissons également un protocole pour l’amorçage MSC médié par IFN-γ et démonstrons enfin une étude comparative de la manière dont les macrophages péritonéaux répondent différemment aux BMSC normaux ou pré-licenciés en IFN-γ.

Protocole

La présente étude a été réalisée avec l’approbation et conformément aux directives du comité d’éthique animale de l’ICMR-National Institute for Research in Reproductive and Child Health (projet IAEC n°09/23) et du comité institutionnel de soins et d’utilisation animale de l’Université du Wisconsin-Madison. Des souris C57Bl/6J femelles âgées de 6 à 8 semaines, reproduites et hébergées dans des conditions spécifiques sans agents pathogènes (SPF), ont été utilisées pour la présente étude.

REMARQUE : Nous avons suivi les protocoles de biosécurité déterminés par le Comité de biosécurité institutionnelle (IBSC) lors des études in vivo ou in vitro . En résumé, pour l’étude animale, nous avons maintenu une manipulation douce afin de réduire le stress et le risque de blessure. Nous avons utilisé des équipements de protection adaptés, tels que des lunettes de sécurité, des gants, une blouse de laboratoire, un masque et un bonnet jetable en forme de bouffant. Pour les réactifs chimiques biohazard comme le DMSO, nous utilisions un cabinet de biosécurité pour manipuler les produits chimiques. Nous avons utilisé le contenant spécifique à déchets pour éliminer les réactifs bio-dangereux ou les objets tranchants.

1. Isolement des cellules stromales mésenchymateuses de la moelle osseuse murine

REMARQUE : Après la collecte des membres postérieurs, le reste des étapes doit être effectué dans une cagoule de culture tissulaire à flux laminaire, et des techniques aseptiques^{stériles 26}.

1. Euthanasiez la souris par luxation cervicale, suivie d’un rinçage approfondi avec 70 % d’éthanol. À l’aide de pinces ophtalmiques, pincez doucement la peau abdominale entre les deux articulations de la hanche de la souris et découpez soigneusement la peau avec des ciseaux.
2. Séparez la peau en tirant doucement vers le pied. Coupez les articulations des hanches et la cheville pour libérer les deux membres postérieurs.
3. Transférez rapidement les membres postérieurs dans du DMEM glacé, complété avec 1x pénicilline/streptomycine et 2 % de FBS pour éviter les dommages tissulaires jusqu’à la dissection suivante.
4. Prenez chaque membre postérieur dans une boîte de Petri contenant le substrat glacé. Retirez soigneusement le muscle et le tissu conjonctif du fémur et du tibia en grattant délicatement la diaphyse de l’os. Transférez l’os nettoyé dans une nouvelle boîte de Pétri contenant le substrat glacé.
5. Décollez le fémur et le tibia, puis faites une coupure aux extrémités du tibia et du fémur juste sous l’extrémité de la cavité moelleuse. Protégez la cavité moelleuse au maximum pendant la procédure de dissection du fémur et du tibia.
6. Prenez une seringue stérile de 1 mL avec une aiguille de 21 G et prélevez le média de la plaque de Petri. Avec des pinces stériles, maintenez le fémur excisé et insérez doucement l’aiguille dans la cavité moelleuse. Rince la cavité de la moelle osseuse pour obtenir la moelle osseuse. Répétez cette étape jusqu’à ce que l’os soit blanc. Rince le tibia de la même manière.
7. Faites doucement une pipette pour disperser les amas cellulaires dans la boîte de Petri. En utilisant un maillage filtrant de 70 mm, filtrez la suspension cellulaire pour éliminer toute particule osseuse. Collectez le filtrat et centrifugez-le à 230 x g pendant 5 minutes à température ambiante.
8. Éliminez le surnageant et resuspendez la pellete avec un milieu complet (DMEM, FBS à 10 %, 5 % de L-glutamine, pénicilline et Streptomycine). Mesurez le rendement et la viabilité des cellules par exclusion de bleu de Trypan et en comptant sur un hémocytomètre.
9. Semez les cellules dans un flacon traité en^{culture tissulaire} de 75 cm 2 avec une densité cellulaire de 5000 cellules/^cm2 dans un milieu DMEM^{complet 13}. Retirez les cellules hématopoïétiques non adhérentes après 48 heures de culture en changeant le milieu. Remplacez le support par du nouveau produit tous les 3 à 4 jours.
   REMARQUE : Utilisez une fiole de culture cellulaire au lieu d’un plat pour éviter la contamination. Ne sortez pas fréquemment la fiole de l’incubateur pour vérifier les cellules, car cela perturbe la croissance cellulaire.
10. Pour détacher les cellules adhérentes, lavez-les 1 fois avec PBS, ajoutez 0,25 % de trypsine-EDTA, gardez les cellules en trypsine pendant 5 minutes. Cela aide à détacher les cellules du puits.
11. Ajoutez le média complet, remettez en suspension et centrifugez à 230 x g pendant 5 minutes à température ambiante. Jetez le surnageant. Ajoutez un milieu DMEM complet au pellet, resuspendez et resemez les cellules à une densité de 5 000 cellules/^cm2.
12. Faites passer les cellules chaque semaine en changeant le milieu tous les 3 à 4 jours. Après le troisième passage, testez la culture de la MSC par analyse cytométrique en flux comme décrit à l’étape 6. Utilisez les cellules du passage 3 à 5 pour toute expérience.
    REMARQUE : Pour cryopréserver les cellules en vue d’un usage expérimental futur, centrifugez les cellules au volume désiré, resuspendez-les dans un milieu de congélation, stockez 1 x 10⁶ cellules dans 1 mL de milieu congelant dans chaque cryovial à -80 °C pendant la nuit, puis transférez les cellules dans de l’azote pour un usage à long terme.
    Composition des milieux de congélation : 70 % DMEM, 20 % FBS, 10 % DMSO.

2. Préparation d’un milieu conditionné à partir de MSC cultivés

1. Semez les cellules à une densité de 5000 cellules/^{cm 2} pouces sur une plaque à 6 puits. Cultivez les MSC jusqu’à 80 % de confluent.
2. Prélever le milieu conditionné de la plaque de culture cellulaire et centrifuger à 230 x g pendant 5 minutes à température ambiante, filtrer et utiliser pour le traitement.

3. Préparation d’un milieu conditionné amorcé par IFNγ à partir de MSC cultivés

1. Semez les cellules dans une plaque de 6 puits à une densité de 5000 cellules/^cm2. Traiter les cellules avec 25 ng/mL d’IFNγ pendant 48 heures. Réaliser une étude dépendante de la dose afin d’obtenir l’effet optimal de l’IFNγ sur les MSC. Pour cette expérience, sélectionnez une plage de concentrations d’IFNγ, 5, 10, 25, 50, 100 ng/mL, pour pré-licencier les MSC. Les concentrations de 5 et 10 ng/mL étaient significativement moins efficaces pour la polarisation des macrophages, et 25 ng/mL a été identifiée comme la concentration optimale (Figure supplémentaire 1).
2. Après avoir décanté le milieu contenant de l’IFN-γ, lavez le puits deux fois avec du PBS pour assurer l’élimination complète de l’IFN-γ. Tout IFN-γ résiduel peut interférer avec le résultat de l’étude.
3. Incubez les cellules pendant encore 24 heures dans un milieu DMEM normal à 37 °C. Après 24 heures, collectez le substrat conditionné en suivant l’étape 2.

4. Isolement et culture des macrophages dérivés de la cavité péritonéale

1. Injectez 5 mL de PBS glacé (avec 3 % de FBS) dans la cavité péritonéale de la souris, suivis d’un massage doux de l’abdomen.
2. Récupérez la solution PBS à l’aide d’une seringue stérile. Collectez dans un tube de 10 mL. Centrifugez la solution à 300 x g pendant 5 minutes.
3. Retirez le surnageant. Dissoudre le pellet dans un média RPMI complet (RPMI, FBS à 10 %, 1x Pénicilline et Streptomycine). Placez les cellules à 5000 cellules/^cm2.
4. Retirer les cellules non adhérentes après 24 heures et cultiver jusqu’à la confluence. Utilisez les cellules pour des procédures expérimentales complémentaires selon les besoins.

5. Dosage immunosorbant lié aux enzymes

1. Pour détecter l’IL-10 dérivé des macrophages traités par les BMSC-CM, suivez les étapes ci-dessous.
   1. Traiter les macrophages avec des CM-CM de BMC pendant 24 heures et prélever le surnageant le lendemain.
   2. Mesurez la quantité d’IL-10 à l’aide du kit IL-10 ELISA en suivant les instructions du fabricant.
2. Pour détecter le CCL2 dérivé des BMSC ou des BMSC traités à IFNγ, utilisez le kit CCL2 ELISA en suivant les instructions du fabricant.

6. Analyse par cytométrie en flux pour les CMS et phénotypage des macrophages

1. Ensemencer les cellules en plaques de 6 puits et les rendre en confluence. Lavez 1x avec PBS (1 mL) suivi de trypsinisation. Ajoutez la trypsine à 0,25 % et faites couver pendant 5 minutes dans la trypsine pour décoller complètement les cellules de la plaque.
2. Ajouter un média pour désactiver l’activité de la trypchine. Collectez les cellules dans un tube en polystyrène de 10 mL. Centrifugez à 300 x g pendant 5 minutes à 4 °C pour les macrophages et 230 x g pendant 5 minutes à 4 °C pour les BMSC.
3. Retirez le surnageant et resuspendez les cellules dans 2 mL de tampon de coloration (PBS glacé avec 2 % de FBS et 0,05 % d’azide). Tournez à 230 x g pendant 7 minutes. Décante et perturbe la pastille. Ajoutez 1 mL de colorant Ghost Red 780 viability et 50 mL de tampon FACS, resuspendez-le, puis placez-le dans le tube de flux. Tache dans le noir pendant 30 minutes.
4. Après 30 minutes, lavez les cellules avec 1 mL de tampon anti-teinture. Décante et perturbe la pastille. Ajoutez le volume désiré de contrôle de l’anticorps ou de l’isotype. Incuber encore 30 minutes dans le noir. Lavez les cellules avec un tampon de coloration, décantez et resuspendez dans 400 mL de tampon de teinture. Le tube d’échantillonnage est prêt à être acquis.
5. Pour préparer le contrôle de la coloration vivante, après trypsinisation et centrifugation, dissolvez la pellete dans 2 mL de tampon de coloration. Retirez 1 mL dans un autre tube de microcentrifuge et ajoutez 10 mL de DMSO pour tuer les cellules. Vortex et incubation pendant 10 minutes. Mélangez maintenant cela avec les 1 mL restants de la solution contenant la cellule dans un tube d’écoulement.
6. Ajoutez 1 mL de tampon de coloration et tournez à 230 x g pendant 7 minutes. Décante et perturbe la pastille. Ajoutez 1 mL de colorant Ghost Red 780 viability et 50 mL de tampon FACS, resuspendez-le, puis placez-le dans le tube de flux. Tache dans le noir pendant 30 minutes. Après 30 minutes, lavez les cellules avec 1 mL de tampon anti-teinture. Décante et perturbe la pastille. Resuspendez-le dans 400 mL de tampon de tache. L’échantillon teinté vivant est prêt à être acquis.
   REMARQUE : Pour la coloration des macrophages de souris, une étape supplémentaire de coloration doit être ajoutée avant le protocole standard de coloration. Pour éviter l’inexactitude des données de flux, le blocage du récepteur FC est une étape cruciale, qui empêche la liaison des anticorps non spécifiques aux récepteurs Fc sur les cellules. Pour bloquer le récepteur Fc, ajoutez 1 mL de réactif bloqueur Fc (anticorps anti-souris purifié CD16/CD32) à la suspension cellulaire et incubez pendant 15 minutes à température ambiante. Effectuez les étapes restantes de coloration des anticorps à flux sans rincer le réactif bloquant le Fc (Fc blocking réactif).
7. Pour analyser les données d’écoulement, il faut d’abord sélectionner des cellules uniques en fonction des paramètres de diffusion avant et de diffusion latérale. Cette étape est cruciale pour éliminer les débris et les agrégats cellulaires. Ensuite, les cellules uniques seront verrouillées sur la base de la coloration vivante-morte. Effectuer une analyse complémentaire basée sur la population cellulaire vivante (Figure supplémentaire 2).

Résultats

Le schéma expérimental global est décrit à la Figure 1. La moelle osseuse de souris a été prélevée à partir du fémur et du tibia, a été semée, traversée et caractérisée par cytométrie en flux (Figure 1A). Les milieux de condition des BMSC (BMSCS-CM) avec ou sans pré-licence IFNγ ont été collectés, et quelques flacons de BMSCS-CM ont été stockés à -80 °C pour de futurs besoins expérimentaux (Figure 1B).

Les cellules dérivées de la moelle osseuse ont été comptées à l’hémocytomètre (Figure 2A) et semées à une densité de 5000 cellules/^cm2 dans un milieu DMEM complet. Après 48 heures, le premier milieu a été changé, puis le milieu a été changé tous les 3/4 jours, jusqu’à la confluence complète. Nous avons fait passer les cellules lorsqu’elles ont atteint 80 % de confluence (Figure 2B). Dans le passage 4, nous avons caractérisé les cellules sur la base de l’expression des marqueurs spécifiques aux MSC. Les cellules étaient positives au niveau CD44, CD29 et CD90, et négatives pour le CD45, le CD11b et le CD34 (Figure 2C). Les BMSC peuvent se différencier en lignées adipogéniques, ostéogéniques et^{chondrogéniques} 14,27,28,29. Cela permet de maintenir les lignes directrices d’identité de la Société internationale de thérapie cellulaire.

Pour comprendre l’effet immunosuppresseur des CMS-CM, nous avons traité les macrophages dérivés de la cavité péritonéale (PMφ) et les avons traités avec des CM-CM (Figure 3A). Nous avons réalisé une analyse par cytométrie en flux des macrophages traités par BMSC (MC) (Figure 3B,C). Les macrophages adaptés à la culture résident dans la cavité péritonéale ont été colorés par des marqueurs de surface spécifiques à M1 et M2. Nous avons empêché la liaison des anticorps non spécifiques en incubant des macrophages avec des anti-souris purifiés CD32/CD16 (bloc Fc de la souris avant d’ajouter les anticorps de coloration), avant la coloration effective des marqueurs cellulaires. L’expression des marqueurs spécifiques à M1, CD86 et iNOS, ainsi que des marqueurs spécifiques à M2, CD206 et CD163, a été étudiée. Les cellules ont d’abord été déclenchées sur la base du marqueur hématopoïétique CD45.2 (pour C57BL6). IL-10 est la cytokine signature du phénotype M2. L’IL-10 libérée par les macrophages traités par les CM a été mesurée par une étude ELISA (Figure 3D). Puisque le LPS/IFNg induit une polarisation^{M1 30}, ce traitement servait de témoin négatif.

CCL2 est l’une des cytokines emblématiques identifiées dans le sécrétome des CMS, qui déclenche la polarisation¹³ des macrophages. CCL2 libéré par les MSC a été détecté par ELISA (Figure 3E). Pour confirmer le rôle de CCL2 dans la polarisation des macrophages, nous avons prétraité les macrophages avec un inhibiteur de CCR2 suivi d’un traitement MSC-CM (Figure 3F), et la polarisation des macrophages a de nouveau été détectée par une étude IL-10 ELISA (Figure 3F).

Nos résultats démontrent clairement que le sécrétome des CMM peut induire une polarisation anti-inflammatoire des macrophages, comme en témoigne une production accrue d’IL-10 dans les macrophages dérivés de l’intestin après traitement par milieu conditionné (Figure 3).

Figure 1 : Organigramme d’étude. (A) Les souris C57BL/6 ont été euthanasiées. La moelle a été éliminée à la fois des fémurs et du tibia, centrifugée et cultivée pendant une semaine avec un changement de substrat tous les 3 jours. Les CMM étaient traversées et au passage 4 caractérisées par cytométrie en flux et étude d’adipogenèse. (B) Les MSC du passage 4 ont été ensemencés dans des plaques à 6 puits, dans un ensemble avec IFNγ ajouté à une concentration de 25 ng/mL, et dans un autre ensemble, conservés non traités. Après 48 heures, remplacez-le par un média DMEM complet et frais normal. Après 24 heures, récupérez le média de la plaque, de la centrifugeuse et du filtre. Conservez le support de condition à -80 °C pour une utilisation ultérieure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Caractérisation phénotypique. (A) Les cellules dérivées de la moelle osseuse ont été comptées à l’aide d’un hémocytomètre avant la sémination. (B) Les cellules étaient laissées croître jusqu’à 80 % de confluence avant chaque passage. (C) Les cellules du passage 4 ont été caractérisées par analyse par cytométrie en flux avec des marqueurs spécifiques aux MSC de souris. La barre d’échelle représente 100 mM. La figure 2C a été modifiée à partir de^{la 14}. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Analyse du sécrétome BM-MSC. (A) Schéma des expériences. (B) Analyse cytométrique représentative du diagramme pour flux de PMφ traité par MSC-CM. Les cellules dérivées du péritonéal ont été sélectionnées sur la base des marqueurs hématopoïétiques de la population CD45,2-positive. La population sélectionnée a été ensuite colorée par les marqueurs spécifiques à M1 CD86 ou iNOS, les marqueurs spécifiques à M2 CD206 ou CD163, ainsi que par une double coloration CD11b dans chaque cas. (C) Le pourcentage de la population de cellules M1 ou M2 a été quantifié. Une population cellulaire traitée avec LPS/IFNγ a servi de témoin négatif. (D) ELISA a été réalisé pour quantifier l’IL-10 libéré par le PMφ traité par MSC-CM. ELISA a été réalisé pour quantifier (E) CCL2 libéré par MSC-CM, (F) IL-10 délivré par PMφ. Comme indiqué sur la figure, un ensemble d’expériences a été réalisé en présence d’un antagoniste CCR2. Les barres d’erreur représentent la moyenne ± SEM. Données représentatives de 3 expériences indépendantes avec 3 échantillons MSC par groupe. Le test t de l’étudiant a été utilisé pour effectuer une analyse statistique de toutes les expériences. ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001, ∗∗∗∗p < 0,0001. La figure 3B-F a été modifiée à partir de^{la 13}. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure supplémentaire 1 : Les BMSC étaient pré-licenciés avec des flux IFNg de 0, 5, 10, 25, 50, 100 ng/mL. Les macrophages ont été traités avec des MSC-CM pré-licenciés en IFNγ. L’ELISA a été réalisé pour quantifier l’IL-10 libéré par le PMφ traité par le MSC-CM. Les barres d’erreur représentent la moyenne ± SEM. Données représentatives de 3 expériences indépendantes avec 3 échantillons MSC par groupe. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : (A-C) Les cellules uniques ont été sélectionnées en fonction des paramètres de diffusion avant et de diffusion latérale. (D) Les cellules individuelles ont été verrouillées sur la base de colorations vivantes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

L’isolement des cellules stromales mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse de souris est une technique essentielle pour comprendre les propriétés immunosuppressives et régénératrices intrinsèques des CMS dans des modèles animaux in vivo . Bien que la méthode semble simple et facile à suivre, plusieurs étapes doivent être exécutées avec précision pour prévenir la contamination bactérienne et garantir un rendement cellulaire optimal. Chaque étape de la procédure doit être réalisée de manière aseptisée dans un environnement ultra-propre.

Pour éviter un faible rendement cellulaire, sélectionnez des souris âgées de 6 à 8 semaines. Lors de la coupe des extrémités du fémur et du tibia, la cavité moelleuse doit être protégée autant que possible, et le processus de rinçage doit être ferme mais doux afin d’assurer une extraction complète de la moelle. Les cellules isolées doivent être incubées sous une concentration appropriée de CO₂ et dans des conditions humidifiées. Lors des changements de milieu, il est essentiel de laver doucement les cellules avec un sérum physiologique tamponné phosphate (PBS) avant de remplacer le milieu afin d’éliminer les cellules hématopoïétiques contaminantes. Pour éviter la contamination cellulaire hématopoïétique, au moment de la régression, la trypsinisation ne doit pas dépasser 5 minutes. Au début du passage, le changement de milieu ne doit pas être trop rapide, car un changement fréquent peut entraîner une contamination bactérienne.

À chaque passage, il est nécessaire de cryopléser les cellules en plusieurs lots afin de maintenir la cohérence et la disponibilité. Pour l’amorçage IFN-γ, une expérience dépendante de la dose doit être menée afin de déterminer les conditions préalables de licence les plus efficaces pour le milieu conditionné par MSC. Dans nos expériences, nous avons testé une gamme de concentrations d’IFNγ, c’est-à-dire 5, 10, 25, 50, 100 ng/mL, pour pré-licencier les MSC. Ensuite, 25 ng/mL a été identifiée comme la concentration optimale.

Pour préserver l’intégrité des données, des cellules d’un nombre de passage spécifique doivent être utilisées de manière constante pour tous les tests expérimentaux. Pour la caractérisation cytométrique en flux des CSM, des cellules du passage 3 ou supérieur doivent être utilisées afin d’assurer une détection fiable de l’expression des récepteurs de surface. La discrimination des cellules vivantes/mortes lors de la coloration par cytométrie en flux est essentielle, car elle réduit la probabilité de faux négatifs.

Les résultats représentent un mécanisme clé par lequel les BMSC délivrées exogènement atténuent l’inflammation intestinale lors de la colite. L’amorçage IFN-γ renforce l’effet des milieux conditionnés par MSC sur la polarisation des macrophages. Le CCL2 libéré par les BMSC est une chimiokine critique qui agit sur les macrophages pour induire la polarisation de M2. Nos résultats précédents ont démontré que les chimiokines CCL2 et CXCL12 agissent de manière coopérative sur les macrophages pour favoriser leur polarisation. Cet événement est essentiel pour propager la signalisation anti-inflammatoire par la modulation ultérieure des phénotypes¹³ des cellules T et B.

Dans notre étude, nous avons spécifiquement suivi un protocole simple pour l’isolation des BMSC, basé sur la propriété d’adhérence plastique des MSC. Le tri par cytométrie en flux ou le tri immunomagnétique peuvent être utilisés pour isoler les BMSC à partir de marqueurs de surface spécifiques aux MSC. Cependant, dans ces deux méthodes, il y a un risque de perdre beaucoup de cellules lors de la préparation de l’échantillon. Comme la moelle osseuse de souris contient un très faible nombre de MSC (estimés à environ 0,001 % à 0,08 % des cellules de moelle osseuse), nous avons préféré la méthode standard d’isolation basée sur les propriétés des adhérents plastiques. Cependant, cette méthode présente quelques inconvénients. Le principal risque est la contamination cellulaire hématopoïétique, qui peut réduire la capacité thérapeutique des CMS. Ainsi, l’identification d’un nombre de passage spécifique est cruciale, lorsqu’une population significative de cellules exprime des récepteurs de surface spécifiques aux CMS.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Hotte de culture cellulaire à flux laminaire vertical, équipée de lumière UV & nbsp ;
Ciseaux chirurgicaux stériles
25/75 cm2 flasque   ;
Seringues de 5/10 mL avec aiguilles de 27 G
Plats de culture à 6 puits   ;
Accutase	Corning	#AT104
Anit-Mouse F4/80 APC	Biolégende	#123116
CD anti-souris 11b PE	BD PharMingen	#557397
APC anti-souris CD 45.2	BD PharMingen	#558702
Anti-souris CD163 Percp eFluor710	eBioscience	#46-1631-80
PE anti-souris CD206	Biolégende	#141706
FITC anti-souris CD86	BD PharMingen	#553691
Anti-Souris iNOS PE-Cy7	eBioscience	#25-5920-80
Kit CCL2 ELISA	Invitrogen	#554722
Antagoniste de CCR2 (RS 102895)	Sigma	#R1903
Centrifuge  ;
DPBS	Corning	#21-031-CV
Aigle moyen modifié de Dulbecco (DMEM)	Corning	# 10-013-CV
Sérum bovin fœtal	Sigma	#F8067
Maillage de filtre (70 mm)  ;
Colorant viable rouge fantôme 780	Biosciences tonbo	#13-0865-T100
IL-10 ELISA Kit	Invitrogen	#88-7105-88
L-Glutamine	Corning	#25-005-CI
Microscope avec équipement de contraste de phase
Murine IFN&gamma ;	R& Systèmes D	#485-MI-100
Pénicilline-streptomycine	Corning	#30-002-CI
Anti-souris Rat CD16/CD32	BD PharMingen	#553142
RPMImedium	Corning	#10-040-CV
Pinces chirurgicales stériles (droites et courbées)
Incubateur à contrôle de température et de composition des gaz
Trypsine	Corning	#25052-cl
Bain marie avec régulateur de température