Article de méthode

Un pipeline informatique pour la quantification de l’ARN amplificateur intergénique/intragénique dans les cellules souches embryonnaires de souris

DOI :

10.3791/69400

⸱

28 octobre 2025

 ,  , 
1Department of Convergent Bioscience and Informatics, and Graduate School of Biological Sciences, Chungnam National University (CNU)

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole fournit un pipeline de calcul rationalisé pour quantifier les transcrits d’amplificateurs naissants. En intégrant l’accessibilité de la chromatine, les caractéristiques de la chromatine et les données transcriptionnelles, il permet une détection précise et une analyse spécifique du brin de l’activité des amplificateurs dans des régions intragéniques complexes, tout en restant accessible aux chercheurs sans formation approfondie en bioinformatique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les éléments cis-régulateurs de base, connus sous le nom d’amplificateurs, jouent un rôle central dans la régulation transcriptionnelle précise des gènes cibles qui contrôlent diverses fonctions cellulaires et processus de développement. Ces amplificateurs sont souvent transcrits dans les deux sens, produisant de longs transcrits non codants appelés ARN amplificateurs (ARNe). L’expression des ARNe est étroitement liée aux caractéristiques actives de la chromatine, telles que H3K27ac et le recrutement de co-activateurs, et contribue fonctionnellement à l’activation transcriptionnelle des gènes cibles. Néanmoins, la détection et la quantification des ARNe restent difficiles, en particulier lorsqu’ils se chevauchent avec la transcription hôte-gène. Pour y remédier, nous présentons un flux de travail informatique standardisé et convivial pour l’analyse de la transcription des amplificateurs à partir de données de séquençage d’ARN naissant. Le protocole guide les utilisateurs à travers le prétraitement des données, la cartographie de lecture et le contrôle de la qualité, suivis d’une quantification spécifique au brin de la transcription associée à l’amplificateur, avec des procédures dédiées pour les amplificateurs intragéniques où l’attribution du signal est complexe. Les modules de visualisation permettent une inspection claire de l’activité des amplificateurs dans des contextes génomiques, et les options intégrées prennent en charge les analyses des amplificateurs intergéniques et intragéniques. Conçu pour les chercheurs disposant d’une expertise limitée en bioinformatique, ce flux de travail fournit un cadre pratique pour des études cohérentes, reproductibles et évolutives de la transcription des amplificateurs, facilitant ainsi une application plus large de la biologie des amplificateurs dans divers systèmes.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les amplificateurs sont des éléments d’ADN cis-régulateurs qui contrôlent la transcription des gènes cibles en organisant la boucle de la chromatine et en recrutant la machinerie transcriptionnelle 1,2,3. Leur activité spécifique aux tissus permet une régulation précise au cours du développement et de l’engagement de la lignée 4,5,6,7,8. Les activateurs présentent des caractéristiques caractéristiques de la chromatine telles que H3K4me1 (monométhylation de l’histone H3, lysine 4) et H3K27ac (acétylation de l’histone H3, lysine 27) et se trouvent généralement dans les régions hypersensibles de la DNase I qui marquent la chromatine ouverte 9,10,11,12. Ces caractéristiques permettent aux facteurs de transcription et à l’ARN polymérase II d’accéder à l’ADN, initiant la transcription naissante aux lociamplificateurs 13,14,15,16.

Ce processus biologique séquentiel produit des transcrits dérivés d’amplificateurs, appelés ARNe, qui sont des ARN bidirectionnels, non codants et généralement non polyadénylés 13,14,15,16. Les ARNe servent de marqueurs de l’activité des amplificateurs et fonctionnent comme des effecteurs à part entière 16,17,18,19,20,21,22,23,24. Ils favorisent l’élongation productive en libérant le facteur d’élongation négatif (NELF) à partir de l’ARN polymérase IIen pause 16,19, et aident à stabiliser les boucles d’amplification-promotion 17,18,20. Ils soutiennent également la formation de condensats transcriptionnels, potentiellement via la modification de m6A (N 6-Methyladenosine) 21,22,23.

Pourtant, la fonction de la transcription intragénique de l’amplificateur, initiée à partir d’éléments régulateurs dans les corps génétiques, reste controversée. Certaines études rapportent que les ARNe provenant d’amplificateurs intragéniques augmentent l’expression des gènes de l’hôte25, potentiellement en favorisant la libération de NELF et l’élongation productive dépendante du stimulus 26,27. En revanche, d’autres travaux suggèrent que cette transcription peut entraver les gènes de l’hôte via des collisions de l’ARN polymérase II ou des interférences transcriptionnelles, conduisant à une atténuation ou à une terminaison prématurée28,29. Ces observations contradictoires, ainsi que le double rôle des ARNe en tant que marqueurs et régulateurs, soulignent la nécessité d’une quantification minutieuse et d’une dissection fonctionnelle. Pourtant, la mesure des ARNe intragéniques est difficile car ils chevauchent souvent les transcrits de l’hôte 13,25,26,30. Le défi est amplifié lorsque les amplificateurs résident dans des régions avec des gènes imbriqués ou une transcription chevauchante sur les deux brins, ce qui obscurcit les signaux spécifiques aux amplificateurs.

Pour surmonter ces défis, nous avons développé un pipeline bioinformatique pour détecter, quantifier et visualiser les transcrits associés aux amplificateurs, en mettant l’accent sur les régions intragéniques. Le pipeline intègre le test de séquençage de la chromatine accessible à la transposase (ATAC-seq), le séquençage de l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP-seq), le séquençage global (GRO-seq) et les annotations génomiques pour obtenir une résolution de niveau amplificateur, même dans des contextes génomiques complexes.

Le pipeline comprend quatre étapes principales : (i) le prétraitement, l’alignement, les appels de pointe et la génération du signal31 ; (ii) l’identification de l’amplificateur à l’aide des caractéristiques de la chromatine ; (iii) l’attribution de l’orientation des brins, en particulier au sein des corps géniques ; et (iv) la quantification et la visualisation des transcrits d’amplificateurs naissants. Ce cadre est particulièrement utile pour les systèmes disposant de données de séquençage à haute résolution, tels que les cellules souches embryonnaires de souris analysées dans cette étude, et il peut être étendu à d’autres organismes lorsque des ensembles de données appropriés sont disponibles. En permettant une quantification spécifique à l’amplificateur lorsque les pipelines existants sont insuffisants, ce flux de travail offre un outil pratique pour l’analyse comparative et l’étude de la transcription intragénique de l’ARNe dans divers contextes génomiques.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

REMARQUE : Tous les jeux de données brutes utilisés dans le flux de travail sont répertoriés dans le Tableau 1. Les détails des outils bioinformatiques sont fournis dans la table des matières. Le nombre de threads utilisés dans ce pipeline peut être ajusté en modifiant la variable THREADS définie en haut de chaque script. Les utilisateurs peuvent augmenter le nombre pour accélérer l’analyse en fonction des ressources CPU de l’utilisateur.
Après chaque étape, un fichier journal est généré. Pour des vérifications rapides des échecs, utilisez des commandes telles que cat StepXX_log.txt ; grep -qF « ERROR » StepXX_log.txt && echo « ERROR found. Réparez avant l’étape suivante. echo « OK : pas de marqueurs d’erreur ». Si une erreur apparaît, considérez l’étape comme ayant échoué et résolvez-la en premier.

1. Téléchargement de l’ensemble du pipeline d’analyse à partir du référentiel GitHub

(https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/)

  1. Lancez l’interface de ligne de commande (CLI) appropriée au système d’exploitation utilisé.
    1. Windows : configurez un environnement Linux à l’aide du sous-système Windows pour Linux (WSL). Suivez les instructions officielles pour installer et configurer WSL avant de continuer32.
    2. macOS : Continuez sans configuration supplémentaire, car macOS est basé sur Unix. Référez-vous au guide officiel pour ouvrir le terminal33.
    3. Utilisateurs de Linux, en particulier ceux qui utilisent Ubuntu : Ouvrez un terminal comme décrit dans les instructions34 référencées.
  2. Exécutez wget https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/archive/refs/heads/main.zip -O ~/pipeline.zip   dans le terminal pour télécharger le pipeline pour l’identification et la quantification de l’ARN de l’amplificateur.
  3. Tapez unzip ~/pipeline.zip -d ~/ dans le terminal. Cela extraira tous les fichiers nécessaires dans le répertoire personnel.
  4. Exécutez rm ~/pipeline.zip et tapez mv ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization-main ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization pour supprimer l’archive et renommer le dossier extrait.
  5. Tapez cd ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/, et exécutez chmod +x scripts/* pour rendre tous les scripts du répertoire « scripts/ » exécutables.

2. Configuration de l’environnement mamba/conda pour le pipeline d’analyse

  1. Tapez bash scripts/Step1_conda_environment_formation.sh pour créer et exécuter un environnement virtuel mamba. Si vous y êtes invité pendant l’exécution, tapez Y et appuyez sur Entrée pour confirmer l’installation du package. Pour macOS, suivez l’étape 2.1.1 ; pour les systèmes sur lesquels Mamba ou Conda est déjà installé, suivez l’étape 2.1.2.
    1. MacOS : Ouvrez le script et remplacez le lien de téléchargement miniconda par la version de macOS :
      https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-latest-MacOSX-x86_64.sh
      Ensuite, suivez l’étape 2.1.
    2. Une fois que (enhancer-env) apparaît dans l’invite, tapez bash scripts/Step2_package_installation.sh pour installer les packages requis pour les analyses en aval. Tapez Y et appuyez sur Entrée si vous y êtes invité lors de l’installation.
    3. Après avoir exécuté l’étape 2.2, vérifiez que la sortie du terminal ne contient pas de messages d’erreur. Résoudre tout problème ; puis relancez l’étape 2.2.
    4. (FACULTATIF) Exécutez mamba list pour confirmer que tous les packages gérés par mamba dans la table des matériaux sont installés. HOMER est installé manuellement et n’apparaîtra pas dans la liste mamba. Vérifiez HOMER en vérifiant que le répertoire « ~/homer/ » existe.

3. Téléchargez des ensembles de données ChIP-seq, ATAC-seq et GRO-seq accessibles au public à partir de SRA (Sequence Read Archive)

  1. Exécutez cp scripts/Step{3..12}_*.sh ./ pour copier les scripts shell nécessaires au traitement de la lecture brute.
  2. Tapez bash Step3_download_file_list.sh > Step3_log.txt 2>&1 et appuyez sur la touche Entrée pour télécharger et traiter les données de séquençage brutes à partir de SRA.
    REMARQUE : Ce script automatise le téléchargement et la préparation des données de séquençage publiques pour l’analyse. Il crée une structure de dossiers standardisée sous « MATERIAL/ », organisée par type de test et par réplication (biologique : rep1/rep2 ; technique : trep1/trep2). Une liste intégrée de numéros d’accession SRA permet l’extraction avec prefetch (v3.2.0), la conversion en FASTQ avec fasterq-dump (v3.2.0) (paired-end : --split-files) et la compression avec pigz (v2.8) pour réduire le stockage. Le traitement suit prefetch, fasterq-dump, pigz, avec les sorties écrites dans les répertoires « 00.Rawdata/ » correspondants.

4. Effectuer le contrôle de la qualité et le découpage des lectures brutes

  1. Tapez bash Step4_read_trimming_and_QC.sh > Step4_log.txt 2>&1 pour effectuer le découpage de lecture et le contrôle qualité des fichiers FASTQ bruts.
    REMARQUE : Ce script traite les fichiers FASTQ bruts de GRO-seq, ATAC-seq et ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1) avec les commandes d’entrée correspondantes. Il exécute FastQC (v0.12.1)35 sur les lectures brutes, puis ajuste les adaptateurs avec Trim Galore (v0.6.10)36 à l’aide de paramètres spécifiques au test. Pour GRO-seq, il supprime d’abord les queues NextSeq G et les lectures très courtes (--nextseq 20, --length 20), puis utilise Cutadapt (v5.1)37 pour supprimer les longs faisceaux poly-A tout en conservant les lectures plus longues que 20 nucléotides ( -a A{15}, -m 20). Pour ATAC-seq, il traite les bibliothèques à extrémités appariées et cible les adaptateurs Tn5/Nextera (--paired, --nextera). Pour H3K27ac et l’entrée correspondante, il gère les bibliothèques ChIP-seq appariées (--paired). Pour H3K4me1 et son entrée, il effectue un découpage standard à une extrémité (par défaut). FastQC est exécuté à nouveau sur les lectures tronquées. Les sorties sont écrites dans le répertoire « 01.Clean/ » de chaque test, et les fichiers intermédiaires coupés par l’adaptateur GRO-seq sont supprimés.

5. Préparez l’indice de référence Bowtie2

  1. Choisissez l’une des deux options ci-dessous pour préparer l’indice du génome Bowtie2 (v2.5.4)38 pour le génome de référence mm10 (Mus musculus).
    1. Exécutez bash Step5_1_download_reference_index.sh > Step5_1_log.txt 2>&1 pour utiliser l’index Bowtie2 prédéfini fourni par les développeurs.
    2. Courir bash Step5_2_download_reference_make_index_with_
      bowtie2.sh > Step5_2_log.txt 2>&1       pour télécharger manuellement la séquence génomique brute mm10 et construire l’index.
      REMARQUE : Les deux approches génèrent un fichier d’index dans le répertoire « reference_index/ » et sont fonctionnellement équivalentes pour l’alignement standard.

6. Alignez les lectures tronquées sur le génome de référence mm10

  1. Tapez bash Step6_alignment_to_make_bam.sh > Step6_log.txt 2>&1 pour aligner les lectures de chaque test sur les fichiers de référence et de génération BAM.
    REMARQUE : Cette étape mappe les lectures de chaque test à la référence mm10 précédemment indexée. H3K27ac ChIP-seq et l’entrée correspondante utilisent le mappage d’extrémité appariée pour une précision équilibrée (-1, -2) avec une sensibilité par défaut. H3K4me1 ChIP-seq et l’entrée correspondante utilisent le mappage à une extrémité avec les paramètres par défaut (-U). ATAC-seq utilise un mappage haute sensibilité pour s’adapter aux fragments variables et longs dérivés de Tn5 (--very-sensitive, -X 2000) avec une entrée d’extrémité appariée (-1, -2). GRO-seq utilise un mappage haute sensibilité pour mieux placer les lectures courtes et tronquées (--très-sensible) avec une entrée à une extrémité (-U). Les fichiers SAM sont convertis en BAM et filtrés avec la vue samtools (v1.22.1)39 , en utilisant une MAPQ modérée pour ChIP/entrée (-b, -q 10) et des seuils plus stricts pour ATAC-seq et GRO-seq (-b, -q 30) ; les fichiers BAM finaux sont écrits dans le répertoire « 02.Align/ » de chaque ensemble de données.

7. Fusionner les répliques techniques des données H3K27ac ChIP-seq

  1. Exécutez bash Step7_merge_trep.sh > Step7_log.txt 2>&1 pour fusionner les répliques techniques de H3K27ac ChIP-seq et les fichiers BAM d’entrée correspondants.
    REMARQUE : Ce script trie les fichiers BAM pour les réplications techniques avec le tri sambamba (v1.0.1)40 , puis fusionne H3K27ac ChIP-seq et les réplications d’entrée correspondantes dans les BAM consolidés avec sambamba merge. Si le jeu de données de l’utilisateur ne contient aucune réplique technique, ignorez cette étape et passez aux fichiers BAM individuels.

8. Supprimez les doublons et les chromosomes non essentiels

  1. Supprimez les doublons et triez les lectures mappées pour ChIP-seq et GRO-seq.
    1. Tapez bash Step8_1_duplicate_removal_sorting-ChIP_GRO.sh > Step8_1_log.txt 2>&1 pour supprimer les doublons des ensembles de données ChIP-seq d’histones et trier les BAM de sortie ChIP-seq et GRO-seq.
      REMARQUE : Ce script supprime les doublons PCR avec le balisage sambamba (-r) et les tris de coordonnées avec le tri sambamba. Pour H3K27ac, le traitement cible les BAM à partir de répliques techniques fusionnées, en gérant séparément ChIP et l’entrée. Pour H3K4me1, chaque réplique et entrée correspondante sont traitées individuellement. Pour GRO-seq, la suppression des doublons est ignorée et seul le tri des coordonnées est appliqué. Les sorties sont enregistrées dans le répertoire « 02.Align/ » de chaque jeu de données.
  2. Supprimez les doublons et filtrez les lectures mirosomiques mirodriales à partir d’ATAC-seq.
    1. Tapez bash Step8_2_duplicate_chrM_removal_sorting_ATAC.sh > Step8_2_log.txt 2>&1 pour supprimer les doublons de PCR, filtrer les lectures mitochondriales (chrM) et trier les BAM ATAC-seq.
      REMARQUE : Ce script fait référence aux recommandations du pipeline ENCODE pour le traitement des données ATAC-seq. Il commence par effectuer le tri des noms avec sambamba sort (-n) et la correction des informations de paire mate à l’aide de samtools fixmate (-m). Cette étape permet de s’assurer que les informations d’accouplement sont correctement attribuées avant de marquer les doublons. Ensuite, les doublons PCR sont supprimés à l’aide du balisage sambamba (-r). Les lectures mitochondriales sont supprimées en générant une liste de conservation à partir de samtools idxstats (excluez chrM et *) et en ne conservant que les références répertoriées avec la vue samtools (-b). Le tri final des coordonnées est effectué avec le tri sambamba. Les BAM nettoyés sont écrits dans le répertoire « 02.Align/ » de chaque réplication.

9. Effectuer des appels de pointe pour chaque ensemble de données

  1. Exécutez le script de l’étape 9 en tapant bash Step9_peak_calling.sh > Step9_log.txt 2>&1 pour effectuer des appels de pointe pour les données ChIP-seq et ATAC-seq.
    REMARQUE : Ce script effectue des appels de pointe avec MACS3 (v3.0.3)41 pour ATAC-seq et ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1). ATAC-seq génère des pics en fournissant tous les BAM répliqués sous forme de signal en mode sans modèle avec décalage/extension (-f BAMPE, --nomodel, --shift -100, --extsize 200, -q 0.01). H3K27ac appelle des pics larges à partir de réplicats techniques fusionnés avec une entrée correspondante (-f BAMPE, --broad). H3K4me1 traite chaque réplique individuellement avec son entrée appariée en mode large à une extrémité (-f BAM, --broad), et les pics qui se chevauchent sont obtenus avec bedtools (v2.31.1)42 intersect. Les sorties sont écrites dans le répertoire « peak_calling/ » de chaque ensemble de données, avec des pics H3K4me1 de confiance élevée sous « peak_calling/overlapped_peak/ ».

10. Fusionnez les réplicats biologiques des fichiers BAM ChIP-seq et ATAC-seq pour l’analyse des signaux en aval

  1. Exécutez bash Step10_merge_rep_forMakingSignal.sh > Step10_log.txt 2>&1 pour fusionner les fichiers BAM à partir de répliques biologiques d’ATAC-seq et de H3K4me1 ChIP-seq.
    REMARQUE : Ce script combine les BAM répliqués avec sambamba merge pour ATAC-seq, H3K4me1 ChIP-seq et l’entrée H3K4me1 correspondante. Les BAM fusionnés prennent en charge les analyses en aval (par exemple, la génération de signaux bigWig, la normalisation). Les BAM de sortie sont enregistrés dans les répertoires « merge/02.Align/ » sous chaque chemin d’échantillonnage.

11. Générez des répertoires de balises et signalez les fichiers bigWig à partir de lectures mappées

  1. Exécutez bash Step11_make_tag_to_signal.sh > Step11_log.txt 2>&1 pour créer des répertoires de balises et générer des fichiers de signaux bigWig pour les lectures mappées de chaque ensemble de données.
    REMARQUE : Ce script construit des répertoires de balises HOMER avec makeTagDirectory , puis génère des pistes de signal bigWig avec la commande makeUCSCfile en utilisant les packages HOMER (v5.1)43 et ucsc-bedgraphtobigwig (v482)44 . Toutes les pistes de signal sont créées à l’aide de fichiers de taille de chromosome à partir de UCSC Genome Browser (https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/mm10/). GRO-seq produit des pistes de signal spécifiques à un brin (-style rnaseq, -strand + / -, -bigWig). ATAC-seq produit des pistes non normalisées à partir de BAM fusionnés (-bigWig). ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1) produit des pistes normalisées en entrée avec un pseudo-compte de 1 (-bigWig, -i, -pseudo 1). Les sorties sont organisées sous « 03.TagDir/ » et « 04.bigwig/ ».

12. Préparez les fichiers pour l’identification de l’amplificateur

  1. Tapez bash Step12_E_identification_material.sh > Step12_log.txt 2>&1 dans le terminal pour préparer les fichiers et la référence nécessaires à l’identification de l’amplificateur.
    REMARQUE : Cette étape rassemble tous les fichiers nécessaires à l’identification de l’amplificateur dans les dossiers « 01.E_identification/material/, organisés en dossiers « ATAC/, « Histone/ » et « Annotation/. Il copie les fichiers de pointe (ATAC-seq, H3K27ac, H3K4me1) dans les répertoires appropriés. Le fichier d’annotation GENCODE M23 (mm10) est téléchargé automatiquement, et les fichiers de référence, y compris ENCODE blacklist45 (mm10-blacklist.v2.bed) et le fichier de taille de chromosome (mm10.chrom.sizes) sont copiés à partir d’un chemin prédéfini.

13. Identifier les candidats promoteurs et les corps génétiques à partir de l’annotation

  1. Tapez cd 01.E_identification/ pour entrer dans le répertoire de travail, puis exécutez cp .. /scripts/Step{13..20}_*.sh ./ pour copier les scripts d’identification d’amplificateur.
  2. Exécutez bash Step13_promoter_candidates_genebody_identification.sh > Step13_log.txt 2>&1 pour générer des fichiers BED pour les régions promotrices, les corps de gènes et les gènes codant pour des protéines (PCG) à l’aide de l’annotation GENCODE.
    REMARQUE : Ce script traite le format de transfert de gènes (GTF) GENCODE M23 téléchargé pour créer des fichiers BED pour les candidats promoteurs, tous les corps de gènes et les corps PCG, en enregistrant les sorties dans « material/Annotation/ ». Les promoteurs sont définis comme une fenêtre de 2 kb autour du TSS (Transcription Start Site) de chaque transcrit avec bedtools slop (-b 2000, -g mm10.chrom.sizes). Les corps codant pour les gènes et les protéines sont dérivés des entrées GTF annotées en tant que gène, les entrées codant pour les protéines étant filtrées par « gene_type = protein_coding ».

14. Pics de processus pour l’identification de l’amplificateur

  1. Exécutez bash Step14_ATAC_ChIP-seq_processing.sh > Step14_log.txt 2>&1 pour prétraiter les fichiers de pic ATAC-seq et histone ChIP-seq pour l’identification de l’amplificateur.
    REMARQUE : Ce script prétraite les ensembles de pics pour l’appel de l’amplificateur. Pour ATAC-seq, il supprime les régions qui chevauchent les régions de la liste noire avec la soustraction des outils de lit (-A), puis exclut les pics qui chevauchent les candidats promoteurs avec la soustraction des outils de base (-A) ; pour les marques d’histones (H3K27ac, H3K4me1), il étend symétriquement chaque pic de 1 kB de chaque côté avec Bedtools Slop (-B 1000 -g mm10.chrom.sizes) puis supprime les chevauchements de promoteurs avec Bedtools Subtract.

15. Identifier et classifier les exhausteurs

  1. Exécutez bash Step15_inter_intragenic_E_sets_identification.sh > Step15_log.txt 2>&1 pour définir et classer les amplificateurs à l’aide des données de pic de chromatine.
    REMARQUE : Cette étape définit et annote les rehausseurs à l’aide d’outils de lit. Les chevauchements entre les pics ATAC-seq et les pics H3K4me1 étendus par slop-expanded sont obtenus avec l’intersection (-wa, -u), et les régions qui chevauchent également les pics H3K27ac flanqués sont classées comme des amplificateurs actifs avec l’intersection (-wa, -u) ; Les amplificateurs non actifs sont obtenus en supprimant les régions actives de l’ensemble complet d’amplificateurs avec soustraire. Les sommets ATAC-seq chevauchant chaque ensemble d’amplificateurs sont collectés avec l’intersection (-u), puis les sommets sont divisés en intergéniques et intragéniques avec intersection (-v ou -u) contre le corps du gène. Les intervalles d’amplification sont finalement attribués aux classes intergéniques/intragéniques en fonction du sommet associé au pic avec l’intersection (-u). Tous les résultats sont enregistrés dans « 01.E_identification/ » sous « 01.allE/ », « 02.interE/ » et « 03.intraE/ ».

16. Attribuez des informations temporaires sur les brins aux amplificateurs intragéniques

  1. Tapez bash Step16_assign_temp_strand_from_gene_overlap.sh > Step16_log.txt 2>&1 pour attribuer des informations temporaires sur les brins au BED d’amélioration intragénique.
    REMARQUE : Cette étape attribue des marqueurs de brins de gènes aux amplificateurs intragéniques en chevauchant les intervalles d’amplification avec les corps géniques à l’aide de l’intersection des outils de lit (-wa, -wb). Les colonnes 1, 2, 3, 4, 5, 16 sont conservées avec awk, puis les enregistrements sont triés et dédupliqués. La sortie est enregistrée sous le nom « 03.intraE/strand_designation/01.overlapped_gene_strand/ES_E_intragenic_strand_with_dup.bed ».

17. Priorisez l’attribution des brins pour les amplificateurs chevauchant les gènes des deux brins

  1. Tapez bash Step17_initial_strand_assignment_for_both_strand_enhancers_PCG_based.sh > Step17_log.txt 2>&1 pour résoudre la direction des brins pour les amplificateurs intragéniques chevauchant les gènes sur les deux brins.
    REMARQUE : Ce script résout l’ambiguïté des brins pour les amplificateurs intragéniques qui chevauchent les gènes sur les deux brins en donnant la priorité aux chevauchements PCG. Les amplificateurs présents sur les deux brins sont d’abord isolés (regroupement awk par chrom/début/fin/id/brin), les cas qui se chevauchent sur le même brin sont sélectionnés avec l’intersection des outils de lit (-s, -wa, -u), et les cas non PCG sont conservés avec l’intersection des outils de lit (-v). Les ensembles sélectionnés et conservés sont concaténés et ordonnés. Sortie : « 03.intraE/strand_designation/02.enhancer_with_PCG_priority/ES_E_intragenic_PCG_priority.bed ».

18. Calculer les valeurs de lectures par kilobase par million de lectures mappées (RPKM) spécifiques au brin pour les gènes chevauchant les amplificateurs intragéniques prioritaires PCG

  1. Tapez bash Step18_RPKM_cal_from_partially_strand_assigned_enhancers.sh > Step18_log.txt 2>&1 pour calculer le RPKM spécifique au brin pour les gènes chevauchant les amplificateurs sur le même brin.
    REMARQUE : Cette étape utilise « ES_E_intragenic_PCG_priority.bed » de l’étape 17, qui contient des amplificateurs qui (i) chevauchaient un PCG sur un brin et recevaient un brin, (ii) chevauchaient des PCG sur les deux brins et restaient ambigus, ou (iii) n’avaient pas de chevauchement PCG et conservaient les deux brins. Les gènes qui se chevauchent sur le même brin sont sélectionnés avec bedtools intersect (-s, -wa, -u), convertis en GTF via awk et quantifiés à partir de GRO-seq avec le mode de comptage spécifique au brin featureCounts (v2.1.1)46 (-s 1, -t gene, -g gene_id, -O, --fraction). Les lectures totales cartographiées sont obtenues avec sambamba flagstat, et RPKM est calculé à partir de la longueur des gènes, du nombre et des totaux. Les sorties sont écrites dans « 03.intraE/strand_designation/03.RPKM_calculation_of_overlapped_gene/ ».

19. Attribution finale du brin basée sur l’expression génique (RPKM) de gènes chevauchants

  1. Tapez bash Step19_second_strand_assignment_by_RPKM.sh > Step19_log.txt 2>&1 pour finaliser l’attribution des brins pour les amplificateurs intragéniques.
    REMARQUE : Cette étape attribue des brins à des amplificateurs intragéniques à l’aide du support d’expression génique de l’étape 18. Des chevauchements de même brin entre les amplificateurs (ES_E_intragenic_PCG_priority.bed) et les gènes se trouvent avec des outils de lit qui se croisent (-s, -wa, -wb). Les valeurs RPKM des gènes sont jointes aux intervalles de gènes via awk/sort/join, produisant le gène RPKM BED. Pour chaque amplificateur, le gène qui se chevauche avec le RPKM le plus élevé est sélectionné, et l’amplificateur hérite du brin de ce gène. Les résultats sont enregistrés dans « 03.intraE/strand_designation/04.enhancer_strand_designation_by_RPKM_of_gene/ES_E_intragenic_PCG_priority_strand_by_gene_RPKM.bed ».

20. Attribuez des informations sur les brins aux amplificateurs intragéniques et aux sommets d’amplificateurs

  1. Tapez bash Step20_strand_assignment_for_intragenicE_and_summits.sh > Step20_log.txt 2>&1 pour attribuer des informations de brin décidées à tous les amplificateurs intragéniques et à chaque sommet.
    REMARQUE : Cette étape permet de finaliser l’attribution des brins pour les rehausseurs intragéniques et les sommets correspondants à l’aide d’outils de lit. Les intervalles de brins opposés sont supprimés avec la soustraction (-S), les amplificateurs désignés par le brin sont intersectés avec des ensembles actifs et non actifs à l’aide de l’intersection (-wa, -u), et les fichiers de sommet sont réannotés par des sommets superposés avec des amplificateurs désignés par le brin via l’intersection (-wa, -wb) et l’obtention du brin avec awk. Les résultats sont enregistrés dans « 03.intraE/final_strand_IntragenicE/ » et son sous-dossier « summit/ ».

21. Préparez les fichiers d’entrée pour la validation de l’amplificateur, la quantification de l’ARN et la visualisation

  1. Tapez cd .. / ou cd ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization pour passer à la racine du pipeline, puis tapez cp scripts/Step21_preparing_quantification_and_visualization.sh ./ pour copier le script pour la préparation de l’analyse en aval.
  2. Exécutez bash Step21_preparing_quantification_and_visualization.sh > Step21_log.txt 2>&1 pour préparer tous les fichiers nécessaires à l’agrégation d’amplificateurs, au traitement du signal GRO-seq et à la quantification de l’ARNe.
    REMARQUE : Cette étape prépare les fichiers d’entrée et la structure des répertoires pour la validation de l’amplificateur, la quantification de l’ARNe et la visualisation du signal sous « 02.E_visualization_quantification/ ». Des sous-dossiers sont créés pour les fichiers bigWig, les BED d’amélioration, les BAMs, les matrices de signaux, les comptages et les tracés. Les entrées clés telles que les BED de sommet, les bigWigs, les listes d’amélioration et les BAM GRO-seq sont copiées aux emplacements appropriés.

22. Générer des graphiques d’agrégation pour la validation de l’amplificateur

  1. Tapez cd 02.E_visualization_quantification/ pour entrer dans le répertoire de travail, puis tapez cp .. /scripts/Step{22..24}_*.* ./ pour copier les scripts nécessaires à l’analyse en aval.
  2. Exécutez bash Step22_generation_of_aggregation_plot.sh > Step22_log.txt 2>&1 pour générer des graphiques d’agrégation de signaux de chromatine autour de chaque type de sommet d’amplificateur.
    REMARQUE : Cette étape permet de visualiser l’enrichissement moyen du signal chromatinal centré sur les sommets d’amplification à l’aide de computeMatrix et plotProfile de deepTools (v3.5.6)47. Pour chaque ensemble d’amplificateurs défini, le point de référence computeMatrix (--referencePoint center, -a 5000, -b 5000, --missingDataAsZero) calcule la densité du signal dans une fenêtre de 10 Ko autour des sommets d’amplification à l’aide de fichiers bigWig pour ATAC-seq, H3K27ac et H3K4me1. La matrice de sortie est transmise à plotProfile, qui génère des courbes d’agrégation de signaux pour la comparaison entre les groupes d’amplificateurs. Les tracés d’agrégation sont enregistrés dans le répertoire « 01.Profiling/04_1.aggregation/ ».

23. Quantifier et visualiser l’expression de l’ARN amplificateur

  1. Exécutez bash Step23_quantifing_eRNA_RPKM.sh > Step23_log.txt 2>&1 pour quantifier les niveaux d’expression de l’ARNe à partir de GRO-seq à l’aide de featureCounts.
    REMARQUE : Cette étape quantifie la transcription de l’ARNe à partir de régions d’amplification définies d’une manière spécifique au brin à l’aide de GRO-seq. Les amplificateurs intergéniques sont comptés avec featureCounts en mode non briné (-s 0, -t enhancer, -g gene_id, -O, --fraction), et les amplificateurs intragéniques sont quantifiés en mode antisens (-s 2) pour exclure le signal de la transcription génique chevauchante. Les régions BED sont converties en GTF avec awk avant d’être comptées. Le nombre total de lectures mappées provient de sambamba flagstat, et les comptes sont normalisés en RPKM à l’aide de la longueur de l’amplificateur, du nombre de lectures et du nombre total de lectures mappées. Les produits sont organisés sous « 02.eRNA_quantification/03.count_normalized_with_RPKM/ » par « inter/ » et « intra/ ».
  2. Exécutez Rscript Step24_visualization_of_enhancer_transcript. R > Step24_log.txt 2>&1 pour visualiser et comparer les niveaux d’expression de l’ARNe entre les groupes d’amplificateurs à l’aide de R.
    REMARQUE : Le script R utilise les packages ggplot2 (v3.5.2)48 et cowplot (v1.2.0)49 pour générer des graphiques en violon et en boîte comparant l’expression active et non active de l’amplificateur en fonction des valeurs RPKM. Pour la visualisation et les tests statistiques, les valeurs RPKM sont transformées en log2 (RPKM + 1). La signification statistique est évaluée à l’aide du test de Wilcoxon et de la somme des rangs. Les graphiques récapitulatifs et la table des valeurs p sont enregistrés dans « 03.eRNA_visualization/ » pour une interprétation en aval.
    REMARQUE : Si une étape de ce pipeline échoue et persiste même après une nouvelle exécution, signalez le problème à https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to visualisation/problèmes. L’indication claire de l’étape ayant échoué et la pièce jointe du fichier journal garantissent une assistance de dépannage précise.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Flux de travail schématique pour le pipeline de quantification de transcription d’amplificateur
Les ensembles de données ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1), ATAC-seq et GRO-seq (Tableau 1) accessibles au public ont été traités à l’aide d’un pipeline standardisé conçu principalement pour la validation. Le découpage de l’adaptateur et le filtrage de la qualité ont été effectués avec Trim Galore et Cutadapt, suivis d’un alignement sur le génome de référence mm10...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Suite à la découverte de transcrits dérivés d’amplificateurs 13,14,15, la quantification précise des ARNe est restée un défi majeur, en particulier dans les contextes intragéniques où les ARNe se chevauchent souvent avec les transcrits du gène de l’hôte. Ce chevauchement complique l’attribution des brins et des signaux, ce qui rend difficile la distinction entre la transcription authentique de l...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été soutenue par le fonds de recherche de l’Université nationale de Chungnam [2022-0582-01 (S.-K.K.) et 2023-0545-01 (S.-K.K.)], Corée du Sud. La figure 1 a été créée à l’aide de BioRender (https://biorender.com/).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Outils de litQuinlan Lab, Université de l’Utah & nbsp ;v2.31.1Utilitaires pour l’édition de fichiers BED
nœud papillon 2Langmead Lab, Université Johns Hopkinsv2.5.4Aligneur multithread pour la correspondance des lectures vers un génome de référence
CowplotWilke Lab, Université du Texasv1.2.0Outils pour combiner et aligner des figures basées sur ggplot2
cutadaptLaboratoire Science For Life, Université de Stockholmv5.1Adaptateur et coupe-queue poly-A/G
deeptoolsCentre de bioinformatique, Institut Max Planckv3.5.6Outil de comptage des lectures pour quantifier les lectures dans des régions géomiques définies
fastqcBabraham Bioinformatique, Institut Babrahamv0.12.1Contrôle qualité pour les lectures de séquençage
FeatureCounts (sous-lu)Shi Lab, Université Monashv2.1.1Outils de comptage brut pour des régions génomiques spécifiées
HomèreBenner Lab, Université de Californie à San Diego (UCSD)v5.1Boîte à outils pour l’analyse ChIP-seq, ATAC-seq et ARN naissant ; inclut la création de répertoires de balises et le profilage de signaux
Macs3Chan Zuckerberg Initiativev3.0.3Appel de pics pour les ensembles de données ChIP-seq et ATAC-seq
pigz.v2.8Outil de compression multithread pour générer des fichiers compressés en gzip
SammbaUniversité d’État de Pétersbourgv1.0.1Kit d’outils de traitement de fichiers SAM/BAM multi-threads
samtoolsInstitut Wellcome Trust Sangerv1.22.1Outils pour traiter et manipuler des fichiers SAM/BAM
SRA-outilsCentre national d’information biotechnologique (NCBI)v3.2.0Pour télécharger des fichiers SRR depuis la base de données NCBI SRA
tidyversePosit PBCv2.0.0Collection de packages R pour la manipulation et la visualisation des données
Trim-galoreAltos Labs, Cambridge Institute of Sciencev0.6.10Adaptateur et découpage de base de basse qualité utilisant le multi-threading
Ubuntu 20.04Développement et test de la chaîne de production
ucsc-bedgraphtobigwig  ;Kent Lab, Université de Californie à Santa Cruzv482Outils pour générer des pistes de signal pour les grands Wig

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bulger, M., Groudine, M. Functional and mechanistic diversity of distal transcription enhancers. Cell. 144 (3), 327-339 (2011).
  2. Smith, E., Shilatifard, A. Enhancer biology and enhanceropathies. Nat Struct Mol Biol. 21 (3), 210-219 (2014).
  3. Li, W., Notani, D., Rosenfeld, M. G. Enhancers as non-coding RNA transcription units: recent insights and future perspectives. Nat Rev Genet. 17 (4), 207-223 (2016).
  4. Whyte, W. A., et al. transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  5. Plank, J. L., Dean, A. Enhancer function: mechanistic and genome-wide insights come together. Mol Cell. 55 (1), 5-14 (2014).
  6. Alexander, J. M., et al. Brg1 modulates enhancer activation in mesoderm lineage commitment. Development. 142 (8), 1418-1430 (2015).
  7. Huang, J., et al. Dynamic control of enhancer repertoires drives lineage and stage-specific transcription during hematopoiesis. Dev Cell. 36 (1), 9-23 (2016).
  8. Xiong, L., et al. Genome-wide identification and characterization of enhancers across 10 human tissues. Int J Biol Sci. 14 (10), 1321-1332 (2018).
  9. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  10. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  11. Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why. Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
  12. Barakat, T. S., et al. Functional dissection of the enhancer repertoire in human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 23 (2), 276-288 (2018).
  13. Kim, T. -K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  14. Melgar, M. F., Collins, F. S., Sethupathy, P. Discovery of active enhancers through bidirectional expression of short transcripts. Genome Biol. 12 (11), R113(2011).
  15. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  16. Gorbovytska, V., et al. Enhancer RNAs stimulate Pol II pause release by harnessing multivalent interactions to NELF. Nat Commun. 13 (1), 2429(2022).
  17. Mousavi, K., et al. eRNAs promote transcription by establishing chromatin accessibility at defined genomic loci. Mol Cell. 51 (5), 606-617 (2013).
  18. Hsieh, C. -L., et al. Enhancer RNAs participate in androgen receptor-driven looping that selectively enhances gene activation. Proc Natl Acad Sci. 111 (20), 7319-7324 (2014).
  19. Schaukowitch, K., et al. Enhancer RNA facilitates NELF release from immediate early genes. Mol Cell. 56 (1), 29-42 (2014).
  20. Pnueli, L., Rudnizky, S., Yosefzon, Y., Melamed, P. RNA transcribed from a distal enhancer is required for activating the chromatin at the promoter of the gonadotropin α-subunit gene. Proc Natl Acad Sci. 112 (14), 4369-4374 (2015).
  21. Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), eaar3958(2018).
  22. Nair, S. J., et al. Phase separation of ligand-activated enhancers licenses cooperative chromosomal enhancer assembly. Nat Struct Mol Biol. 26 (3), 193-203 (2019).
  23. Lee, J. -H., et al. Enhancer RNA m6A methylation facilitates transcriptional condensate formation and gene activation. Mol Cell. 81 (16), 3368-3385 (2021).
  24. Chen, Q., et al. Enhancer RNAs in transcriptional regulation: recent insights. Front Cell Dev Biol. 11, 1205540(2023).
  25. Moon, J., et al. Embryonic stem cell-specific intragenic enhancer RNA essential for NSUN2-mediated stem cell fate regulation. Int J Biol Macromol. 245, 470(2025).
  26. Tuvikene, J., et al. Intronic enhancer region governs transcript-specific Bdnf expression in rodent neurons. Elife. 10, e65161(2021).
  27. Cheng, F., et al. Intronic enhancers of the human SNCA gene predominantly regulate its expression in brain in vivo. Sci Adv. 8 (47), eabq6324(2022).
  28. Hobson, D. J., Wei, W., Steinmetz, L. M., Svejstrup, J. Q. RNA polymerase II collision interrupts convergent transcription. Mol Cell. 48 (3), 365-374 (2012).
  29. Cinghu, S., et al. Intragenic enhancers attenuate host gene expression. Mol Cell. 68 (1), 104-117 (2017).
  30. Bressin, A., et al. High-sensitive nascent transcript sequencing reveals BRD4-specific control of widespread enhancer and target gene transcription. Nat Commun. 14 (1), 4971(2023).
  31. Lee, J., et al. Introductory analysis and validation of CUT&RUN sequencing data. J Vis Exp. (214), e67359(2024).
  32. How to install Linux on Windows with WSL. , Microsoft. https://learn.microsoft.com/en-us/windows/wsl/install (2025).
  33. Terminal user guide. , Apple. https://support.apple.com/guide/terminal/welcome/mac (2025).
  34. How to open terminal in Linux. , GeeksforGeeks. https://www.geeksforgeeks.org/linux-unix/how-to-open-terminal-in-linux/ (2025).
  35. Simon, A. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. Version 0.10.1, (2010).
  36. Krueger, F. Trim Galore!: a wrapper around Cutadapt and FastQC to consistently apply adapter and quality trimming to FastQ files, with extra functionality for RRBS data. Babraham Inst. , (2015).
  37. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 3(2011).
  38. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  39. Li, H., et al. The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  40. Tarasov, A., Vilella, A. J., Cuppen, E., Nijman, I. J., Prins, P. Sambamba: fast processing of NGS alignment formats. Bioinformatics. 31 (12), 2032-2034 (2015).
  41. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  42. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  43. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  44. Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
  45. Amemiya, H. M., Kundaje, A., Boyle, A. P. The ENCODE blacklist: identification of problematic regions of the genome. Sci Rep. 9 (1), 9354(2019).
  46. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
  47. Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44, W160(2016).
  48. Wickham, H. ggplot2: elegant graphics for data analysis. , Springer. 189-201 (2016).
  49. Wilke, C. O. cowplot: streamlined plot theme and plot annotations for ggplot2. CRAN Contrib. Packages. , (2015).
  50. Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
  51. Spicuglia, S., Vanhille, L. Chromatin signatures of active enhancers. Nucleus. 3 (2), 126-131 (2012).
  52. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Res. 21 (8), 1273-1283 (2011).
  53. Blinka, S., Reimer, M. H., Pulakanti, K., Rao, S. Super-enhancers at the Nanog locus differentially regulate neighboring pluripotency-associated genes. Cell Rep. 17 (1), 19-28 (2016).
  54. Zhao, S., Ye, Z., Stanton, R. Misuse of RPKM or TPM normalization when comparing across samples and sequencing protocols. RNA. 26 (8), 903-909 (2020).

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Amplificateurs interg niquesamplificateurs intrag niquesanalyse GRO seqdonn es ATAC seqac tylation de H3K27donn es de pics de chromatinequantification sp cifique du bringraphiques d agr gation

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