1. Préparation d’échantillons de peau synthétique
Une feuille de modèle de peau synthétique à base de collagène (VITRO-Skin) a été découpée en échantillons rectangulaires mesurant 5,0 cm × 2,5 cm dans des conditions aseptiques dans un cabinet de biosécurité. Chaque échantillon était placé dans une boîte de Petri stérile et conservé à 4 °C jusqu’à utilisation. Avant l’inoculation, les échantillons étaient équilibrés à température ambiante et hydratés dans une chambre d’humidité selon les instructions du fabricant pour imiter le niveau d’hydratation de la peau humaine.
2. Préparation de cultures microbiennes
Souches de référence de l’American Type Culture Collection (ATCC), incluant Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922), Enterobacter aerogenes (ATCC 13048), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Acinetobacter baumannii (ATCC 19606), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883) et Candida albicans (ATCC 10231), ont été utilisés. Les colonies individuelles ont été inoculées dans un bouillon de soja tryptique (TSB) de 5 mL dans des conditions aseptiques. Les cultures bactériennes ont été incubées à 35 °C pendant 24 heures, et les cultures fongiques à 22 °C pendant 5 jours. Après l’incubation, la turbidité a été ajustée à 0,5 standard McFarland (environ 1,5 × 10⁸ UFC/mL) à l’aide de solution stérile au phosphate tamponné (PBS) pour des tests antimicrobiens.
3. Inoculation de modèles cutanés synthétiques
Chaque section de peau synthétique hydratée a été inoculée avec 100 μL de suspension microbienne et répartie uniformément à l’aide d’un évacuateur jetable stérile. Les surfaces inoculées ont été séchées à l’air pendant 15 minutes dans une chambre stérile dans des conditions de laboratoire ambiantes (22-24 °C, 60 %-70 % d’humidité humeur). Les échantillons ont été répartis en trois groupes : témoins non traités (Groupe A), source lumineuse (LED lumineuse bleue, 405 nm), irradiation (Groupe B) et irradiation LED UV-C (265 nm) (Groupe C). La figure 1 montre la représentation schématique des expériences d’évaluation de l’efficacité antimicrobienne de la source lumineuse à l’aide du modèle cutané synthétique.
4. Configuration de la source lumineuse et irradiation
Un dispositif LED à lumière bleue de 405 nm était monté sur un dissipateur thermique en aluminium pour éviter l’accumulation de chaleur et garantir une irradiation thermiquement sûre des échantillons de peau synthétique (Figure 2). L’irradiance était mesurée au plan de traitement exact à l’aide d’un photomètre calibré, la hauteur de la sonde étant ajustée pour tenir compte de l’épaisseur du capteur. L’irradiance de travail a été standardisée à 30 mW/cm² en ajustant la distance de projection de la LED.
L’uniformité de l’illumination sur le champ de traitement a été vérifiée en mesurant l’irradiance à 16 points espacés régulièrement, donnant une moyenne de 30,14 ± 0,78 mW/cm² (Figure 3). Pour une comparaison de base des effets germicides, des traitements UV-C ont été réalisés à l’aide d’une source LED de 265 nm délivrant 3 mW/cm² à une distance de 20 cm pendant 2 minutes.
La fluence était calculée comme l’irradiance × temps d’exposition et correspondait à 27 J/cm² pour la lumière bleue (30 mW/cm² × 900 s) et 3,6 J/cm² pour les UV-C.
Pour les tests antimicrobiens, des échantillons de peau synthétique hydratée inoculés avec des suspensions microbiennes étaient placés de façon aseptique dans des boîtes de Petri stériles (couvercles retirés) et placés directement sous la LED à lumière bleue. Les échantillons assignés au groupe d’irradiation (Groupe B) étaient exposés en continu jusqu’à ce que la fluidité cible soit atteinte (15 min). La durée d’exposition de 15 minutes (27 J/cm²) a été sélectionnée sur la base d’expériences préliminaires de time-kill, qui ont démontré une efficacité antimicrobienne constante entre espèces tout en représentant une durée d’exposition pratique pour des applications cliniques ou au point de soins. La température de chaque échantillon était surveillée toutes les 5 minutes à l’aide d’un thermomètre infrarouge sans contact pour confirmer qu’aucun chauffage significatif n’a eu lieu lors de l’illumination. La surveillance de la température n’a révélé aucune augmentation mesurable de la température de surface (>2 °C) lors de l’irradiation à la lumière bleue, confirmant que les effets antimicrobiens observés étaient non thermiques.
5. Efficacité antimicrobienne de la lumière bleue, des LED et des UV-C contre les agents pathogènes des plaies
Après le traitement, chaque échantillon de peau synthétique a été transféré dans un tube stérile de 15 mL contenant 9,0 mL de PBS (pH 7,4). Les tubes ont été délicatement tourbillonnés pendant 1 minute pour déloger les microbes adhérents à la surface. Des dilutions dix fois multipliées par sérinettes ont été préparées, et des aliquotes de 100 μL ont été placées sur l’agar tryptique de soja (TSA) pour les bactéries et l’agar Sabouraud dextrose (SDA) pour les champignons. Des plaques ont été incubées (bactéries à 35 °C pendant 24 heures ; champignons à 22 °C pendant 5 jours), et des unités formant des colonies (UFC) ont été recensées. La réduction microbienne a été quantifiée à l’aide des équations suivantes :
Réduction logarithmique = log10(A) - log10(B)
Réduction en pourcentage = ((A - B)/A) × 100
Où A = nombre d’unités de CFU provenant du contrôle ; B = Nombre d’UFC provenant d’échantillons traités.
Les témoins négatifs comprenaient des plaques uniquement à base de milieu et du PBS pour vérifier la stérilité, tandis que des échantillons inoculés non traités ont été utilisés pour comparer l’efficacité du traitement. Les plaques témoins positives consistaient en des suspensions microbiennes ATCC inoculées pour confirmer la viabilité des cultures. Toutes les étapes expérimentales ont été réalisées dans des conditions aseptiques.
6. Efficacité antimicrobienne dépendante du temps de l’irradiation à la lumière bleue
Pour évaluer l’effet dépendant de la fluidité, les durées d’exposition à la lumière bleue ont été fixées à 2 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min et 30 min. L’activité antimicrobienne a été évaluée par énumération des UFC comme ci-dessus, permettant d’analyser les relations dose-dépendantes.
7. Efficacité des LED à lumière bleue dans une chambre aérosolisée simulant des conditions nosocomiales
Une chambre aérosol acrylique personnalisée, dans des conditions environnementales contrôlées, a été utilisée pour simuler une exposition nosocomiale en suspension aérienne (Figure 4). Des suspensions microbiennes aérosolisées (~1,5 x 106 UFC/mL) ont été introduites à l’aide d’un nébuliseur, et des échantillons synthétiques de peau ont été exposés pendant 30 minutes. La lumière bleue était dirigée vers les échantillons pendant toute l’exposition (10 μW/cm², distance de 20 cm). Dans l’expérience témoin, des conditions d’exposition identiques ont été appliquées, mais le dispositif BL-LED est resté éteint. Les densités cellulaires microbiennes dans la chambre aérosols ont été surveillées à l’aide de mesures d’activité de retombée, dans lesquelles les plaques d’agar ont été placées à l’intérieur de la chambre avant l’exposition. Des cellules microbiennes viables adhérées aux échantillons synthétiques de peau (2 cm x 2 cm) ont été quantifiées à l’aide d’une analyse standard du nombre de plaques comme décrit ci-dessus. Cette faible irradiance (10 μW/cm²) a été sélectionnée pour imiter les conditions d’éclairage ambiant réelles dans les établissements de santé, où une irradiation continue à haute intensité n’est pas envisageable.
8. Transmission optique et tests de colonies embarquées
- Transmission optique via un substrat de peau synthétique
Pour quantifier la pénétration de la lumière bleue à travers la peau synthétique, l’irradiance a été mesurée à l’aide d’un photomètre calibré placé au niveau du plan de traitement. L’intensité BL (405 nm, 30 mW/cm²) a été enregistrée avec ou sans échantillons synthétiques hydratés placés horizontalement entre la LED et le détecteur. La transmission ( %) était calculée comme le rapport entre l’irradiance transmise (avec la peau) et l’irradiance incidente (sans la peau).
La transmission en conditions aqueuses a été évaluée à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Visible. Une bande synthétique hydratée était insérée verticalement dans une cuvette standard en polystyrène remplie d’eau déionisée. La cuvette remplie d’eau seule servait de blanc. Une absorbance à 405 nm a été enregistrée, et le pourcentage de transmission a été calculé en utilisant % T = 10(-A) × 100.
- Validation fonctionnelle à l’aide d’un test de colonie embarquée
Des tests de réduction microbienne en surface et en colonie enfoncée ont été réalisés comme corrélat fonctionnel de transmission, où des échantillons étaient inoculés sur une surface mais irradiés du côté opposé (inférieur) pour simuler la présence de microbes sous la surface cutanée. Les UFC ont été quantifiées comme décrit ci-dessus dans la section efficacité antimicrobienne.
9. Spectroscopie FT-IR pour la dégradation de la peau synthétique après exposition à la lumière bleue et aux UV-C
Pour évaluer les changements chimiques et structurels potentiels de la matrice cutanée synthétique à base de collagène dus à l’exposition à la lumière, une spectroscopie infrarouge par transformée de Fourier (FT-IR) a été réalisée. Les échantillons synthétiques (2 cm × 2 cm) ont été hydratés selon les instructions du fabricant, identiquement aux échantillons utilisés dans les tests de réduction microbienne. Les échantillons hydratés ont été exposés soit à une lumière bleue de 405 nm (30 mW/cm²), soit à 265 nm UV-C (3 mW/cm²) pendant 15 minutes (exposition standard, 27 J/cm²) ou 60 minutes (pire des cas de contrainte). Après irradiation, les échantillons ont été doucement absorbés pour éliminer l’humidité de surface et immédiatement analysés par FT-IR.
10. Mesure ATR-FTIR
Les spectres étaient acquis à l’aide d’un spectrophotomètre IR équipé d’un logiciel d’analyse compatible. Tous les échantillons ont été analysés à l’aide du module Attenuated Total Reflectance (ATR) iD7. Pour isoler les changements spectraux attribuables à l’irradiation, (1) Une comparaison spectrale directe a été réalisée entre des témoins non traités et des échantillons irradiés. (2) Les comparaisons soustraites de base ont été réalisées en utilisant l’échantillon témoin non traité comme référence de fond avant de scanner les échantillons irradiés, permettant de visualiser uniquement les pics nouveaux ou modifiés.
Cette approche double réduit le bruit topographique et améliore la détection de changements subtils dans les régions amide et empreintes digitales. Le niveau d’hydratation, l’épaisseur de l’échantillon et l’orientation ont été standardisés sur tous les échantillons afin de réduire la variabilité spectrale. Chaque condition d’exposition (témoin, BL-15 min, BL-60 min, UV-15 min, UV-60 min) était scannée en triple exemplaire.
11. Analyse statistique
Toutes les expériences ont été réalisées en utilisant des triplicates biologiques indépendants, sauf indication contraire. Les données sont présentées en moyenne ± écart-type (SD) ou en moyenne avec intervalles de confiance (IC) à 95 %, comme indiqué dans les légendes des figures. La normalité de la distribution des données a été évaluée à l’aide du test de Shapiro-Wilk. Des comparaisons par paires entre deux groupes (par exemple, lumière bleue vs. UV-C, colonies de surface vs. colonies plongées) ont été réalisées à l’aide de tests t de Student à deux queues non appariés. Pour les comparaisons impliquant plus de deux conditions ou points temporels, une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) suivie de tests post-hoc appropriés a été appliquée. Le test statistique spécifique utilisé pour chaque comparaison est indiqué dans la légende correspondante de la figure. Une valeur p <0,05 était considérée comme statistiquement significative.