Article de méthode

Une technique simple de microaspiration pour isoler les cellules somatiques du sperme équin cryopréservé en tant que donneurs nucléaires pour le clonage

DOI :

10.3791/69404

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19 décembre 2025

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1Doctorado en Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, 2Departamento de Producción Agrícola y Animal, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, 3Integrated Cell Culture & Bioimaging Laboratory, Division of Science, Mathematics & Agribusiness, Mayville State University, 4Conservation, Genetics & Biotech, LLC, 5Laboratorio de Manejo de la Reproducción Animal, Departamento de Producción Agrícola y Animal, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole présente une technique simple de microaspiration pour isoler des cellules somatiques (SC) viables à partir du sperme équin cryopréservé. Contrairement aux approches traditionnelles, cette technique évite les longues cultures in vitro et permet de contourner la contamination par les spermatozoïdes, permettant une utilisation immédiate dans le clonage des cellules somatiques.

Résumé

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Le sperme est un fluide complexe qui, en plus des spermatozoïdes, contient d’autres populations cellulaires, notamment des cellules immunitaires, des cellules germinales mâles immatures, des cellules épithéliales et des fibroblastes. Ces cellules partagent la condition diploïde, ce qui en fait des candidates appropriées comme donneuses nucléaires pour le clonage de transfert nucléaire des cellules somatiques (SCNT). La génération d’embryons et de descendants viables a été démontrée grâce à ces cellules. Les méthodes efficaces pour les isoler du sperme incluent la centrifugation et les techniques de gradient osmotique ; Cependant, des périodes prolongées de culture in vitro sont nécessaires pour établir des cultures primaires à partir de ces cellules isolées. De plus, les échantillons prélevés contenaient une forte charge de spermatozoïdes, ce qui entrave l’établissement et le maintien des cultures in vitro . À ce jour, les cultures primaires n’ont été établies avec succès qu’à partir d’échantillons de sperme frais, tandis que les tentatives utilisant du sperme cryopréservé ont systématiquement échoué. Cette limitation limite considérablement la possibilité de générer des clones à partir d’échantillons de sperme cryopréservé. La présente étude propose une méthodologie simple basée sur la microaspiration pour isoler les cellules somatiques à partir du sperme équin cryopréservé. Cette approche permet la récupération rapide d’un nombre suffisant de cellules pour une utilisation immédiate dans les procédures de clonage SCNT.

Introduction

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Le clonage par transfert nucléaire par cellules somatiques est un outil inestimable pour le sauvetage et la multiplication d’individus d’intérêt zootechnique et scientifique. De nombreuses lignées cellulaires ont été utilisées comme donneuses nucléaires, notamment des cellules issues de la peau, du muscle, des granuloses, des lymphocytes et des cellulesurinaires 1,2,3,4. Fait intéressant, le sperme est apparu comme une alternative nouvelle pour la collecte de cellules somatiques (SC) destinées à être utilisées comme donneurs nucléaires pour leclonage de 5,6. Cette découverte est particulièrement importante pour le sauvetage des individus pour lesquels seul le sperme a été conservé. Cependant, la création de cultures primaires à partir de SC isolés à partir de sperme congelé a échoué et, à ce jour, reste le principal obstacle à l’obtention d’animaux clonés à partir de cettesource 7,8,9. Ces cellules proviennent probablement de l’épithélium glandulaire et de la muqueuse des tubules, des sécrétions séminales, et – ce qui est important – d’une contamination par l’urine par le sperme, cette dernière étant une source bien connue de cellules somatiques à fort potentiel prolifératifet non différencié 3.

Diverses méthodes pour isoler les SC du sperme ont été mises en œuvre, notamment la centrifugation5, les gradientsosmotiques 7, 8, 10 et la cytométrieen flux 11. Cependant, les cellules somatiques, une fois isolées par ces méthodes, nécessitent encore des conditions optimales pour l’attachement, la croissance etla prolifération 8. Les besoins spécifiques de ces cellules rendent la culture in vitro plus complexe, car des périodes d’incubation prolongées sont nécessaires pour l’établissement des cultures cellulairesprimaires 9. De plus, la forte concentration de spermatozoïdes présente dans les échantillons interfère à la fois avec l’initiation et le maintien de cescultures 5.

Contrairement aux approches précédemment décrites, cette technique de microaspiration présente plusieurs avantages évidents. Il permet de sélectionner les SC en fonction de la taille et de la morphologie12 et permet la récupération des noyaux à partir de cellules viables et non viables, une stratégie démontrée avec succès avec des tissus congelés sans cryoprotecteurs13 et des cellules reproductriceslyophilisées 14,15,16. Il est important de noter que les SC peuvent être utilisées immédiatement après la décongélation du sperme, réduisant ainsi le risque d’erreurs de ploïdie généralement associées à une culture in vitro prolongée des cellules somatiques primaires utilisées pour le clonageanimal 17,18. Plus précisément, la technique se concentre sur le sperme équin cryopréservé, permettant de collecter un nombre suffisant de SC pour être immédiatement utilisés pour SCNT12.

La fabrication de micropipettes et le développement de techniques de microaspiration ont considérablement progressé ces dernières décennies. L’utilisation de ces outils permet une manipulation précise des gamètes, embryons et de leurs cytostructures, créant de nouvelles possibilités dans le domaine de la biotechnologie reproductive (https://www.jove.com). Les techniques de micromanipulation permettent d’évaluer les propriétés mécaniques cellulaires et fournissent des informations précieuses sur leur étatphysiologique 19,20, mais ce domaine reste encore relativement inexploré.

À ce jour, aucune recherche n’a détaillé une technique efficace pour isoler les SC du sperme en utilisant une quelconque variante de la micromanipulation. Compte tenu des limites des méthodes d’isolation conventionnelles, cette étude propose un protocole pratique basé sur la microaspiration pour isoler les SC du sperme équin cryopréservé, permettant leur utilisation immédiate dans les procédures de clonage somatique après la collecte.

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Protocole

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Des échantillons de sperme cryopréservés, conservés plus de 19 ans dans de l’azote liquide, ont été obtenus auprès de distributeurs commerciaux autorisés par les autorités vétérinaires compétentes au Mexique, conformément à la norme officielle mexicaine NOM-027-ZOO-1995, qui régit le processus zoosanitaire du sperme provenant d’animaux domestiques. Tous les échantillons de sperme, qu’ils soient utilisés ou non pour analyse, ont été désactivés et éliminés conformément aux protocoles institutionnels de biosécurité et aux réglementations applicables, y compris la NOM-087-ECOL-SSA1-2002 pour la gestion des déchets biologiques et infectieux au Mexique. L’acide fluorhydrique résiduel (HF) était neutralisé en toute sécurité sous une hotte en le transférant lentement dans un contenant en plastique et en ajoutant progressivement de petites portions de CaCO3 ou Ca(OH)2 jusqu’à ce que l’effervescence cesse, formant ainsi unCaF 2 insoluble. Le pH de la suspension neutralisée a été confirmé entre 6 et 8 avant qu’elle ne soit gérée comme déchets chimiques inorganiques selon la réglementation locale. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Fabrication d’aiguilles en micropipette pour l’isolement des cellules somatiques

  1. Sélectionnez des capillaires en verre borosilicate (1,0 mm de diamètre du verre × 0,78 mm de diamètre du verre × 100 mm).
  2. Utilisez un extracteur de micropipette pour produire des capillaires à pointe fine. Ajustez le point de coupe pour varier le diamètre de la pointe.
  3. Insérez le capillaire dans le tireur et verrouillez-le fermement.
  4. Retirez la micropipette avec précaution après l’extraction et placez-la horizontalement sur la microforge.
  5. Alignez le chauffage et la micropipette dans le champ de vision du microscope.
  6. Localiser le point de coupe à l’aide du réticule de l’oculaire (Figure 1A,B).
  7. Mettez la pointe de la micropipette en contact avec la bille en verre (sur le filament du chauffage).
  8. Augmentez progressivement la chaleur jusqu’à ce que la pointe fonde dans la bille.
    1. Éteins le chauffage.
    2. Laissez la pointe adhérer à la bille et séparez-vous.
      REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de plier la micropipette ; il peut être utilisé sous sa forme simple. Cependant, si l’opérateur le préfère, un angle peut être formé (Figure 1C).
  9. Ne lissez pas la pointe, car cette étape est inutile pour la procédure.
  10. Nettoyez les pointes de la pipette en immergeant chaque pointe pendant ~10 secondes séquentiellement dans :
    1. 20 % d’acide fluorhydrique (HF).
      ATTENTION : L’acide fluorhydrique est hautement toxique et corrosif. Utilisez l’équipement de protection individuelle indiqué par le fournisseur. Insistez sur l’utilisation de protection oculaire et faciale, de gants et d’une blouse de laboratoire, et travaillez toujours dans une hotte à vapeur.
    2. Eau stérile double distillée.
    3. De l’éthanol absolu.
      REMARQUE : Pour faciliter le lavage de la pointe de la pipette, préparez les solutions mentionnées ci-dessus dans des tubes Corning stériles de 15 mL.
  11. Faites sécher les micropipettes au four à 50 °C.
  12. Conservez les micropipettes dans un contenant stérile.

2. Installation de microaspiration

  1. Vérifiez que le système de microaspiration fonctionne correctement, avec le joystick de microaspiration centré sur le panneau de contrôle.
  2. Pour les systèmes utilisant de l’huile, assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air à l’intérieur, car elles peuvent affecter la précision des mouvements.
  3. Insérez la micropipette d’aspiration de la cellule somatique dans le manipulateur de retenue du côté main dominante de l’opérateur.
    REMARQUE : Remplacez la micropipette par une nouvelle si la pointe se bouche lors de la collecte des cellules somatiques.

3. Dégel et dilution du sperme équin cryopréservé

  1. Retirez les pailles de l’azote liquide, exposez-les à l’air pendant 10 secondes, puis décongelez à 37 °C pendant 30 secondes.
  2. Première dilution du sperme : prélever un échantillon du sperme décongelé (250 μL) et diluer avec 1,0 mL de milieu DMEM/F12 complété avec 10 % de sérum fœtal bovin, 0,1 mg/mL d’albumine sérique bovine, 12,5 μM de β-mercaptoéthanol et 1 % antibiotique antimycotique.
    1. Faites couver le mélange à 37 °C pendant 30 minutes.
  3. Deuxième dilution du sperme : Prenez 25 μL de la première dilution, diluez-les dans 975 μL de 1x DPBS complétés par 0,1 mg/mL de poly(alcool vinylique) (PVA) ou de polyvinylpyrroldone (PVP), déposez-le dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL, puis mélangez doucement.
    1. Maintenez ce mélange à 37 °C tout au long du processus de collecte des cellules.

4. Préparation des plats pour la collecte des SC

  1. Collectez les SC à l’aide de deux couvercles provenant de bacs de culture de 35 mm de diamètre.
  2. Préparez le premier couvercle comme suit (couvercle #1, Figure 2A).
    1. Prenez 100 μL de la seconde dilution de sperme et déposez-les au centre du couvercle (voir Figure 2A).
    2. Préparez une seconde micro-goutte (10 μL) de 1x DPBS complétée par 0,1 mg/mL de PVA ou PVP au-dessus de la première goutte (voir Figure 2A).
    3. Couvrez complètement les deux micro-gouttes d’huile de paraffine pour éviter l’évaporation et maintenir la stabilité de la température lors de l’aspiration du SC.
  3. Préparez le second couvercle pour éliminer les débris cellulaires et les spermatozoïdes associés (couvercle #2, Figure 2B).
    1. Placez trois gouttes de 30 à 50 μL de 1x DPBS complétées par 0,1 mg/mL de PVA ou PVP au centre du couvercle ; Ne les recouvrez pas d’huile minérale.
      REMARQUE : Préparez ce bol de culture seulement après que toutes les cellules somatiques ont été sélectionnées afin d’éviter les modifications des propriétés physico-chimiques de la solution de DPBS dues à l’exposition à l’air.
  4. Effectuer toutes les étapes de microaspiration sous un microscope inversé à température ambiante. Évitez les changements brusques de température.

5. Procédure de microaspiration pour isoler les SC du sperme équin cryopréservé

  1. Placez le premier couvercle (couvercle #1, Figure 2A) sur l’étage du microscope, prêt à collecter les SC.
  2. Sélectionnez une micropipette avec le diamètre approprié pour collecter les SC et connectez-la au système d’aspiration mécanique.
  3. Insérez soigneusement la micropipette dans la micro-goutte et alignez-la avec le fond du couvercle de la vaisselle. Une fois que la pipette a aspiré le milieu de culture, on commence la capture individuelle des SC.
  4. Au fond de la boîte, diverses morphologies cellulaires devraient être visibles (Figure 3).
  5. Placez la pointe de la micropipette à côté de chaque SC et aspirez-les sous pression négative. Aspirez les cellules toutes rondes et allongées, quelle que soit leur taille. Le volume d’aspiration varie selon les captures de SC.
  6. Après avoir capturé 10 cellules, déposez-les dans la micro-goutte située sur le dessus (10μL) (Figure 2A). Répétez cette étape jusqu’à obtenir le nombre requis de SC pour l’expérience de clonage.
  7. Conservez toutes les cellules somatiques capturées dans cette micro-goutte tout au long du processus de collecte.
  8. Une fois le nombre requis de SC obtenu pour le clonage, effectuer une procédure de lavage simple à l’aide de micro-gouttes pour éliminer les spermatozoïdes associés, les débris cellulaires et les contaminants microbiens.
  9. Prenez le second couvercle de vaisselle et effectuez un lavage séquentiel en trois étapes des SC (couvercle #2, Figure 2B) :
    1. Capturez les cellules somatiques avec une micropipette et déposez-les soigneusement à la surface de la première goutte. Laissez-les se calmer pendant 3 à 5 minutes (Figure 2B ; Drop #1).
    2. Répétez l’étape 5.9.1, puis déposez-les dans la seconde goutte (Figure 2B ; Drop #2).
    3. Répétez l’étape 5.9.1, et déposez les cellules somatiques dans la troisième goutte (Figure 2B ; Drop #3).
  10. En dernière étape, déposez les cellules somatiques isolées dans une micro-goutte finale préparée pour une utilisation ultérieure dans les procédures de transfert nucléaire des cellules somatiques (Figure 4D).
    REMARQUE : Aspirez les SC dans le plus petit volume moyen possible lors de chaque recapture afin de minimiser les spermatozoïdes, les débris et les contaminants microbiens.

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Résultats

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Le tableau 1 montre que la technique de microaspiration récupère efficacement les cellules somatiques à partir du sperme équin cryopréservé, avec des taux de capture allant de 317,7 ± 9,60 à 424,7 ± 33,65 cellules/heure sur trois étalons. L’étalon #03 avait le rendement le plus élevé, démontrant l’efficacité de la méthode même avec des échantillons stockés à long terme. Les données indiquent que la technique isole de manière cohérente et efficace les cellules somatiques d...

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Discussion

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La micromanipulation des cellules et des gamètes a permis de simplifier les techniques complexes de procréation assistée. Parmi ces exemples, on trouve le clonage somatique par Hand MadeCloning 21, l’éclosionassistée 22, l’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI)23, et la microinjection pronucléaire chez les zygotes24, entre autres.

Le développement de ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

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Les auteurs remercient le Laboratoire de Gestion de la Reproduction, Département de la Production Agricole et Animale, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco (UAM-X), pour leur soutien technique et logistique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2 bêta MercaptoéthanolSIGMAM7522Culture de cellules somatiques
1x DPBSGIBCOREF-21600010Manipulation des cellules somatiques
Éthanol absoluHYCELEL CRISOL 50181-1L73Pour la fabrication de pipettes
Antibiotique-antimicotique 100xINVITRO SA. Mé ; xicoCulture de cellules somatiques
Capillaires borosilicatés (1,0 mm de diamètre et multiplié par 0,78 mm de diamètre intérieure et multiplié par 100 mm de longueur)HARVARD APPARATUS, ÉTATS-UNISEC1-30-0035Pour la fabrication de pipettes
BSASIGMAA3311Culture de cellules somatiques
DMEM/F12 moyenGIBCOREF-12500-062Culture de cellules somatiques
Échantillon de sperme cryopréservé équinLes échantillons de sperme cryopréservés ont été obtenus auprès d’un distributeur commercial et ont été conservés pendant plus de 19 ans dans de l’azote liquide. Tous les échantillons de sperme équins congelés ont été prélevés auprès de distributeurs commerciaux autorisés par les autorités vétérinaires compétentes au Mexique, conformément à la norme officielle mexicaine NOM-027-ZOO-1995, Processus zoosanitaire du sperme provenant d’animaux domestiques.
Réticule de l’oculaireOutil pour la fabrication de pipettesÉquipement requis
Sérum fœtal bovinGIBCOREF-26140-079Culture de cellules somatiques
Acide hydrofluriqueSIGMA-ALDRICH339261Pour la fabrication de pipettes
Microscope optique inverséEclipse, TE 200NIKONMicromanipulation des cellules somatiques
Laboratoire  ; Four secOutil pour la fabrication de pipettesÉquipement requis
MicroforgeOutil pour la fabrication de pipettesÉquipement requis
Ensemble de micromanipulateurs pour microscope inverséMicromanipulation des cellulesÉquipement requis
Extracteur de micropipetteP-97, SUTTER INSTRUMENTOutil pour la fabrication de pipettesUtilisez les paramètres suivants &mdash ; Chaleur : 720 ; Tirage : 30 ; Vitesse : 50 ; Temps : 220 ; Pression
Huile minéraleSIGMAM8410Manipulation des cellules somatiques
Nunclon  ; Plats de culture cellulaire, diamètre & époque ; H 35 mm et fréquences ; 10 mmNUNCLONNunc 153066
PVASIGMAP8136Culture de cellules somatiques
PVPSIGMAP5288Culture de cellules somatiques
Solution bleue de Trypan 0,4 %GIBCOREF- 15250061Colorant cellulaire

Références

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Microaspiration TechniqueSomatic Cell IsolationCryopreserved Equine SemenNuclear Donor CellsSomatic Cell Nuclear TransferEquine CloningCell Morphology SelectionMicropipette AspirationSequential Cell WashingDiploid Cell Recovery

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