Coloration par peroxysome dans les cellules de mammifères à l’aide de sondes spécifiques aux peroxysomes

Résumé

Les sondes PeroxiSPY sont utilisées pour détecter les peroxysomes dans les cellules de mammifères. Ici, nous montrons comment utiliser les sondes pour colorer les peroxysomes dans des cellules vivantes et fixes.

Résumé

Les peroxysomes sont des organites omniprésents ayant un rôle essentiel dans la santé humaine, et leur dysfonctionnement entraîne un éventail de troubles génétiques. La visualisation des peroxysomes est essentielle pour identifier les dysfonctionnements des peroxysomes ; Cependant, les progrès ont été limités par l’absence de sondes spécifiques aux peroxysomes. En développant PeroxiSPY, des sondes spécifiques aux peroxysomes qui imitent les métabolites naturels des peroxysomes, nous avons permis la détection, le suivi et la quantification en temps réel de la dynamique des peroxysomes chez les cellules de mammifères vivants. De plus, l’application de cette technique aux cellules de patients atteints de troubles des peroxysomes révèle des phénotypes pathologiques. Nous fournissons ici un protocole détaillé pour la détection des peroxysomes dans les cellules de mammifères vivants, ainsi que pour la détection des peroxysomes après coloration dans des cellules fixes. Nous démontrons comment colorer les peroxysomes dans des cellules vivantes à l’aide de sondes spécifiques aux peroxysomes, en nous concentrant sur la préparation des cellules, le calendrier de la procédure, la reproductibilité et le dépannage. Ces sondes permettent une détection rapide, spécifique et non toxique des peroxysomes dans les cellules vivantes, offrant une méthode unique et quantitative pour évaluer la fonction des peroxysomes et son dysfonctionnement dans les troubles liés aux peroxysomes.

Introduction

Le peroxysome est l’organite eucaryote le plus abondant, certaines cellules dépassant mille^peroxysomes. Leurs fonctions sont essentielles au développement de l’organisme et à l’adaptation^{métabolique 1,2}, comme en témoignent une série de troubles des peroxysomes humains, généralement des troubles neurodégénératifs et neurométaboliques incurables chez les jeunes^{enfants 3,4}. À notre connaissance, il y a auparavant un manque de méthodes sélectives pour marquer les peroxysomes dans les cellules et tissus vivants. Ces outils sont inestimables pour la recherche et les applications diagnostiques, permettant une mesure directe et quantitative de plusieurs aspects de la formation et de la fonction des^{peroxysomes 6}. Ces sondes sont suffisamment polyvalentes pour, d’une part, fournir une lecture quantitative de la fonction des peroxysomes dans les cellules, et d’autre part, être utilisées dans des tests d’efficacité translationnelle ou comme diagnostics des troubles des^{peroxysomes 6}. La coloration PeroxiSPY est une technique rapide, spécifique et non cytotoxique pour la détection non invasive des peroxysomes de cellules vivantes. Ici, nous décrivons comment colorer les peroxysomes dans les lignées cellulaires de mammifères à l’aide de sondes peroxysomiques (les sondes ont également démontré une coloration peroxysomale spécifique chez des embryons de poisson-zèbre, mais ne conviennent pas à la coloration des peroxysomes dans les cellules d’Arabidopsis thaliana ⁶). La coloration peut être réalisée en moins de 10 minutes. La sonde peut alors être détectée pendant des heures ou fixée à l’aide d’un protocole de fixation au paraformodéhyde pour une immunocoloration supplémentaire.

Protocole

1. Coloration des cellules vivantes

1. Préparation de la culture cellulaire pour l’imagerie de cellules vivantes (durée : 24 h)
   REMARQUE : L’étude a suivi les protocoles standards de culture cellulaire pour toutes les expériences. Les lignées cellulaires ont été maintenues en DMEM ou DMEM/F12 pour SH-SY5Y, complétées par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 1 % de pénicilline/streptomycine, à 37 °C et 5 % de_CO-2. Certains systèmes d’imagerie sont sensibles à la composition du milieu. Si le microscope détecte le signal du rouge de phénol dans le milieu, utilisez des alternatives sans rouge de phénol. De plus, si le microscope n’est pas équipé d’une chambre de_CO2 , remplacer le milieu par un milieu contenant un HEPES (pH 7,4).
   1. Un jour avant l’expérience, séparez les cellules en une plaque d’imagerie à fond de verre pour obtenir une confluence de 30 à 70 % le lendemain.
      REMARQUE : Dans ce protocole, des plaques de 35 mm à 4 puits étaient utilisées.
      1. (Critique) N’utilisez pas de cellules affamées ou stressées pour se diviser pour l’expérience. Assurez-vous que les lignées cellulaires subissent régulièrement des changements de milieu frais (au moins tous les 2-3 jours) et qu’elles soient séparées avant d’atteindre 90 % de confluence. L’objectif est d’avoir une lignée cellulaire saine afin d’assurer une coloration uniforme.
         REMARQUE : Certaines cellules, par exemple les cellules souches, nécessitent un revêtement en verre avec une couche de revêtement appropriée, par exemple Matrigel, qui n’interfère pas avec la coloration.
2. Préparation de l’installation d’imagerie (durée : 1h)
   REMARQUE : L’imagerie des organites et de la dynamique des organites nécessite une haute résolution spatiale. Pour ce protocole, un microscope confocal équipé d’un module photomultiplicateur GaAsP, d’une chambre de_CO-2 et d’une unité de contrôle de température a été utilisé. L’imagerie a été réalisée à l’aide d’un mode de balayage galvanométrique bidirectionnel avec un objectif CFI Plan Apo Lambda 60x huile NA 1.42, et un laser de 561 nm (50 mW) a été utilisé pour la sonde 555. Utilisez un laser 640 nm ou équivalent pour la sonde 650. Les peroxysomes ont été visualisés dans des lignées cellulaires humaines. Le temps d’incubation avec les sondes peut différer selon les lignées cellulaires. Il est recommandé d’optimiser le timing en visualisant les cellules à différents moments après la coloration (Figure 2A).
   1. Activez le système confocal. Assurez-vous que le_CO2 et la température (37 °C) sont stabilisés pendant 20 minutes avant de commencer la coloration et d’introduire les cellules au microscope.
      REMARQUE : (Critique) Il est essentiel de vérifier que les cellules restent saines tout au long de l’expérience par inspection visuelle et que le pH et la température du milieu sont maintenus. Cela peut être réalisé en utilisant des unités de contrôle pour les paramètres et en inspectant visuellement la coloration du support, si le rouge phénol est utilisé. Pour cela,_{des contrôleurs} de température et de CO 2 peuvent être utilisés.
   2. Installez le logiciel de microscope confocal. Lance le logiciel et allume le laser 561 nm pour la coloration de la sonde 555. Ajustez les paramètres d’acquisition et de puissance laser. Ce protocole utilise 1 % de puissance laser, un gain de haute fréquence de 100, et une résolution de 1024 à 1024 pixels avec un zoom de 3 pour imager les cellules.
3. Coloration au peroxysome (Durée : 1-5 min)
   1. Pipeter une aliquote de la sonde pour une concentration de travail finale de 1 μM, par exemple pour 0,5 mL de milieu, pipeter 0,5 μL de la sonde.
   2. Sélectionnez le puits à teindre, et identifiez-le à l’extérieur avec un marqueur.
   3. Depuis le puits choisi, on pipette tout (0,5 mL) du milieu et on le dispense dans un tube microcentrifuge contenant l’aliquote de la sonde de l’étape 1.3.1.
      REMARQUE : Il est crucial d’enlever tous les milieux du puits à cette étape pour assurer une teinture uniforme.
   4. Pipette de haut en bas 3 fois pour mélanger le média et la sonde. Aspirez tout le mélange dans la pipette.
      REMARQUE : Le mélange par vortex peut être utilisé à la place du pipetage.
   5. Reversez le mélange goutte par goutte dans le puits choisi, en veillant à ce que la pipette soit en contact avec la paroi du puits. Après avoir remis le mélange dans le puits, commencez un minuteur de 10 minutes.
   6. Fermez le couvercle, ajoutez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif (ce protocole utilise un objectif à 60× d’huile), puis positionnez la plaque sur le microscope pour l’imagerie.
      REMARQUE : Il est recommandé d’optimiser la concentration de la sonde pour chaque lignée cellulaire afin d’assurer une coloration uniforme. Il est recommandé de tester à 0,25, 0,5, 1 et 2 μM pendant 5 à 20 minutes ; les concentrations plus faibles se colorent généralement avec un fond inférieur (Figure 2A). Selon la lignée cellulaire et la sensibilité du détecteur au microscope, les cellules colorées peuvent être imagées dès 5 minutes après l’ajout de la sonde jusqu’à 24 heures après l’addition. Dans certains cas, par exemple lors de l’imagerie des cellules souches, la visualisation des cellules peut être effectuée pendant plus de 180 minutes après l’ajout de la sonde sans changement du signal. À tout moment, le support peut être modifié pour nettoyer la sonde. Cela entraînera une perte progressive de la coloration en environ 30 minutes pour HEK293T cellules.
4. Imagerie confocale des peroxysomes dans les cellules vivantes (durée : 10 min-3 h)
   1. Une fois la plaque positionnée sur le microscope, ajustez la mise au point sur les cellules du puits coloré et commencez l’imagerie.
   2. Une fois les cellules nettes, ajustez le gain (HV ou sensibilité du détecteur) et les réglages de puissance laser en suivant les directives standard de configuration du microscope confocal.
   3. Trouver et positionner (zoom) sur le groupe de cellules. Après avoir focalisé les cellules, ajustez les paramètres d’acquisition à la qualité d’image requise.
      1. Définir les paramètres d’imagerie pour l’acquisition d’image : 0,5-1 % de puissance laser, 100 HV (gain) dans le logiciel NIS-Elements. Vérifiez que l’image n’est pas sursaturée (si c’est le cas, modifiez l’intensité et le gain).
      2. Sélectionnez la taille du scan. Acquérir 1024 images 1024 px, vitesse de balayage (1/2-1/4), moyenne de ligne (2), zoom (3) adapté à l’imagerie réalisée.
         REMARQUE : Les peroxysomes se déplacent lors de l’acquisition de l’image, ce qui peut entraîner des artefacts. Les paramètres recommandés sont optimisés pour minimiser les traces de mouvement tout en assurant une qualité suffisante des images pour la quantification. Lors de la création d’un time-lapse, assurez-vous que l’intervalle, la durée et les boucles sont spécifiés avant de lancer la vidéo. Les sondes sont photoscriptables.
   4. Acquérez et enregistrez toutes les images avec des étiquettes accessibles (ici, le format logiciel Nikon .nd2 NIS-Elements est utilisé).

2. Coloration des cellules fixes

1. Préparation de la culture cellulaire pour l’imagerie de cellules vivantes (durée : 24 h)
   REMARQUE : Les protocoles standards de culture cellulaire ont été suivis pour toutes les expériences. Les cellules Huh7 ont été maintenues en DMEM/F12 complétées avec 10 % de FBS, 1 % de pénicilline/streptomycine, à 37 °C et 5 % de_CO2.
   1. Un jour avant l’expérience, séparez les cellules en une plaque avec des couvertures pour atteindre une confluence de 30 à 70 % le lendemain.
      REMARQUE : Semez 50 000 cellules/puits dans des plaques à 12 puits avec des gloutes de 18 mm, ou 15 000 cellules/puits dans des plaques à 24 puits avec des glappes de 13 mm.
2. Coloration au peroxysome (Durée : 1-5 min)
   1. Diluer la sonde avec un nouveau milieu jusqu’à une concentration de travail finale de 4 μM dans un tube de microcentrifuge photosensible vide, par exemple pour 0,5 mL de milieu, et pipeter 2 μL de la sonde (solution d’origine : 1 mM).
   2. Sélectionnez le puits à teindre et étiquetez-le à l’extérieur avec un marqueur.
   3. À partir du puits choisi, aspirez tout (0,5 mL) du milieu et remplacez-le par le milieu sonde de l’étape 2.2.1. Dispensez le milieu de sonde dans le puits choisi, goutte par goutte, en veillant à ce que la pipette soit en contact avec la paroi du puits.
   4. Après avoir réintégré le mélange dans le puits, couver les cellules à 37 °C pendant 10 à 15 minutes.
      REMARQUE : À partir de ce moment, les cellules sont sensibles à la lumière et doivent être recouvertes de papier aluminium.
3. Fixation post-coloration et imagerie des peroxysomes dans des cellules fixes
   1. Après la coloration, retirez soigneusement le milieu et lavez les cellules deux fois avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS).
   2. Appliquez une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans du PBS à température ambiante pendant 20 minutes.
   3. Retirez soigneusement le PFA dans un contenant à déchets spécifiquement désigné. Lavez les cellules une fois avec PBS.
      ATTENTION : La PFA est toxique et doit être éliminée conformément aux réglementations institutionnelles.
   4. Pour procéder à l’immunofluorescence, suivez les étapes ci-dessous
      1. Ajoutez 0,5 % de Triton-X (dilué dans PBS) pour perméabiliser les cellules. Laissez reposer 2,5 minutes.
      2. Retirez prudemment le Triton-X. Laver les cellules deux fois, pendant 10 minutes avec PBS.
      3. Bloquez avec une solution d’albumine sérique bovine à 5 % (BSA) dans un PBS pendant 20 minutes à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C.
      4. Procédez à la procédure standard d’immunofluorescence.

Résultats

Les sondes PeroxiSPY sont conçues pour imiter les substrats naturels des peroxysomes - acides gras ramifiés et à très longue^{chaîne 5}. Par conséquent, la coloration entraînera une importation dépendante du triphosphate d’adénosine (ATP) de la sous-famille D de cassettes de liaison D (ABCD) du cytoplasme dans les peroxysomes ^5,6,7. Selon l’état métabolique cellulaire, le transport ABCD dépendant de l’ATP peut importer efficacement et rapidement les sondes, ce qui entraînera un rapport de fluorescence élevé entre peroxysomes et cytoplasme (Figure 1A). Les étapes cruciales pour garantir un ratio élevé incluent l’évitement de la privation des cellules en remplaçant régulièrement le milieu cellulaire et en évitant la croissance des cellules à forte confluence.

Pour vérifier la spécificité de la coloration par peroxysome, il est recommandé d’inclure plusieurs témoins (Figure 1B, C). Analyse de co-localisation avec un marqueur peroxysomal de référence, par exemple, le marqueur d’importation de protéine - GFP-SKL (Figure 1B,C). De plus, si des lignées cellulaires déficientes en peroxysomes sont disponibles, par exemple PEX19 KO, la coloration sera absente dans ces cellules (Figure 1B)^5,8.

Les sondes de peroxysome peuvent être utilisées pour mesurer la densité des peroxysomes (Figure 1C)^5,9, et sont en cours de développement pour évaluer l’importation du substrat, la dynamique des peroxysomes et les interactions. Pour l’imagerie quantitative, il est important de standardiser la procédure de coloration, le moment d’acquisition de l’image (par exemple, 10-20 minutes après la coloration), la préparation de la lignée cellulaire et les paramètres d’acquisition. Certaines lignées cellulaires nécessitent une optimisation de la concentration de la sonde ainsi que du timing afin d’améliorer l’intensité du signal des peroxysomes par rapport au fond cytosolique ; par exemple, 250 nM et 20 min fonctionnent mieux pour les cellules COS-7 (Figure 2A). Les cellules métabolisent les sondes, ce qui conduit à une réduction progressive de la coloration des peroxysomes au fil du temps ; cependant, le rapport peroxysome/cytoplasme peut s’améliorer sur 24 heures (Figure 2B). De plus, nous avons développé une procédure de fixation, qui permet la co-coloration avec des anticorps et la visualisation ultérieure des peroxysomes (Figure 2C,D).

Figure 1 : Imagerie cellulaire vivante des peroxysomes. (A) Schéma de coloration. (B) Microscopie confocale des cellules WT et PEX19 KO HEK293T surexprimant GFP-SKL et colorée avec la sonde peroxysome rouge (1 μM pendant 10 minutes). Barres d’échelle - 1 μm et 10 μm. Le profil d’intensité représentatif est affiché. (C) Microscopie confocale de fibroblastes humains surexprimant GFP-SKL et colorée avec PeroxiSPY (1 μM pendant 10 minutes). Barres d’échelle - 1 μm et 10 μm. Le profil d’intensité représentatif est affiché. (D) Microscopie confocale des cellules SW13 (Cortex surrénal), SH-SY5Y (Neuroblastes), CCL-136 (Myocytes), HaCat (Kératinocytes), U2OS (ostéoblastes) et HEK293T (rein embryonnaire humain) colorées avec la sonde peroxysome rouge (1 μM pendant 10 minutes). Barres d’échelle - 2 μm et 10 μm. La quantification a été réalisée en utilisant les Fidji comme décrit^{précédemment 9} et montre le nombre de peroxysomes par micron carré, la moyenne ± SEM, N = 100 cellules regroupées à partir de 3 répétitions biologiques, *** - p < 0,001, **** - p < 0,0001, test de Kruskal-Wallis. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Optimisation par imagerie par peroxysome et coloration des cellules fixes. (A) Microscopie confocale des cellules COS-7 (rein du singe vert africain) colorées avec la sonde peroxysome rouge selon le protocole (1 μM pendant 10 minutes ; avant optimisation) et dans des conditions optimisées (250 nM pendant 20 minutes ; après optimisation). Barre-d’échelle - 10 μm. L’intensité moyenne des pixels des peroxysomes et du cytosol a été quantifiée à l’aide de Fidji et exprimée sous forme de rapport. N = 7 cellules (avant optimisation) et 21 cellules (après optimisation). Moyenne ± SEM, *** - p < 0,001, **** - p < 0,0001, test de Shapiro-Wilks. (B) Microscopie confocale de HEK293T cellules colorées avec la sonde peroxysome rouge (1 μM) pendant 15 minutes et 24 heures. La quantification montre l’intensité de fluorescence des peroxysomes et du cytoplasme, ainsi que le rapport peroxysome/cytoplasme, la moyenne ± SEM, N = 680 peroxysomes regroupés à partir de 3 répétitions biologiques, **** - p < 0,0001, test de Shapiro-Wilks. (C) Microscopie confocale de cellules Huh7 colorées avec des sondes peroxysomes en utilisant le protocole de fixation. Les peroxysomes ont été co-colorés avec l’anticorps primaire anti-PEX14 (1:100 en solution bloqueante, incubation de 1 h à RT) et l’anticorps secondaire (1:1000 en solution bloquante, anti-Rabbit Alexa Fluor 488 pour la chèvre, incubation de 1 h à RT). Des images représentatives de confocaux sont montrées. Barres d’échelle - 10 μm. (D) La quantification montre les variations d’intensité de fluorescence des peroxysomes lors de la fixation et de la perméabilisation effectuées sur HEK293T cellules selon le protocole, moyenne ± SEM, N = 100 cellules regroupées à partir de trois répétitions biologiques, **** - p < 0,0001, test de Shapiro-Wilks. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Discussion

Cette simple détection de peroxysome peut être réalisée en moins de 10 minutes dans les cellules animales. La coloration PeroxiSPY permet la visualisation, la quantification et le traçage des peroxysomes dans les cellules vivantes et est disponible sous forme de rouge (Table of Materials) et de sonde^{rouge lointain 5} (Table of Materials). La coloration offre une visualisation peroxysome similaire à celle d’une coloration classique basée sur le signal de ciblage peroxysome (PTS1)^{l 10} (Figure 1B) sans besoin de surexpression. Les fluorophores sont photostables et peuvent être utilisés pour l’imagerie à super-résolution et l’acquisition à long terme de la dynamique des peroxysomes dans différentes conditions^{expérimentales 5,9,11}. De plus, les sondes sont sensibles au fonctionnement des peroxysomes ; ils peuvent donc être utilisés pour détecter et quantifier la pathologie des^{peroxysomes 5} à des fins de recherche et des applications diagnostiques. La coloration par peroxysome dépend du métabolisme des peroxysomes et de la capacité des peroxysomes à importer et oxyder les acides gras. Il est donc important d’optimiser la concentration et le moment pour les lignées cellulaires utilisées. Nous présentons ici une procédure standard qui fonctionne pour les lignées cellulaires que nous avons testées ; cependant, le moment de la coloration peut être prolongé à 24 heures sans perte du rapport d’intensité de fluorescence peroxysome/cytoplasme (Figure 2B).

Les sondes ont été testées sur de nombreuses lignées cellulaires de mammifères (Figure 1 et Figure 2) ainsi que sur des cellules et embryons 5 de poisson-zèbre Danio rerio^, montrant une spécificité aux peroxysomes et une facilité d’utilisation. Ces sondes n’ont pas été testées sur d’autres lignées cellulaires animales, et les conditions ainsi que les concentrations des sondes devront être optimisées pour elles. Les sondes ne colorent pas les peroxysomes dans les cellules d’Arabidopsis thaliana ⁵.

Certains problèmes et leurs solutions respectives pour le dépannage sont abordés ici. Si le rapport peroxysome/cytoplasme est trop bas (faible coloration au peroxysome), assurez-vous que les cellules sont fraîchement divisées, puis séparez-les à nouveau pour la coloration. Utilisez une confluence de 30 à 70 % pour la coloration. Optimisez la concentration de la sonde (une concentration trop élevée entraînera un dépassement de la capacité de peroxysome à absorber les sondes) et le timing (par exemple, voir Figure 2A). Utilisez un plat à fond en verre de 35 mm (la coloration dans des plaques à 96 puits est plus difficile à cause du mélange en faible volume). Assurez-vous que les sondes sont ajoutées au tube de la microcentrifuge et bien mélangées au milieu avant d’être ajoutées aux cellules. Différentes lignées cellulaires et conditions variées auront un effet sur la coloration. Enfin, laver la sonde réduira le fond ; cependant, le signal sera progressivement perdu, réduisant ainsi le temps nécessaire pour effectuer efficacement l’imagerie.

S’il n’y a pas de peroxysomes visibles, assurez-vous que la sonde a été mélangée au substrat. Augmenter la concentration de la sonde (par exemple, à 2 μM). Introduire un marqueur peroxysomal supplémentaire pour s’assurer que les peroxysomes peuvent être visualisés. S’il y a une variation de coloration d’une cellule à l’autre, il est important d’enlever tout le milieu et de le mélanger soigneusement avec l’aliquote avant de le réintégrer aux cellules. Cela assure une teinture uniforme. S’il existe encore une variation, il est possible que la population cellulaire soit hétérogène dans leur capacité d’importation de substrats peroxysomes. La synchronisation des cellules par une séparation régulière favorise une coloration uniforme. Si aucun signal n’est détecté, vérifiez que les réglages laser des microscopes sont compatibles avec les paramètres d’excitation/émission de la sonde. Si le fond extérieur de la cellule est trop lumineux, il faut laver les sondes pour retirer ce fond ; cependant, le signal sera progressivement perdu, réduisant ainsi la fenêtre de temps pendant laquelle l’imagerie peut être réalisée efficacement. De plus, la fixation peut être utilisée pour réduire le fond. Si le signal post-fixation est très faible, vérifiez si le signal est perdu après l’ajout du Triton-X 100. Cette étape peut être modifiée ou supprimée selon l’application en aval. Réduisez les étapes de lavage.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps anti-PEX14	Proteintech	10594-1-AP
Confocal Microscope	Nikon	A1r	Tout microscope confocal avec un objectif NA élevé, par exemple 60x huile NA1.4
DMEM	Pan Biotech	; P04-03590	Milieu de culture cellulaire
Plaques d’imagerie à fond de verre	Cellvis	D35C4-20-1.5-N
Anti-Lapins Alexa Fluor 488  ;	ABCAM	ab150081
HEK293T	ATCC	CRL-3216  ;
PeroxiSPY555	Spirochrome	https://spirochrome.com/product/peroxi_spy555/	; https://doi.org/10.1038/s41467-024-48679-2
PeroxisPY650	Spirochrome	https://spirochrome.com/product/peroxi_spy650/	; https://doi.org/10.1038/s41467-024-48679-2