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Article de méthode

Modélisation des macrophages associés aux tumeurs in vitro : le rôle des facteurs sécrétés dans la dynamique des microenvironnements tumoraux

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DOI :

10.3791/69406

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30 décembre 2025

 ,  ,  , 
1Instituto de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, 2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Instituto de Medicina Experimental (IMEX), CONICET, Academia Nacional de Medicina

Dans cet article

Résumé

Ce manuscrit présente un protocole in vitro pour générer des cellules macrophages associées à la tumeur en exposant des monocytes humains à des milieux conditionnés issus de lignées cellulaires tumorales.

Résumé

Les macrophages présentent une plasticité remarquable, leur permettant d’acquérir des états fonctionnels distincts en réponse à une variété d’indices environnementaux. Dans les tumeurs solides, elles constituent fréquemment la population cellulaire immunitaire la plus abondante dans le microenvironnement tumoral, où elles sont appelées macrophages associés à la tumeur (TAMs). Les TAM interagissent étroitement avec les cellules malignes, favorisant activement la progression tumorale, l’angiogenèse et l’évasion immunitaire. Les cellules tumorales peuvent reprogrammer les macrophages par contact direct cellule-cellule et une large gamme de facteurs sécrétés, façonnant leur polarisation vers des phénotypes pro-tumoraux. Pour étudier ces mécanismes de polarisation TAM in vitro, nous proposons une méthode qui expose les monocytes humains à des facteurs solubles présents dans des milieux conditionnés par des lignées cellulaires tumorales. Ce protocole permet la génération de macrophages de type TAM dans des conditions contrôlées, facilitant l’analyse des changements phénotypiques et fonctionnels induits par des signaux d’origine tumorale. Notre approche propose un modèle reproductible et physiologiquement pertinent pour étudier les interactions tumeur-macrophage, approfondit notre compréhension de la reprogrammation des macrophages et soutient la recherche sur de nouvelles stratégies thérapeutiques en immunologie du cancer et en immunothérapie.

Introduction

Les macrophages sont des cellules immunitaires innées multifonctionnelles dont la plasticité remarquable leur permet d’adopter des phénotypes divers en réponse aux signaux environnementaux1. Au sein des tumeurs solides, les macrophages deviennent souvent la population cellulaire immunitaire la plus abondante et se différencient en macrophages associés à la tumeur (TAMs)2. Ces cellules sont activement reprogrammées par le microenvironnement tumoral pour soutenir la croissance tumorale, favoriser l’angiogenèse, faciliter la métastase et supprimer les réponses immunitaires antitumorales efficaces. Les cellules tumorales entraînent cette polarisation à la fois par des interactions cellulaires directes et un répertoire complexe de facteurs sécrétés, incluant les cytokines, les chimiokines et les facteurs de croissance, qui remodelent les programmes transcriptionnels et fonctionnels desmacrophages 3. Cette interaction dynamique sous-tend le rôle central des TAM dans la biologie du cancer et met en lumière la plasticité des macrophages comme un défi et une opportunité d’interventionthérapeutique 2.

La pertinence clinique des TAM est de plus en plus reconnue : leur abondance dans les tumeurs est souvent corrélée à un mauvais pronostic et à une résistance aux thérapies 4,5. Par conséquent, lesTAM 6 se sont imposés comme des cibles thérapeutiques attractives. Des stratégies visant à bloquer leur recrutement, à inhiber leur survie ou à les reprogrammer vers des phénotypes inflammatoires et tumoricides sont actuellement en coursd’étude 6. Comprendre les mécanismes par lesquels les facteurs dérivés des tumeurs polarisent les macrophages en TAM est donc essentiel pour développer des immunothérapies efficaces. Bien que le blocage des points de contrôle immunitaires ait montré un grand succès dans de nombreux cancers, son efficacité reste limitée chezd’autres 7. La combinaison de thérapies ciblant les cellules T, telles que les anticorps anti-protéine anti-mort cellulaire programmée 1 (-1) ou anti-anti-ligand de mort cellulaire programmée 1 (PDL-1), avec des stratégies de reprogrammation des macrophages, peut renforcer la réponse immunitaire antitumorale globale.

Les modèles expérimentaux traditionnels pour étudier la biologie des TAM ont inclus des modèles in vivo du cancer murin, qui offrent un environnement complexe et physiologiquementpertinent 8. Ces modèles ont apporté des informations fondamentales sur le recrutement et le fonctionnement des TAM. Cependant, des différences interespèces significatives dans la signalisation immunitaire, la biologie tumorale et l’ontogenèse des macrophages peuvent limiter la traduction directe vers la maladiehumaine 9,10. De plus, la complexité des systèmes in vivo rend difficile l’isolement et l’étude de voies de signalisation spécifiques ou d’événements moléculaires qui entraînent la polarisation des macrophages.

En revanche, les modèles in vitro offrent des conditions plus simples et contrôlées pour disséquer ces mécanismes. L’approche la plus largement utilisée consiste à polariser les macrophages dérivés des monocytes humains avec des stimuli définis : l’interféron gamma (IFN) et le lipopolysaccharide bactérien (LPS) pour générer des macrophages pro-inflammatoires (M1), ou l’interleucine 4 (IL-4) et l’interleukine 10 (IL-10), ou encore la dexaméthasone pour obtenir divers sous-types de macrophages anti-inflammatoires (M2) 11,12,13,14 . Ces modèles ont permis d’identifier des marqueurs moléculaires et des programmes transcriptionnels associés aux états canoniques de polarisation des macrophages. Néanmoins, elles ne parviennent pas à reproduire l’environnement complexe et multifactoriel rencontré par les macrophages dans les tumeurs, où la polarisation résulte de l’influence simultanée de nombreux médiateurs solubles, des signaux métaboliques et des interactions cellulaires15,16. Bien que la classification classique M1/M2 reste utile pour décrire les états fonctionnels des macrophages, il est désormais clair qu’il existe bien plus de populations de macrophages qu’on ne le pensait auparavant. Les travaux du groupe du Dr Ginhoux et d’autres, utilisant des approches transcriptomiques unicellulaires, ont démontré la grande diversité des sous-ensembles de macrophages présents à la fois dans des conditions physiologiques et dans la maladie17,18. Cela met en lumière que les TAM, bien que souvent décrits comme ressemblant à des profils de type M2, ne sont pas strictement équivalents aux macrophages différenciés uniquement par des cytokines canoniques ; ils partagent plutôt certaines caractéristiques mais présentent aussi des différences distinctes et dépendantes du contexte.

Pour combler cet écart, nous présentons un protocole in vitro qui modélise la polarisation de type TAM en exposant des macrophages dérivés des monocytes humains à des milieux conditionnés collectés sur des lignées cellulaires tumorales. Cette méthode capture l’influence du sécrétome tumoral, un mélange riche de cytokines, de chimiokines et de facteurs de croissance sécrétés par les cellules cancéreuses. Il offre ainsi un système pertinent et expérimentalement accessible pour étudier la reprogrammation phénotypique et transcriptionnelle des macrophages en réponse aux facteurs solubles dérivés des tumeurs. Contrairement aux approches précédentes où les monocytes étaient directement exposés à des milieux conditionnés par la tumeur, ce protocole se concentre spécifiquement sur la reprogrammation des macrophages, reflétant ainsi mieux le comportement des macrophages résidents dans le microenvironnementtumoral 19,20. De plus, il intègre un panel optimisé et simple de marqueurs de surface pour évaluer la polarisation des macrophages par cytométrie en flux, ce qui est facile à mettre en œuvre et peut être étendu selon les besoins del’enquêteur 14,21. Enfin, puisque le M-CSF a montré qu’il est prêt à préparer les monocytes vers un phénotypede type M2 10,15,22,23,24, nous l’avons délibérément omis afin de nous assurer que toute polarisation observée des macrophages résulte spécifiquement de l’exposition à des milieux conditionnés dérivés de lignées cellulaires tumorales.

Cette approche présente plusieurs forces : elle conserve la reproductibilité et la simplicité des systèmes in vitro, utilise les cellules humaines primaires pour une plus grande pertinence translationnelle, et reflète mieux la nature hétérogène et multifactorielle du microenvironnement tumoral que les modèles à cytokineunique 25,26,27,28. De plus, il facilite des études comparatives des réponses des macrophages à des milieux conditionnés issus de différents types de tumeurs ou de cellules cancéreuses génétiquement modifiées, et sert de plateforme pour tester des agents pharmacologiques susceptibles de modifier la polarisation TAM. Au-delà de son applicabilité générale, cette méthode peut être adaptée à différents modèles tumoraux en sélectionnant des lignées cellulaires appropriées ou en ajustant la proportion de milieux conditionnés. Néanmoins, les utilisateurs doivent être conscients que la variabilité entre donneurs sains et lignées cellulaires tumorales peut affecter la reproductibilité, soulignant l’importance d’une conception expérimentale rigoureuse et d’une standardisation.

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Protocole

Des échantillons de sang périphérique ont été prélevés auprès de donneurs sains après consentement éclairé conformément à la Déclaration d’Helsinki. Ce protocole a été approuvé par le Comité d’éthique institutionnelle de l’Université de Buenos Aires. Voir le tableau des matériaux pour les détails sur tous les matériaux et réactifs utilisés dans ce protocole.

REMARQUE : Maintenir des conditions stériles tout au long du protocole, en travaillant dans une armoire de biosécurité niveau 2 (BSL-2), et assurer la viabilité cellulaire >90 %. Pour leur élimination, tous les déchets biologiques doivent d’abord être décontaminés en les laissant tremper dans une solution d’hypochlorite de sodium à 10 % pendant au moins 30 minutes, puis placés dans le contenant approprié pour l’élimination des risques biologiques.

1. Culture de lignées tumorales et préparation de milieux conditionnés

  1. Décongeler la lignée cellulaire MDA-MB-231 triple négative du cancer du sein humain (ou d’une autre tumeur sélectionnée) à partir du stockage d’azote liquide. Immergez immédiatement les cryotubes contenant des lignées cellulaires dans un bain-marie à 37 °C et faites doucement tourner le flacon pour assurer une décongélation rapide et uniforme. Retirez rapidement le flacon lorsqu’il est presque décongelé.
  2. Transférez les cellules décongelées dans un tube de centrifugation de 15 mL contenant 5 mL de solution séline tamponnée phosphate stérile (PBS). Centrifugez la suspension à cellules à 400 × g pendant 5 minutes à température ambiante (RT).
    REMARQUE : Le processus de décongélation doit être effectué rapidement pour préserver la viabilité cellulaire.
  3. Éliminez soigneusement le surnageant et resuspendez rapidement le pellet cellulaire dans 1 mL de Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) frais et complet, contenant un taux élevé de glucose (4,5 g/L) avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 4 mM de glutamine et 1 mM de pyruvate de sodium. Comptez les cellules de la pastille en suspension en effectuant la dilution en série en deux étapes suivantes :
    1. Préparez d’abord une dilution en suspension 1:5 dans un milieu DMEM stérile, puis (1:2) avec la coloration de viabilité Trypan Blue pour obtenir une dilution finale de 1:10.
    2. Utilisez un microscope optique pour compter les cellules viables à l’intérieur de l’hémocytomètre de Neubauer (ou chambre de comptage). Comptez les cellules viables (uniquement celles qui excluent le colorant bleu) et déterminez le nombre moyen de cellules viables par grand carré d’angle.
    3. Calculez la concentration finale à l’aide de la formule suivante : Cellules/mL = (Moyenne des cellules par carré) x (Facteur de dilution) x 10 000.
      REMARQUE : Resuspendez les cellules dans un volume désiré de milieu DMEM complet pour obtenir une concentration finale de 1x 105cellules/mL.
  4. Semez 2,5 x10 5 à 5,0 x10 5 cellules dans une fiole de culture T25 contenant 5 mL de milieu DMEM complet. Maintenir la culture à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % deCO2 jusqu’à atteindre la densité cellulaire requise pour la récolte.
  5. Le lendemain après le sémis, vérifiez l’attache des cellules au microscope. Si plus de 50 % des cellules flottent (ce qui indique une mort cellulaire), aspirez doucement l’ancien milieu et remplacez-le par 2,5 mL de milieu frais pré-chauffé.
  6. Surveillez la croissance cellulaire quotidiennement. Lorsque la culture atteint environ 90 % de confluence (environ 2,3 x 106 cellules dans une fiole de T25), généralement en moins de 5 jours, les cellules sont prêtes à être subcultivées (divisées). Pour diviser les cellules à un ratio de 1:8, suivez ces étapes :
    1. Retirez le médium usé à l’aide d’une pipette Pasteur stérile.
    2. Rincez la monocouche cellulaire une fois avec 3 mL de PBS stérile 1x pour éliminer le sérum résiduel, qui inhibe la trypsine. Aspirez et jetez 1x PBS.
    3. Ajoutez aux cellules 1 mL de solution d’acide éthylénédiaminétique tétraacétique (EDTA) à 0,25 % de trypsine et 1 mM et incubez à 37 °C, 5 % deCO-2 sur un incubateur humidifié pendant 3 minutes pour détacher les cellules.
      REMARQUE : Le temps optimal d’incubation avec la trypsine / EDTA dépend de la lignée cellulaire spécifique et peut devoir être ajusté. Vérifiez les cellules au microscope après 3 minutes pour vous assurer qu’elles sont complètement détachées.
    4. Neutraliser l’activité enzymatique en ajoutant 3 mL de milieu DMEM complet. Immédiatement après, pipetez doucement de haut en bas pour détacher complètement et suspendre les cellules.
  7. Transférez 3,5 mL de la suspension de la cellule dans un tube conique de 15 mL et centrifugez-la pendant 5 minutes à 400 x g en RT.
  8. Retirez soigneusement le surnageant et remettez le pellet en suspension dans 1 mL de milieu congélant (qui doit contenir 90 % de FBS plus 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO)). Transférez et aliquotez la suspension cellulaire dans des cryoviaux, assurant ainsi une concentration de 5 x 105 cellules par tube pour une utilisation future.
    1. La congélation doit être refroidie progressivement en plaçant les cryovials dans un récipient Mr. Frosty (ou un récipient de congélation à taux contrôlé similaire). Transférez le récipient dans un congélateur à -80°C et laissez les cellules congeler toute la nuit. Les cellules peuvent être maintenues à -80°C pendant quelques jours, mais doivent ensuite être transférées à l’azote liquide pour un stockage à long terme.
      REMARQUE : Tenez des registres détaillés des passages cellulaires et utilisez les premiers passages pour les expériences. Il est recommandé d’utiliser des cellules avec moins de 20 passages.
  9. Une fois que les nouvelles cultures atteignent à nouveau une confluence de ~90 %, aspirez et collectez le surnageant dans un tube conique de 15 mL. Si vous souhaitez maintenir la culture en cours, remplacez le volume collecté par un nouveau support DMEM complet.
    1. Centrifugez le surnageant collecté à 400 × g pendant 5 minutes à 4 °C pour pelleter et éliminer les débris cellulaires. Gardez le surnageant (le média conditionné clarifié), et jetez la pellete.
  10. Aliquote les milieux conditionnés clarifiés en portions de 1 mL, étiquetez les tubes et conservez-les à -20 °C jusqu’à utilisation.
    REMARQUE : Pour le contrôle qualité, gardez toujours un registre de la date de collecte du support conditionné et si l’aliquote a déjà été décongelée. Il est fortement conseillé d’éviter de décongeler la même aliquote plus de deux fois. De plus, utilisez le conditionné dans le délai d’un mois suivant la date de gel pour garantir son activité optimale.

2. Isolement des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC)

REMARQUE : Les PBMC sont isolés de 40 mL de sang périphérique anticoagulé avec 3,8 % de citrate de sodium. L’isolation est réalisée à l’aide d’un gradient de densité de Ficoll-Hypaque (1077) et d’une centrifugation. L’ensemble de ce protocole doit être réalisé dans des conditions stériles dans une armoire BSL2.

  1. Aliquote l’échantillon de sang périphérique anticoagulé dans un tube conique de 15 mL ou 50 mL avant l’étape suivante de centrifugation.
  2. Centrifugez les échantillons sanguins à basse vitesse, 200 × g pendant 15 minutes en RT pour séparer les composants sanguins. Ce processus donne un plasma riche en plaquettes (PRP) comme couche supérieure et la fraction cellulaire (globules rouges et blancs) en dessous. Utilisez un réglage centrifugeuse d’accélération : 4 et de décélération : 2, lorsque le maximum est de 5.
  3. Après centrifugation, aspirez le surnageant (la fraction supérieure), qui est le PRP, puis transférez-le dans un nouveau tube stérile.
    REMARQUE : Si nécessaire pour des expériences en aval, le PRP collecté peut être centrifugé à nouveau à 600 × g en RT pendant 10 minutes (accélération et décélération maximales) pour retirer les plaquettes, et stocker le plasma sans plaquettes à -20 °C pour d’autres tests.
  4. La fraction inférieure cellulaire obtenue lors de la centrifugation initiale à l’étape 2 doit être doucement diluée jusqu’à un volume final de 2 à 3 fois à l’aide d’un PBS stérile à température ambiante de 1x. Homogénéisez doucement par inversion la suspension résultante et utilisez-la pour la centrifugation à gradient de densité de Ficoll-Hypace.
  5. Administrez 15 mL de Ficoll-Hypaque à température ambiante dans un tube stérile de 50 mL.
  6. Posez prudemment et lentement 30 mL de sang dilué sur le Ficoll-Hypaque, en veillant à ce que les deux phases ne se mélangent pas.
  7. Centrifugez le tube stratifié de sang de Ficoll pendant 25 minutes à 600 × g en RT. Réglez la centrifugeuse sans frein (accélération : 1 ; Décélération : 0).
  8. Utilisez une pipette Pasteur stérile pour éliminer au moins 4 mL de la fraction supérieure obtenue afin d’éviter qu’il ne se renverse. Utilisez ensuite la même pipette pour récupérer l’anneau blanc contenant les PBMC formé entre la fraction supérieure et la fraction transparente de Ficoll-Hypaque. Évitez de collectionner Ficoll avec la bague PBMC.
  9. Transférez l’anneau PBMC du tube vers un tube centrifuge stérile de 15 mL contenant au moins 3 mL de PBS 1x.
  10. Remplissez le tube de 15 mL avec plus de PBS 1x et centrifugez à 600 × g (accélération et décélération maximales) pendant 10 minutes en RT.
  11. Retirez le surnageant par inversion, remplissez à nouveau avec 1x PBS, puis centrifugez à 600 × g (accélération et décélération maximales) pendant 10 minutes en RT.
  12. Retirez le surnageant et resuspendez le comprimé PBMC dans 2 à 3 mL de PBS stérile 1x plus 2 % de FBS inactivé à la chaleur (1x PBS-2 % FBS), puis augmentez le volume à 10 mL. Comptez les cellules, préparez une suspension 1:5 de cellules diluée dans un froid stérile 1x PBS puis (1:2) dans du bleu de Trypan à 0,4 % pour obtenir une dilution finale de 1:10. Utilisez une chambre cellulaire sur un microscope optique comme décrit à l’étape 1.3.2 pour le comptage.
  13. Faites tourner la suspension PBMC à 300 × g pendant 5 minutes à 8-10 °C. Resuspendez les cellules dans un volume désiré de 1x PBS-2 % de PBS froid pour obtenir une concentration finale de 108 cellules/mL. Laissez ces cellules à 4 °C jusqu’à l’étape suivante.
    REMARQUE : À ce stade, les PBMC collectés peuvent être congelés dans un flacon cryogénique à 108 cellules/mL dans un milieu de congélation (90 % FBS-10 % DMSO). Conservez à -80 °C dans un récipient Mr. Frosty toute la nuit pour permettre aux cellules de geler lentement. Le lendemain, transférez les cellules dans une boîte de stockage et laissez-les à -80 °C pendant quelques jours, ou transférez-les dans une cuve d’azote liquide pour une longue période de stockage, ou poursuivez le protocole.

3. Tri des monocytes CD14+ à l’aide de billes magnétiques

REMARQUE : Les monocytes purifiés CD14+ sont obtenus à partir du PBMC à l’aide d’un kit de tri magnétiqueà sélection positive 11 du CD14+ humain. Le pourcentage de cellules CD14+ chez PBMC dépend du donneur mais peut être estimé à 10 % (variant de 5 à 20 %). Adaptez le nombre initial de PBMC et les volumes finaux de réaction en fonction du nombre requis de monocytes pour votre expérience. Le volume de réaction minimum suggéré est de 100 μL, même en cas de traitement inférieur à 1 × 107 PBMC.

  1. Ajoutez 10 μL du cocktail de sélection positive pour chaque 100 μL de PBMC, pipetez de haut en bas, puis laissez sur glace pendant 15 minutes.
  2. Faites un vortex sur la suspension des talons pendant 30 secondes avant utilisation. Ajoutez ensuite 10 μL de billes par 100 μL de suspension PBMC. Mélangez bien et faites couver pendant 15 minutes sur glace.
  3. Ajoutez 1x PBS - 2 % FBS - 1 mM EDTA à un volume final de 2,5 mL, mélangez doucement la suspension et insérez le tube sur l’aimant et faites couver pendant 5 minutes.
  4. Inversez l’aimant (sans retirer le tube) sur un tube récepteur à décharger pendant 2 à 3 secondes, évitant tout mouvement de secousse. Les cellules positives resteront dans le tube.
  5. Retirez le tube de l’aimant et ajoutez 1x PBS-2 % FBS -1 mM EDTA sur les parois du tube jusqu’à un volume final de 2,5 mL.
  6. Insérez à nouveau le tube dans l’aimant et incubez pendant 5 minutes.
  7. Inversez l’aimant (sans retirer le tube) sur un tube récepteur à décharger pendant 2 à 3 secondes, évitant tout mouvement de secousse. Récupérez le tube de l’aimant et ajoutez 3 mL de 1x PBS-2 % FBS sur les parois du tube pour récupérer toutes les cellules.
  8. Prenez 10 μL pour compter le nombre de cellules CD14+ dans une chambre de Neubauer avec un microscope optique. Diluez avec du Trypan Blue 1:2.
    REMARQUE : Calculez le nombre de cellules en suivant cette équation : Nombre de cellules CD14+ = nombre de cellules vivantes par quadrant x facteur de dilution x 10,000.
  9. Placez la suspension CD14+ dans un nouveau tube stérile de 15 mL et lavez les cellules en centrifugant à 600 × g ( accélération et décélération maximales) pendant 10 minutes à 4 °C.
  10. Resuspendez les cellules CD14+ avec un milieu RPMI 1640 complété avec un milieu complet à 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine (P/S) à un volume pratique afin d’obtenir 2,5 x 106 cellules/mL pour l’étape suivante, en tenant compte du nombre de cellules obtenues.
    REMARQUE : Maintenez les monocytes CD14+ sur glace jusqu’à l’étape suivante afin d’éviter l’attachement de ces cellules à la paroi du tube plastique.

4. Différenciation des macrophages

  1. Plaque purifiée les monocytes CD14+ à 2,5 x 105 cellules en suspension dans 250 μL de milieu RPMI complet (10 % FBS-1 % PS) par puits dans une plaque traitée à 48 puits.
    REMARQUE : Cela peut aussi se faire avec la moitié du nombre de cellules dans une plaque traitée à 96 poils de traitement.
  2. Ajoutez de l’eau stérile dans les puits vides environnants pour réduire l’évaporation lors de l’incubation sur plaques.
  3. Incubez les cellules pendant 5 jours à 37 °C avec 5 % de CO₂ dans un incubateur humidifié sans déranger, en surveillant quotidiennement la morphologie, la différenciation et la viabilité.
    REMARQUE : Bien que le M-CSF (25 ng/mL) puisse être ajouté pour la différenciation, nous confirmons que notre protocole utilise uniquement 10 % de FBS de haute qualité pour obtenir des macrophages M0 après cinq jours de culture. Nous recommandons spécifiquement d’éviter le M-LCR en raison de son potentiel à activer les monocytes vers un phénotype10,22 de type M2.

5. Exposition des macrophages à des milieux conditionnés et analyse

  1. Au jour 5 de différenciation, retirez doucement 50 % (125 μL) du milieu de chaque puits et remplacez-le par :
    1. 125 μL de milieu complet RPMI frais (témoin),
    2. 125 μL de milieu conditionné par lignées cellulaires tumorales (par exemple, à partir de MDA-MB-231), ou
    3. 125 μL de milieu complet DMEM (contrôle pour les milieux conditionnés).
      REMARQUE : Pour une optimisation initiale avec de nouvelles lignées cellulaires tumorales, testez une gamme de concentrations de milieux conditionnés (par exemple, 10 %, 25 % et 50 %). Cette plage est suggérée pour garantir la viabilité des macrophages et les changements de différenciation. Choisissez la concentration la plus élevée de milieux conditionnés qui montrent une viabilité élevée des macrophages.
  2. Poursuivre l’incubation jusqu’au jour 7.
    REMARQUE : Au jour 5, des macrophages M0 sont obtenus, puis 2 jours supplémentaires de culture en présence de milieux conditionnés suffisent à induire l’expression des marqueurs de polarisation de surface. Les marqueurs de surface de polarisation sont déterminés par cytométrie en flux, de la même manière lors de l’utilisation de cytokines standardisées pour générer des macrophages M1 ouM2 11,14.
  3. Évaluez quotidiennement la viabilité et la morphologie des macrophages au microscope.
    REMARQUE : Surveillez quotidiennement la différenciation des macrophages pendant la période de culture de 7 jours. L’adhésion cellulaire est utilisée comme indicateur d’une culture saine et viable. Une proportion plus élevée de cellules fusiformes indique une différenciation et une polarisation accrues dans le groupe traité par milieu conditionné (CM), comme le montre la Figure 2.

6. Récolter les macrophages pour l’évaluation des marqueurs de polarisation par cytométrie en flux

REMARQUE : En option, pour étendre davantage la caractérisation phénotypique des macrophages associés aux tumeurs, isoler l’ARN pour mesurer l’expression des gènes associés à la polarisation (par exemple, TGM2, IRF-4 et CXCL10) par réaction en chaîne quantitative par polymérase (qPCR) ou collecter les surnatants en culture pour mesurer la production canonique de cytokines (par exemple, TNFα, IL-6 et IL-10) par un test immunosorbent lié aux enzymes (ELISA) comme rapporté par notre groupe11, 14.

  1. Éliminez en aspirant doucement avec une pipette Pasteur stérile ou en versant le volume total du milieu de culture de chaque puits et ajoutez 200 μL de tampon froid 1x PBS-2 % FBS-1 mM EDTA pour la récolte cellulaire.
  2. Incubez pendant 10 à 15 minutes sur de la glace puis ajoutez 200 μL de 1x PBS-2 % FBS pour diluer le tampon EDTA. Collectez les macrophages en pipettant de haut en bas (toujours sur glace) pendant 5 minutes supplémentaires jusqu’à ce que toutes les cellules se détachent.
    REMARQUE : Cette étape est cruciale pour obtenir un bon nombre de macrophages viables. Il est important de ne pas prolonger plus que recommandé le temps d’exposition à l’EDTA afin de préserver la viabilité cellulaire. Vérifiez les cellules au microscope après la procédure afin de vous assurer qu’elles sont complètement détachées.
  3. Collectez les macrophages sur un microtube de 1,5 mL et lavez-les avec 1 mL de 1x PBS-2 % FBS par centrifugation à 400 × g pendant 5 minutes à 8-10 °C.
  4. Resuspendez la pellete de macrophages avec 200 μL de 1x PBS-5 % FBS et transférez-les sur une microplaque à fond arrondi de 96 puits pour un blocage non spécifique à RT pendant 15 minutes. Centrifugez les cellules à 400 x g pendant 5 minutes à 8-10 °C.
  5. Écartez le surnageant en inversant rapidement la plaque.
  6. Préparez le cocktail approprié d’anticorps directement conjugués en 1x PBS - 2 % de FBS en utilisant un facteur de dilution 1:50 pour chaque anticorps. Colorez chaque échantillon avec 50 μL du cocktail d’anticorps et faites éclore pendant 30 minutes dans l’obscurité sur de la glace.
    REMARQUE : Cocktail d’anticorps : CD11b-PE/Cy7 (200 μg/mL), CD64-AlexaFluor 647 (150 μg/mL), CD163-PerCP/Cy5.5 (200 μg/mL), HLADR-PE (40 μg/mL) et CD206-AlexaFluor 488 (400 μg/mL). La concentration d’anticorps pré-titrée est listée dans le tableau 1 ; les numéros de catalogue se trouvent dans le Tableau des Matériaux.
  7. Lavez les macrophages colorés en ajoutant 150 μL de 1x PBS et centrifugez à 400 × g pendant 5 minutes à 8-10 °C.
  8. Écartez le surnageant en inversant rapidement la plaque.
  9. Pour mesurer la viabilité cellulaire, ajoutez 100 μL de la teinture de viabilité réparable Zombie Violet (1:1 000 dans 1x PBS) et incubez dans le noir pendant 30 minutes sur de la glace.
  10. Lavez les cellules colorées en ajoutant 100 μL de 1x PBS et centrifugez à 400 x g pendant 5 minutes à 8-10 °C. Répétez la procédure de lavage en utilisant 200 μL de 1x PBS.
  11. Corrigez en resuspendant la granule cellulaire avec 20 μL de paraformaldéhyde frais préparé à 1 % et en les incubant pendant 20 minutes sur de la glace et dans le noir.
    REMARQUE : 1 % de paraformoldéhyde a été utilisé pour la fixation, sans perméabilisation. Optionnel : Le composant fixateur commercial (du kit fixateur/perméabilisation BD) peut également être utilisé pour cette étape11.
  12. Lavez les cellules en ajoutant 180 μL de 1x PBS-2 % de FBS et centrifugez à 400 x g pendant 5 minutes à 8-10 °C. Répétez la procédure de lavage en utilisant 200 μL de 1x PBS-2 % FBS.
  13. Éliminer le surnageant par inversion de plaque et resuspendre le pellet dans 200 μL de PBS 1x pour l’apporter à l’équipement de cytométrie en flux pour mesure.
    REMARQUE : Si des échantillons colorés et fixés ne peuvent pas être analysés par cytométrie en flux le même jour, conservez-les à 4 °C et protégez-les de la lumière. Analysez les échantillons dès que possible les jours suivants.
  14. Analysez les résultats de la cytométrie en flux à l’aide du logiciel FlowJo. La stratégie de gating commence par exclure les débris utilisant la diffusion avant et latérale (FSC/SSC). Ensuite, sélectionnez des macrophages vivants sous forme de cellules violettes zombies CD11b⁺.
    REMARQUE : Comme l’autofluorescence chez les macrophages dépend du donneur, il est essentiel d’utiliser des contrôles dérivés du même donneur pour chaque expérience.

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Résultats

Nous avons généré des cellules macrophages associées au cancer du sein (TAM) triple négatives en traitant des macrophages dérivés de monocytes avec un milieu conditionné (CM) à 50 % issu de la lignée cellulaire MDA-MB-231. Les monocytes ont été triés à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (CMP) de six donneurs sains indépendants et différenciés selon notre protocole. La préparation de la CM utilisait des cellules MDA-MB-231 à 90 % de confluence (Figu...

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Discussion

Le protocole décrit ici propose une approche reproductible et pratique pour étudier la polarisation macrophage associée à la tumeur en exposant des macrophages dérivés de monocytes humains à des milieux conditionnés par des lignées cellulaires tumorales. Ce système capture l’influence des facteurs solubles sécrétés par les cellules tumorales, connues pour jouer un rôle clé dans la reprogrammation des macrophages dans le microenvironnementtumoral 7,9,10,...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Nous reconnons le soutien financier apporté par l’Agence nationale pour la promotion de la science et de la technologie (ANPCyT-FONCYT) via les subventions PICT 2021 I-INVI-00034 (à DR), PICT 2021-I-A-00807 (à E.A.C.S.) et PICT 2021-I-A-00716 (à A.E.E.). Nous remercions également le Conseil National de la Recherche Scientifique et Technique (CONICET) pour la subvention PIP 2022-0763 et l’Université de Buenos Aires pour PIDAE 2022, attribuée à A.E.E.

M.C.L. a reçu une bourse Legado Peruilh de la Faculté de médecine de l’Université de Buenos Aires, et a bénéficié d’une bourse doctorale ANPCyT-FONCYT. D.R., E.A.C.S. et A.E.E. sont des enquêteurs de carrière chez CONICET.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Alexa Fluor 488 souris anti-humaines   ; Clone d’anticorps CD206 15-2BioLegend, San Diego, CA, États-Unis.Cat# 321113 ; RRID : AB_571874
Alexa Fluor 647 souris anti-humain CD64 Clone d’anticorps 10.1BioLegend, San Diego, CA, États-Unis.Cat# 305012 ; RRID : AB_528867
BD Cytofix/CytopermBD en biosciences, San Jose, CA, États-UnisCat# 554714Kit fixateur/perméabilisation
Eagle Medium modifié (DMEM) de Dulbecco, glycémie élevéeGibco & nbsp ; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA & nbsp ;Cat# 11965092
Kit de sélection positive EasySep pour l’humain CD14 ; Cocktail EasySep Positive Selection ; Nanoparticules magnétiques EasySep ; Easy Sep MagnetSTEMCELL Technologies, Vancouver, CanadaCat# 18058
Cytomètre FACS Canto   ;Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, États-Unis.
Sérum bovin fœtal, qualifié, Nouvelle-Zélande & nbsp ;Gibco & Trade ;   ; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA & nbsp ;Cat# 10091148
Ficoll-Paque PLUS CytivaGE Healthcare - Sciences de la vie, États-UnisCat# 17144003
FlowJoFlowJo LLC.RRID : SCR_008520
GraphPad Prism  ;   ;GraphPad Software Inc.RRID : SCR_002798
Partec CyFlow space cytomètre   ;Sysmex Partec, Allemagne
Clone anticorps HLA-DR anti-PE L243BioLegend, San Diego, CA, États-Unis.Cat# 307605 ; RRID : AB_314683
Clone d’anticorps anti-souris de rat PE/Cy7 CD11b M1/70BioLegend, San Diego, CA, États-Unis.Cat# 101216 ; RRID : AB_312799
Clone anticorps anti-humain CD163 PerCP/Cy5.5 de souris GHI/61BioLegend, San Diego, CA, États-Unis.Cat# 333607 ; RRID : AB_1134006
RPMI 1640 MoyenGibco & nbsp ; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA & nbsp ;Cat# 11875119
Solution de pyruvate de sodiumSigma-Aldrich Merck, San Luis, MO, États-Unis. & nbsp ;Cat#  ; S8636
Trypsine-EDTA (0,25 %), phénol rougeGibco & nbsp ; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA & nbsp ;Cat# 25200056
Kit de viabilité réparable Zombie VioletBioLegend, San Diego, CA, États-Unis.Cat# 423113

Références

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