Method Article

Méthode à microbilles magnétiques rapides pour la purification efficace de neutrophiles de faible densité

DOI:

10.3791/69407

⸱

November 11th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Inmunología, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les neutrophiles de basse densité (LDN) augmentent considérablement dans plusieurs maladies. Les LDN sont généralement isolés par tri cellulaire. Nous présentons une méthode pratique pour obtenir de la NDT pure et viable. Après la centrifugation du sang périphérique par gradient de densité, les cellules sont incubées avec des microbilles magnétiques, puis la LDN est séparée par des colonnes magnétiques.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les neutrophiles, leucocytes importants de l’immunité innée, ont traditionnellement été considérés comme une population cellulaire homogène. Néanmoins, des preuves récentes ont montré que les neutrophiles existent dans plusieurs sous-populations. L’une de ces sous-populations est celle des neutrophiles de faible densité (NDT). Les LDN se trouvent en petit nombre dans le sang des individus en bonne santé, mais leur nombre augmente considérablement dans des maladies telles que le lupus érythémateux disséminé, les maladies auto-immunes, le cancer et les infections. Dans ces cas, la NDT peut participer à la pathogenèse de la maladie. La seule façon d’isoler la LDN est la centrifugation à gradient de densité du sang périphérique. Cependant, après centrifugation, les LDN co-purifient avec les cellules mononucléaires. Par conséquent, l’étude de cette sous-population de neutrophiles est un défi. Il n’existe pas de méthodologie standard pour séparer la NDT des cellules mononucléaires. En règle générale, les LDN sont séparés par tri cellulaire dans un cytomètre en flux. Cependant, cette méthode nécessite de longs temps de tri (heures) pour obtenir suffisamment de cellules pures pour des études fonctionnelles ultérieures. Cela affecte gravement la viabilité et la fonction des cellules. Ici, nous proposons une méthode pratique pour obtenir un grand nombre de LDN pure et viable en peu de temps. Après centrifugation par gradient de densité, la fraction de cellule mononucléaire est incubée avec des microbilles magnétiques anti-CD66b, puis les LDN sont séparés par des colonnes magnétiques en < 30 min. Les LDN purifiés (cellules CD66b+ ) sont marqués avec des anticorps monoclonaux contre CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16b, CD33, CD62L, CD66b et CD98, et sont analysés par cytométrie en flux pour confirmation. Les LDN purifiés sont complètement fonctionnels, comme l’indique leur capacité à produire des espèces réactives de l’oxygène et à former des pièges extracellulaires de neutrophiles. Cette nouvelle méthode de purification permet d’obtenir une LDN d’une pureté (plus de 90 %) et d’une viabilité (plus de 96 %) élevées dans un court laps de temps. Cette méthode peut facilement être mise à l’échelle pour obtenir un grand nombre de LDN purs afin d’évaluer les fonctions de LDN dans différentes maladies par le biais d’analyses biochimiques ou d’autres analyses omiques.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les neutrophiles, les leucocytes prédominants dans le sang humain1, sont des participants clés du système immunitaire inné. Ils arrivent en grand nombre dans les tissus atteints d’inflammation ou d’infection2. Là, les neutrophiles activent plusieurs fonctions effectrices, telles que la phagocytose 3,4, la dégranulation 5,6 et la formation de pièges extracellulaires neutrophiles (TNE)7. De plus, les neutrophiles participent également à la réponse immunitaire adaptative8. La vision classique des neutrophiles les considère comme des cellules homogènes produites dans la moelle osseuse avec des réponses prédéterminées 9,10. Cependant, des études récentes révèlent que les neutrophiles sont des cellules hétérogènes avec de multiples états phénotypiques et fonctionnels dans les états sains et pathologiques 11,12,13,14,15.

Parmi plusieurs sous-populations de neutrophiles, les neutrophiles de faible densité (LDN) ont suscité beaucoup d’intérêt en raison de leurs propriétés intrinsèques et parce qu’ils augmentent en nombre dans plusieurs maladies 16,17,18. Des LDN ont été trouvées dans le sang de patients atteints de lupus érythémateux disséminé (LED) en 198619. Ils ont été détectés à la suite du processus de séparation des leucocytes dans un gradient de densité20,21. Après centrifugation du sang ou du plasma riche en leucocytes sur un milieu de densité (par exemple, Ficoll-Paque), les monocytes et les lymphocytes (appelés cellules mononucléées du sang périphérique [PBMC]) forment une bande dans la partie supérieure (de faible densité) du tube. Les neutrophiles se déposent au fond du tube. Parmi les PBMC, quelques neutrophiles ont également été trouvés ; il s’agit de la LDN (Figure 1). De petits nombres de LDN se trouvent dans le sang d’individus en bonne santé22. Cependant, le nombre de LDN augmente considérablement dans de multiples conditions d’immunosuppression et d’inflammation chronique, notamment le LED23,24, la septicémie25, le psoriasis26, l’asthme27, l’arthrite juvénile idiopathique28, la vascularite associée aux anticorps cytoplasmiques anti-neutrophiles (ANCA)29, l’infection par le VIH30, le paludisme31 et la tuberculose32. Bien que le nombre de LDN augmente dans toutes les pathologies mentionnées, les LDN ont été principalement étudiés dans le cadre du LED17. La LDN du sang des patients atteints de LED semble avoir une plus grande capacité à former des TNE33, à sécréter de grandes quantités de médiateurs pro-inflammatoires34 et à activer les lymphocytes T24. Cependant, dans d’autres conditions, telles que le cancer, les LDN seraient constitués de neutrophiles matures et immatures35, avec des propriétés suppressives des lymphocytes T 36,37,38. De même, chez les patients atteints de COVID-19, la LDN supprimerait également la prolifération des lymphocytes T39, mais contrairement au LED, la LDN semble produire moins de TNE39. Par conséquent, l’origine, la composition et les propriétés fonctionnelles de la LDN sont encore controversées.

Parce que les LDN se trouvent en même temps que les PBMC, leur étude est techniquement compliquée. Pour explorer pleinement les propriétés de la LDN dans différentes pathologies, il est nécessaire de les purifier. Une procédure courante de séparation LDN est le tri cellulaire fluorescent 22,40,41,42,43,44,45. Cependant, le tri cellulaire nécessite beaucoup de temps pour la séparation des cellules. Cela peut entraîner une perte de cellules ou une faible récupération si le temps de tri n’est pas suffisant. De plus, les cellules sont soumises à un stress excessif, ce qui entraîne des résultats variables lors de l’étude de la fonction de ces cellules. Un long temps de tri augmente également le coût des procédures expérimentales et nécessite du personnel spécialisé.

Ici, nous présentons une méthode rapide et efficace pour obtenir un grand nombre de LDN humaine pure et viable en très peu de temps. Après centrifugation par gradient de densité, les LDN sont séparés par tri magnétique des cellules (MACS ; Figure 1). Le principal avantage de cette méthode de purification est que les LDN sont séparés avec une pureté (plus de 90 %) et une viabilité (plus de 96 %) élevées. De plus, les LDN purifiés sont complètement fonctionnels, comme l’indique leur capacité à générer des espèces réactives de l’oxygène (ROS) et à libérer des TNE. Ce protocole peut être facilement mis en œuvre dans n’importe quel laboratoire intéressé par la biologie des neutrophiles pour séparer rapidement la LDN du sang des personnes atteintes de plusieurs maladies afin d’étudier davantage ces cellules.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les procédures de ce protocole suivent les directives du Comité de bioéthique de la recherche humaine de l’Instituto de Investigaciones Biomédicas - Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Tous les participants ont fourni un consentement éclairé.

1. Isolement des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) et des neutrophiles dans le sang humain

  1. Prélevez environ 10 ml de sang d’un volontaire adulte en bonne santé par ponction veineuse. Ajouter 10 U/mL d’héparine comme anticoagulant.
    ATTENTION : Jetez l’aiguille dans un récipient d’élimination des aiguilles à risque biologique. Les seringues et autres matériaux en contact avec le sang doivent être placés dans un sac et autoclavés avant d’être éliminés.
  2. Dans un tube à centrifuger conique de 15 ml, ajouter 2 ml de dextran T500 à 6 % dans du PBS. Ajoutez ensuite 10 ml de sang en l’égouttant sur le côté du tube. Retournez le tube plusieurs fois pour mélanger le sang et le dextran.
  3. Laissez reposer le tube pendant 45 min, pendant que les érythrocytes sédimentent. Le plasma riche en leucocytes apparaît au-dessus de la couche érythrocytaire.
  4. Dans un autre tube à centrifuger de 15 ml, ajoutez 5 ml de milieu à gradient de densité. Pipetez soigneusement le plasma, sans toucher les érythrocytes, et superposez-le sur le milieu. Deux phases distinctes doivent être formées.
  5. Centrifuger le tube à 516 x g pendant 20 min à 4 °C. Les cellules mononucléées (PBMC) forment une bande entre le plasma et les couches moyennes. Les neutrophiles forment une pastille au fond (figure 1).
  6. Isolement des PBMC
    1. Éliminer par aspiration le plasma au-dessus du PBMC sans toucher les cellules. Prélevez les cellules de la bande entre le plasma et le milieu. Assurez-vous d’aspirer le moins de fluide possible.
    2. Placez les cellules dans un tube à centrifuger conique de 50 ml. Ajouter 20 ml de PBS. Centrifuger le tube à 400 x g pendant 5 min à 4 °C.
    3. Aspirez soigneusement le surnageant et raclez le tube pour séparer les cellules. Ajouter 10 ml de PBS froid pour remettre les cellules en suspension. Comptez le PBMC à l’aide d’une chambre Neubauer.
      REMARQUE : N’utilisez pas de pipette pour remettre les cellules en suspension, car cela pourrait endommager les cellules.
  7. Isolement des neutrophiles
    1. Retirez le milieu de gradient de densité. Séparez les cellules en raclant le tube et ajoutez 10 ml de PBS froid.
    2. Placez les cellules dans un tube à centrifuger frais de 50 ml et centrifugez à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirer le surnageant et séparer les cellules comme décrit à l’étape 1.6.3.
  8. Pour éliminer les érythrocytes résiduels, ajouter 10 ml de solution hypotonique froide (0,2 % de NaCl, 1 % de BSA, 20 mM de Hepes, pH = 7,4) et mélanger doucement pendant exactement 1 min.
  9. Ajouter rapidement 10 mL de solution hypertonique froide (1,6 % de NaCl, 1 % de BSA, 20 mM d’HEPES, pH = 7,4) pour rendre la solution isotonique.
  10. Comptez les neutrophiles à l’aide d’une chambre Neubauer (pureté > 95 %). Granulez les cellules par centrifugation comme à l’étape 1.6.2. et les remettre en suspension dans du PBS froid. Maintenez le tube sur de la glace.
    REMARQUE : Il est rapporté que la demi-vie des neutrophiles in vitro est de 8 à 12 h 46,47,48. D’après notre expérience avec ce protocole, les neutrophiles conservent leurs fonctions pendant environ 6 à 8 heures.

2. Purification des neutrophiles de basse densité (LDN)

  1. Centrifugeuse PBMC à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Éliminer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 120 μL de tampon de lavage à froid (1 % BSA dans le PBS).
  2. Ajouter 35 μL de microbilles magnétiques CD66b. Incuber le mélange à l’obscurité à 4 °C pendant 30 min. Mélangez doucement toutes les 10 minutes pour éviter l’agrégation cellulaire.
  3. Ajouter 1 mL de tampon de lavage à froid. Placez les cellules dans une microcentrifugeuse et faites-les tourner à 400 x g pendant 3 min.
  4. Retirez le surnageant, séparez la pastille de cellule en raclant le tube et remettez les cellules en suspension dans 1 mL de tampon de lavage.
  5. Placez une colonne de séparation magnétique sur un aimant. Ajoutez 0,5 ml de tampon de lavage dans la colonne et laissez-le passer à travers la colonne.
  6. Transférer les cellules (1 mL) sur la colonne. Laissez passer la mémoire tampon dans la colonne goutte à goutte.
  7. Ajoutez 0,5 mL de tampon de lavage dans la colonne et laissez-le passer. Ajoutez 0,5 mL de tampon de lavage dans la colonne.
  8. Retirez la colonne de l’aimant et placez-la dans un tube de microcentrifugation. Ajouter 1 mL de tampon de lavage dans la colonne.
  9. Insérez le piston sur le dessus de la colonne et appliquez doucement une pression pour éluer les cellules. Retirez le piston et placez la colonne sur un nouveau tube de microcentrifugation.
  10. Ajouter 1 mL de tampon de lavage. Insérez le piston sur le dessus de la colonne et appliquez doucement une pression pour éluer les cellules.
  11. Placez les deux tubes dans une microcentrifugeuse et faites-les tourner à 800 x g pendant 3 min. Enfin, remettez en suspension les cellules (LDN) des deux tubes dans 1 mL de PBS froid. Restez sur la glace.
    REMARQUE : Les premiers 2 mL de liquide à flux continu contiennent le reste du PBMC. Ces cellules peuvent être utilisées pour d’autres études.

3. Cytométrie en flux multicolore

  1. Remettre en suspension les cellules purifiées à raison de 1 x 106 cellules/mL dans le tampon de marquage (1 % FBS dans le PBS). Ajouter 250 μL de cellules dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
  2. Ajoutez les anticorps correspondants contre les molécules de membrane neutrophile (pour plus de détails, voir le tableau des matériaux). Incuber les cellules pendant 30 min à 4 °C en les protégeant de la lumière.
  3. Ajouter 1 mL de PBS. Placez les tubes dans une microcentrifugeuse et faites-les tourner à 800 x g pendant 3 min.
  4. Aspirez le surnageant, brisez la pastille cellulaire en tapotant le tube et remettez les cellules en suspension dans 0,5 mL de paraformaldéhyde à 1 %.
  5. Maintenir les cellules à 4 °C à l’abri de la lumière, jusqu’à ce qu’elles soient analysées par cytométrie en flux. Analysez les cellules par cytométrie en flux, en capturant 10 000 événements par échantillon. Effectuez le tri des cellules comme décrit précédemment22.
    ATTENTION : Le paraformaldéhyde est un irritant pour la peau et les voies respiratoires. Assurez-vous de ne pas respirer les vapeurs.

4. Détection des espèces réactives de l’oxygène (ROS)

  1. Dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml, ajoutez 2,5 x 105 cellules. Placez les tubes dans une microcentrifugeuse et faites-les tourner à 800 x g pendant 3 min.
  2. Aspirez le surnageant, raclez le tube pour séparer les cellules et remettez les cellules en suspension dans 100 μL de 15 μM de dihydrorhodamine 123 dans du PBS.
  3. Incuber les cellules à l’abri de la lumière à 37 °C pendant 20 min. Ajouter 1 mL de PBS.
  4. Placez les tubes dans une microcentrifugeuse et faites-les tourner à 800 x g pendant 3 min. Aspirez le surnageant, raclez le tube pour séparer les cellules et mettez-les en suspension dans 100 μL de 50 nM de phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) dans du PBS.
  5. Incuber les cellules à l’abri de la lumière à 37 °C pendant 45 min. Ajouter 1 mL de PBS.
  6. Placez les tubes dans une microcentrifugeuse et faites-les tourner à 800 x g pendant 3 min. Aspirez le surnageant, raclez le tube pour séparer les cellules et mettez-les en suspension dans 0,5 mL de paraformaldéhyde à 1 % dans du PBS.
  7. Maintenir les cellules à 4 °C à l’abri de la lumière jusqu’à ce qu’elles soient analysées par cytométrie en flux. Analysez les cellules par cytométrie en flux, en capturant 10 000 événements par échantillon.

5. Visualisation des pièges extracellulaires des neutrophiles (TNE)

  1. Placez les lamelles dans les puits d’une plaque de 12 puits et couvrez-les de 10 μg/mL de poly-L-lysine. Incuber la plaque pendant la nuit à 4 °C en agitant doucement.
  2. Retirez la poly-L-Lysine et lavez les lamelles avec du PBS, en incubant la plaque pendant 5 minutes à température ambiante avec une légère agitation. Lavez les lamelles avec du PBS deux fois de plus.
  3. Retirez le PBS et laissez sécher les lamelles en plaçant la plaque à l’intérieur d’un capot à flux laminaire pendant 2 h.
  4. Remettre en suspension la LDN à 1 x 106 cellules/mL dans le milieu RPMI-1640 avec 5 % de FBS. Prélever 350 μL (3,5 x 105 cellules) de suspension cellulaire et les placer dans un puits de la plaque à 12 puits contenant les lamelles.
  5. Conservez la plaque pendant 30 min dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C. Ajouter 3,5 μL de PMA 5 μM dilué dans du PBS dans chaque puits (la concentration finale de PMA est de 50 nM).
  6. Conserver la plaque pendant 4 h dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C. Ajouter 350 μL de paraformaldéhyde à 8 % dans du PBS et conserver la plaque toute la nuit dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C.
  7. Placez un film transparent sur un support de tube à essai comme décrit précédemment49, de sorte que des puits se forment sur les trous du tube.
  8. Remplissez chaque puits avec les différentes solutions pour laver ou tacher les lamelles, formant une grosse goutte. Retirez les lamelles et mettez-les à l’envers sur une goutte d’eau pendant 5 min. De la même manière, lavez les lamelles trois fois de plus avec de l’eau.
  9. Placez les lamelles à l’envers sur une goutte de tampon de blocage (5 % BSA dans PBS) et incubez pendant 20 min à température ambiante.
  10. Transférez les lamelles dans une goutte de l’anticorps primaire correspondant (par exemple, anti-élastase ou anti-citrulline) dans un tampon de blocage et incubez pendant 60 minutes à température ambiante.
  11. Laver les lamelles 2x en 0.01 % Tween-20 en PBS. Transférez les lamelles dans une goutte de l’anticorps secondaire correspondant dans un tampon de blocage contenant 150 nM de DAPI, et incubez pendant 60 min à température ambiante, à l’abri de la lumière.
  12. Laver les lamelles 2x en 0.01 % Tween-20 en PBS. Placez une goutte de support de montage anti-décoloration sur une lame de verre et placez les lamelles à l’envers.
  13. Scellez les lamelles sur le pourtour avec du vernis à ongles. Rangez les diapositives montées à 4 °C, à l’abri de la lumière. Visualisez les TNE à l’aide d’un microscope à fluorescence.

6. Détection des pièges extracellulaires neutrophiles (TNE)

  1. Remettre en suspension les cellules à 5 x 105 cellules/mL dans 500 nM Sytox Green, dilué dans un milieu RPMI-1640 avec 5 % de FBS.
  2. Prélever 100 μL (5 x 104 cellules) de la suspension cellulaire et les mettre dans un puits d’une plaque de culture tissulaire à 96 puits.
  3. Conservez la plaque pendant 20 min dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C. Ajouter à chaque puits 20 μL de PMA 300 nM dilué dans un milieu RPMI-1640 (la concentration finale de PMA est de 50 nM).
  4. Transférez la plaque dans un lecteur de microplaques préchauffé. Incuber la plaque à 35 °C pendant 4 h, en prenant des mesures de fluorescence depuis le bas de la plaque toutes les 5 min (à l’aide des filtres d’excitation de 485 nm et d’émission de 528 nm).

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Results

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Les neutrophiles de basse densité (NDT) chez les individus sains représentent environ 5 % des PBMC (Figure 2A). Le protocole décrit ici fournit généralement de la LDN pure (> 90 %). Les cellules sont également récupérées efficacement (rendement d’environ 98 %) avec une viabilité élevée (> 95 %; Figure 2B). À titre de comparaison, les LDN ont également été purifiés par tri cellulaire activé par fluorescence, comme décrit pré...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En général, les neutrophiles étaient considérés comme des cellules homogènes. Cependant, des preuves récentes ont montré que les neutrophiles pourraient exister sous forme de cellules avec différents états d’activation et/ou plusieurs phénotypes. Ainsi, diverses sous-populations de neutrophiles peuvent exister 13,14,15. Une sous-population de neutrophiles, les neutrophiles de basse densité (LDN)...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs affirment que cette étude a été réalisée sans aucun lien commercial ou financier qui pourrait être perçu comme un conflit d’intérêts potentiel.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient César Díaz-Godínez (Instituto de Investigaciones Biomédicas-UNAM) pour son aide avec la microscopie fluorescente pour visualiser les TNE. Cette recherche a été financée par la subvention PAPIIT IN205523 de la Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), Mexique, et par la subvention CF-2023-I-610 de Secretaría de Ciencias, Humanidades, Tecnología e Inovación (Secihti), Mexique.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
  ; Anticorps polyclonal anti-citrulline du lapinAbCamAB100932Dilution 1/50
Plaque de culture tissulaire à 96 puitsPartenaire ; Corning, Inc.3596
Anticorps IgG1 de souris Alexa Fluor 488 anti-humain CD11bBioLegend3013170,25 &mu ; g/mL
Anticorps IgM de souris Alexa Fluor 647 anti-humain CD66bBioLegend3051090,05 &mu ; g/mL
Anticorps anti-souris IgG (H+L) contre la chèvre, Alexa Fluor 488Invitrogen - Thermo Fisher ScientificA-11001Dilution 1/50
Anticorps monoclonal IgG1 de souris anti-élastase neutrophileSanta Cruz BiotechnologieSC-5554910 & micro ; g/mL
Anticorps anti-IgG de lapin (H+L) anticorps d’âne, Alexa Fluor 555Invitrogen - Thermo Fisher ScientificA-31572Dilution 1/50
Anticorps IgG1 de souris anti-humain APC CD62LBioLegend3048090,03 & mu ; g/mL
Anticorps IgG1 de souris anti-humain APC/Cyanine7BioLegend3671070,25 &mu ; g/mL
Attune NxT flow cytometer   ;Thermo Fisher Scientific, Inc.(lasers bleu/rouge)
Fraction V de l’albumine sérique bovine (BSA)MP Biomédicals810025
Anticorps IgG1 de souris Brilliant Violet 510 anti-humain CD33BioLegend3666090,30 & mu ; g/mL
DAPICalbiochem/EMD Millipore268298
Dextran T500Pharmacosmos A/C5.51005E+11
Dihydrorhodamine-123Anaspec, Inc.AS-85711
Trieur de cellules FACSBecton Dickinson  ;Modèle FACSAria
Sérum fœtal bovin (FBS)Gibco16000-044
Ficoll-PaqueMerck KGGE 17-1440-03
Anticorps IgG1 FITC anti-humain CD98 de sourisBioLegend3156030,30 & mu ; g/mL
Logiciel FlowJoBecton DickinsonVersion 10, 2019
Microscope inversé à fluorescenceOlympeModèle IX-70
HéparineInhepar - PiSA Farmaceutica36601495000 UI/mL
HepesSigma AldrichH7006
Microbilles de chimérisme CD66b du MacSprepMiltenyi Biotec130-111-552
AimantMiltenyi Biotec130-042-102
Colonne de séparation magnétiqueMiltenyi Biotec130-042-201
MicrocentrifugeuseEppendorfModèle 5415C
Lecteur de microplaquesBioTek InstrumentsSynergie des modèles HT
ParaformélélidoïdeSigma Aldrich158127
Anticorps IgG1 de souris anti-PEBioLegend3122030,05 &mu ; g/mL
Anticorps IgG2a de souris anti-PEBD Pharmingen550868Dilution 1/40
Anticorps IgG1 de souris anti-humain PE/Cyanine5BioLegend3230130,25 &mu ; g/mL
Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA)Sigma AldrichP8139
poly-L-lysineSigma AldrichP2658
Centrifugeuse réfrigéréeEppendorfModèle 5702R
Milieu de culture tissulaire RPMI-1640Gibco23400-021
SYTOX GreenMolecular Probes, Inc.S-7020
Préados-20 & nbsp ;Sigma AldrichP2287
VectashieldLaboratoires VectorH-1000

References

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