Protocole de construction d’un modèle murin de fibrose myocardique hypertensive à l’aide de l’angiotensine II

Summary

La perfusion continue d’angiotensine II (Ang II) via des pompes osmotiques est l’une des méthodes classiques de construction de modèles animaux de fibrose myocardique hypertensive. Ce protocole a systématiquement optimisé le processus de construction de ce modèle et a élaboré les points clés de l’implantation de la pompe osmotique, du positionnement et du réglage de la concentration de l’Ang II.

Abstract

La perfusion continue d’angiotensine II (Ang II) via des pompes osmotiques est une approche largement utilisée pour établir des modèles animaux de fibrose myocardique hypertensive. Néanmoins, cette technique présente certaines limites dans les rapports actuels, telles que l’instabilité de l’Ang II, le placement imprécis de la pompe et l’absence d’une procédure standardisée. Les rapports actuels sur la méthodologie d’établissement restent relativement limités. Ce protocole a systématiquement optimisé l’établissement de modèles de fibrose myocardique hypertensive induite par la pompe osmotique Ang II chez la souris, y compris la préparation standardisée de la solution d’Ang II, l’étalonnage du dosage, l’implantation sous-cutanée précise des pompes osmotiques et les normes quantitatives pour les indicateurs d’évaluation des modèles. Les résultats expérimentaux ont démontré que la pompe osmotique Ang II induisait une fibrose myocardique hypertensive chez les souris avec des taux de survie élevés. La pression artérielle systolique (TAS) s’est stabilisée à 160 mmHg après sept jours d’implantation sous-cutanée. Les souris modèles présentaient une réduction significative des fractions d’éjection ventriculaire gauche et une augmentation des dimensions diastoliques finales du ventricule gauche. Par rapport au groupe de chirurgie simulée, le dépôt de collagène dans le tissu interstitiel myocardique hypertensif et les régions périvasculaires a augmenté. Cette étude, basée sur un échantillon de petite taille (n = 6), a permis de valider de manière préliminaire la faisabilité d’établir un modèle murin de fibrose myocardique hypertensive à l’aide d’Ang II combiné à une pompe osmotique, et d’établir un système de vérification quantitative du phénotype.

Introduction

La fibrose myocardique (MF), une conséquence pathologique majeure de l’hypertension, se caractérise par un dépôt excessif de fibres de collagène dans le myocarde endommagé ou comprimé. Il représente l’une des formes les plus importantes de lésions des organes cibles médiées par l’hypertension et contribue à un dysfonctionnement cardiaque progressif ^1,2. L’établissement de modèles animaux appropriés est essentiel pour faire avancer la recherche mécaniste et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour la fibrose myocardique hypertensive. L’angiotensine II (Ang II), un effecteur central du système rénine-angiotensine, joue un rôle central dans la pathogenèse de l’hypertension³. L’induction basée sur l’Ang II est donc devenue une approche largement utilisée pour établir des modèles d’hypertension chez la souris.

Les méthodes actuelles de construction de modèles animaux d’hypertension comprennent principalement l’induction chirurgicale, l’induction pharmacologique et les modèles spontanés transgéniques. L’induction chirurgicale utilise généralement des techniques telles que la constriction de l’artère rénale, la constriction aortique ascendante ou la constriction de l’arc aortique pour augmenter artificiellement la résistance du flux sanguin, induisant ainsi une pression artérielle élevée⁴. Bien que ces méthodes puissent rapidement établir des états d’hypertension adaptés à l’étude des processus de remodelage cardiaque liés à la charge de stress, elles impliquent des procédures complexes avec de nombreuses complications postopératoires. L’induction pharmacologique utilise généralement l’injection intrapéritonéale ou l’administration orale pour élever la pression artérielle chez les animaux de laboratoire⁵. Bien que la technologie soit relativement simple, la stabilité du modèle reste sensible aux interférences dues à la posologie du médicament, à la fréquence d’administration et aux réponses au stress chez l’animal. Les modèles transgéniques tels que les rats hypertendus spontanément et les souris hypertendues HBP/2J, qui présentent des phénotypes d’hypertension stables, sont largement utilisés dans la recherche sur l’hypertension héréditaire. Cependant, leurs mécanismes pathogènes singuliers limitent leur capacité à simuler l’hypertension clinique induite par plusieurs facteurs.

Plus récemment, les modèles d’hypertension basés sur la perfusion continue d’Ang II via des pompes osmotiques sous-cutanées ont gagné en popularité. Cette méthode permet une libération prolongée de l’Ang II à un taux constant, en maintenant des concentrations sanguines stables sur de longues périodes pour imiter étroitement les processus pathologiques et reproduire la fibrose myocardique hypertensive de souris ^6,7,8. Néanmoins, d’importantes limites subsistent, notamment en ce qui concerne la standardisation du protocole et les résultats fibrotiques incohérents, qui peuvent être influencés par des facteurs tels que la technique d’implantation de la pompe et les réponses spécifiques aux animaux⁹. Pour combler ces lacunes, cette étude affine le modèle basé sur la pompe osmotique Ang II, normalise les étapes clés et fournit un protocole visualisé. Ces améliorations améliorent la reproductibilité et l’applicabilité pratique, offrant une référence précieuse pour les études futures sur la fibrose myocardique hypertensive.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health, et les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité de recherche animale de la Southwest Medical University (numéro d’approbation SWMU2020317).

1. Préparation de la solution d’Ang II et remplissage de la pompe osmotique

1. Sélectionner 12 souris mâles C57BL/6J de grade SPF (voir le tableau des matières) pesant 20 ± 1 g en sélectionnant des animaux âgés de 8 semaines pour leur uniformité de développement afin de contrôler les facteurs de confusion liés à l’âge. Divisez les souris en un groupe de chirurgie simulée et un groupe modèle à l’aide d’une méthode de randomisation simple, avec 6 souris dans chaque groupe.
2. Mesurer le poids corporel initial de la souris et déterminer la dose d’Ang II (voir le tableau des matériaux) à 1,46 mg/kg/j.
   REMARQUE : D’après l’expérience préliminaire, 1,46 mg/kg/j est la dose optimale d’Ang II. Cette dose maintient de manière fiable la pression artérielle systolique à environ 160 mmHg, induisant efficacement une fibrose myocardique pathologique tout en assurant la survie des animaux tout au long de l’étude de 4 semaines.
3. Ajouter 2,45 mL de solution saline stérile à 0,9 %, pré-refroidie à 4 °C, à 10 mg de poudre lyophilisée Ang II. Mélangez soigneusement la solution et conservez-la sur de la glace pour une utilisation immédiate.
4. Effectuez la procédure sur de la glace à l’aide d’une seringue pour aspirer la solution d’Ang II, puis injectez séquentiellement 200 μL (concentration de 3,91 mmol/L) dans chacune des six chambres de la pompe osmotique (voir le tableau des matériaux).
5. Activez l’entraînement de pression osmotique en immergeant la pompe dans une solution saline stérile à 37 °C pendant 48 h.
   REMARQUE : Remplissez les pompes osmotiques pour le groupe de chirurgie simulée avec un volume égal de solution saline. Comme l’Ang II est photosensible, la procédure doit être menée sous une protection complète contre la lumière.

2. Implantation des pompes osmotiques et construction du modèle ⁶

1. Préparation des animaux et anesthésie
   1. Faites jeûner les souris pendant 4 h avec un accès libre à l’eau. Ensuite, pesez chaque souris et calculez la dose d’anesthésique appropriée (80 mg/kg de pentobarbital sodique)¹⁰.
   2. Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de la dose calculée de pentobarbital sodique.
      REMARQUE : La manipulation du pentobarbital nécessite le respect de la réglementation, le fonctionnement dans une hotte, le port d’un équipement de protection et l’étiquetage du liquide résiduel pour une élimination séparée.
2. Retirez les poils de la peau dorsale sur la région s’étendant de la base de la queue jusqu’au milieu de la zone dorsale à l’aide d’un rasoir ou d’une crème dépilatoire.
3. Désinfectez soigneusement la zone rasée trois fois avec de l’éthanol à 70 %¹¹.
4. À l’aide d’un scalpel, faites une incision sous-cutanée de 0,5 cm dans la zone désinfectée.
5. À travers l’incision, à l’aide d’une pince, séparez brutalement le tissu sous-cutané vers la partie postérieure du cou, créant ainsi une poche.
6. Orientez le corps de la pompe avec l’extrémité de son cathéter pointant vers la tête de la souris. Ensuite, clampez l’embout avec une pince hémostatique et insérez la pompe par voie sous-cutanée dans cette direction.
7. Après l’implantation de la pompe, suturez le tissu sous-cutané avec des sutures résorbables 6-0 interrompues et fermez l’incision cutanée avec des sutures chirurgicales. Ensuite, placez la souris dans un tapis thermique préchauffé à 37 °C jusqu’à ce qu’elle se remette complètement de l’anesthésie (environ 5 à 10 minutes).
8. Perfuser en continu la solution d’Ang II préparée à la dose prédéterminée (1,46 mg/kg/j) via les pompes osmotiques pendant 28 jours.
9. À la fin de la période de perfusion de 28 jours, recueillir toutes les données expérimentales. Ensuite, anesthésie les souris de la même manière que pour les anesthésies précédentes, c’est-à-dire en suivant les procédures décrites aux étapes 2.1.1-2.1.2, et euthanasie-les par luxation cervicale.

3. Mesure de la pression artérielle

1. Préchauffage de l’équipement (voir tableau des matériaux) : Réglez la plate-forme de chauffage à 37-38 °C pour assurer la vasodilatation dans les vaisseaux sanguins de la queue de souris.
2. Saisissez doucement la souris et placez-la dans le support de retenue, en vous assurant que la queue dépasse librement à travers le trou arrière. Ensuite, nettoyez soigneusement la queue exposée avec une boule de coton imbibée d’alcool.
3. Placez un brassard gonflable à la base de la queue. Positionnez le capteur de pouls à environ 5 à 10 mm distal du brassard sur la section médiane à inférieure de la queue.
4. Activez l’appareil et attendez que la forme d’onde de l’impulsion se stabilise avant de continuer.
5. Lancez le cycle de mesure. Le système gonfle automatiquement le brassard à une pression supérieure à 200 mmHg pour obstruer le flux sanguin, puis se dégonfle lentement à 2-3 mmHg par seconde. Le capteur détecte la réapparition de l’onde de pouls lorsque le débit reprend, déterminant ainsi la pression systolique.
6. Mesurez la pression artérielle systolique (TAS) à des intervalles de 7 jours après la modélisation, pour un total de cinq mesures. Pour chaque souris, à chaque point temporel, enregistrez trois lectures séquentielles, en laissant une période de repos de 2 minutes entre les mesures consécutives.
7. Après les mesures, remettez la souris dans sa cage avec de la nourriture et de l’eau. Nettoyez le support et le manchon de queue pour éviter la contamination croisée.

4. Mesure de la fonction cardiaque

1. Au 28e jour de modélisation, anesthésier toutes les souris expérimentales avec du pentobarbital sodique (80 mg/kg de pentobarbital sodique).
2. Positionnez la souris en position couchée sur une plate-forme à température constante.
3. Réaliser une échocardiographie transthoracique à l’aide d’un système d’échographie (voir Tableau des matières). Connectez les membres de la souris aux électrodes de la plate-forme pour surveiller les signaux de l’électrocardiogramme (ECG).
4. Obtenez une imagerie à axe court au niveau du muscle mammaire via l’échographie en mode M pour visualiser le cœur et analyser la fonction cardiaque. Capturez trois images par souris et faites la moyenne des données pour l’analyse ultérieure de la dimension diastolique interne du ventricule gauche (LVIDd), du diamètre interne du ventricule gauche systolique (LVID), du raccourcissement fractionnel du ventricule gauche (LVFS) et de la fraction d’éjection ventriculaire gauche (LVEF).
   REMARQUE : Maintenez le contact de la sonde avec la paroi thoracique sans comprimer la cavité thoracique ; assurer la ligne de prélèvement en mode M perpendiculaire au septum ventriculaire ; Effectuer des mesures continues pendant ≥ 3 cycles cardiaques pour obtenir des valeurs moyennes.

5. Coloration Masson

1. Prélèvement et fixation cardiaques
   1. Anesthésier la souris avec du pentobarbital sodique (80 mg/kg de pentobarbital sodique). Ensuite, faites une incision longitudinale d’environ 1,5 cm dans la cavité thoracique à l’aide de ciseaux, ligaturez les principaux vaisseaux cardiaques et excisez rapidement le cœur pour éviter les lésions de traction¹².
   2. Rincez immédiatement le cœur excisé avec du PBS pré-refroidi pour éliminer le sang et épongez doucement l’excès d’humidité à l’aide de papier filtre propre. Par la suite, effectuez une section transversale le long du muscle papillaire pour obtenir une tranche de tissu de 3 mm d’épaisseur.
   3. Pour la fixation, immergez les échantillons cardiaques dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant plus de 48 h, en assurant un rapport de volume tissu/fixateur minimum de 1:10.
2. Retirez le tissu cardiaque du fixateur de paraformaldéhyde à 4 %. Ensuite, sous une hotte, tranchez finement le tissu d’une épaisseur de 4 μm avec un couteau chirurgical et transférez les tranches dans une cassette de déshydratation¹³.
3. Chargez des sections de tissus dans le déshydrateur et effectuez les étapes suivantes : 70 % d’éthanol, 80 % d’éthanol, 95 % d’éthanol pendant 1 h chacune ; 100 % éthanol I et II pendant 45 min chacun ; xylène I et II pendant 30 min chacun.
4. Incorporez le tissu dans de la paraffine, puis solidifiez les blocs sur une plaque froide pré-refroidie à -20 °C.
5. À l’aide d’un microtome de paraffine, on obtient des coupes longitudinales de 4 m d’épaisseur à partir des blocs de tissu enrobés de paraffine. Ensuite, immergez séquentiellement les sections dans les solutions suivantes pendant 5 minutes chacune pour les déparaffiniser et les réhydrater : xylène I, xylène II, éthanol absolu, éthanol à 95 %, éthanol à 80 %, éthanol à 70 % et enfin eau distillée.
6. Immergez le tissu dans la solution de coloration à l’hématoxyline de fer de Weigert préparée pendant 8 min. Ensuite, rincez à plusieurs reprises à l’eau distillée pour éliminer l’excès de solution de coloration. Différencier dans une solution de différenciation acide de l’éthanol pendant 5 s, puis bleuir dans la solution bleuissante de Masson pendant 5 min. Enfin, rincez à l’eau distillée¹⁴.
7. Teindre les sections avec du rouge carmin pendant 10 min, en appliquant environ 200 à 300 μL par lame pour assurer une couverture complète et uniforme du tissu. Ensuite, rincez les sections avec de l’acide acétique glacial à 0,2 % pendant 1 min.
8. Traitez les sections avec une solution d’acide phosphomolybdique pendant environ 5 minutes, ou jusqu’à ce que les fibres musculaires deviennent rouges. Ensuite, colorez les sections avec un volume suffisant de solution de bleu d’aniline pour couvrir complètement le tissu (généralement 200 à 300 μL par lame) pendant 5 min. Enfin, rincez les sections avec une solution d’acide acétique glacial à 0,2 %¹⁵.
9. Déshydratez les sections à travers une série d’éthanol gradué. Procédez à l’élimination des tissus avec du xylène en utilisant trois immersions de 1 à 2 minutes chacune.
10. Montez les sections en appliquant une petite quantité de résine neutre et en les recouvrant d’une lamelle.
11. Examen microscopique (voir la Table des matières) : Observer les tissus colorés à Masson à des grossissements de 40×, 20× et 10×. Photographiez chaque diapositive pour préserver des images représentatives.
    REMARQUE : Éliminez tous les déchets conformément aux protocoles de sécurité de l’établissement. Recueillir la solution de différenciation acide et l’acide acétique glacial dans des fûts résistants à la corrosion, neutraliser les déchets à haute concentration à pH 6-8 et ne pas mélanger avec des solutions alcalines. Conservez l’éthanol dans des fûts antidéflagrants dans un endroit frais, à l’abri des sources d’incendie. Conservez le xylène dans des barils bruns, utilisez une hotte avec un équipement de protection et ne mélangez pas d’acides (substances) avec de l’éthanol. Placez les tissus animaux dans des contenants étiquetés, scellez-les et stockez-les dans des conditions de congélation¹⁶. Enfin, transférer tous les déchets à des institutions professionnelles qualifiées pour élimination ; interdire strictement le mélange des déchets ou leur élimination occasionnelle.

6. Analyse statistique

1. Collectez toutes les données numériques et analysez-les à l’aide de GraphPad Prism 9.0.
2. Utilisez l’échantillon indépendant t-test pour analyser les différences entre les groupes.
3. Définissez la signification statistique comme **P < 0,01 pour très significatif et *P < 0,05 pour significatif.

Results

Douze souris ont été implantées par voie sous-cutanée avec des pompes osmotiques et ont survécu. Le groupe modèle a tous développé une hypertension (n = 6). Sept jours après l’implantation, la TAS moyenne dans le groupe modèle dépassait 160 mmHg (figure 1A). Les jours 14, 21 et 28, la TAS dans le groupe modèle est demeurée constamment supérieure à 160 mmHg. En revanche, le groupe de chirurgie simulée a maintenu des niveaux normaux de TAS (environ 90-110 mmHg) tout au long de l’expérience san...

Discussion

Ce protocole a optimisé les étapes clés impliquées dans la perfusion continue d’Ang II pour induire une fibrose myocardique hypertensive à l’aide d’une pompe osmotique et a détaillé les aspects critiques, tels que le positionnement d’implantation de la pompe osmotique et le réglage de la concentration d’Ang II. La pompe modèle 2004 a été choisie pour sa durée de 4 semaines, et la dose d’Ang II a été calculée sur la base du débit de perfusion nominal, en tenant compte d’une variabilité mi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ang II	Sigma-Aldrich Corporation	Sigma, A9525
Machine d’anesthésie animale	Shenzhen Reward Life Science Co., Ltd	R530
Ventilateur pour animaux	Shenzhen Reward Life Science Co., Ltd	R415
GraphPad Prism  ;	GraphPad Software Inc.	Version 9.0
Tensiomètre intelligent non invasif	Nippon Soft Dragon Co., Ltd	Softron, BP-98A
Microscope optique	Yijingtong Optical Technology (Shanghai) Co., Ltd	OLYMPUS, SZ61TR
Solution et kit de coloration Tricolor Masson	Beijing Soleibao Technology Co., Ltd	Solarbio, G1340
Souris	Chengdu Dossy Exprimental Animals CO., Ltd	C57BL/6J
Pompes osmotiques	ALZA Corporation	Alzet, Modèle 2004
Systèmes d’imagerie par ultrasons	FUJIFILM VisualSonics Corporation, Canada	FUJIFILM, Vevo 3100