Modélisation des métastases cérébrales : analyse standardisée de la colonisation métastatique et des schémas de croissance histologiques par injection intracorticale stéréotaxique

Résumé

La technique d’injection intracrânienne stéréotaxique permet une implantation précise et localisée de cellules tumorales dans le cortex de la souris, ce qui en fait un modèle puissant pour étudier la colonisation métastatique du cerveau.

Résumé

Les métastases cérébrales sont une complication fréquente et dévastatrice des tumeurs solides avancées, souvent associées à un mauvais pronostic, un déclin neurologique et une diminution de la qualité de vie. L’incidence de l’insuffisance du système nerveux central (SNC) et de la mort neurologique augmente rapidement, pourtant les mécanismes à l’origine des dernières étapes de la métastase cérébrale, tels que la dissémination secondaire, la recolonisation et la contribution du schéma de croissance histologique (HGP) comme paramètre substitut potentiel, restent mal compris.

Le modèle standardisé d’injection intracorticale stéréotaxique permet l’implantation précise et reproductible de cellules tumorales, ou de populations mixtes incluant des composants stromales ou immunitaires, directement dans le cortex cérébral de la souris. Ce protocole soutient également la création d’une archive tissulaire préclinique, offrant une plateforme robuste pour étudier des aspects essentiels de la colonisation du SNC, tels que : la croissance métastatique, la dynamique de croissance spécifique à HGP, et les mécanismes physiopathologiques contribuant à l’échec neurologique. De plus, ce modèle permet de soutenir les tests pharmacologiques dans un contexte cliniquement reproductible et pertinent.

Contrairement aux méthodes d’injection systémique (par exemple, veine caudale ou intracardiaque), qui sont optimisées pour étudier les premières étapes métastatiques mais entraînent des taux variables et souvent faibles de colonisation cérébrale, le modèle stéréotaxique assure une croissance métastatique cohérente et spécifique au cerveau et permet l’étude des stades avancés de la métastase du SNC. Comparé aux systèmes ex vivo tels que les organoïdes ou les cultures par tranches cérébrales, le modèle stéréotaxique in vivo préserve la vascularisation, la signalisation systémique et toute la complexité du paysage immunitaire cérébral, soutenant des études à long terme sur la progression tumorale et la réponse thérapeutique.

En fournissant une plateforme reproductible et cliniquement pertinente, notre modèle améliore la capacité du domaine à identifier les marqueurs pronostiques, à explorer des stratégies thérapeutiques et à comprendre les mécanismes des métastases cérébrales à un stade avancé.

Introduction

Les métastases cérébrales sont une complication fréquente et dévastatrice chez les patients atteints de tumeurs solides, souvent associées à un mauvais pronostic, à un déclin neurologique important et à une réduction de la qualité^{de vie 1,2,3}. En particulier, l’insuffisance du système nerveux central (SNC) et la mort neurologique sont devenues des issues de plus en plus fréquentes dans des cancers tels que les cancers du poumon, du sein et^{le mélanome} 4,5,6,7. L’insuffisance du SNC dans le contexte des métastases cérébrales peut résulter de divers mécanismes, notamment l’effet de masse local, l’œdème péritumoral, l’hémorragie intracrânienne et la dissémination méningée, qui peuvent agir de manière indépendante ou synergique pour finalement entraîner une mort^{neurologique 8}.

Malgré son importance clinique, les mécanismes physiopathologiques sous-jacents à l’échec du SNC et aux dernières étapes de la progression métastatique restent mal comprises. Des processus tels que la dissémination alternative, la dissémination secondaire et la recolonisation sont rarement au cœur d’une enquête^{dédiée 8}. Les études cliniques et précliniques limitent souvent leurs analyses à des critères tels que le nombre de métastases cérébrales, la taille ou la survie globale (SO), négligeant ainsi les connaissances mécanistes cruciales et les véritables causes du déclin neurologique et de la mort.

Dans ce contexte, nous et d’autres avons identifié des schémas de croissance histologiques (HGP) distincts dans les métastases cérébrales qui sont corrélés aux résultats^{cliniques 9,10,11}. Trois HGP majeurs ont été décrits : i) non infiltratives, caractérisées par une bordure tumorale bien délimitée souvent entourée d’un bord astrocytique réactif ; ii) infiltration épithéliale, où des groupes de cellules tumorales infiltrent le parenchyme cérébral adjacent sans confinement astrocytaire ; et iii) infiltratif diffus, caractérisé par une infiltration généralisée de cellules tumorales uniques ou de petits groupes, provoquant une astrogliose^{étendue 10,12}.

Cliniquement, les HGP infiltratives sont associées à un pronostic nettement pire comparé aux schémas non^{infiltratifs 9,10,11}. De plus, les HGP semblent refléter des aspects clés de la dynamique de croissance tumorale et des mécanismes conduisant à la mort neurologique. Alors que les métastases non infiltratives s’étendent généralement en une seule lésion et contraignent les structures vitales du cerveau, les lésions infiltratives présentent une diffusion secondaire (à partir de la lésion existante et non de la tumeur primaire) au sein du SNC, contribuant à des dommages généralisés et à une destruction totale des organes (données non publiées). Les lésions infiltratives peuvent également recoloniser les méninges, contribuant à la métastase méningée et compliquant davantage le cours de la maladie^10,13. Malgré leur pertinence clinique, les HGP des métastases cérébrales et les dernières étapes de la colonisation du SNC, y compris la dissémination secondaire et la recolonisation du même organe, restent peu étudiées, principalement en raison du manque de modèles expérimentaux appropriés.

Pour combler cette lacune, nous présentons un modèle stéréotaxique d’injection intracrânienne qui permet l’implantation précise et reproductible de cellules tumorales ou de mélanges cellulaires comprenant des cellules tumorales et d’un ou plusieurs types cellulaires non tumoraux dans le cortex cérébral de souris expérimentales. Ce modèle surmonte les principales limites des modèles de métastases systémiques et offre une plateforme solide pour étudier des aspects essentiels de la colonisation du SNC, tels que : les interactions tumeur-cellules immunitaires lors de la^{colonisation 14}, l’impact des mélanges cellulaires^{pré-traités 15}, la procroissance^{métastatique 16}, la dynamique de croissance spécifique à HGP et les mécanismes physiopathologiques contribuant à l’échec neurologique (données non publiées). De plus, ce modèle soutient les tests pharmacologiques dans un contexte reproductible et cliniquement^{pertinent 14,15}.

Ce protocole propose un cadre méthodologique détaillé pour mettre en œuvre le modèle d’injection stéréotaxique afin d’étudier les HGP dans les métastases cérébrales. Il soutient également le développement d’une archive d’échantillons précliniques structurée et d’une bibliothèque numérique de tissus pour l’investigation systématique de la biologie de la colonisation du SNC à un stade avancé. Notre objectif est de permettre l’identification de biomarqueurs pronostiques et potentiellement prédictifs, de contribuer au développement de stratégies thérapeutiques améliorées et d’améliorer notre capacité à prédire les réponses aiguës et chroniques du parenchyme cérébral et du système immunitaire. Grâce à cette approche, nous cherchons à fournir une plateforme standardisée pour une étude systématique de la colonisation du SNC et de la progression métastatique.

Protocole

Toutes les procédures animales décrites dans ce protocole ont été menées conformément aux directives institutionnelles et approuvées par le gouvernement de Basse-Franconie (numéro de permis : RUF-55.2.2-2532-2-1678). Ce protocole est conçu pour l’injection stéréotaxique intracorticale de cellules tumorales chez des souris adultes syngéniques (âgées de 10 à 12 semaines) comme modèle de colonisation métastatique du cerveau. Toute modification du protocole doit être discutée avec l’agent désigné pour le bien-être animal.

1. Procédures préopératoires

1. Acclimatation des animaux
   REMARQUE : Les souris doivent être acclimatées pendant au moins 7 jours avant le début des procédures expérimentales.
   1. Héberger les animaux expérimentaux en groupes dans des conditions de laboratoire standard (22 ± 2 °C, 50-60 % d’humidité relative, cycle clair/obscur de 12 heures) avec un accès improvisé à la nourriture et à l’eau.
   2. Pour promouvoir le bien-être et réduire le stress, offrez un enrichissement environnemental sous forme de matériaux de nidification, d’abris et de blocs à ronger.
   3. Manipulez les animaux une fois par jour (3 à 5 minutes par séance) pendant la période d’acclimatation pour les familiariser avec le contact humain. De plus, réalisez des procédures simulées qui simulent des aspects clés de la prochaine opération, y compris la pesée et l’exposition à l’anesthésie, sans effectuer d’intervention invasive. Ces séances visent à habituer les animaux à l’environnement procédural et à minimiser la variabilité liée au stress.
2. Examen physique (contrôle de santé pré-chirurgical)
   REMARQUE : Avant l’injection de cellules tumorales, tous les animaux doivent subir un examen physique et neurologique approfondi afin d’exclure toute anomalie préexistante non liée à l’étude. Les animaux présentant des déficits ou des anomalies doivent être exclus de l’étude. L’examen physique peut être effectué la veille de l’injection.
   1. Effectuer une inspection physique complète évaluant la santé générale, y compris l’état du pelage, la posture, la respiration, la démarche, le poids corporel et le comportement général.
   2. Évaluer la fonction neurologique à l’aide du test du fil suspendu pour évaluer la force de prise et la coordination. Pour effectuer le test du fil suspendu, suspendez un fil horizontal (d’environ 2 mm de diamètre) entre deux supports, avec des plateformes d’évacuation positionnées aux extrémités à environ 30 cm au-dessus d’une surface rembourrée. Placez la souris au centre du fil et laissez-la saisir le fil avec ses pattes avant. Relâche la souris et commence le timing immédiatement. Terminez l’épreuve lorsque la souris atteint l’une des plateformes ou tombe. Considérons une souris réussie si elle atteint la plateforme en moins de 60 s ; Enregistrer comme échec s’il tombe ou n’atteint pas la plateforme dans ce délai.
3. Préparation des postes de travail
   1. Le jour de l’opération (jour 0), installez quatre postes de travail dédiés comme décrit ci-dessous afin d’assurer un flux de travail efficace et de maintenir une technique stérile tout au long de la procédure.
      REMARQUE : Utilisez des matériaux chirurgicaux stériles (sous-couches, compresses en gaze, points de suture, etc.) et des instruments chirurgicaux autoclavés (scalpel, pinces, ciseaux, spatules, etc.).
      1. Poste de travail #1 - Préparation animale avant la chirurgie : Utilisez ce poste de travail pour peser les souris, préparer la solution anesthésiante et administrer l’anesthésie. Préparez une surface propre contenant une balance, deux cages avec literie (désignez-en une pour les souris anesthésiées), une seringue de 1 mL remplie de solution anesthésiante et une pommade pour les yeux.
      2. Poste de travail #2 - Installation avant et après l’opération : Utilisez ce poste pour effectuer l’incision du cuir chevelu, sceller le crâne et suturer la plaie. Préparez une surface propre contenant un scalpel, une seringue de 10 mL contenant 0,9 % de NaCl, de la cire osseuse, une spatule, du matériel pour suture, des pinces et ciseaux, des cotons-tigeons, un désinfectant (70 % d’éthanol), une seringue de 1 mL avec des analgésiques, et une bouillotte ou une plateforme de chauffage similaire.
      3. Poste de travail #3 - Préparation des cellules tumorales : Utilisez ce poste de travail pour préparer la solution des cellules tumorales avant l’inoculation. Préparez une surface propre contenant une glacière avec une seringue Hamilton de 10 μL et un tube Eppendorf avec suspension cellulaire dans un milieu à matrice extracellulaire (ECM), une pipette avec des embouts de 100 μL pour la resuspension des cellules, et trois vaisseaux pour nettoyer la seringue Hamilton après inoculation des cellules tumorales contenant de l’eau distillée, 70 % d’éthanol et 0,9 % de NaCl.
      4. Poste de travail #4 - Injection stéréotaxique : Utilisez ce poste de travail pour effectuer l’injection stéréotaxique de cellules tumorales dans le cortex cérébral. Préparez une surface propre contenant le cadre stéréotaxique pour petits animaux, une perceuse dentaire de précision, de grandes pinces et des cotons-tiges.
4. Préparation de la suspension de cellules tumorales
   REMARQUE : Toutes les procédures de préparation de la suspension des cellules tumorales doivent être effectuées dans une armoire de sécurité biologique certifiée (cagoule de classe II) utilisant un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, comprenant la blouse de laboratoire, les gants et la protection oculaire, afin d’assurer la stérilité et de protéger le personnel contre une exposition potentielle à des risques biologiques.
   1. Trypsinisez les cellules avec 1 mL de trypsine 1x EDTA.
      REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser les cellules tumorales en phase de croissance exponentielle.
   2. Déterminez le nombre de cellules avec précision à l’aide d’une méthode de comptage appropriée (par exemple, hémocytomètre ou compteur cellulaire automatisé).
   3. Préparez une suspension cellulaire contenant 1 x 10³ cellules dans un milieu ECM de 3 μL par animal. Utilisez un mélange 2:1 de MEE et de milieu de culture standard contenant 10 % de FCS et d’autres compléments si nécessaire. Augmentez le volume de suspension et le nombre de cellules selon le nombre d’animaux (par exemple, pour 10 souris, préparez 10 × 10^{cellules 3} dans un milieu ECM de 30 μL).
      REMARQUE : Le nombre de cellules injectées doit être soigneusement ajusté pour chaque lignée cellulaire.
   4. Gardez la suspension de la cellule sur glace jusqu’à l’injection, pendant un maximum de 2 heures.

2. Procédures intraopératoires

1. Anesthésie de souris
   1. Peser chaque souris à l’aide d’une balance de précision et calculer le volume d’anesthésie requis en fonction du poids corporel.
   2. Administrez le volume calculé de l’anesthésique par voie intrapéritonéale.
      REMARQUE : Utilisez un traitement anesthésique qui couvre toute la procédure (environ 2 heures). Par exemple : Kétamine 10 % (chlorhydrate de kétamine, 100 mg/mL ; 100 mg/kg de poids corporel) combiné à Domitor (chlorure de médétomidine, 1 mg/mL ; 0,25 mg/kg de poids corporel), ou un protocole équivalent.
   3. Une fois la profondeur d’anesthésie suffisante confirmée, placez la souris sur une bouillotte pré-chauffante (maintenue à 37-38 °C) pour soutenir la thermorégulation et appliquez une pommade pour protéger la cornée du dessèchement.
      REMARQUE : Confirmez une profondeur d’anesthésie suffisante en pinçant doucement la patte arrière avec une pince. Ne procédez à l’opération que si aucun réflexe de sevrage n’est observé.
2. Préparation du cuir chevelu et incision
   1. Administrez la lidocaïne préopératoirement pour administrer une anesthésie locale au site de l’incision. Utilisez une solution de lidocaïne à 1 % (5 mg/mL) et injectez environ 0,05 à 0,1 mL par voie sous-cutanée le long de la ligne d’incision prévue. Laissez au moins 2 à 3 minutes l’anesthésique faire effet avant de procéder à l’incision du cuir chevelu.
   2. Désinfectez soigneusement le cuir chevelu à l’aide d’une solution à base d’iode.
   3. Étirer la peau jusqu’à ce qu’elle soit tendue et effectuer une incision médiane d’environ 3-4 mm le long du crâne à l’aide d’un scalpel stérile.
   4. Avec le même scalpel, grattez doucement le périoste pour exposer la surface du crâne.
3. Mise en place du cadre stéréotaxique, identification des coordonnées et craniotomie
   1. Fixez la tête de la souris dans le cadre stéréotaxique à l’aide de barres d’oreilles.
   2. À l’aide du bras stéréotaxique, localisez le Bregma (l’intersection des sutures coronale et sagittale du crâne), puis déplacez le bras stéréotaxique 2 mm antérieur et 1 mm latéral (droit) vers le site cible d’injection dans le cortex frontal comme indiqué à la Figure 1B et marquez-le avec un marqueur chirurgical.
      REMARQUE : Si un vaisseau sanguin est présent au site d’injection prévu, la localisation peut être ajustée jusqu’à 0,5 mm pour prévenir une hémorragie.
   3. Forez soigneusement le crâne à l’aide d’une perceuse dentaire de précision, en veillant à ne pas pénétrer la dure-mère.
   4. Confirmez l’ouverture en sondant doucement avec des pinces stériles pour sentir la percée.
4. Injection de cellules tumorales
   REMARQUE : Travaillez rapidement pendant cette étape, car l’ECM commence à se solidifier à température ambiante, ce qui peut nuire à la précision et à la consistance de l’injection.
   1. Resuspendez soigneusement la suspension des cellules tumorales en pipettant de haut en bas pour assurer une distribution uniforme.
      REMARQUE : Évitez le vortex pour éviter la formation de bulles d’air.
   2. Chargez 3 μL de la suspension à cellules dans une seringue Hamilton de 10 μL et placez-la dans le cadre stéréotaxique à l’aide du support approprié.
   3. Positionnez soigneusement l’aiguille de la seringue au-dessus du trou de meule.
      REMARQUE : Assurez-vous que le biseau de l’aiguille est orienté vers la gauche pour améliorer la reproductibilité lors de l’injection.
   4. Insérez l’aiguille verticalement dans le tissu cérébral à une profondeur de 3,5 mm. Une fois cette profondeur atteinte, retirez lentement l’aiguille de 0,5 mm pour aider à prévenir le reflux de la suspension cellulaire pendant et après l’injection.
   5. Injectez lentement les 3 μL de suspension de cellules tumurales sur une période d’une minute. Après l’administration complète du volume, maintenez l’aiguille en place pendant 2 minutes supplémentaires pour permettre aux cellules et à la MCE de se stabiliser, minimisant ainsi tout risque de reflux.
   6. Retirez prudemment la seringue et retirez la souris du cadre stéréotaxique.
5. Suture et récupération après anesthésie
   1. Rincez doucement le crâne avec une solution stérile de NaCl à 0,9 %.
   2. Séchez et scellez le trou de meule avec de la cire osseuse.
   3. Fermez l’incision du cuir chevelu à l’aide de 3 à 4 points de suture, en veillant à ce que chaque suture soit nouée avec trois nœuds serrés placés près des bords de la plaie pour une bonne cicatrisation.
   4. Marque les oreilles de la souris avec un motif de perforation approprié correspondant au numéro d’identification désigné.
   5. Réappliquez la pommade oculaire si nécessaire pour éviter la sécheresse cornéenne pendant la récupération. Immédiatement après, remettez la souris sur un coussin chauffant préchauffé (maintenu à 37-38 °C) pour soutenir la thermorégulation et faciliter une récupération en douceur après l’anesthésie.
      REMARQUE : Il est recommandé d’héberger les souris individuellement pendant la convalescence afin d’éviter les blessures dues aux interactions entre animaux éveillés et en convalescence.
   6. Nettoyez et désinfectez soigneusement la seringue Hamilton en rinçant l’aiguille et le canon trois fois de suite : d’abord avec de l’eau distillée, puis à 70 % d’éthanol, et enfin avec une solution stérile de NaCl à 0,9 %.
   7. Après le nettoyage, conservez la seringue Hamilton sur la glace jusqu’à sa prochaine utilisation.

3. Procédures postopératoires

1. Analgésie postopératoire
   1. Administrez des analgésiques par voie sous-cutanée pendant que la souris est encore sous anesthésie afin d’assurer un soulagement immédiat de la douleur postopératoire.
      REMARQUE : Utilisez des analgésiques adaptés à ce type de procédure. Par exemple, le Carprofène à 10 mg/kg de poids corporel.
   2. Une fois que la souris est complètement réveillée et a retrouvé ses fonctions motrices normales, transférez-la dans une cage propre avec une literie fraîche. Surveillez brièvement l’animal pour détecter un comportement normal et des schémas respiratoires.
   3. Après une récupération complète, administrez des analgésies par eau potable (par exemple, métamizole à 200 mg/kg de poids corporel) pendant au moins 24 heures après l’opération.
      REMARQUE : Pour encourager la consommation d’eau, sucrez l’eau potable avec 0,5 % de saccharose. Enveloppez les bouteilles dans du papier aluminium pour protéger la solution de la lumière et remplacez-les chaque jour. Étiquetez chaque bouteille pour suivre la consommation d’analgésiques. Si les analgésiques ne sont pas consommés par l’eau potable ou si des signes de douleur sont observés, administrez du Carprofène (10 mg/kg de poids corporel) par voie sous-cutanée toutes les 12 heures jusqu’à la guérison complète.
2. Surveillance de la souris
   1. Surveillez toutes les souris de près toutes les 24 heures pendant les 48 premières heures post-opératoire, en évaluant la fonction motrice et le comportement. À partir du troisième jour, surveillez les souris au moins tous les 3 jours, y compris les mesures de poids corporel.
   2. Si des signes de détresse ou de comportement anormal sont observés (par exemple, activité motrice altérée, comportement inhabituel), effectuez le test du fil suspendu, comme décrit précédemment. Si la souris réussit le test, continuez à surveiller et répétez le test un jour sur deux.
   3. Euthanasiez immédiatement les souris (voir Section 3.4) après avoir atteint l’un des critères humains prédéfinis : perte de poids > 20 % par rapport au poids corporel initial (jour 0), échec à réussir le test du fil suspendu, ou détresse modérée persistante pouvant aller jusqu’à 48 heures.
3. Traitement thérapeutique (optionnel)
   1. Après une récupération post-opératoire complète, un schéma thérapeutique peut être initié selon le plan expérimental. Si tel est le cas, définissez clairement le moment d’initiation du traitement dans le protocole de l’étude et adaptez le plan de suivi pour refléter les effets attendus et les effets secondaires potentiels de l’intervention thérapeutique.
      REMARQUE : Le traitement ne doit pas commencer tant que les animaux n’ont pas montré un comportement normal, un poids stable et aucun signe de détresse postopératoire.
4. Euthanasie et collecte de tissus
   REMARQUE : Les souris doivent être euthanasiées immédiatement après avoir atteint des objectifs humains prédéfinis ou à des moments expérimentaux désignés, selon les objectifs spécifiques de la recherche.
   1. Anesthésiez la souris selon une méthode appropriée (voir étape 2.1.2).
   2. Ouvrir la cavité thoracique et effectuer une perfusion transcardique avec 10 à 20 mL de NaCl stérile glacé à 0,9 %, suivi de 10 à 20 mL de paraformodéhyde glacé à 4 % (PFA).
      REMARQUE : Si un tissu frais est nécessaire pour des applications en aval (par exemple, isolement d’ARN ou FACS), omettez l’étape de perfusion PFA.
   3. Collectez le cerveau et d’autres organes d’intérêt.
      REMARQUE : Les organes peuvent être congelés instantanément dans de l’azote liquide, fixés dans du formol pour le traitement du FFPE, ou utilisés directement pour des analyses en aval.
5. Analyse post-mortem structurée
   REMARQUE : Pour confirmer la croissance métastatique et caractériser les caractéristiques histopathologiques associées, une analyse post-mortem du tissu cérébral doit être réalisée à l’aide d’échantillons natifs (fraîchement congelés) et fixes (FFPE).
   1. Dissection tissulaire
      1. Disséquez le cerveau au niveau du site d’injection, comme indiqué dans le schéma fourni à la Figure 1C.
      2. Conservez la partie antérieure pour le traitement frais congelé (FF). Divisez cette partie en hémisphères injectés (i.) et non injectés (n.i.).
      3. Conserver la partie centrale pour la fixation du formol et l’incorporation de la paraffine (FFPE).
      4. Écartez la partie postérieure, y compris le cervelet et le tronc cérébral.
   2. Traitement des échantillons
      1. Congelez brusquement la portion antérieure dans de l’azote liquide et conservez les échantillons de FF à -80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.
      2. Fixez la partie centrale dans 5 à 7 mL de PFA à 4 % à température ambiante pendant 48 h avant le traitement du FFPE.
         REMARQUE : La fixation du PFA doit être effectuée dans une hotte chimique tout en portant des EPI appropriés afin d’éviter l’exposition aux vapeurs toxiques.
   3. Quantification de la charge métastatique (échantillons FF)
      1. Isoler l’ARN total à l’aide d’un kit ou protocole d’extraction approprié, optimisé pour le tissu cérébral.
         REMARQUE : L’isolement de l’ARN doit être effectué dans une armoire de sécurité biologique à l’aide d’équipements de protection appropriés afin d’éviter la contamination et l’exposition à des réactifs dangereux.
      2. Effectuer une PCR quantitative (qPCR) en utilisant un marqueur spécifique à une cellule tumorale, tel que Ck8.
         REMARQUE : Des cibles supplémentaires (par exemple, marqueurs immunitaires ou stromals) peuvent être évaluées en sélectionnant des marqueurs génétiques appropriés. Le séquençage de l’ARN (RNA-seq) peut être utilisé comme alternative à l’analyse à l’échelle du transcriptome.
      3. Calculez la charge tumorale relative en normalisant le gène d’intérêt (GOI, par exemple Ck8) en un gène de ménage (HK).
   4. Analyse histologique (échantillons FFPE)
      1. Insérez du tissu fixé au formol dans la paraffine.
      2. Coupez les échantillons en tranches de 3 μm d’épaisseur à l’aide d’un microtome.
         REMARQUE : L’utilisation du microtome doit être réalisée par du personnel formé disposant d’équipements de protection appropriés, utilisant la protection de la lame lorsqu’elle ne coupe pas et jetant les lames dans des contenants à objets tranchants pour garantir la sécurité.
      3. Effectuer la coloration standard de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E) ainsi que l’immunohistochimie (IHC) en utilisant les anticorps pertinents, tels que Ck8 (cellules tumorales), Cd3 (lymphocytes T), Iba1 (microglies/macrophages) et Gfap (astrocytes).
         REMARQUE : Les procédures H&E et IHC doivent être effectuées dans un espace bien ventilé ou une hotte à fumées afin d’assurer la sécurité et d’éviter l’exposition à des produits chimiques.
      4. Numérisez numériquement toutes les lames colorées à l’aide d’un scanner haute résolution pour constituer une bibliothèque de tissus numérique.
      5. Évaluer le schéma histologique de croissance (HGP) de la métastase cérébrale selon le protocole^{publié 10,12}.

Résultats

Le protocole d’injection stéréotaxique (Figure 1) peut être appliqué à la fois aux modèles murins syngéniques et à xénogreffes, y compris les souches sauvages ou génétiquement modifiées, selon la question scientifique. Toute lignée cellulaire adaptée capable de croître dans le cerveau peut être utilisée. Parmi les lignées cellulaires tumorales murines capables de coloniser le cerveau, on retrouve sans s’y limiter les cellules tumorales du sein 4T1 et 410.4, les cellules cancéreuses colorectales CMT93, et la lignée cellulaire de mélanome B16-F10. Le temps nécessaire aux cellules tumorales pour établir des métastases dans le cerveau varie selon la lignée cellulaire, allant de quelques jours à plusieurs semaines, et la pénétrance est également variable. Nous recommandons d’utiliser un modèle avec une pénétration de ~70 %, ce qui signifie qu’au moins 7 animaux sur 10 développent des métastases dans une période expérimentale maximale de 20 semaines (Figure 2A). Chaque lignée cellulaire doit être optimisée individuellement et le nombre de cellules injectées soigneusement tiré.

À titre d’exemple, nous avons comparé deux modèles de métastase cérébrale du cancer du sein syngénique étroitement liés : 410,4 et son dérivé 4T1. Malgré leur similarité génétique¹⁷, ces lignées cellulaires présentent des comportements métastatiques et des schémas de croissance nettement différents^{dans le cerveau 16}. Bien que les deux atteignent une charge métastatique similaire (Figure 2B), chacun présente un parcours temporel unique (Figure 2C) et des HGP clairement distincts (Figure 2D). Pour évaluer et comparer systématiquement l’efficacité de la colonisation entre différentes lignées cellulaires, nous avons développé l’Indice de Colonisation, une formule mathématique intégrant le nombre de cellules injectées, le temps médian de survie et le succès de la colonisation (Figure 2E-G).

Lors de la première injection stéréotaxique ou du test d’une nouvelle lignée cellulaire, il est essentiel d’évaluer soigneusement les schémas de croissance et de comparer les résultats entre animaux, chirurgies et expérimentateurs afin d’assurer leur reproductibilité. Une étape cruciale est l’injection de cellules tumorales, durant laquelle une fuite de la suspension cellulaire peut se produire. Cela peut entraîner une localisation trompeuse des tumeurs, notamment l’ensemencement iatrogène des cellules tumorales sur le crâne et/ou les méninges, pouvant entraîner une métastase méningée faussement positive qui ne représente pas une véritable colonisation intracérébrale avec une dissémination méningée secondaire ultérieure. Ces scénarios sont illustrés à la Figure 3.

Figure 1 : Procédures pré-, intra- et post-opératoires pour l’injection stéréotaxique intracorticale de cellules tumorales chez la souris. Aperçu schématique de la procédure. (A) La phase préopératoire comprend l’acclimatation animale, l’évaluation de santé, la préparation du site chirurgical et la suspension des cellules tumorales. (B) La phase intraopératoire comprend l’induction de l’anesthésie, l’incision du cuir chevelu, la pose dans le cadre stéréotaxique, une craniotomie précise, l’injection de cellules tumorales dans le cortex cérébral en utilisant des coordonnées stéréotaxiques, la fermeture de la plaie et la récupération après anesthésie. (C) La phase post-opératoire comprend l’administration d’analgésiques, le suivi régulier pour évaluer la récupération post-chirurgicale, l’état général de santé et le développement des symptômes neurologiques (test du fil suspendu), suivie de l’euthanasie et du prélèvement d’organes. Une analyse post-mortem structurée est incluse pour évaluer la charge métastatique dans le tissu frais congelé (FF) via qPCR et pour évaluer les schémas de croissance histologiques des échantillons FFPE à partir d’une bibliothèque de lames numériques. Les étapes clés de la procédure sont illustrées séquentiellement pour mettre l’accent sur le timing et le flux de travail chirurgical. Image créée dans BioRender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Résultats représentatifs de la croissance métastatique dans des modèles murins de métastase cérébrale après injection stéréotaxique de cellules 4T1 et 410,4 de cancer du sein. (A) Images macroscopiques montrant l’absence de croissance tumorale chez les souris témoins Balb/C injectées par ECM (Témoin) et la présence de lésions métastatiques visibles chez des souris injectées avec des suspensions de cellules tumorales (Met). (B) Quantification de la charge métastatique chez les souris témoins injectées par ECM (CTRL) et chez les souris présentant des métastases cérébrales dérivées de cellules 4T1 et 410,4 du cancer du sein. La charge métastatique a été évaluée par qPCR en utilisant Ck8 comme marqueur tumoral, avec Gapdh et Pgk1 comme gènes de maintien (HK). Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes avec des points de données individuels. L’analyse statistique a été réalisée à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple de Dunnett (n = 5 ; ****P < 0,0001). (C) Courbes de survie de Kaplan-Meier comparant la survie globale (OS) de souris injectées stéréotaxiquement avec ECM seule (témoin, noir), 4T1 (orange) ou 410,4 (bleues) cellules tumorales. L’analyse statistique a été réalisée à l’aide du test du rang Logarithmique (Mantel-Cox) (4T1 vs 410,4 ; n = 10 ; ***P < 0,001). (D) Images histologiques représentatives des métastases cérébrales dérivées des cellules 4T1 et 410,4, illustrant les différences de schémas de croissance, y compris respectivement les HGP épithéliales infiltratifs de type cohorte et filament. Les coupes tissulaires ont été colorées avec un anticorps anti-cytokératine 8. (E) Analyse comparative de l’efficacité de la colonisation à l’aide de l’Indice de colonisation (IC). Les valeurs d’IC 4T1 (orange) et 410,4 (bleu) sont affichées. (F) Formule utilisée pour calculer l’IC. (G) Tableau résumant les paramètres inclus dans l’IC pour les deux modèles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Exemples représentatifs de résultats d’injection stéréotaxique réussis ou sous-optimaux. (A,C) Images macroscopiques montrant une croissance métastatique à différents endroits : (A) croissance tumorale du crâne et méninges résultant d’une injection incorrecte et d’une fuite de cellules tumorales, et (C) métastase parenchymatouse réussie après une injection intracorticale appropriée. (B,D) Les sections histologiques correspondantes confirmant (B) la croissance de la tumeur intraméningée avec infiltration ultérieure dans le parenchyme cérébral, et (D) la diffusion secondaire des méninges à partir d’une métastase parenchymatouse établie. Les coupes tissulaires ont été colorées avec un anticorps anti-cytokératine 8. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Discussion

La technique d’injection intracrânienne stéréotaxique permet la délivrance précise et localisée de cellules tumorales ou de mélanges cellulaires directement dans le cortex cérébral de souris expérimentales. Combiné à une analyse post-mortem structurée, ce modèle est particulièrement précieux pour étudier les stades avancés de la métastase cérébrale, incluant la prolifération métastatique, la dissémination intra-organique secondaire et la cause potentielle du décès. En revanche, les méthodes d’injection systémique (par exemple, la veine caudale ou l’injection intracardiaque) sont mieux adaptées à l’étude des premières étapes de la cascade métastatique, telles que la survie des cellules tumorales dans la circulation, l’extravasation et l’ensemencement dans des organes éloignés. Cependant, ces approches ne sont pas spécifiques au cerveau et entraînent généralement des taux faibles et incohérents de colonisation^cérébrale 18,19,20.

Les modèles systémiques présentent également une grande variabilité biologique, notamment en ce qui concerne les régions cérébrales affectées, ce qui rend les études thérapeutiques difficiles et nécessite de grandes cohortes animales. De plus, les animaux développent souvent des métastases extracrâniennes, ce qui peut entraîner l’arrêt précoce de l’essai¹⁹. Ces limitations réduisent considérablement leur utilité pour étudier les métastases cérébrales à un stade avancé. De plus, la dissemination secondaire et la re-colonisation sont particulièrement difficiles à étudier à l’aide de modèles systémiques, car il est presque impossible de distinguer la propagation primaire (provenant de la tumeur primaire) de la propagation secondaire (issue d’une métastase déjà établie). De plus, une analyse post-mortem structurée, notamment pour évaluer la croissance macro-métastatique et les HGP des métastases cérébrales, est limitée dans ces contextes.

Comparé aux systèmes ex vivo, tels que les organoïdes dérivés du patient (PDO) et les co-cultures organotypiques par tranche^cérébrale 21,22,23,24, l’injection stéréotaxique présente plusieurs avantages essentiels. Bien que les modèles ex vivo préservent certains aspects de l’architecture cérébrale native et puissent inclure des cellules immunitaires résidentes et infiltrées provenant de patients ou de donneurs, ils manquent de vascularisation, de signalisation systémique et de toute la complexité du microenvironnement tumoral in vivo, en particulier l’infiltration supplémentaire des lymphocytes T ou d’autres cellules immunitaires dérivées du sang ou de la moelle^{osseuse 23}. Ces limitations limitent leur application à des études à court terme et des contextes simplifiés, tels que le dépistage de drogues ou les tests basiques d’interaction cellulaire-cerveau métastatique. En revanche, l’approche stéréotaxique soutient des études à long terme sur la progression tumorale, la réponse immunitaire et l’intervention thérapeutique au sein d’un organisme vivant et intact. Il est important de noter que l’évaluation des symptômes neurologiques comme un critère humain permet une mesure cliniquement pertinente de l’apparition macro-métastatique. Cela rend le modèle encore plus reflétant le cours des maladies humaines, ce qui est particulièrement précieux dans la recherche translationnelle. Bien qu’il implique l’utilisation d’animaux, soulevant des considérations éthiques prises en compte par le respect des 3R (Remplacement, Réduction et Raffinement), ce modèle ne peut actuellement pas être entièrement remplacé par des alternatives ex vivo. Sa capacité à reproduire le contexte physiologique complet des métastases cérébrales en fait une indispensable pour faire progresser notre compréhension de la dynamique métastatique et de la physiopathologie spécifique au SNC.

Malgré ses nombreux avantages, le modèle d’injection stéréotaxique présente certaines limites à prendre en compte. Une préoccupation majeure est la fuite potentielle de la suspension des cellules tumorales lors de l’injection, ce qui peut entraîner des schémas de croissance trompeurs. En particulier, une adhésion involontaire des cellules tumorales aux méninges peut entraîner une métastase méningée⁸ iatrogène, ce qui ne reflète pas fidèlement le cours naturel de la diffusion métastatique dans cette lignée cellulaire particulière. Pour garantir la fiabilité des données, les schémas de croissance d’une lignée cellulaire tumorale donnée doivent être comparés de manière cohérente entre animaux, interventions chirurgicales et expérimentateurs. Pour minimiser la fuite des cellules tumorales, nous proposons d’utiliser la matrice extracellulaire (ECM), car sa consistance gélatineuse et sa capacité à se solidifier à température corporelle en font un outil utile. Cependant, la MCE présente également des défis, notamment la nécessité d’une manipulation rapide lors de l’injection pour éviter une solidification prématurée. Un autre aspect à considérer dans notre protocole est que les cellules tumorales sont injectées dans un mélange de MEC et de milieux contenant du sérum. Bien que la FBS favorise l’engressement des cellules tumorales en fournissant des nutriments généralement limités dans le cerveau, elle peut également favoriser l’inflammation. Si cela est un problème, des milieux sans sérum ou des solutions salées équilibrées (par exemple, HBSS ou PBS) peuvent être utilisés comme alternatives.

De plus, l’injection stéréotaxique est techniquement plus exigeante que d’autres méthodes, telles que l’injection intraveineuse (perfusion). Elle nécessite une formation spécifique pour assurer la reproductibilité, et la procédure est nettement plus longue, prenant généralement 15 à 30 minutes par animal contre 3 à 5 minutes pour les injections intraveineuses. Cette durée plus longue limite le nombre d’animaux pouvant être traités par séance, ce qui peut poser un défi pour les études thérapeutiques nécessitant de grandes cohortes pour atteindre la puissance statistique. Cependant, cette limitation peut être efficacement relevée en distribuant les injections sur plusieurs jours, ce qui augmente non seulement la flexibilité et la faisabilité expérimentales, mais introduit aussi une variabilité biologique précieuse, reflétant des différences plus réalistes entre individus tant dans le comportement des cellules tumorales que dans la réponse de l’hôte.

Enfin, il est important de noter que ce modèle contourne les étapes antérieures de la cascade métastatique, comme évoqué précédemment. Le modèle expérimental approprié doit être choisi en fonction de la question de recherche et de la phase spécifique de la métastase étudiée. Pour étudier la colonisation cérébrale à un stade avancé, l’injection intracorticale stéréotaxique reste la référence absolue.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pince à poinçons d’oreilles d’animaux	LabArt
Bepanthen® ; Pommade pour les yeux et le nez	Bayer Vital GmbH	1578675
Cire osseuse	B.Braun	210434
Cotonne-tiges	Hartmann	143213
Extrait de membrane basale de Cultrex (ECM)	B & ; D	3432-005-01
Désinfectant	B.Braun	; 107190
Mèche de forage	Bilaney Consultants GmbH	D #76
Ciseaux à œil	Hermle	501
Seringue Hamilton (10 & micro ; L volume)	VWR	5491135
Bouillotte & nbsp ;	Intergastro	258122
Essai Nase/Barre de dents de souris (900/1430)	Bilaney Consultants GmbH	DKI 926-B
Noyes ciseaux pour les yeux	Hermle	545
Paur 60 et degrés ; conseil non noptore Mouse Ear Bars	Bilaney Consultants GmbH	DKI 922
Scalpel	PFM Medical AG	17027
Pinces standard de Semkin	Hermle	710
Suture en polyamide Seralon (DR-009, USP 7/0, EP 0.5)	Serag-Wiessner GmbH  ;	V0053491
Drill stéréotaxique - Jacobs Chuck - 18000 tr/min	Bilaney Consultants GmbH	DKI 1471-200-CE-A
Stéréotaxie sans adaptateur Rat	Bilaney Consultants GmbH	DKI 963 % 920
Un HDD à seringue pour 5 & 10µ ; I Hamilton	Bilaney Consultants GmbH	DKI 1772-F1
Porte-aiguilles TC Mayo-Heear 160mm	Hermle	6425