Une isolation séquentielle optimisée des cryptes et des cellules stromales mésenchymates à partir de tissu intestinal porcine

Summary

Cette étude fournit un protocole par étapes pour l’isolement séquentiel des cryptes intestinales et des cellules stromales mésenchymateuses intestinales (iMSC) à partir de tissu jéjunal porcin. La méthode génère des monocouches entéritales 2D et des iMSC adaptés au développement de modèles de coculture épithéliale-stromale reproductibles et physiologiquement pertinents afin d’étudier la diaphonie cellulaire lors de l’homéostasie et de la régénération intestinales.

Abstract

L’épithélium intestinal interagit étroitement avec les cellules stromales mésenchymateuses intestinales sous-jacentes (iMSC) pour réguler le développement, l’homéostasie et la régénération. Cependant, les méthodes standardisées pour isoler séquentiellement à la fois les fractions épithéliales et stromales du tissu porcine sont limitées. Ce protocole décrit un processus optimisé par étapes pour isoler les cryptes et les iMSC du même segment jéjunal de porcelets. La méthode utilise un tampon de dissociation à base d’acide éthylénédiaminétique tétraacétique/dithiothréitol (EDTA/DTT) pour libérer les cryptes, suivi d’une digestion collagénase/dispase de la matrice extracellulaire pour isoler les iMSC. Cette approche minimise les variations spatiales dans les cellules isolées. Les cryptes isolées ont été cultivées avec succès et formaient des monocouches entéroïdes bidimensionnelles (2D) en expansion typiques sur des plaques recouvertes d’hydrogel de collagène. Les iMSC cultivés ont adhéré aux flasques de culture et exprimé des marqueurs stromales tels que le récepteur alpha du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFRα) et le cluster de différenciation 81 (CD81), déterminé par immunocoloration. Dans l’ensemble, ce protocole d’isolation optimisé permet de produire à la fois des cellules épithéliales et stromales issues du même segment porcelet jéjunal, fournissant une base reproductible pour de futures recherches impliquant organoïdes intestinaux et systèmes de co-culture iMSC afin d’élucider les mécanismes contrôlant les interactions épithélio-stromales chez les porcs, un modèle translationnellement pertinent pour la physiologie humaine et l’avancement des sciences animales.

Introduction

L’épithélium intestinal est un tissu dynamique qui subit un renouvellement et une différenciation continus afin de maintenir l’homéostasie intestinale et de faciliter la régénération après des lésions^{muqueuses 1,2}. Les cellules épithéliales intestinales proviennent des cellules souches intestinales (ISC) et interagissent avec divers facteurs microenvironnementaux 3,4,5,6,7,8. Les compartiments sous-épithéliaux, principalement la lamina propria et la muqueuse musculaire, sont constitués de populations cellulaires diverses issues de différentes^{lignées 9}. Parmi ces populations cellulaires, les cellules stromales mésenchymates intestinales (iMSC), y compris les fibroblastes et les myofibroblastes, produisent des facteurs trophiques et de croissance qui modulent la time, la prolifération et la différenciation des ISC afin de réguler l’homéostasie épithéliale et^la régénération 6,7,10,11.

Pour étudier ces interactions cellulaires, des études récentes ont développé de nouvelles approches permettant de déchiffrer les mécanismes d’action possibles qui entraînent la diaphonie des cellules épithéliales intestinales et des iMSC. Les systèmes de co-culture combinant organoïdes avec des cellules stromales ou immunitaires ont fait progresser notre compréhension des interactions cellulaires épithéliales-sous-épithéliales lors du développement, de la régénération, du dépistage des médicaments et de la modélisation^{des maladies} 12,13,14,15,16,17. Cependant, la plupart des études sur la coculture d’organoïdes ont utilisé des tissus murins, qui échouent souvent à imiter efficacement la physiologie humaine et les phénotypes de maladies, limitant leur pertinence translationnelle^{clinique 18}.

Dans la plupart des protocoles d’isolement intestinal murin, les cellules épithéliales et stromales sont obtenues à partir de segments de tissu séparés, ce qui peut fournir des échantillons reflétant des caractéristiques légèrement différentes, pouvant affecter la reproductibilité à travers les expériences^19,20. Actuellement, il n’existe pas de protocoles standardisés et optimisés pour isoler les cryptes intestinales porcines et les iMSC à partir du même échantillon de tissu. De plus, les limites pratiques pour obtenir des échantillons intestinaux humains appropriés ont conduit de nombreux chercheurs à s’appuyer sur des types cellulaires désappariés provenant de différents organes (comme les entéroïdes humains avec fibroblastes cutanés) pour évaluer la diaphonie cellulaire épithéliale-mésenchymateuse, ce qui peut confondre l’interprétation des données 21,22,23.

Bien qu’un protocole récemment publié pour la biopsie intestinale humaine ait isolé des cryptes et obtenu des fibroblastes par excroissance à partir du tissu appauvri en épithélium résiduel, des approches standardisées comparables font défaut chez^{les porcs 24}. Les porcs sont utilisés comme modèle animal adapté à la recherche translationnelle en raison de leur ressemblance anatomique et physiologique avec les humains 2,18,25,26,27,28,29. Par conséquent, cette méthode présente un protocole d’isolement séquentiel qui permet de récupérer les cryptes intestinales et les iMSC du même segment jéjunal porcin en fonction de la structure physiologique, anatomique et morphologique de^{l’intestin 4,30}. La procédure fournit un cadre reproductible pour isoler à la fois les cryptes et les iMSC, adapté à de futures études de co-culture intestinale porcine.

Protocol

Un segment de 5 cm a été disséqué à partir du jéjunum proximal excisé de porcelets âgés de 21 jours hébergés dans l’établissement porcin de l’Université du Maryland, College Park. La procédure (R-JUN-22-30) utilisée pour sacrifier le porcelet suivait les directives relatives aux politiques de soins et d’utilisation des animaux approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’université. Avant de procéder aux étapes d’isolement, le plan du protocole est présenté à la Figure 1, et la liste des réactifs et équipements utilisés pour l’isolement séquentiel des cryptes intestinales porcines et des iMSC est fournie dans le Tableau des matériaux.

1. Étape de préparation avant l’isolement

1. Préparez 30 mL de tampon de lavage par segment de tissu de 5 cm dans des tubes coniques de 50 mL.
2. Ajustez le volume en fonction du nombre d’échantillons de tissu prélevés.
   REMARQUE : Consultez le Tableau 1 pour la composition du tampon de lavage. Toutes les étapes de préparation des tissus et d’isolement cellulaire se font sur un établi.

2. Stade de préparation des tissus intestinaux

1. Placez le tissu intestinal excisé dans les 30 mL de tampon de lavage dans des tubes coniques de 50 mL.
   REMARQUE : Les tissus excisés peuvent être placés dans un tampon à laver froid pendant une heure avant utilisation.
2. Rinçez le tissu à 3× avec un tampon de lavage refroidi à l’aide d’une seringue de 21 G pour éliminer les contenus luminaux.
3. Placez le tissu sur une surface stérilisée en mousse de polystyrène et retirez soigneusement le tissu mésentérique et adipeux du sérose.
4. Disséquez le tissu longitudinalement à l’aide d’une lame chirurgicale pour ouvrir la lumière (Figure 2A).
5. Transférez le tissu partiellement nettoyé et disséqué dans un tampon de lavage frais et lavez deux fois, ou jusqu’à ce que le tampon devienne clair.
6. Placez le tissu dans le tampon de lavage dans une boîte de Petri de 100 mm et coupez-le en morceaux de 10 à 15 mm à l’aide d’une nouvelle lame chirurgicale (Figure 2B,C). Cette étape augmente la surface exposée au tampon de digestion.
7. Transférez le tissu haché dans un nouveau tube conique de 50 mL.
8. Lavez doucement avec un tampon de lavage et laissez le mouchoir haché se déposer par gravité pendant environ 30 secondes (Figure 2D).
9. Aspirez doucement le surnageant, ne laissant que suffisamment de tampon pour recouvrir les morceaux de tissu dans le tube conique.
10. Stade de dissociation épithéliale
    1. Ajoutez 30 mL de tampon de dissociation épithéliale préchauffée (Tableau 2) et faites couver pendant 20 à 30 minutes à 37 °C dans un bain de billes statiques ou un bain-marie secouant à environ 9 × g.
    2. Secouez doucement le tube toutes les 15 minutes pour augmenter la libération des cryptes de la membrane épithéliale.
    3. Laissez le tissu se déposer et aspirez doucement le surnageant avec une pipette sérologique, ne laissant que suffisamment de tampon pour recouvrir le tissu déposé dans le tube conique.
    4. Ajoutez 30 mL de tampon frais au tissu déposé et secouez vigoureusement pour libérer les villosités, les cryptes et les débris (Figure 3A). Laissez les restes tissulaires se déposer, puis décantez doucement le surnageant du tampon de lavage, qui contient les segments de crypte suspendus, à travers une tamoire cellulaire de 100 μm dans un nouveau tube conique de 50 mL.
       1. Répétez le processus d’ajout d’un tampon de lavage frais au tissu résiduel et de décantation trois fois (3×). Pipeter 10 μL de tampon de lavage contenant les cryptes dans une boîte de Petri de 100 mm et examiner la densité de la crypte au microscope stéréoscopique.
          REMARQUE : Gardez chaque tampon de lavage contenant des cryptes après chaque lavage.
    5. Après le troisième lavage, le tampon de lavage contenant les cryptes devrait être dégagé avec un minimum de débris (Figure 3B).
       REMARQUE : Conservez les résidus tissulaires avec la matrice extracellulaire (ECM) dans le tube conique pour un traitement d’isolation iMSC ultérieur.
    6. Centrifugez la suspension de la crypte à 150 × g pendant 2 minutes à température ambiante pour pelleter les fragments de la crypte.
    7. Aspirez et resuspendez la pastille cryptique dans un milieu de culture épithéliale.
    8. Centrifugez à nouveau les cryptes en suspension à 150 × g pendant 2 minutes pour collecter la pastille de fragments de la crypte.
    9. Ajoutez un milieu de culture épithéliale pour resuspendre les cryptes et pipetez 5× à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 μL.
    10. Semez environ 100 cryptes en suspension sur des plaques pré-préparées de collagène de type 1 recouvertes d’hydrogel à 6 puits pour cultiver et étendre les cryptes en monocouches enteroïdes bidimensionnelles (2D).
        REMARQUE : Vérifiez la préparation en plaques enrobées d’hydrogel de collagène dans le tableau 3. La concentration finale de collagène de type 1 devrait être de 1,0 mg/mL. Évitez de plaquer des cryptes trop denses ou des fragments de débris pour éviter la contamination par levures ou fongiques. Un antibiotique-antimycotique (anti-anti-anti) dans le tampon de lavage et le milieu de culture devrait offrir une protection.
    11. Examinez les cellules sous un microscope à contraste de phase inversé avant d’incuber à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO_.
    12. Remplacez le milieu de culture dans les 12 heures suivant le semis pour éliminer les débris flottants et réduire la contamination bactérienne.
    13. Cultivez les entéroïdes à l’aide d’un milieu de culture épithéliale (Tableau 4) et remplacez le milieu tous les deux jours jusqu’au jour 8 environ, lorsque les monocouches 2D étendues atteignent ≥85 % de confluence pour la sous-culture.
11. Stade de dissociation de la matrice extracellulaire
    REMARQUE : Poursuivez le processus d’isolement avec les fragments de tissu restants contenant la matrice extracellulaire dans le tube conique (Figure 3C et Figure 4A).
    REMARQUE : Bien que l’EDTA dans le tampon de dissociation épithéliale puisse inhiber l’activité collagénase, les trois étapes précédentes éliminent tout l’EDTA et la DTT. Ainsi, l’activité de la collagénane ne devrait pas être affectée lors du processus ultérieur.
    1. Réduisez à nouveau le tissu restant en petits morceaux avant d’isoler les iMSC dans la lame proprie.
    2. Ajoutez 25 mL de tampon de digestion extracellulaire (Tableau 5) au tissu et incubez dans un bain de billes statiques pendant 15 à 20 minutes à 37 °C (Figure 4B).
    3. Secouez vigoureusement après l’incubation.
       REMARQUE : Le surnageant deviendra trouble avec moins de fragments de tissu flottants. Pipettez 10 μL du surnageant sous un microscope inversé pour examiner la densité des iMSC dans le surnageant. Continuez à incuber le tissu dans le bain de billes pendant 15 minutes supplémentaires si la densité observée de l’iMSC est faible.
    4. Décantez doucement le surnageant (immédiatement après un secouement vigoureux à l’étape 2.2.3) à travers un filtre cellulaire de 100 μm dans un nouveau tube conique pour minimiser les débris.
    5. Centrifugez la suspension à cellules à 280 × g pendant 5 minutes à température ambiante pour pelleter les iMSC.
    6. Aspirer le surnageant et resuspendre les iMSC dans un milieu de culture mésenchymateux (voir les supports de culture iMSC dans le tableau 6).
    7. Centrifugez à nouveau les iMSC en suspension à 280 × g pendant 5 minutes pour laver le tampon de dissociation.
    8. Aspirez et resuspendez les iMSC dans un milieu de culture mésenchymateuse.
    9. Placez les iMSC dans une fiole de culture T75 à environ 5 × 10⁵ cellules par flasque.
       REMARQUE : Assurez-vous que les cellules plaquées couvrent environ 60 % de la surface de la fiole, car les cellules mésenchymates nécessitent une densité de semis modérée à élevée pour une croissance optimale.
    10. Remplacez le milieu de culture dans les 12 heures suivant le plaquage pour éliminer l’excès de débris et éviter toute contamination bactérienne.
    11. Examinez les cellules de type fibroblaste sous un microscope à contraste de phase inversé au deuxième jour après l’ensemencement.
        REMARQUE : Changez le milieu de culture mésenchymatose tous les deux jours. Les iMSC devraient atteindre environ 85 % de confluence et être prêts pour la subculture dès le 4e jour.

3. Dosage immunocytochimique

1. Cultivez environ 5 000 iMSC par puits dans une plaque de 96 puits avec un milieu de culture mésenchymatose pendant 2 à 3 jours jusqu’à ce que les cellules atteignent environ 80 % de confluence.
2. Aspirez doucement le milieu et rincez les iMSC cultivés deux fois avec 100 μL de 1× PBS/puits à température^{ambiante 31}. Toutes les références aux kits d’immunocoloration sont fournies dans le Tableau des matériaux.
3. Ajoutez 100 μL de paraformoldéhyde (PFA) à 4 % par puits pour fixer les iMSC cultivés et incubez sur un établi statique à température ambiante pendant 30 minutes.
4. Lavez deux fois les iMSC fixes en culture avec 100 μL de 0,1 % Tween-20/PBS (PBST) pendant 5 minutes chacun, puis perméabilisez avec 100 μL de 0,5 % de Triton X-100/PBS pendant 30 minutes.
5. Ajoutez 100 μL d’albumine sérique bovine (BSA)/PBST à 5 % par puits pour bloquer la liaison non spécifique sur les cellules fixées.
   REMARQUE : Laissez à température ambiante pendant 1 h avant de laver deux fois avec 100 μL de PBST pendant 5 minutes chacun.
6. Ajoutez 100 μL d’anticorps primaires dilués (1:250 ; c’est-à-dire 1 μL d’anticorps primaire dans 250 μL de diluent anticorps) à chaque puits et incubez les cellules toute la nuit à 4 °C. Les principaux anticorps utilisés sont PDGFRα et CD81.
   REMARQUE : Inclure les puits témoins négatifs en n’ajoutant que diluant anticorps sans anticorps primaires.
7. Le deuxième jour, rincez les anticorps primaires deux fois avec 100 μL de PBST pendant 5 minutes chacun.
8. Diluez les anticorps secondaires dans 1× PBS en utilisant les rapports suivants : Alexa Fluor Plus 555 (1 μL :100 μL), Alexa Fluor Plus 647 (1 μL :100 μL) et DAPI (1 μL :800 μL).
9. Contre-colorer les cellules avec les anticorps secondaires dilués à température ambiante pendant 1 heure.
10. Lavez les cellules deux fois avec 1× PBS pendant 5 minutes chacun.
11. Ajoutez 100 μL de substrat de montage par puits, couvrez la plaque, enveloppez-la dans du papier aluminium, et conservez à 4 °C jusqu’à 6 mois jusqu’à l’imagerie fluorescente.

4. Isolement de l’ARN et test qPCR

1. Extraire l’ARNm total des iMSC cultivés dans des fioles T75 en utilisant la technique de séparation acide guanidinium-thiocyanate-phénol-chloroforme.
   REMARQUE : Déterminez la concentration et la pureté de l’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre.
2. Transcrire en revers l’ARNm total en ADNc pour l’utiliser comme modèle pour le test quantitatif de réaction en chaîne par transcription inverse par polymérase (qRT-PCR) afin de vérifier les graphiques d’amplification pour l’amorce du gène Sus scrofa sélectionné, GAPDH (forward : ATCCTGGGCTACACTGAGGAC ; reverse : AAGTGTCGTTGAGGGCAATG), comme rapporté dans des études^{précédentes 2,28}.

Results

Lors de la dissociation épithéliale, l’acide éthylénédiaminététraacétique (EDTA) chélate les ions calcium pour perturber les adhérences cellulaires dépendantes du calcium, tandis que le dithiothréitol (DTT) fend les liaisons disulfure dans les glycoprotéines muciniques pour faciliter la mucolyse. Ainsi, l’utilisation combinée d’un composé chélant (EDTA) et d’un agent réducteur (DTT) permet une libération efficace des cryptes de la membrane épithéliale sans perturber la structure de la matrice extracellulaire (ECM

Discussion

Isoler les cryptes intestinales et les iMSC du même segment jéjunal porcin offre une approche novatrice pour préserver les caractéristiques cellulaires et fonctionnelles spécifiques au segment tissulaire. C’est crucial car les tissus intestinaux présentent des identités régionales et spatiales, comme l’ont démontré des études porcines^{antérieures 2,36,37,38}. Des...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,5M EDTA	Promega	PR-V4231
Tampon HEPES 1 M	ThermoFisher	15630080	Pour la préparation de la plaque d’hydrogel de collagène
Pointes de pipet à 1000 uL	Alkali Scientific FT1000	104027-530
10x PBS	Invitrogen	AM9624	Pour la préparation de la plaque d’hydrogel de collagène
1N hydroxyde de sodium	Thermo	SS266-1	Pour la préparation de la plaque d’hydrogel de collagène
1x HBSS	ThermoFisher	14025092
1X PBS	Hyclone	SH30256FS
4 % de paraformaldéhyde (PFA)	ThermoFisher	AAJ61899AK
Tubes coniques de 50 mL	ThermoFisher	12-565-271
Plaques à 6 puits	Fisherbrand	FB012927
Solution de bicarbonate de sodium à 7,5 %	Corning	MT25035CI	Pour la préparation de la plaque d’hydrogel de collagène
DMEM avancé/F12  ;	Gibco & nbsp ;	12634-010
Alexa Fluor plus 647	Invitrogen	A32728	Anticorps secondaire
Alexa plus 555 - A32732  ;	Invitrogen	A32732	Anticorps secondaire
Feuille d’aluminium	Reynolds	https://www.amazon.com/dp/B00M8ZEAW4?ref=fed_asin_title&th=1
ANTI-ANTI	Gibco	15240096
B27	ThermoFisher	12587010
BSA	Fisherbrand	BP1600-100
CD81  ;	Protéinintech	66866-1-ig	Anticorps primaire
Eau de qualité culture cellulaire	Hyclone	SH30529FS	Pour la préparation de la plaque d’hydrogel de collagène
Collagène, type 1	Corning	356236	Pour la préparation de la plaque d’hydrogel de collagène
Colagnase IV	Gibco	17104019
Boîte de Petri de 100 mm de Corning	Corning	07-202-011
Milieu de cryoconservation à cellules cryostores	Technologies des cellules souches	7930
Cryovial pour les cellules & nbsp ;	Fisherbrand	1050026
Diluant anticorps Dako	Dako/Agilent	Numéro de pièce : S302283-2	Diluant primaire à anticorps
Supports de montage fluorescents Dako	Dako/Agilent	Numéro de pièce : S302380-2
DAPI	Promocell/VWR	10180-470	Coloration de l’ADN
Dispase II	Roche	4942078001
DMEM, glycémie élevée	Corning	MT10013CV
TDT	Sigma	646563
EGF	Peprotech	315-09
FBS (HI)	Avantor	1300-500H
Gastrin	Anaspec	AS-64149
Gentamicin	MP Biomédicals	ICN1676045
GlutaMax	ThermoFisher	35050061
HEPES	ThermoFisher	15630-080
Microscrrope fluorescente inversée	Nikon	ECLIPSE Ti2	Imagerie fluorescente
Microscope à contraste de phase inversé	Nikon	Eclipse TS100	Pour l’imagerie cellulaire en culture   ;
Kit de synthèse avancée d’ADNc iScript	Bio-Rad	1725038	Kit RT-PCR
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725122	Kit qPCR
Médias conditionnels LWRN	ATCC	CRL-3276	Les médias LWRN ont été préparés en interne selon la procédure ATCC
N-acétylcystéine	Biographie MP	194603
Spectrophotomètre Nanodrop 2000	ThermoFisher	ND 2000
Nicotinamide	Sigma	N0636-100G
Plaques optiques à 384 puits avec code-barres	Biosystèmes appliqués	4483285	Kit qPCR
PDGFR&alpha ;	Abcam	ab230457	Anticorps primaire
Prostaglandine E2 (PGE2)	Caïman Chemical  ;	14010
QuantStudio 5	Biosystème appliqué	A28570	Instrument qPCR
SB202190	LC Laboratories	S-1700
Microscope stéréoscopique	Nikon  ;	SMZ745
Flasque T 75	Fisherbrand	FB012937
Triton X100	Fisherbrand	PI85111
Réactif Trizol   ;	Invitrogen	15596026
Préadolescent 20 ans, détergent 100 % nonionique	Bio-rad	1706531
Y27632	ApexBio	A3008-200