EasyFiji : une interface graphique pour un traitement d’images à fluorescence convivial aux Fidji

Summary

EasyFiji est un plugin d’interface graphique pour les Fidji (ImageJ) qui propose une suite sélectionnée d’outils de visualisation et de traitement d’images fluorescentes, fréquemment utilisés par les spécialistes de la vie.

Abstract

Fiji (Fiji Is Just ImageJ) est un logiciel de traitement d’images open source étendu et extensible, largement utilisé par la communauté d’analyse de bioimages. Cependant, pour les scientifiques de la vie non computationnels, interagir manuellement avec les nombreuses capacités des Fidji nécessite d’apprendre et de naviguer dans un système de menus profondément complexe. De plus, certains comportements par défaut de certaines commandes ne sont pas idéaux pour l’affichage et le traitement d’images fluorescents. Pour augmenter l’efficacité des scientifiques de la vie travaillant avec des images de microscopie à fluorescence, nous avons développé EasyFiji, un plugin d’interface graphique (GUI) sélectionné pour les Fidji. Chaque commande EasyFiji est exécutée via des boutons et curseurs améliorés par infobulle et affiche toujours une exécution spécifique au canal, comme nécessaire pour les images de fluorescence. Les commandes qui modifient l’intensité des pixels sont également impossibles à faire en un seul clic pour permettre un traitement plus interactif et peuvent être automatiquement enregistrées et enregistrées en texte pour la tenue des registres. Un panneau d’information d’image affiche des paramètres essentiels à l’interprétation de l’image. De nouvelles fonctions de rendu d’image et de correction de la javel sont également fournies. Le plugin est disponible gratuitement sur GitHub et en tant que site de mise à jour fidjien. Ce protocole décrit les étapes pour utiliser l’interface d’EasyFiji afin de visualiser et de traiter les images de microscopie à fluorescence.

Introduction

Fiji (Fiji Is Just ImageJ) est un logiciel de traitement d’images open source étendu et extensible, largement utilisé par la communauté de l’analyse de bioimages ^1,2. La vaste base de code d’algorithmes polyvalents des Fidji, ainsi que son langage macro et son interface de plugins, peuvent être facilement exploités par les analystes computationnels pour fournir une solution à presque tous les problèmes de traitement ou d’analyse d’images. Cependant, pour les utilisateurs des sciences de la vie ayant peu d’expérience en informatique, les >1 100 commandes de FIJI, réparties dans un menu déroulant profondément complexe, peuvent être d’une complexité intimidante à naviguer et à utiliser efficacement. Plusieurs approches ont été prises pour simplifier l’utilisation manuelle des Fidji. La barre de recherche fidjienne est une alternative à la navigation dans les menus, offrant un accès à une excellente documentation d’aide, mais seulement si l’utilisateur connaît le nom de l’algorithme dont il a besoin. Les boutons de la barre d’outils de Fidji peuvent être personnalisés pour offrir un accès rapide aux commandes définies par l’utilisateur, mais cette procédure nécessite d’écrire un code macro et de prévoir quelles commandes seront les plus utiles. Le plugin ActionBar propose une interface graphique (GUI) autonome avec des ensembles de boutons personnalisables et organisables, mais encore une fois, le code et l’expérience sont nécessaires pour remplir efficacement les^{boutons 3}. Aucune de ces solutions ne répond aux besoins des scientifiques de la vie ayant peu d’expérience en traitement d’image.

Au-delà des problèmes d’interface utilisateur, de nombreux scientifiques de la vie travaillant avec des images de microscopie à fluorescence nécessitent des procédures d’affichage et de traitement spécifiques à chaque canal. Cependant, certaines commandes fidjiennes couramment utilisées ne sont pas conscientes du canal par défaut. Par exemple, les utilisateurs peuvent vouloir rendre les canaux pseudo-colorés ensemble de manière tout aussi saillante, ou pour mettre en évidence spécifiquement des régions d’intensité similaire entre les canaux, ou encore pour préserver le contraste en niveaux de gris d’un signal morphologique tout en affichant la fluorescence. Dans chacun de ces cas d’utilisation, la technique de rendu composite RVB des Fidji masque l’information souhaitée au niveau perceptif. Lors du traitement d’images multi-canaux, les filtres d’images Fiji natifs (c’est-à-dire Process | Filtres), soit ne traitent que le plan binaire 2D actif, soit tous les plans binaires de la fenêtre image (c’est-à-dire la « pile » telle que définie par la classe ImageStack). Le premier comportement ne traite pas à travers la dimension z ou t pour un canal donné, tandis que le second comportement est presque toujours impropre, car chaque canal contient un motif de coloration unique et un rapport signal/bruit uniques, nécessitant l’utilisation de paramètres de traitement spécifiques à chaque canal. Les commandes de correction de la javel des Fidji natives (Image | Ajuster | Correction de Javel) agissent incorrectement lorsqu’elles sont appliquées aux images de fluorescence multi-canaux, car là encore, elles corrigent sur l’ensemble de l’ImageStack, où les données du canal sont entrelacées, plutôt que de corriger à travers la dimension z ou t de chaque canal individuellement.

Pour répondre à ces problèmes pour les scientifiques de la vie travaillant avec des images de microscopie à fluorescence, nous avons développé EasyFiji, un plugin d’interface graphique sélectionné et guidé pour les Fidji. EasyFiji est un ensemble sélectionné de commandes thématiquement organisées qui permettent un rendu et un traitement sensibles au canal. Quatre panneaux tabulats, Affichage, Processus, Sauvegarde et Informations d’image, contiennent chacun des collections thématiques de boutons et de curseurs améliorés par infobulles pour l’exécution des commandes. Parmi les autres commodités, on trouve une fonctionnalité d’annulation pour le traitement interactif, un enregistreur d’actions simple en texte brut qui peut automatiquement sauvegarder les actions de modification de pixels ainsi qu’une image, ainsi qu’un affichage formaté des paramètres d’acquisition importants pour l’interprétation de l’image. EasyFiji propose également de nouveaux outils de rendu d’image et de correction de la javel. EasyFiji ne prend pas en charge l’analyse quantitative d’images ni les fonctions de traitement par lots, car ces procédures ne doivent être réalisées qu’avec l’aide d’un analyste expert en bioimage. Bien qu’EasyFiji soit concis par conception, toutes les commandes natives fidjiennes sont toujours disponibles via le système de menus natif fidjien. Nous pensons que la conception ciblant le public⁴ d’EasyFiji augmentera l’utilisation de Fiji parmi les scientifiques de la vie. Nous présentons ici la conception, la mise en œuvre et l’application d’EasyFiji aux images de microscopie à fluorescence. Le plugin est facile à installer via un site de mise à jour fidjienne (https://imagej.github.io/list-of-update-sites/ et https://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin), tandis que le code open source peut être téléchargé via GitHub ; Le plugin et le code source sont librement disponibles (https://github.com/stjude/EasyFiji).

Protocol

Ce protocole décrit comment installer et utiliser EasyFiji.

1. Installer EasyFiji...

1. Téléchargez la dernière version de Fiji (>1.54g) adaptée au système d’exploitation et installez-la dans un dossier auquel l’utilisateur a accès en lecture/écriture (voir le tableau des matériaux pour un lien vers le site de téléchargement de Fiji).
2. Lancez Fiji et naviguez vers Aide | Mise à jour... dans la barre de menu.
3. Dans la fenêtre Updater , cliquez sur Gérer les sites de mise à jour. Sélectionnez EasyFiji dans la liste, puis cliquez sur Appliquer et Fermer. EasyFiji sera installé automatiquement, et Fiji sera automatiquement mise à jour avec les futures versions d’EasyFiji.
4. Redémarrez les Fidji. Sélectionnez EasyFiji dans le menu Fiji Plugins.
   REMARQUE : EasyFiji est entièrement compatible avec de nombreuses anciennes versions de Fiji et est principalement compatible avec ImageJ. Des informations détaillées sur la compatibilité et les dépendances sont disponibles sur la page wiki GitHub d’EasyFiji (https://github.com/stjude/EasyFiji) et la page wiki d’EasyFiji ImageJ.net (https://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin#quick-start). Les retours peuvent être fournis via la page GitHub ou le fil EasyFiji sur le forum Image.sc (https://forum.image.sc/t/announcing-easyfiji-a-user-friendly-gui-plugin-for-fiji/117617) (voir le tableau des supports pour les liens vers ces ressources).

2. Utilisation du panneau d’affichage EasyFiji

REMARQUE : Comme montré à la Figure 1A, le panneau d’affichage prend en charge la pseudo-coloration par canal de fluorescence à l’aide de boutons d’échantillonnage de couleur, des contrôles intuitifs d’ajustement du contraste et de nouvelles options pour des rendus d’images multi-canaux calibrés perceptuellement. Des commandes natives fidjiennes pour la projection d’images 3D/4D et le re-découpage sont également incluses. Le tableau 1 documente la correspondance entre les commandes EasyFiji et les commandes natives fidjiennes.

1. Définissez la couleur ou la visibilité d’un canal (Panneau d’affichage , section Couleur du canal ).
   1. Sélectionnez le canal désiré à l’aide du curseur de canal de la fenêtre d’image.
   2. Appuyez sur un bouton d’échantillon de couleur pour assigner une nouvelle table de recherche de couleurs (LUT).
   3. Appuyez sur le bouton d’échantillon noir pour désactiver l’affichage d’une chaîne.
   4. Appuyez sur le bouton AllChs pour afficher tous les canaux en même temps.
   5. Appuyez sur le bouton EachCh pour afficher chaque canal de façon séquentielle, en faisant défiler le curseur du canal dans la fenêtre de l’image.
2. Régler le contraste du canal à l’intérieur ou entre les images (panneau d’affichage , section Contraste du canal ).
   1. Pour modifier la plage d’affichage d’un canal (contraste), sélectionnez le canal à l’aide du curseur de canal en bas de la fenêtre d’image de l’image.
   2. Déplacez le curseur de gain d’affichage pour spécifier l’intensité des pixels d’image (valeur montrée à droite) à afficher comme la valeur la plus lumineuse à l’écran.
      REMARQUE : Nous utilisons le terme gain d’affichage pour décrire cette action car elle rend le canal linéairement plus lumineux, analogue à l’effet de modification du gain sur un détecteur lors de l’acquisition d’image.
   3. Appuyez sur le bouton de réinitialisation du gain d’affichage pour afficher l’intensité maximale possible des pixels du canal (déterminée par sa profondeur binaire) comme la valeur la plus lumineuse à l’écran.
   4. Déplacez le curseur de décalage d’affichage pour spécifier l’intensité des pixels d’image (valeur affichée à droite) comme la valeur la plus sombre à l’écran.
      REMARQUE : Nous avons utilisé le terme décalage d’affichage pour décrire cette action car il fixe le niveau de noir de l’image, analogue à l’effet de régler le décalage sur un détecteur lors de l’acquisition de l’image.
   5. Appuyez sur le bouton de réinitialisation du décalage d’affichage pour régler l’intensité du pixel d’image de zéro à la valeur la plus sombre sur l’écran.
   6. Appuyez sur le bouton AutoCh pour ajuster automatiquement le gain et le décalage d’affichage.
   7. Appuyez sur le bouton AutoAll pour ajuster automatiquement le gain et l’offset d’affichage pour tous les canaux.
   8. Appuyez sur le bouton Propagation pour transférer les réglages de gain et de décalage d’affichage de l’image active vers toutes les autres images ouvertes contenant le même nombre de canaux.
3. Créez un affichage multicanal (Panneau d’affichage , section Vues de canal ).
   1. Pour rendre deux canaux de fluorescence ensemble en image couleur, utilisez les boutons préfixés FF (fluorescence avec fluorescence). Pour rendre ensemble un ou plusieurs canaux de fluorescence et un canal morphologique en niveaux de gris en image couleur, utilisez le bouton FG préfixé (fluorescence avec niveaux de gris). Les rendus sont créés dans une nouvelle fenêtre d’image.
      REMARQUE : Avant de créer une Vue de Canal, ajustez d’abord le gain et le décalage d’affichage pour chaque canal de sorte que le signal d’intérêt couvre la plage dynamique de l’affichage (section 2.2), puis appliquez ces gains et décalages à l’aide des boutons Appliquer le gain et le décalage dans l’onglet Traitement (section 3.2.3). Les rendus ne seront pas optimaux si les gains et décalages ne sont pas ajustés et appliqués.
   2. Appuyez sur le bouton FFColoc pour produire un rendu couleur à partir de deux canaux de fluorescence qui met en surbrillance sous forme de pixels jaunes où l’intensité est similaire dans les deux canaux (avec un minimum de 25 %).
      REMARQUE : Les pixels avec des intensités différentes entre les canaux sont rendus en niveaux de gris. Les pixels jaunes suggèrent une colocalisation⁵ basée sur la corrélation lorsque le signal d’intérêt sur chaque canal couvre la plage dynamique de l’affichage.
      ATTENTION : Le rendu FFColoc est destiné uniquement à l’exploration ou à l’illustration des données. Ce n’est pas un substitut à une quantification rigoureuse de la localisation avec l’aide d’un expert.
   3. Appuyez sur le bouton FFMerge pour produire un rendu des couleurs à partir de deux canaux de fluorescence, où le signal dans chaque canal est également perceptible.
      REMARQUE : À chaque pixel, la luminance est réglée selon le signal à intensité plus élevée, tandis que la teinte dépend du rapport des intensités entre les canaux (suivant les concepts décrits par Taylor et ^al.6). Voir aussi la section Discussion.
   4. Appuyez sur le bouton FGMerge pour produire un rendu des couleurs à partir des canaux de fluorescence et d’un canal en niveaux de gris, où la coloration des canaux de fluorescence est conservée, tandis que le contraste du canal en niveaux de gris est conservé.
      REMARQUE : Le canal en niveaux de gris est généralement une modalité non fluorescente contenant des informations morphologiques, telles que la CID, le contraste de phase ou la microscopie électronique.
   5. Appuyez sur le bouton Montage pour diviser les canaux en images individuelles, les placer automatiquement en tuiles à l’écran et synchroniser leur visualisation.
   6. Appuyez sur le bouton SyncWins pour synchroniser la visualisation de plusieurs images du même type.
4. Créez des vues 2D d’une pile z ou t 3D (panneau d’affichage , section Vues de la pile ).
   REMARQUE : Chaque rendu est affiché dans une nouvelle fenêtre d’image.
   1. Appuyez sur le bouton MIP pour créer une projection d’intensité maximale.
      REMARQUE : L’intensité à chaque emplacement de l’image 2D résultante correspond à l’intensité du pixel le plus intense sur la^3e dimension de l’image 3D. Cette procédure peut accentuer le bruit, il peut donc être utile de lisser la pile (voir onglet Traitement ) avant de créer un MIP.
   2. Appuyez sur le bouton SIP pour créer une projection d’intensité somme.
      REMARQUE : L’intensité à chaque emplacement de l’image 2D résultante correspond à la somme des intensités le long de la^3e dimension de l’image 3D. Cette procédure préserve l’intensité totale, ce qui donne une image moins bruyante que n’importe quelle tranche individuelle.
   3. Appuyez sur le bouton Ortho pour créer un visualiseur de tranches orthogonales, qui affiche de manière interactive les trois plans orthogonaux d’une pile 3D (par exemple, xy, xz, yz) qui se croisent à l’emplacement actuel du curseur.
   4. Appuyez sur le bouton Kymo pour créer un kymographe.
      REMARQUE : Un kymographe est une image 2D où l’axe vertical (y-) correspond à la troisième dimension d’une pile (généralement t-), et l’axe horizontal (x-) correspond à la position le long d’une ligne tracée par l’utilisateur sur la pile d’entrée. Lorsque la^3e dimension est le temps, un kymographe est utilisé pour illustrer ou quantifier le mouvement.
      Ce bouton repose sur le plugin^{KymographBuilder 7} fourni avec Fiji mais doit être téléchargé séparément si vous utilisez ImageJ.
5. Définir les options diverses (Panneau d’affichage ).
   1. Appuyez sur le bouton Dup pour dupliquer la fenêtre d’image active à Fidji. Une nouvelle fenêtre d’image apparaîtra.
      REMARQUE : Dessinez une région rectangulaire d’intérêt (ROI) sur l’image à l’aide de l’outil Rectangle ROI de Fiji, et le bouton Dup recadrera à la frontière du ROI. Spécifier les plages de canaux, z- et/ou t- pour remodeler la dimensionnalité de l’image dupliquée.
   2. Appuyez sur le bouton ToClip pour copier l’image active telle qu’affichée à l’écran vers le presse-papiers système. Pour coller l’image dans une autre application (pour préparer des diapositives ou éditer des photos), activez l’autre application et sélectionnez coller (Ctrl+V sous Windows ou Cmd+V sur Mac).
   3. Appuyez sur le bouton |--um--| pour afficher une barre d’échelle sur l’image en superposition. Basculez le bouton |--euh--| pour retirer la barre de balance.

3. Utilisation du panneau EasyFiji Process

REMARQUE : Comme montré à la Figure 1B, la section Caractéristiques du canal du panneau Processus fournit des commandes de traitement d’image basées sur des curseurs avec des bulles qui peuvent être utilisées pour améliorer l’affichage de l’image. Le bouton Annuler la dernière permet un traitement interactif. Les dimensions de l’image peuvent être modifiées en utilisant les boutons Modifier les dimensions. La Table d’actions sert à enregistrer en texte brut les commandes de traitement qui modifient les valeurs d’intensité des pixels de l’image. Le journal peut alors être automatiquement sauvegardé avec l’image sous le même titre (voir panneau Sauvegarder).

1. Modifier les caractéristiques spatiales d’une image (panneau de procédure , section Modifier les caractéristiques du canal ).
   REMARQUE : Toutes les commandes s’appliquent uniquement au canal actif, et les résultats sont automatiquement affichés dans la fenêtre d’image originale. Une nouvelle fenêtre d’image n’est pas créée.
   1. Déplacez le curseur Smooth pour appliquer un flou gaussienne, réduisant ainsi la variation normalement distribuée pixel par pixel (~bruit de tir et bruit de lecture).
      1. Pour les images échantillonnées ~Nyquist (70-150 nm taille xy pixel), commencez par des valeurs de curseur comprises entre 1,0 et 2,0.
      2. Pour une taille de pixel donnée, augmentez la valeur du curseur à mesure que le rapport signal/bruit (SNR) de l’image diminue.
      3. Avec un SNR, augmentez la valeur du curseur à mesure que la taille du pixel diminue.
      4. Pour les piles d’images, appliquez un lissage 3D, où le rayon z est automatiquement réglé à un tiers du rayon xy, selon les données échantillonnées par Nyquist.
         REMARQUE : La valeur du curseur correspond à l’écart-type d’un noyau gaussien mesuré en pixels.
   2. Déplacez le curseur de débruit pour appliquer un filtre médian, éliminant ainsi les valeurs extrêmes (pixel chauds de la caméra ou émissions thermoioniques PMT).
      REMARQUE : La valeur du curseur correspond au rayon en pixels d’un noyau de boîte. Des valeurs comprises entre 0,5 et 1,0 sont un bon point de départ.
   3. Déplacez le curseur Netteté pour appliquer un masque de dénetteté 2D, réduisant ainsi le flou ou la brume, comme cela peut être causé par une lumière floue. L’accentuation accentue aussi le bruit.
      REMARQUE : La valeur du curseur correspond à l’écart-type d’un noyau gaussien (en unités de pixels) utilisée pour définir l’échelle du flou. Pour les images échantillonnées par ~Nyquist (70-150 nm taille xy pixel), des valeurs de curseur entre 2,0 et 4,0 sont un bon point de départ. Le paramètre de poids est fixé à 0,6.
2. Modifier l’intensité des pixels de l’image (Processus Panel, Modifier les intensités des canaux section).
   REMARQUE : Toutes les commandes s’appliquent uniquement au canal actif, et les résultats sont automatiquement affichés dans la fenêtre de l’image. Une nouvelle fenêtre d’image n’est pas créée.
   1. Déplacez le curseur Sub.Bkgd. pour appliquer l’algorithme « rolling ball », supprimant ainsi le fond (c’est-à-dire les variations d’intensité spatialement graduelles).
      REMARQUE : La valeur du curseur correspond au rayon de la boule qui roule en pixels, donc des valeurs plus grandes soustrait moins de fond total. La valeur dépend du contenu de l’image mais doit généralement être ≥ 2x supérieure à la taille (mesurée en pixels) des éléments à préserver. Des valeurs entre 10 et 20 sont souvent un bon point de départ.
   2. Déplacez le curseur Gamma pour améliorer la visualisation des signaux plus faibles mélangés à des signaux plus brillants, comme ceux qui peuvent être nécessaires pour mettre en valeur des structures fines lorsqu’elles sont mélangées à de grandes structures.
      REMARQUE : Après normalisation, la valeur de chaque pixel est élevée à une puissance (exposant) donnée par la valeur du curseur. La valeur dépend du contenu de l’image, mais des valeurs comprises entre 0,6 et 0,8 sont souvent un bon point de départ.
      ATTENTION : Les images où le gamma a été appliqué ne peuvent pas être utilisées pour la quantification de l’intensité.
   3. Appuyez sur le bouton Appliquer le gain et le décalage : ToCh ou ToAll pour mapper la plage d’affichage de l’image (telle que spécifiée par les curseurs de gain et de décalage dans le panneau d’affichage) sur l’ensemble des intensités fournies par la profondeur de bits de l’image.
      REMARQUE : Ce processus est également appelé application de table de recherche (LUT). Le gain et le décalage d’affichage doivent être appliqués de cette manière avant de créer des vues de canal dans le panneau d’affichage .
   4. Utilisez les boutons de correction d’intensité pour corriger les variations d’intensité artificielles sur les dimensions z ou t des images 3D, comme cela pourrait être causé par le photoblanchiment, des aberrations ou la diffusion de la lumière.
      REMARQUE : L’action s’applique uniquement au canal actif. Les corrections locales et globales peuvent être appliquées séquentiellement au même ensemble de données. Voir la section Résultats pour une explication plus approfondie des méthodes sous-jacentes.
   5. Appuyez sur les boutons Global pour corriger les pertes graduelles d’intensité du signal qui se produisent sur toute la dimension z ou t, tout en préservant la plupart des variations d’intensité biologiques. Il y a deux options :
      1. Appuyez sur le bouton GlobalL pour corriger les z-stacks où les premières tranches peuvent être sombres ou noires, et la perte totale d’intensité entre la première et la dernière image est légère (<50 %). L’algorithme modélise la perte d’intensité comme une tendance linéaire puis applique un facteur de correction à chaque tranche de sorte que la pente de la ligne d’ajustement devienne nulle.
      2. Appuyez sur le bouton GlobalP pour corriger les séries temporelles où les premières images sont les plus lumineuses et la perte totale d’intensité de la première à la dernière image est importante (50 % à 95 %). L’algorithme modélise la perte d’intensité comme une tendance polynomiale^d’ordre 2, puis applique un facteur de correction à chaque tranche de sorte que la courbe d’ajustement soit transformée en une droite avec une pente nulle.
   6. Appuyez sur le bouton Local pour corriger les changements localisés et abrupts d’intensité du signal, tout en préservant les variations progressives.
      REMARQUE : Ces changements peuvent être causés par le blanchiment de quelques plans au sein d’une plus grande pile z ou par des fluctuations de puissance d’excitation (scintillement). L’algorithme modélise les variations d’intensité biologiquement pertinentes comme un polynôme du quatrième ordre, puis applique un facteur de correction pour garantir que l’intensité médiane de chaque référentiel soit égale à la valeur de la courbe ajustée.
   7. Appuyez sur le bouton Égalisation pour rendre l’intensité médiane du signal de chaque image égale, similaire à la méthode de correction de la javel à « ratio simple » des Fidji.
      ATTENTION : Equalize peut être utile à des fins de visualisation lorsque toutes les autres méthodes échouent, mais il efface les variations biologiquement pertinentes de l’intensité médiane et ne peut donc pas être utilisé en même temps que la quantification de l’intensité.
3. Modifier la dimensionnalité d’une image (panneau de procédé , section Modifier les dimensions ).
   REMARQUE : Ces commandes s’appliquent à tous les canaux de la fenêtre d’image et ne peuvent pas être inversées en utilisant le bouton Annuler .
   1. Appuyez sur le bouton Rotation pour faire pivoter l’image, comme cela peut être nécessaire pour aligner les axes anatomiques d’un embryon ou d’un tissu avec la page ou l’écran.
   2. Appuyez sur le bouton Recadre pour réduire les dimensions xy de l’image. Cherchez l’outil de ROI rectangulaire qui est automatiquement sélectionné, et suivez l’invite pour dessiner un ROI sur l’image qui sera utilisée pour le recadrage.
   3. Appuyez sur le bouton sous-ensemble pour créer une nouvelle pile d’images à partir d’un sous-ensemble des dimensions non xy de l’image d’entrée.
      REMARQUE : Cela sert à supprimer des canaux et/ou à tronquer des tranches dans z ou t.
4. Enregistrez les commandes de traitement appliquées à une image (Panneau de processus, section Actions d’enregistrement).
   REMARQUE : Le but de l’enregistreur d’actions est d’enregistrer automatiquement les actions en texte brut puis d’enregistrer l’image avec les actions appliquées, qui modifient les valeurs d’intensité des pixels. Le journal est une commodité permettant à l’utilisateur de ne pas avoir à prendre des notes manuellement ou à déchiffrer les entrées de l’enregistreur macro Fiji. Les commandes qui ne modifient pas l’intensité des pixels ne sont pas enregistrées.
   1. Appuyez sur le bouton Rec pour commencer l’enregistrement des commandes.
      REMARQUE : Le cadran du bouton affiche « ON » lorsque l’enregistreur enregistre. Les commandes exécutées et les paramètres associés apparaîtront dans la table d’actions. Les commandes qui sont « annulées » sont retirées de la table.
   2. Appuyez sur le bouton Clr pour vider la table d’action.
   3. Appuyez sur le bouton Enregistrer pour enregistrer la table d’actions en fichier texte. Si des actions appliquées à plusieurs images ont été enregistrées, elles seront regroupées selon le titre de l’image lors de la sauvegarde du fichier texte.
      REMARQUE : Sinon, sauvegardez une image à l’aide du panneau Enregistrer (section 4 ci-dessous). Cochez la case Enregistrer les actions et toutes les actions appliquées à l’image seront automatiquement sauvegardées sous forme de fichier texte en utilisant le nom et le chemin du fichier de l’image.

4. Utilisation du panneau de sauvegarde EasyFiji

REMARQUE : Comme montré à la Figure 1C, le panneau Sauvegarder est conçu pour aider les non-experts à sélectionner le bon format de fichier image pour leur cas d’utilisation prévu. Lorsque la case Actions Enregistrer est cochée, toutes les actions de traitement appliquées à une image, telles que listées dans la table d’actions, sont automatiquement sauvegardées avec l’image, en utilisant le même nom de fichier et le même chemin, sauf avec une extension *.txt. Si plusieurs images sont ouvertes et traitées en parallèle, toutes les actions effectuées sur toutes les images sont affichées dans la table d’actions. Cependant, seules les actions appliquées à l’image enregistrée sont sauvegardées avec cette image. Le fichier texte sauvegardé apparaît dans le système de fichiers mais ne s’ouvre pas aux Fidji. Si désiré, les fichiers texte peuvent être ouverts à Fidji en faisant glisser l’icône de fichier sur la barre d’outils fidjienne.

1. Sauvegarder une image (panneau d’enregistrement , section Méthodes de sauvegarde ).
   1. Appuyez sur le bouton Données brutes pour enregistrer l’image en fichier *.tif, où les valeurs exactes des pixels, la structure des canaux et certaines métadonnées sont préservées. Utilisez cette option lorsque l’objectif est de quantifier ou d’analyser davantage une image.
   2. Appuyez sur le bouton Enregistrer pour la présentation afin de sauvegarder l’image telle qu’elle est actuellement affichée en utilisant la compression jpeg à des fins d’envoi par email ou d’utilisation dans une présentation de diaporama (diaporama).
      ATTENTION : Cette option ne doit jamais être utilisée pour créer des chiffres ou pour l’analyse quantitative.
   3. Déplacez le curseur Niveau de Qualité pour définir le niveau de compression jpeg.
      REMARQUE : Des valeurs plus grandes correspondent à une meilleure préservation des intensités et des caractéristiques des pixels (et à une taille de fichier plus grande), mais toutes les caractéristiques ne sont jamais préservées.
   4. Appuyez sur le bouton Enregistrer pour la figure pour enregistrer l’image telle qu’elle est actuellement affichée au format png compatible avec d’autres programmes graphiques (par exemple, Photoshop, Illustrator, Publisher ou GIMP). L’image est enregistrée telle qu’affichée à l’écran, mais les canaux et les métadonnées ne sont pas préservés.
      ATTENTION : Cette option ne doit jamais être utilisée pour la quantification.
   5. Appuyez sur le bouton Enregistrer comme film pour enregistrer une pile d’images en format mov qui se joue les tranches séquentiellement (z ou t).
      REMARQUE : La lecture de fichiers mov sur un système d’exploitation Windows nécessite le lecteur multimédia VLC open source.

5. Utilisation du panneau d’informations d’image EasyFiji

REMARQUE : Comme montré à la Figure 1D, le panneau Informations d’image affiche des paramètres d’acquisition spécifiques au fournisseur en texte brut, essentiels à l’interprétation des images. Voir le tableau 2 pour une liste des types de formats d’image confocales actuellement pris en charge.

1. Appuyez sur le bouton Info du canal pour charger les paramètres d’acquisition .
2. Consultez la section Informations sur le canal pour les réglages d’acquisition spécifiques au canal, incluant la puissance du laser en pourcentage, la longueur d’onde du laser, la bande passante(s) d’émission, le gain et la taille du sténopé.
3. Consultez la section Configuration du système pour les réglages à l’échelle de l’image, incluantle nom de l’ystem, l’objectif, le mode de balayage, le temps de séjour et la taille du voxel.

Results

Des rendus pseudo-colorés d’images de fluorescence multi-canaux peuvent être utilisés pour illustrer les relations spatiales ou d’intensité entre les signaux ; cependant, la Fidji native n’offre qu’une technique de rendu composite RVB qui embrouille intrinsèquement la coloration et la luminosité au niveau perceptuel. Pour illustrer ce problème, la Figure 2 utilise une image à deux canaux de N-Myc et de la polymérase ARN II (RNAPolII). Dans

Discussion

Fiji est un logiciel open source de traitement et d’analyse d’images, largement populaire parmi les analystes d’images. Cependant, son interface de menu complexe et ses comportements parfois peu intuitifs concernant l’affichage et le traitement des images fluorescentes posent des défis pour les spécialistes de la vie non computationnels. EasyFiji propose aux bioscientifiques un ensemble sélectionné de boutons et de curseurs thématiquement organisés et améliorés par infobulles, qui présen...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
EasyFiji GitHub Site	Open Source		https://github.com/stjude/EasyFiji
Forum Image.sc EasyFiji	Open Source		https://forum.image.sc/t/announcing-easyfiji-a-user-friendly-gui-plugin-for-fiji/117617
Site ImageJ.net EasyFiji	Open Source		https://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin#quick-start
Logiciels FIJI	Open Source		https://imagej.net/software/fiji/downloads
Lecteur multimédia VLC	Open Source		https://www.videolan.org/vlc/