Article de méthode

Une approche comparative pour les études quantitatives de comptage cellulaire dans des cerveaux de mammifères très différents

DOI :

10.3791/69446

⸱

16 janvier 2026

 ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi, 2Department of Veterinary Sciences, University of Turin, 3Department of Anthropology and Center for the Advanced Study of Human Paleobiology, The George Washington University

Dans cet article

Résumé

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Les neurosciences modernes doivent explorer les différences entre de nombreuses espèces, y compris les rongeurs de laboratoire et les humains. Cependant, des difficultés techniques surviennent lorsque des mammifères à gros cerveau sont impliqués. Cette approche aborde la variation interespèces des populations neuronales chez des mammifères très différents, produisant des résultats comparables à cartographier pour révéler des schémas évolutifs.

Résumé

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La plupart des études neurobiologiques sont menées sur des rongeurs de laboratoire. Malgré de nombreuses similitudes entre les cerveaux des mammifères, des différences importantes existent également, ce qui peut être trompeur lors de la traduction. Des différences interespèces marquées ont été observées dans la plasticité cérébrale, en particulier la neurogenèse. Différents processus neurogènes peuvent être répandus en raison de compromis évolutifs, présentant des variations selon les structures cérébrales et les mammifères, et déplaçant le potentiel de plasticité chez des espèces divergentes, comme les souris et les humains. Comparer des espèces très différentes soulève plusieurs questions : les études comparatives rencontrent des difficultés techniques lorsque des cerveaux de grande taille sont impliqués ; L’utilisation d’approches expérimentales hétérogènes par différents laboratoires peut limiter la comparaison des résultats ; L’hétérogénéité peut être liée à différents parcours temporels des processus neurodéveloppementaux chez les mammifères, ajoutant ainsi des variables à la comparaison.

Pour remédier à ces limitations, une approche visant à étudier la variation interespèces d’une population de neurones corticaux immatures de couche II chez des mammifères, différenciant largement par la taille du cerveau, la gyrencéphalie, la niche socioécologique et l’âge. Malgré certaines variables qui ne peuvent pas être entièrement standardisées, une méthode combinant une hétérogénéité réduite dans les cerveaux collecteurs et l’établissement de structures anatomiques communes comme points de référence pour effectuer le comptage cellulaire sur les niveaux cérébraux correspondants. Les données obtenues (par exemple, les densités cellulaires) peuvent être cartographiées sur des arbres phylogénétiques pour révéler des schémas évolutifs et analysées pour détecter la covariance avec les caractéristiques neuroanatomiques (par exemple, taille du cerveau, surface corticale). Cette approche a démontré une variation remarquable du nombre de neurones corticals immatures entre groupes phylogénétiques et a révélé une covariation avec la taille du cerveau. La méthode peut également être utilisée pour quantifier les différences à travers différents stades de développement chez la même espèce et peut être étendue à d’autres mammifères divers et processus biologiques afin de cartographier des résultats comparables permettant une quantification plus précise des différentes populations cellulaires dans le cerveau adulte afin de soutenir la plasticité.

Introduction

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La recherche en neurosciences utilise principalement des souris et des rats consanguins pour transposer les résultats à l’humain. Malgré de nombreuses similitudes moléculaires, cellulaires et même anatomiques, d’importantes différences interespèces existent également, ce qui peut être trompeur pour l’interprétation des donnéesprécliniques 1,2. Bien que des études comparatives soient nécessaires, elles sont entravées par des difficultés techniques et pratiques lorsque des cerveaux de grande taille sont impliqués (par exemple, d’une moyenne de 0,5 g chez la souris à 1300 g chez l’humain ; Figure 1A). De plus, des approches expérimentales hétérogènes menées par différents laboratoires peuvent limiter la comparaison des résultats, en particulier les analyses quantitatives, générant parfois des controverses. C’est le cas de la plasticité structurelle cérébrale, avec une référence particulière aux processusneurogéniques 3,4,5, un sujet qui intéresse la compréhension de la neuroplasticité développementale et de la réparationcérébrale 6,7.

Des découvertes récentes dans le domaine de la plasticité cérébrale suggèrent fortement que des différences substantielles sont apparues au cours de l’évolution dans la fréquence, la fréquence et la localisation anatomique de différents types de processusneurogènes. Un exemple est donné par la diminution évidente de la neurogenèse due aux cellules souches chez les mammifères adultes à gros cerveau par rapport aux rongeursde laboratoire 5,9,10, probablement liée à une expansion différente des régions et fonctions cérébrales en adaptation aux pressionsécologiques 7,8, ainsi qu’à différents parcours temporelsneurodéveloppementaux 11,12. Le taux de neurogenèse semble différer de manière remarquable entre la souris et l’humain, soulevant ainsi la question de la traduction13.

D’un autre côté, un nouveau type de « neurogenèse sans division » représenté par des neurones bloqués dans la maturation arrêtée (les soi-disant neurones immaturesou dormants 14,15,16,17,18,19) a été hypothétique comme passant d’espèces à petit cerveau à une espèce à gros cerveau 20,21. Fait intéressant, la population de neurones immatures indépendante des cellules souches est hébergée dans le cortex cérébral (un site de cognition d’ordre élevé chez les espèces gyrencéphales22,23) et éloignée des sites neurogènes canoniques, principalement liés à l’olfaction et à la navigation spatiale, qui conservent une grande importance chez les espèces lissencéphaliques 7,8. Ces différences entre les structures cérébrales et les espèces de mammifères vont au-delà de l’intérêt comparatif pur, puisqu’elles peuvent être pertinentes en traduction en déplaçant le potentiel de plasticité chez la souris et l’humain. Pour ces raisons, il est crucial d’évaluer de manière « comparable » dans quelle mesure ces différences représentent une variation phylogénétique entre mammifères très différents, en se référant particulièrement aux rongeurs de laboratoire et aux primates.

Une approche récemment établie pour étudier la variation interespèces d’une population de neurones corticaux immatures de couche II (cIN) chez des mammifères très différents en taille cérébrale, gyrencéphalie et niche socioécologique 22,24,25 est décrite. Cette méthode repose sur trois principes : i) considérer plusieurs espèces de mammifères (diverses) à traiter en parallèle selon les mêmes procédures ; ii) minimiser les variables qui ne peuvent pas être totalement standardisées dans des cerveaux très différents (procédure de fixation, intervalle post-mortem, âge) et traiter la spécificité spécifique des anticorps en immunocytochimie en utilisant des caractéristiques largement partagées de la population cellulaire étudiée comme témoins positifs internes ; et iii) établir les structures anatomiques correspondantes comme points de référence pour effectuer le comptage cellulaire des niveaux cérébraux correspondants de différentes espèces (Figure 1B et Figure 2). Les données obtenues (par exemple, les densités cellulaires) en comptant les cellules identifiées au marqueur bien établi doublecortine (DCX 15,17,26) peuvent être cartographiées sur des arbres phylogénétiques pour révéler des schémas évolutifs et analysées pour détecter la covariance avec différents paramètres, tels que la taille du cerveau, la gyrencéphalie et la surface corticale.

Figure 1
Figure 1 : Traitement de cerveaux de mammifères très différents pour évaluer la distribution et la quantité de cin dans le manteau cortical. (A) Les mammifères appartenant à différentes espèces et ordres se caractérisent par des tailles cérébrales très différentes et des degrés d’expansion gyrencéphale et corticale. Icônes de cerveau reproduites sous licence BioRender. (B) Des sections coronales représentatives teintées de bleu Toluidine découpées dans des cerveaux de tailles très différentes et une extension du manteau cortical. Des sections en série colorées histologiquement (coupe cryostatique, coronale, épaisseur de 40 μm) sont utilisées pour identifier les principales structures neuroanatomiques de chaque espèce animale (voir Figure 3) ; Notez les différences remarquables de taille cérébrale et de périmètre cortical. Les icônes animales du panneau A ont été reproduites avec la permission de La Rosa et al.22. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Enfin, puisque tous les processus plastiques subissent généralement une réduction progressive avec l’augmentation de l’âge27,28, un autre problème en neuroplasticité comparative est d’évaluer les différents parcours temporels d’une telle réduction, qui peuvent être liés à différents parcours temporels des processus neurodéveloppementaux chez lesmammifères 12,29,30. En fait, l’existence d’espèces à maturation rapide (souris) versus à maturation lente (primates) est une autre raison pour laquelle le système modèle le plus courant, la souris de laboratoire, est limité dans la résolution des défis en sciences biomédicales. La méthode décrite ici peut également être utile pour considérer les populations cellulaires à différents âges tout au long de la durée de vie de chaque espèce, puis comparer les tendances résultantes entre les espèces. Des variations phylogénétiques dans la densité de cIN, ainsi que des différences dans leur persistance à travers les âges, ont été observées entre les mammifères à petit et groscerveau 22,28.

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Protocole

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Toutes les procédures animales respectaient les réglementations nationales et institutionnelles pertinentes. Des tissus de souris ont été obtenus auprès de l’Institut de Neurosciences Cavalieri Ottolenghi (NICO), Orbassano, Italie, sous autorisation du Ministère italien de la Santé (RRID : MGI :3696370), avec l’aimable autorisation de Serena Bovetti et Charles River Laboratories. Des tissus nus de rats-taupes ont été collectés à l’Université Queen Mary de Londres (Royaume-Uni) immédiatement après l’euthanasie, conformément à l’annexe 1 de l’Animals (Scientific Procedures) Act 1986. Les expériences sur les lapins ont suivi la directive 86/609/UE du Conseil des Communautés européennes et la législation italienne (DL.vo 116/92), avec l’approbation du ministère italien de la Santé (autorisation 66/99-A). Des cerveaux de moutons et de chevaux ont été obtenus après l’autopsie dans un abattoir commercial selon la directive 86/609/CEE et une supervision vétérinaire continue. Les cerveaux de chiens ont reçu l’autopsie par les laboratoires MarshallBio (Lyon, France) avec les autorisations requises ; Des cerveaux de chats ont été prélevés post-mortem à l’Université de Padoue lors de nécropsies diagnostiques de routine avec le consentement du propriétaire. Toutes les procédures respectaient la législation européenne et italienne. Les échantillons de chimpanzés ont été traités selon les principes directeurs internationaux du Conseil des organisations internationales des sciences médicales (CIOMS) et sous le permis A5761-01 du National Institutes of Health - Office of Laboratory Animal Welfare (NIH-OLAW) (pour des détails sur chaque espèce animale et expérience, voir le Tableau Supplémentaire 1 et les Réf.22,25).

1. Collecte de cerveaux

  1. Collectez les cerveaux directement ou auprès d’autres institutions et banques de tissus, mais ne considérez que l’ensemble des hémisphères. Mettez en place avec les institutions la meilleure procédure pour extraire le cerveau de l’espèce animale, en visant à réduire les dommages à l’hémisphère et à garantir l’intervalle post-mortem minimum (PMI, voir NOTE ci-dessous) ainsi qu’une immersion rapide dans une solution fixative après l’extraction.
    REMARQUE : Selon la sensibilité de l’anticorps d’intérêt, soyez conscient de l’IPM. Compte tenu de la forte sensibilité de la doublecortine (DCX) à la dégradation, prélever des échantillons avec une plage PMI de 0 à 1 h (à l’exception du chimpanzé, ayant un PMI jusqu’à 14 h, ce qui, cependant, n’a pas modifié la qualité de la coloration, Tableau Supplémentaire 1).
  2. Compte tenu de la grande variabilité de l’espérance de vie de l’animal, il faut prédéterminer les groupes d’âge qui seront collectés parmi les différents mammifères considérés pour l’étude, afin d’obtenir des données comparables.
    1. Pour cette conception d’étude et pour définir des groupes d’âge comparables, analysez les informations issues de deux bases de données sur l’histoire et la diversité animales : AnAge, une base de données sélectionnée sur le vieillissement et l’histoire de vie chez les animaux, et Animal Diversity Web, une base de données en ligne sur l’histoire naturelle animale, sa distribution, sa classification et la biologie de la conservation.
    2. Divisez la durée de vie de l’animal en quatre stades (un prépúbal et trois post-puberal, à savoir « adulte »), en commençant par la classification de l’American Veterinary Medical Association (AVMA) pour les stades de vie chezles chiens 31, où la durée de vie était divisée en six stades : chiot, junior, adulte, mature, senior et gériatrique.
    3. En condensant les stades senior et gériatrique, ainsi que les stades adulte et mature, appliquez cette terminologie : prépuberal, jeune adulte, âge moyen et senior/22 ans.

2. Fixation et traitement du tissu cérébral

REMARQUE : Les procédures de fixation peuvent varier selon la taille du cerveau et les préoccupations éthiques concernant certaines espèces animales (la plupart des primates ou chevaux à gros cerveau ne peuvent pas être perfusés et doivent être fixés par immersion dans la solution fixative après extraction).

  1. Gardez le cerveau complètement immergé dans une solution fixative (4 % de paraformaldéhyde ou 10 % de formol recommandé).
    NOTE Le temps de fixation varie selon la taille du cerveau (par exemple, 3 semaines pour le cerveau canin ; 3 mois pour le cerveau équin, Tableau supplémentaire 1). Évitez un temps trop long ou excessif dans la solution fixative afin de maintenir l’intégrité de l’antigène d’intérêt.
  2. Coupez l’hémisphère cérébral préféré en tranches égales (1 à 1,5 cm d’épaisseur) à l’aide d’une règle (pour effectuer une coupe droite) et d’un couteau poignard.
  3. Immergez les tranches de cerveau dans un tampon phosphate (PB) 0,1 M (28,49 g de phosphate dibase de sodium et 7,8 g de phosphate de sodium monobasique dissous dans de l’eau distillée, pH 7,4) et maintenez-les sous une agitation douce sur un shaker pendant 24 heures. Si nécessaire (voir NOTE ci-dessous), jetez la solution et remplacez-la par une solution fraîche de PB 0,1 M, pH 7,4 le lendemain.
    REMARQUE : Le volume et le nombre de lavages dans le PB 0,1 M varient selon la taille du cerveau (par exemple, 30 min pour le cerveau de souris, 3 jours pour le cerveau de cheval). Assurez-vous que le cerveau est entièrement immergé dans le PB 0,1 M et que les déchets de formol, de sang et de tissus ne sont plus présents pour arrêter le lavage.
  4. Cryoprotégez les tranches en les immergeant dans des solutions de saccharose à concentration croissante (10 %, 20 %, jusqu’à 30 %) dans du PB 0,1 M, pH 7,4, et maintenez-les sous une légère agitation sur un shaker.
    REMARQUE : Le volume des solutions de saccharose varie selon la taille du cerveau. Assurez-vous que le cerveau est entièrement immergé dans des solutions de saccharose et qu’il s’enfonce complètement avant de les amener à une concentration accrue de saccharose.

3. Coupe du cryostat de l’hémisphère entier

  1. Retirez les méninges des tranches de cerveau à l’aide d’une pince à épiler courbe pour éviter les problèmes lors de la coupe.
  2. Mettez les tranches dans des moules d’encastrement remplis d’un composé optimal à température de coupe (OCT). Si la tranche ne remplit pas le moule d’incrustation, coupez un morceau carré de Parafilm légèrement plus grand que la tranche cerveau et ajoutez un médium OCT au centre de la pièce, puis placez la tranche sur le dessus de l’OCT.
  3. Congelez la tranche par immersion dans 300 mL d’isopentane liquide refroidi à l’azote à -50 °C jusqu’à ce que le milieu OCT devienne entièrement blanc. Les tranches de cerveau peuvent être conservées à -80 °C pour un stockage à long terme jusqu’à la coupe.
  4. Avant de sectionner, maintenez la tranche cérébrale à -20 °C pendant au moins 5 heures afin de permettre au tissu d’atteindre lentement et de manière homogène la même température que le cryostat.
  5. Découpez la tranche en coupes coronales en série de 40 μm d’épaisseur à l’aide d’un cryostat, en maintenant une plage de température intérieure de -20 °C à -25 °C.
  6. Collectez des sections flottantes dans des plaques à 12 puits et stockez-les dans une solution cryoprotectrice (150 mL de glycérol, 150 mL d’éthylène glycol, 150 mL d’eau distillée et 50 mL de tampon F [1,682 g de phosphate monobase dihydré et 0,385 g d’hydroxyde de sodium dissous dans de l’eau distillée, pH 7,4]) (1 mL/puits ou plus pour recouvrir complètement les coupes dans le cas des cerveaux géants) à -20 °C jusqu’à la coloration.
    REMARQUE : Les tranches de l’hémisphère entier varient selon la taille du cerveau. Les cerveaux plus gros (par exemple, chimpanzés, chevaux) doivent être divisés en deux blocs égaux (dorsal et ventral) pour être traités dans le cryostat. Dans ce cas, des sections flottantes peuvent être collectées dans deux plaques à 6 puits. Une alternative consiste à sectionner des hémisphères à partir d’espèces à gros cerveau avec un microtome coulissant, ce qui permet d’obtenir des blocs de plus grande taille.

Figure 2
Figure 2 : Traiter des cerveaux très différents en suivant la même procédure et gérer des variables qui ne peuvent pas être standardisées. Dans la méthode décrite ci-dessus, toutes les procédures pouvant être standardisées sont réalisées de la même manière (fixation générale, coupe de coupes coronales en série de même épaisseur dans tout l’hémisphère, procédures immunocytochimiques générales, comptage cellulaire). Figure créée avec BioRender (https://app.biorender.com/). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

4. Coloration histologique

  1. Choisissez des césariennes coronales sériées (1 section sur 12). Pour obtenir cet espacement, il faut choisir toutes les sections d’un puits à partir de la plaque à 12 puits. Utilisez-les pour obtenir une représentation complète de l’hémisphère entier et comme référence pour choisir des sections coronales à différents niveaux cérébraux comparables selon les espèces étudiées (voir section 5). Montez-les sur des lames gélatinisées à 1 %. Laissez-les sécher quelques heures.
  2. Préparez les solutions suivantes (150 mL/solution) : éthanol 50 %, 70 %, 96 %, 100 %, Xylol et bleu de toluidine.
  3. Protocole de coloration : Placez les lames à des concentrations croissantes d’éthanol (50 % à 100 %), 1 minute chacune à 50 % à 70 %, 2 minutes à 96 % à 100 %, puis transférez dans une solution de xylol pendant 1 minute.
  4. Placez les lames dans l’ordre inverse : solution de xylol pendant 1 minute puis concentrations diminuantes de solutions d’éthanol (100 %-50 %), 2 minutes chacune à 100 %-96 %, 1 minute chacune à 70 %-50 %.
  5. Placez les lames dans 150 mL de H2Odistillé (2 min).
  6. Placez les lames dans la solution de teinture bleue Toluidine (5-10 min). Après cette étape, les sections tachées apparaissent en bleu foncé.
    REMARQUE : Le temps de conservation des sections dans les solutions pour la coloration histologique peut varier selon l’espèce. Tester les sections cérébrales de l’espèce d’intérêt afin de définir le protocole de coloration optimal.
  7. Rincez les lames dans 150 mL de H2Odistillé pendant 1 minute.
  8. Poursuivez l’étape de différenciation en plaçant les lames dans des concentrations croissantes d’éthanol (70 %-100 %) pendant 1 minute à 70 %, 2 minutes chacune à 96 % à 100 %, puis transférez dans une solution de xylol pendant 1 min 30 s. Au cours de ces étapes, les sections passent d’un bleu foncé à une couleur bleu ciel.
  9. Assurez-vous que les sections sont encore humides depuis la dernière étape du xylol avant de couper le couvercle avec un support de montage (si elles sèchent, rincez-les dans une solution de xylol pendant 5 secondes). Ensuite, laissez sécher les lames quelques jours.

5. Sélection des niveaux cérébraux et coloration immunohistochimique

  1. En utilisant les coupes colorées histologiquement obtenues dans la section 4 comme référence, identifiez les niveaux cérébraux en fonction de caractéristiques neuroanatomiques spécifiques : Niveau 1 (L1) - de l’ouverture antérieure du ventricule latéral jusqu’à L2 ; Niveau 2 (L2) - du début antérieur de la capsule interne jusqu’à L3 ; Niveau 3 (L3) - du début antérieur de l’amygdale jusqu’à L4 ; Niveau 4 (L4) - de la fermeture postérieure du ventricule latéral à une extension équivalente à celle de L2 (même nombre de sections en série de 40 μm d’épaisseur ; Figure 3).
    REMARQUE : Les références neuroanatomiques listées ci-dessus ont pour but de permettre la comparaison des cortex cérébraux appartenant à des cerveaux de tailles très différentes et à la gyrencéphalie. Selon la région cérébrale d’intérêt, les caractéristiques anatomiques utilisées comme référence peuvent changer.
  2. Choisissez trois coupes coronales espacées de chaque niveau cérébral.
    REMARQUE : Le volume de chaque tampon utilisé dans les étapes suivantes varie selon la taille du cerveau (par exemple, 0,5 mL/puits pour les sections de souris, 1,5 mL/puits pour les sections de cheval). Assurez-vous que les sections flottantes sont entièrement couvertes par chaque tampon.
  3. Lavez les sections trois fois dans PBS 0,01 M, pH 7,4, pendant 5 minutes chacune.
  4. Incubez des sections dans une solution bloqueuse endogène de peroxydase (0,6 %H2O2, 1 % Triton X-100 dans 0,01 M PBS, pH 7,4 ; 20 min) ou effectuez la récupération d’antigènes à l’aide d’acide citrique (10 mM d’acide citrique dans de l’eau distillée complétée avec 0,05 % Tween 20, pH 6,0), 5 minutes à 90 °C.
    REMARQUE : Selon la procédure/le temps de fixation et l’antigène d’intérêt, une récupération d’antigène peut être nécessaire pour obtenir une coloration optimale (tampon, température, pH et temps d’incubation peuvent varier selon l’antigène concerné).
  5. Lavez à nouveau les sections en PBS 0,01 M, pH 7,4 (3 x 5 min lavages).
  6. Incubez des sections dans une solution blocante (albumine sérique bovine (BSA) à 1-5 %, sérum normal, 1-1,5 % Triton X-100 dans 0,01 M PBS, pH 7,4 ; 90 min à la RT).
  7. Incuber des sections avec une solution primaire d’anticorps (1-5 % de BSA, 2-3 % de sérum normal, 1-1,5 % de Triton X-100, anticorps primaire dans 0,01 M PBS, pH 7,4 ; 48 h à 4 °C sous un brassage doux).
    REMARQUE : Les anticorps contre l’antigène d’intérêt peuvent donner des résultats différents en termes de qualité de coloration lorsqu’ils sont utilisés dans différentes régions cérébrales et chez différentes espèces26. Une comparaison entre un ensemble d’anticorps de différents fabricants est nécessaire pour choisir l’outil optimal à utiliser dans les différentes espèces envisagées pour l’étude (afin de réduire la variabilité entre échantillons).
  8. Répétez l’étape de lavage décrite à l’étape 5.3.
  9. Incuber des sections avec une solution secondaire d’anticorps biotinylés (1-5 % de BSA, 2-3 % de sérum normal, 1-1,5 % de Triton X-100, anticorps biotinylé secondaire dans 0,01 M PBS, pH 7,4 ; 2 h à RT).
    REMARQUE La méthode du complexe avidin-biotine peroxydase est utilisée pour le comptage cellulaire sur Neurolucida (voir section 6), car elle fournit un précipité dense et durable, permettant ainsi de se concentrer à travers l’épaisseur de la section lors du comptage. L’immunofluorescence et l’analyse confocale peuvent également être utilisées pour effectuer une immunocoloration double/triple afin de mieux caractériser les cellules (pour les protocoles, voir Réf.22,25,32).
  10. Préparez le complexe avidin-biotine-peroxydase en utilisant le kit disponible.
    REMARQUE : Préparez une solution complexe avidin-biotine peroxydase dans Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 (qui assure un pH stable pour la formation complexe) au moins 1 h avant utilisation, afin de permettre la formation complexe.
  11. Lavez les sections deux fois en PBS 0,01 M, pH 7,4 (2 x 5 min lavages), et une fois en Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 (5 min).
    REMARQUE : Puisque le complexe avidin-biotine-peroxydase est en solution avec Tris-HCl 0,05M, le rinçage avec Tris-HCl 0,05 M permet d’habituer le tissu à la solution.
  12. Incubez des sections dans le complexe avidina-biotine-peroxydase (1 h à RT).
  13. Lavez les sections en Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 (3 lavages de 5 min).
  14. Sous une hotte à fumées, incubez des coupes dans une solution de coloration 3,3'-diaminobenzidine (DAB) (H2O2, DAB en Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5) jusqu’à obtenir la coloration optimale. Au cours de cette étape, les sections passent d’une couleur transparente à une couleur brun/rouge bordeaux.
    REMARQUE : Le temps nécessaire pour obtenir la coloration optimale varie selon l’espèce analysée (par exemple, pour DCX, 2 à 5 minutes pour les sections de souris, 20 à 30 minutes pour les sections de chevaux). Vérifiez les zones qui se tachent toutes les 2 minutes pour éviter que les surtaches.
  15. Lavez les sections en PBS 0,01 M, pH 7,4 (3 x 5 lavages min).
  16. Montez les sections sur une culasse, une fois sèches, couvrez avec une gaine de couverture avec un médium de montage, puis laissez sécher les lames quelques jours.

Figure 3
Figure 3 : Établir les niveaux neuroanatomiques du cerveau pour l’étude de la distribution et de la quantité de neurones immatures de DCX+ dans le cortex cérébral. Quatre structures neuroanatomiques correspondantes (démarrage antérieur du ventricule latéral [niveau 1, L1] ; démarrage antérieur de la capsule interne [L2] ; démarrage antérieur de l’amygdale [L3]) ; fermeture postérieure du ventricule latéral [L4] ; indiqués par des cercles rouges) ont été considérés comme établissant quatre « niveaux cérébraux » antérieurs à postérieurs correspondants chez tous les mammifères considérés, afin d’étudier le nombre de cIN dans le cortex cérébral de manière « comparable ». (A) Un exemple est donné pour les rongeurs de laboratoire (souris, à gauche) et les primates (chimpanzé, à droite). Trois coupes coronales de chaque niveau cérébral (pour un total de 12 sections ; pointes de flèches rouges) sont envisagées pour le comptage cellulaire sur tout le périmètre de la couche II de chaque section coronale (REMARQUE : toutes les sections contiennent du néocortex, tandis que seules certaines contiennent également du paléocortex). Cette approche vise à permettre d’effectuer des analyses sur des niveaux neuroanatomiques correspondants dans des cerveaux de tailles très variées. (B) Un exemple est donné pour l’identification du premier niveau (L1) dans des sections histologiquement colorées d’espèces de mammifères très différentes. Icônes de cerveau et d’animaux créées avec BioRender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

6. Comptage des cellules

  1. Ouvrez le logiciel Neurolucida sur la station de travail et placez la lame sous le microscope avec l’objectif sélectionné pour le comptage cellulaire.
    REMARQUE : Pour le comptage de cellules DCX+, un objectif de 20x a été utilisé.
  2. À faible grossissement (par exemple, 4x), dessinez le contour de la couche corticale II à l’aide de l’outil de lignes de niveau à main levée dans le menu Trace du logiciel, pour obtenir le périmètre de longueur (paléocortex et néocortex).
  3. Sélectionnez les symboles préférés pour le comptage des cellules dans la barre d’outils Marqueurs, présents dans la partie gauche de l’écran. Pour cette analyse, comptez différemment deux cellules différentes dans chaque région d’intérêt (paléocortex, néocortex) selon leur morphologie (correspondant à différents états de maturation : type 1, avec un petit soma et une forme bipolaire, plage de diamètre soma de 3 à 9 μm ; type 2, avec un soma plus grand et une arborisation dendritique complexe, diamètre du soma de 9 à 18 μm).
    REMARQUE : Pour cette analyse, deux symboles/types de cellules différents pour chaque région d’intérêt sont sélectionnés dans la barre d’outils des marqueurs. Diviser le diamètre du soma en différentes plages est crucial pour catégoriser minutieusement les cellules sans morphologie claire, qui peuvent être à un état intermédiaire de maturation. Pour éviter le surcomptage, les cellules coupées à la surface supérieure de la section sont exclues de l’analyse.
  4. Collectez les données pour l’analyse phylogénétique de trois régions différentes : paléocortex, néocortex et cortex cérébral (ce dernier obtenu en ajoutant des données du paléocortex et du néocortex).
  5. Rassemblez dans un fichier tableur le périmètre de la couche corticale deux (mm), visible dans la barre d’outils Mesures de contour du logiciel.
  6. Sur le même tableur, collectez le nombre de cellules de type 1 et type 2 (visibles dans la barre d’outils des marqueurs) ainsi que le nombre total de cellules (obtenu en additionnant les cellules de type 1 et type 2) dans chaque région cérébrale et le niveau cérébral pris en compte (trois sections/niveau, total de 12 sections/échantillon).
  7. Utilisez ces données pour obtenir, pour chaque section de chaque région, la densité cellulaire linéaire (nombre de cellules/mm) et le pourcentage de cellules de type 1 et de type 2 (nombre de cellules de type 1/type 2 divisé par le nombre total de cellules et multiplié par 100).
  8. Calculez la valeur médiane de la densité (en utilisant la fonction médiane sur le tableur) des 12 sections considérées/échantillon, afin de représenter graphiquement la densité linéaire des cellules. Utilisez la médiane comme mesure centrale car l’échantillon par groupe est relativement petit (4 animaux/groupe), et certains groupes présentent des distributions asymétriques (la médiane est moins influencée par les valeurs extrêmes).
  9. Calculez le pourcentage de cellules de type 1 et 2 dans chaque spécimen (en utilisant la formule décrite ci-dessus) puis obtenez la valeur moyenne des pourcentages parmi les quatre spécimens considérés/espèces (en utilisant la fonction Moyenne sur le tableur). Ensuite, utiliser la densité cellulaire linéaire pour effectuer des analyses phylogénétiques (voir section 7), et utiliser le nombre total de cellules comptées dans chaque coupe coronale pour estimer le nombre total de neurones/hémisphères immatures.
  10. Utilisez l’outil de contour à main levée sur Neurolucida Software pour tracer une ligne à travers le diamètre du soma perpendiculaire à son axe principal. En effectuant cette étape, calculez la longueur du diamètre d’au moins 100 cellules DCX-positives (DCX+) sélectionnées au hasard des deux types dans chaque espèce (25 cellules/spécimen) dans chaque région cérébrale, afin d’obtenir la plage de diamètre de Soma des cellules de type 1 et de type 2.

7. Analyses phylogénétiques : génération phylogénétique des arbres

  1. Créez une liste des espèces analysées dans Notepad en utilisant leurs noms scientifiques, puis téléchargez-la sur le site https://timetree.org/.
    NOTE Les noms scientifiques peuvent être consultés en utilisant le site : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy
  2. Exportez le fichier arbre obtenu en cliquant sur le bouton vers le fichier Newick .

8. Analyses phylogénétiques : Intégration des données de comptage dans l’arbre phylogénétique

  1. Dans des colonnes séparées d’une fiche technique, listez toutes les espèces analysées ainsi que les données correspondantes à corrélér (dans ce cas : densité cellulaire DCX+ du cortex entier, densité cellulaire DCX+ du néocortex et densité cellulaire DCX+ du paléocortex). Si plusieurs individus sont disponibles par espèce, calculez la moyenne de la densité médiane pour les paramètres sélectionnés.
  2. Téléchargez le logiciel Mesquite Project (https://www.mesquiteproject.org/) pour fusionner l’arbre phylogénétique avec les données de comptage.
    REMARQUE : Ce logiciel nécessite que Java soit déjà présent sur l’ordinateur.
  3. Ouvrez le fichier Newick précédemment sauvegardé par Timetree en cliquant sur Ouvrir un fichier. Ensuite, sélectionnez l’option Simple Newick/Phylip Treefile . Traitez le fichier comme du texte et enregistrez-le en « .nex ».
  4. Dans la nouvelle page qui s’ouvre, sélectionnez Taxa&Arbres suivis de Nouvelles Fenêtres à Trois Fenêtres, et sélectionnez Avec les Arbres depuis la source. Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez Arbre Stocké, puis appuyez sur OK. Un nouvel onglet appelé Arbres importés sera affiché.
  5. Modifiez graphiquement l’arbre phylogénétique (par exemple, police, taille, branches proportionnelles à la longueur) dans la section Affichage .
  6. Ajoutez un nouvel onglet sur Mesquite, sélectionnez Ajouter suivi de Nouvelle matrice de caractères et choisissez le nombre de caractères (pour cette étude, nombre = 3, ce qui correspond aux trois densités de cellules DCX+). Traitez les caractères comme des données continues.
    REMARQUE : Les caractères représentent les données à corrélér avec l’arbre phylogénétique.
  7. Copiez dans cet onglet nouvellement créé les données qui seront corrélées avec l’arbre phylogénétique (pt. 6.4) et enregistrez-les.
  8. Dans l’onglet Arbres importés, sélectionnez Analyse :Arbre et Trace l’historique des caractères pour effectuer une analyse des États ancestraux Parcimonie.
  9. Enregistrer le fichier en PDF.

9. Analyses phylogénétiques : corrélation de la taille du cerveau et des densités cellulaires DCX+

  1. Dans la fiche technique précédemment créée, ajoutez une colonne avec la taille du cerveau pour chaque espèce.
  2. Calculez le logarithme naturel des densités cellulaires DCX+ et de la taille du cerveau.
  3. Lancez le logiciel statistique préféré (https://www.statskingdom.com/linear-regression-calculator.html) et effectuez une simple régression linéaire
  4. Téléchargez les fichiers de résultats et enregistrez les résidus sous forme de nouvelles colonnes dans la fiche technique.
    REMARQUE : Les résidus représentent la déviation des points de données par rapport à la ligne de régression.
  5. Dans la fiche technique, sélectionnez la colonne des résidus et la colonne contenant les noms des espèces. Ensuite, allez dans Insert et choisissez le graphique histogramme pour afficher graphiquement les résidus.

10. Analyses phylogénétiques : extension néocorticale et corrélation de densité cellulaire DCX+ néocorticale

  1. Dans la fiche technique précédemment créée, ajoutez une colonne avec les données de surface de la couche néocorticale II de chacune des espèces, et calculez les logarithmes naturels.
  2. Dans le logiciel statistique, effectuez une régression linéaire simple en utilisant les valeurs de la surface logarithmique de couche néocorticale II comme variable X et la densité cellulaire DCX+ du néocortex logarithmique comme variable Y.
  3. Téléchargez les fichiers obtenus et enregistrez les résidus dans une nouvelle colonne de la fiche technique, où le graphique résiduel peut être créé comme à l’étape 9.5.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules DCX+ du cortex cérébral de toutes les espèces étudiées partagent systématiquement une série de caractéristiques indiquant l’existence d’une population bien préservée de neurones indifférenciés (Figure 4A). En résumé, elles : (i) sont disposées topographiquement pour former une monocouche le long de la couche corticale II ; (ii) montrer les sous-types morphologiques décrits pour les différents stades de maturation chez les neurones immatures, (a) avec une forte prévalence de peti...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La méthode décrite ici fournit des données quantitatives comparables lorsque l’on considère des espèces diverses très différentes en taille cérébrale et en neuroanatomie. Il peut être utilisé pour évaluer la cohérence des populations cellulaires dans l’ensemble du cerveau de divers mammifères, ainsi que pour suivre leur développement chez une seule espèce à travers les stades suivants, du postnatal au vieillissement. Cela part de l’hypothèse qu’un nombre relativement élevé de cerveaux (h...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions Matteo Piumatti et Chiara La Rosa d’avoir contribué à définir le protocole rapporté ici pour les neurones corticali immatures. Les travaux ont été soutenus par la Fondazione CRT - Cassa di Risparmio di Torino (subvention RF=2022.0618) à LB ; PRIN2022 (accorder 2022LB4X3N) à LB ; National Science Foundation (subventions EF-2021785, DRL-2219759) et National Institutes of Health (subventions NS092988, AG067419) au CCS.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10 % de formolSigma-AldrichHT501128
2-méthylbutane & nbsp ;Sigma-Aldrich320404Isopentane
3,3&prime ;-Diaminobenzidine tétrahydrochlorure hydrateSigma-AldrichD5637
4 % de paraformoldéhydeSigma-Aldrich441244
Albumine sérique bovineSigma-AldrichA9647
Acide citrique   ;SigmaC0759
Montage DPX pour histologieSigma-Aldrich  ; 06522
ÉthanolMerck1.00983
Éthylène glycolSigma-Aldrich102466
GlycérolSigma-AldrichG7893
Solution de peroxyde d’hydrogèneSigma-AldrichH1009
Killik - Complexe O.C.T.Bio-optique  ; 05-9801
Logiciel MesquiteProjet MesquiteMesquite version 3.81 (build 955)
Neo-mountSigma-Aldrich1.09016
Tampon phosphate (PB)NANASur mesure
Solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS)NANASur mesure
Hydroxyde de sodiumRiedel-de Haen6213
Dihydre phosphate de sodiumSigma-Aldrich71645
Phosphate de sodium monobase dihydréSigma-Aldrich71500
SaccharoseSigma-AldrichS9378
Bleu ToluidineSigma-Aldrich89640
Triton X-100 & nbsp ;Sigma-AldrichT8787
Préadolescent 20Sigma-AldrichP9416
VECTASTAIN Elite ABC-HRP Peroxydase (Standard)Laboratoires VectorPK-6100
Xylol & nbsp ;Sigma-Aldrich247642

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Comparative NeurobiologyMammalian Brain VariationCortical Immature NeuronsBrain PlasticityNeurogenesis DifferencesBrain Size ComparisonPhylogenetic AnalysisNeurodevelopmental ProcessesCell Population Quantification

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