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Article de méthode

Immunocoloration complète des ovaires fœtaux et néonatals de souris

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DOI :

10.3791/69455

⸱

28 avril 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Syracuse University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode d’immunomarquage à monture entière des ovaires de souris en développement, avec des applications sur d’autres petits tissus.

Résumé

La réserve ovarienne se compose des ovocytes disponibles pour la reproduction chez une femelle et se trouvent dans les follicules primordiaux, chacun contenant un ovocyte entouré de plusieurs cellules de granulosa. Les ovocytes commencent sous forme de cellules germinales primordiales qui se forment à l’extérieur de la gonade et migrent vers l’ovaire en développement au cours du développement embryonnaire. Une fois qu’ils atteignent l’ovaire, ils deviennent oogones et se divisent par mitose, avec une cytokinèse incomplète, formant des groupes de cellules interconnectées appelés kystes germinaux. Pendant la présence de kystes, les cellules entrent en méiose et deviennent des ovocytes. Chez la souris, deux jours avant la naissance, les kystes commencent à se décomposer, et chaque ovocyte est conditionné dans un follicule primordial. Seuls certains ovocytes survivent pendant ce processus, les autres subissent une apoptose. La régulation de la dégradation des kystes et de la formation des follicules primordiaux n’est que partiellement comprise, et l’identification des molécules impliquées est cruciale pour comprendre ce processus. L’immunocoloration en monture entière des ovaires de souris en développement peut être utilisée pour déterminer la localisation de molécules régulatrices potentielles et pour évaluer les effets sur la formation des follicules primordiaux due à une mutation ou à d’autres modifications moléculaires à l’aide de marqueurs oocytes et cellulaires somatiques. Les ovaires sont prélevés sur des souris fœtales ou néonatales, fixés dans du formaldéhyde et bloqués. Les ovaires sont ensuite exposés à des anticorps contre une protéine d’intérêt, suivis d’anticorps secondaires conjugués à une marque fluorescente qui détectent les anticorps primaires. Enfin, les ovaires sont montés et examinés par microscopie confocale. Cette procédure peut détecter plusieurs protéines d’intérêt et peut être appliquée à d’autres petits tissus, comme les testicules fœtaux de souris.

Introduction

L’immunocoloration de montures complètes combinée à l’imagerie confocale est une méthode puissante pour analyser l’expression protéique et la morphologie cellulaire dans les petits tissus sanssectionner 1. Dans cette méthode, les tissus sont d’abord prélevés, fixés et bloqués, puis exposés à des anticorps contre les protéines d’intérêt. Les anticorps sont soit directement conjugués aux fluorophores, soit suivis d’un marquage avec des anticorps secondaires conjugués aux fluorophores qui reconnaissent les anticorps primaires. Le tissu est ensuite incubé avec le colorant fluorescent 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour visualiser les noyaux cellulaires. Cette étape est importante pour fournir une orientation spatiale lors de l’imagerie du tissu. Enfin, le tissu est monté et visualisé par microscopie confocale. Une autre technique utilisée pour étudier la morphologie tissulaire consiste à plonger le tissu dans la paraffine, à le sectionner, puis à le marquer avec des colorants tels que l’hématoxyline et l’éosine, soit avec des anticorps. Sinon, des coupes congelées peuvent être préparées et immunocolorées. Malheureusement, ces deux techniques impliquent la coupe, ce qui entraîne la perte d’informations tridimensionnelles. Bien que les sections en série puissent aider, l’analyse est fastidieuse et implique de visualiser un grand nombre de sections. Ainsi, la méthode de montage globale est avantageuse car elle préserve la structure tridimensionnelle du tissu qui peut être visualisée par coupe optique.

Le développement des cellules germinales primordiales (PGC) en ovocytes et l’assemblage des ovocytes dans les follicules primordiaux sont essentiels à la fertilité féminine. Les PGC se forment de manière extraembryonnaire et doivent migrer vers l’ovaire pendant le développement embryonnaire. Une fois que les PGC arrivent à l’ovaire, à partir d’environ le jour embryonnaire (E) 10,5 chez la souris, ils sont classés comme oogonia2. Les oogones subissent une mitose mais avec une cytokinèse incomplète, formant des groupes interconnectés de cellules appelés kystesgerminaux 3. Les Oogonia entrent en méiose à partir de E 13,5 pour devenir des ovocytes et progressent par la prophase I jusqu’au stade diplotène. Au fur et à mesure que les ovocytes se développent, les kystes se décomposent, permettant à chaque ovocyte d’être entouré d’une couche de cellules de granulosa, formant des follicules primordiaux contenant chacun un ovocyte arrêté parle diplotène 4. Il y a une perte d’un grand nombre d’ovocytes en même temps que la dégradation des kystes, ce qui est considéré comme important pour le contrôle de la qualité lors de la formation des follicules primordiaux. Le nombre d’ovocytes arrêtés par des diplotènes dans les follicules primordiaux constitue la réserve ovarienne d’ovocytes disponibles pour la reproduction et est directement lié à la fertilité. Si la formation des follicules est perturbée, cela pourrait entraîner une réserve ovarienne plus réduite, limitant ainsi la durée de vie reproductive féminine.

L’immunocoloration de montures entières a été utilisée pour identifier et analyser l’expression des protéines lors du développement embryonnaire, fœtal et néonatal des ovocytes. Les molécules examinées incluent MSY2, SYCP3, ESR1, ESR2, CYP19A1, 3βHSD, KIT et STAT3 5,6,7,8,9. Cette technique a également été largement utilisée pour découvrir comment la formation des follicules primordiaux est régulée. Les ovaires fœtaux ou néonatals ont été cultivés et exposés à des molécules de signalisation ou à des inhibiteurs. Les ovocytes dans les ovaires cultivés subissent une formation folliculaire primordiale, similaire à celle du 10 in vivo. La culture ovarienne a été utilisée avec succès pour examiner les signaux de l’hormone stéroïde 6,10,11, KIT 8 et PI3K12 à cette étape du développement de l’ovaire. Après culture, une immunocoloration de montures entières est utilisée à l’aide d’anticorps contre l’hélicase DEAD box 4 (DDX4, également connue sous le nom d’homologue du vasa de souris (MVH)), une protéine exprimée dans le cytoplasme des ovocytes. Les ovaires sont ensuite examinés par microscopie confocale pour évaluer la formation des follicules primordiaux.

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Protocole

Toutes les procédures utilisant des souris ont été examinées et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Syracuse (IACUC). Le protocole suivant sert à marquer les ovaires de souris néonatales les jours postnatales 1 à 5 (voir Figure 1 pour le schéma). Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Prélèvement et réparation des ovaires

  1. Euthanasiez les souris néonatales C57BL/6 en suivant le « Guide for the Care and Use of Laboratory Animals » des National Institutes of Health et les protocoles animaux approuvés par l’IACUC. Disséquez les ovaires dans une solution saline tamponnée phosphate (PBS).
    REMARQUE : Pour cette procédure, les souris néonatales ont été euthanasiées par décapitation conformément à notre protocole IACUC pour animaux. Les mâles et les femelles de la souche C57BL/6 peuvent être distingués chez les nouveau-nés par la présence d’une petite tache sombre entre les ouvertures anogénitales chez les mâles. Pour disséquer les ovaires, coupez d’abord au niveau de l’estomac puis retirez les intestins. Ensuite, ouvrez l’abdomen avec une incision médiane à la queue, puis faites deux coupures horizontales. Localisez les ovaires sous chaque rein, isolez chaque ovaire et nettoyez l’excès de tissu.
  2. Placez les ovaires directement dans 600 μL de 5,3 % de paraformoldéhyde (PFA ; PFA de qualité EM à 16 % dilué dans 1x PBS) (fixez) dans un tube microfuge à température ambiante (RT). Incubez les ovaires fixés sur un nutator toute la nuit (O/N) à 4 °C.
    ATTENTION : Le paraformoldéhyde est toxique. À utiliser dans une hotte ou dans un endroit bien ventilé. Portez des gants, une protection oculaire et des vêtements de protection pour éviter le contact visuel avec la peau. Jetez-les comme déchets dangereux.
  3. Retirez, fixez et lavez les ovaires deux fois dans 1 mL 0,1 % Triton X-100 en 1 PBS (PT) rapidement, puis une fois tous les 1 mL de PT sur nutator pendant au moins 30 minutes en RT. Incubez en 1 mL de PT + 5 % de BSA (bloc) pendant au moins 30 minutes au RT sur nutator ou conservez à 4 °C pendant jusqu’à 2 semaines.

2. Incubation avec des anticorps primaires et secondaires

  1. Incuber avec un anticorps primaire dilué dans 500 μl de PT + 5 % de BSA O/N à 4 °C sur le nutator. Laver trois fois en 1 mL de PT + 1 % de BSA, 30 min à RT sur nutator.
    REMARQUE : La dilution dépend de l’anticorps. Les données représentatives présentées ici sont marquées avec DDX4 dilué 1:200. Les anticorps contre deux protéines différentes peuvent être utilisés simultanément tant que les anticorps primaires sont produits chez deux espèces différentes et qu’un secondaire n’est pas produit dans l’espèce reconnue par l’autre secondaire (n’utilisez pas l’anti-bouc pour la souris - Alexa 488 et l’anti-chèvre pour l’âne - Alexa 568).
  2. Lors de l’incubation des ovaires avec un anticorps primaire, incuber un anticorps secondaire dilué avec une pincée de poudre d’embryon dans 500 μL PT + 5 % BSA O/N à 4 °C sur nutator (recouvert de feuille d’aluminium) afin de réduire la liaison non spécifique de l’anticorps secondaire. Centrifugez l’anticorps secondaire à 6000 x g pendant 30 s pour recueillir la poudre résiduelle au fond. Veillez à ne pas extraire ce résidu lors du transfert secondaire vers le tube d’échantillon.
    REMARQUE : La dilution dépend de l’anticorps. Les données représentatives présentées ici sont indiquées avec l’anti-lapin pour chèvres Alexa 488 dilué 1:200.
  3. Incuber avec un anticorps secondaire fluorescent préabsorbé (produit à l’étape 2.2) pendant 2 à 4 heures au RT sur le nutator. Couvre-le avec du papier aluminium à partir de maintenant. Laver trois fois en 1 mL de PT + 1 % de BSA, pendant 30 minutes à RT sur un nutator.

3. Marquage des noyaux avec DAPI et montage des ovaires sur une lame

  1. Incuber en DAPI 1:1000 dans PBS pendant 90 minutes en RT. Laver une fois avec 1 mL 1x PBS.
  2. Transférez les ovaires sur une lame de microscope à l’aide d’une large pointe de micropipette de 200 μL. Retirez l’excès de PBS avec une aiguille/seringue. Ajoutez 3 gouttes de substrat de fixation sur les ovaires.
  3. Appliquez délicatement une housse de protection sur le dessus des ovaires, en veillant à ce que le support de montage s’étende sur les bords de la gaine. Scellez les bords de la gaine avec du vernis à ongles et laissez sécher le vernis à ongles, puis conservez à -20 °C.

4. Préparation de la poudre d’embryon

  1. Homogénéiser ~ E 12,5–E 14,5 embryons de souris dans un volume minimum de 1x PBS glacé. Ajoutez 4 volumes d’acétone bien froide, mélangez, puis faites couver sur la glace pendant 30 minutes.
    ATTENTION : L’acétone est inflammable et irritante pour les yeux et la peau. À utiliser dans une hotte ou dans un endroit bien ventilé. Portez des gants, une protection oculaire et des vêtements de protection pour éviter le contact visuel avec la peau. Jetez-les comme déchets dangereux.
  2. Centrifugez à 10 000 x g pendant 10 minutes, retirez le surnageant, puis lavez la pellete avec de l’acétone bien froide et faites tourner à nouveau.
  3. Étalez les granulés sur une feuille de papier filtre, placez-les dans un plateau en plastique, et laissez sécher les O/N dans une hotte chimique. Moudre jusqu’à obtenir une fine poudre, laisser sécher complètement à l’air libre, et conserver à -20 °C.

5. Analyse de l’expression protéique par microscopie confocale

  1. Après avoir marqué la protéine d’intérêt, visualisez-la par microscopie confocale. Pour examiner l’expression des protéines, nous utilisons généralement 3 à 4 animaux (6 à 8 ovaires) et prenons plusieurs images de chaque ovaire.
    REMARQUE : Les images décrites dans la section des résultats représentatifs ont été obtenues soit avec un microscope confocal à disque tournant, soit avec un microscope à balayage laser confocal. Les paramètres utilisés sont décrits dans la section des résultats représentatifs et varieront selon le microscope utilisé.

6. Analyse de la formation et du développement des follicules primordiaux par microscopie confocale

  1. Après avoir marqué les ovaires pour un marqueur oocytoplasmique tel que DDX4, pour chaque ovaire, attribuez aléatoirement deux zones ou « cœurs » à visualiser.
    REMARQUE : Un noyau se compose de 4 sections optiques principales de 212 × 212 μm, chacune séparée par une profondeur de 15 à 20 μm. Les 4 sections optiques couvrent à la fois le cortex et la moelle moelle afin de garantir que toutes les régions de l’ovaire sont évaluées. Pour chaque ovaire, il y aura 2 noyaux avec 4 sections optiques pour un total de 8 sections (voir Figure 2).
  2. Après avoir imagé la section optique principale pour analyse, prenez une pile en Z de 5 images au-dessus et 5 images en dessous de la section principale, chacune espacée d’un μm. Pour chaque section principale, comptez le nombre total d’ovocytes dans la section
  3. Ensuite, pour chaque ovocyte de la section principale, déterminez s’il est associé à un autre ovocyte ou non en examinant la section principale ainsi que la pile de sections afin de déterminer si les ovocytes de la section principale étaient associés à des ovocytes au-dessus ou en dessous du plan de focalisation. Enfin, pour chaque ovocyte, déterminez à quel stade du développement du follicule il se trouve (primordial, primaire ou secondaire).
    REMARQUE : Il est recommandé d’analyser au moins 4 animaux (8 ovaires) afin d’obtenir des données statistiquement significatives.

7. Utilisation de l’iodure de propidium comme marqueur nucléaire alternatif

  1. Après l’étape 2.3, incuber pendant 30 minutes dans 0,1 mg/ml RNase A (10 μL de 10 mg/ml dans 1 mL de PT + 1 % de BSA). Retirer la RNase A et incuber dans 10 μg/mL d’iodure de propidium (10 μL de 1 mg/mL dans 1 mL PT + 1 % de BSA) pendant 20 minutes à la RT sur un nutator. À partir de là, couvrez le tube de papier aluminium.
    ATTENTION : Le propidium iodure est toxique et mutagénique. À utiliser dans une hotte ou dans un endroit bien ventilé. Portez des gants, une protection oculaire et des vêtements de protection pour éviter le contact visuel avec la peau. Jetez-les comme déchets dangereux.
    REMARQUE : Toto-3 peut également être utilisé comme marqueur nucléaire.
  2. Retirez l’iodure de propidium et lavez pendant 30 minutes à 1 mL PT + 1 % de BSA. Sauter l’étape 3.1 (coloration DAPI).

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Résultats

Les résultats typiques de la méthode d’immunocoloration décrite ici sont présentés. Les images des figures 3, 4, 5 et 6 ont été prises avec un microscope confocal à disque tournant à l’aide d’un objectif huile 40x, NA 1,3, avec un temps d’exposition entre 100 et 250 ms et une puissance laser comprise entre 0,01 et 0,1 %. Dans la Fig...

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Discussion

Ce rapport décrit une méthode pour marquer par fluorescence des ovaires entiers à la recherche de protéines d’intérêt. Cette procédure a été largement utilisée pour déterminer l’expression des protéines lors de la formation des follicules primordiaux et également pour caractériser les changements dans la formation des follicules dans différentes conditions 4,5,6,7,8,9,10,11.

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

L’imagerie a été réalisée au Blatt Imaging Center de l’Université de Syracuse. Les images de la Figure 7 ont été obtenues à partir d’un Zeiss LSM980 avec Airyscan2 supporté par le NIH S10 OD026946-01A1. Ce travail a été soutenu par des subventions R03 HD102016 et R21 HD112756 du NIH (vers le MEP).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
VASA anti-humain (fabriqué chez la chèvre)R& DAF2030
anti-DDX4/MVH (fabriqué en lapin)Abcamab13840
anti-GCNA1/TRA98 (fabriqué en rat)Abcamab82527
Albumine sérique bovine (BSA)FisherBP-1600
Encartes de couverture 22 x 22 #1.5Warner Instruments64-0721
DAPI (poudreuse)Sigma AldrichD-9542préparer une solution de 5 mg/ml en dH2O
Portée de dissection
Anti-Chèvre Alexa 568InvitrogenA11057
Alexa 488 anti-souris de l’âneInvitrogenA21202
Anti-Lapin Âne Alexa 568InvitrogenA10042
Anti-Lapin Alexa 647 de l’âneInvitrogenA31573
Alexa 488 anti-Rat de l’âneInvitrogenA21208
Éthanol 200 proofPharmco111000200
Ciseaux fins - TranchantsOutils scientifiques finement14060-09pour un travail fin pour retirer l’ovaire et tailler l’excès de tissu
Pince (Pince Dumont, Style 5)Science de la microscopie électronique72705-01 (0209-5-PO)
Alexa 488 anti-Lapin de chèvreInvitrogenA11008
Tubes à microcentrifuge 1,5 mLThermo Scientific3451PK
Lames de microscopeFisherbrand12-550-123
Mélangeur de nutationLabNetS0500
Paraformeldéhyde 16 %Science de la microscopie électronique15710
Plaques de Petri 100 x 15 mmFabrication de bioplastes940-10774
Solution physiologique tamponnée au phosphate 1X(Fisher) S271-1 ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; (Sigma) P9541-500G ; (Fisher) BP332-500 ; (Fisher) P285-500800 mL MQ H2O  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; 80 g de NaCl  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; 2.0 de KCl  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; 14,4 g Na2HPO4  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; 2,4 g KH2PO4 & nbsp ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; Ajustez le pH à 7,4 avec HCl ; volume final 1 L Puis diluer de 10X à 1X pour usage
Porte-épinglesOutils scientifiques finement26016-12pour maintenir l’aiguille droite pliée dans une légère courbe
Embouts de filtre à pipetteOneTip(10uL) 1121-3810 ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; (20 uL) 1120-1810 ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; (200 uL) 1120-8810 ;   ;   ;   ;   ; (1000 uL XL) 1122-1830
Pointes de pipetteOneTIp(10 uL) 1111-3800 ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; (200 uL) 1111-1800 ;   ;   ;   ;   ; (1250 uL) 1112-1820
Pipettes 0,2-2, 2-20, 20-200, 100-1000Gilson(0,1-2 uL) F144054M ;   ;   ;   ; (2-20 uL) F144056M ;   ;   ; (20-200 uL) F144058M ;   ;   ;   ; (100-1000 uL) F144059M
Iodure de propidium, 1 mg/ml dans dH2OInvitrogenP3566
Poudre RNase ASigma AldrichRG513-50mgpréparer une solution de 10 mg/ml dans 0,1 M d’acétate de sodium (pH 5,2). Chauffez à 100 oC pendant 15 minutes. Refroidissez pour faire du RT et ajustez le pH en ajoutant 0,1 volume de 1 M Tris-Cl (pH 7,4)
Aiguille droiteaiguille droite courbée en forme de courbe pour sectionner l’excès de tissu de l’ovaire
Triton X-100Thermo ScientificX100-100ML
Seringue tuberculine 28G x 1/2Tyco/Healthcare Kendall Monoject1180128012
VectashieldLabratories vectorielsH-1900
Ciseaux de WagnerOutils scientifiques finement14068-12Pour la décapitation, et les coupures plus grandes
Embout de pipette à large calibre 20 ulLabCon1026-965-008-9

Références

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