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Article de méthode

Culture explant un rein de rongeur et établissement d’une culture cellulaire épithéliale du bourgeon urétérique primaire

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DOI :

10.3791/69462

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30 décembre 2025

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1Stem Cells and Metabolism Research Program Unit, Faculty of Medicine, University of Helsinki, 2GM Unit, Helsinki Institute of Life Science, University of Helsinki, 3Department of Pediatric Surgery, Section of Pediatric Urology, New Children's Hospital, Helsinki University Hospital, 4Laboratory Animal Centre, University of Helsinki

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit l’établissement de la culture rénale mammifère la plus couramment utilisée, qui permet la croissance et la différenciation rénales dans un système d’interphase air-liquide de type Trowell. Nous détaillons également comment installer des cultures cellulaires épithéliales de bourgeons urétériques primaires à partir des premiers rudiments rénaux.

Résumé

Le rein en développement est un système modèle largement utilisé pour étudier l’organogenèse chez les mammifères. La différenciation rénale est orchestrée par des interactions tissulaires inductives réciproques entre le mésenchyme, le strome et l’épithélium. La morphogenèse ramifiée du bourgeon urétérique épithélial favorise non seulement la croissance des reins embryonnaires et le schéma 3D, mais induit aussi des transitions mésenchyme-épithélium au sein du bassin progéniteur de néphron environnant, assurant ainsi la formation de néphrons nécessaire à la filtration fonctionnelle.

Les décisions de destin cellulaire critique dans les trois couches tissulaires, épithélium, mésenchyme et stroma, sous-tendent un équilibre dynamique entre le renouvellement de soi des progéniteurs et l’équilibre de différenciation. Ces interactions régulatrices complexes et multi-couches dépendent intrinsèquement de l’intégrité structurelle de l’organe, rendant les modèles rénaux intacts essentiels pour étudier les processus morphogénétiques et les comportements cellulaires dans leur contexte naturel.

Les méthodes de culture des organes rénaux offrent des plateformes éclairantes pour visualiser les processus développementaux et disséquer les mécanismes morphologiques, cellulaires et moléculaires qui régissent la différenciation rénale. Il existe une variété de méthodes de culture rénale, chacune offrant des avantages distincts. Dans cet article, nous détaillons la mise en place d’un système traditionnel de culture d’interphase air-liquide de type Trowell pour le développement rénal in vitro . Pour améliorer la résolution des analyses cellulaires et moléculaires, nous décrivons également la mise en place d’une culture cellulaire épithéliale du bourgeon urétéric primaire, qui permet une étude ciblée des mécanismes spécifiques à l’épithélium.

Enfin, nous démontrons que la technique traditionnelle de culture des organes rénaux est applicable au rein embryonnaire d’un organisme modèle nouveau, la souris épineuse (Acomys dimidiatus). Cela ouvre des voies innovantes intéressantes pour la recherche sur les cellules souches et la régénération, car Acomys possède une capacité de réparation fonctionnelle remarquable dans plusieurs systèmes d’organes étudiés à ce jour.

Introduction

La pratique de la culture des orgues remonte au début duXXe siècle. Les reins furent parmi les premiers organes à être cultivés in vitro lorsque Rienhoff introduisit la méthode de la goutte suspendue pour les reins embryonnaires de poulet en 1922. Dans les années 1950, des cultures rénales embryonnaires de souris (Mus musculus) ont établi l’importance des interactions mésenchyme-épithélium pour guider les processusdéveloppementaux 3,4. Depuis, les cultures de tissus et d’organes servent de méthode pour étudier la morphogenèseramifiée 5,6,7,8,9,10,11,12, la signalisation inductive 3,4,13,14, la différenciation 15,16,17, 18, 19, et leurs mécanismes. Cependant, la culture d’organes in vitro, très pertinente, permet d’ajouter différentes molécules de signalisation, agonistes ou antagonistes/inhibiteurs aux cultures pour surveiller leurs effets sur les événementsmorphologiques 20,21,22.

La culture de reins génétiquement modifiés (MG) a fourni des informations précieuses sur la régulation de la différenciationrénale 6,7,9,20,23,24,25,26,27. Les méthodes de marquage génétique et les techniques d’imagerie en temps réel permettent de visualiser des populations cellulaires spécifiques ou même des cellules individuelles, facilitant l’analyse de leur contribution aux processusmorphologiques 9,10,12,18,24,25,26,28,29,30.

Il existe au moins quatre types différents de systèmes de culture ex vivo rénale : 1) la méthode de la goutte suspendue, où le tissu est cultivé dans une petite goutte moyenne suspendue à une engobe de couverture ou à un couvercle de boîte dePétri 2,31 ; 2) Culture d’interphase liquide de type trowell à air, où les explants sont placés sur une membrane au-dessus d’une grille métallique ou suspendus à un cadre en plastique (inserts commerciaux) avec un support sous la membrane32,33 ; 3) culture à faible volume, où une très petite quantité (~85 μL) de milieu de culture et le tissu sont placés à l’intérieur d’un anneau en silicium sur une lameen verre 34 ; et 4) Culture à direction Z fixe (FiZD) optimisée pour l’imagerie confocale en direct et où le rein est comprimé entre une lame en verre et une membrane séparée par des espaceurs35. La culture rénale de type Trowell est présentée ici pour sa simplicité, sa grande rentabilité, sa facilité de visualisation des processus morphologiques, et parce qu’elle n’est pas liée à une microscopiespéciale 6.

Les méthodes de culture rénale permettent de comprendre l’organogenèse de manière holistique. Les cultures cellulaires primaires offrent une approche complémentaire pour étudier les mécanismes biochimiques et moléculaires, en particulier ceux impliqués dans l’adhésion cellulaire et ses modifications, sa délamination et sa motilité. Pour ceux-ci, la culture in vitro de cellules épithéliales est un excellent modèle36. La culture monocouche du bourgeon urétérique primaire (UB) est établie en environ 48 heures, après quoi les cellules ne se divisent pas mais survivent vivantes pendant environ deuxsemaines. Un tel phénotype non prolifératif peut être utilisé efficacement pour analyser, par exemple, la migration cellulaire par test scratch ou les forces d’adhésion intercellulaires et cellule-matrice 7,37,38. De plus, les cellules issues de souris MG globales peuvent fournir des informations essentielles spécifiques au type cellulaire sur la différenciationrénale 6,7.

Le développement permanent du rein (métanéphros) commence par le processus appelé induction rénale, où les interactions intercurrentes inductives entre le canal de Wolff épithélial (WD, également appelé canal néphrique) et le mésenchyme métanéphrique (MM) induisent la formation du bouton urétérique initial (UB)13,39,40,41. Le MM sécrète des signaux tels que les facteurs de croissance des fibroblastes (FGF) et le facteur neurotrophe dérivé de la lignée cellulaire gliale (GDNF), ce qui fait que les cellules du WD se regroupent d’abord puis dépassent pour former le UB primaire initial, qui envahit le MM 5,40,42,43. Chez la souris, le modèle mammifère le plus courant utilisé pour étudier l’organogenèse, cela se produit au jour embryonnaire 10,5 (E10,5) et chez l’humain vers la semaine gestationnelle 4-5 40,44,45,46.

Le processus d’induction rénale est suivi par le début de la morphogenèse ramifiée de l’UB. Ici, la pointe du bourgeon s’allonge d’abord, puis se gonfle en ampoule pour finalement se bifurquer en une structure en T avec deux nouvelles extrémités (Figure 1)12,37,39,47,48. Les nouvelles pointes UB reçoivent non seulement des indices réglementaires du MM, mais influencent également activement le sort et le comportement du MM 6,42,49. En conséquence, la différenciation de l’épithélium de néphron est induite par chaque extrémité UB (Figure 1). Ainsi, l’étendue de la branche UB détermine le nombre final de néphrones dans le rein. La morphogenèse ramifiée se poursuit avec des cycles itératifs jusqu’à la naissance, mais la majorité des ramifications se produisent sur 10 à 13 cycles, ayant lieu par E15,5 chez la souris, après quoi le taux de formation de nouvelles pointes diminuesignificativement de 30,49. Fait intéressant, la formation de néphrons se poursuit plus longtemps, et la base morphologique et moléculaire de celle-ci commence seulementà être élucidée 50,51,52,53,54.

L’UB est divisé moléculairement et fonctionnellement en deux sous-populations, la pointe et la tige, qui diffèrent par leurs profils d’expression génique et leur capacité de prolifération 12,55,56,57,58,59. La plupart des bifurcations qui engendrent de nouvelles branches se produisent dans les extrémités, tandis que la différenciation a lieu dans la région du tronc où naissent les deux types de cellules ducales collectrices, les cellules principales et intercalées, 11,12,60,61,62. Des études fortement dépendantes des cultures rénales in vitro ont identifié que les pointes UB hébergent une population progénitrice capable de donner naissance à de nouvelles pointes, le tronc, l’uretère et l’ensemble du système de conduitscollecteurs 5,25. Malgré la régionalisation connue des troncs de pointe, les mécanismes qui contrôlent les décisions de différenciation versus auto-renouvellement au sein des progéniteurs de conduits collecteurs sont peu connus. Il est important de noter que l’identité in situ des progéniteurs de conduits collecteurs et les moyens de les identifier ne sontqu’à 37 d’émergence.

La pointe UB constitue une niche fondamentale pour l’établissement du mésenchyme de la capuche, qui constitue le réservoir progéniteur néphron(NP) 13,63. D’un côté, le mésenchyme de la capsule est entouré par l’UB, et de l’autre côté par les progéniteurs stromales donnant naissance aux cellules interstitielles, telles que les péricytes et les cellules mésangiales (Figure 1)27,64,65,66,67,68. Au cours de chaque cycle de branche UB, un sous-ensemble de cellules NP s’auto-renouvelle pour maintenir la population NP, et une autre portion est induite à se différencier en néphronnesfonctionnels 66. On sait beaucoup moins sur le comportement des progéniteurs stromals, qui, bien que persistent autour des cellules NP à la périphérie du rein embryonnaireen croissance 65,69.

Le mésenchyme de la capsule hébergeant les cellules NP est très organisé et dynamique parnature 28,66. Les cellules les plus proches des extrémités sont les véritables progénitrices, tandis que celles un peu plus éloignées, dans les aisselles du bouton T, sont pré-engagées dans la différenciation 18,28,67. Ainsi, la position des cellules NP à l’intérieur du chapeau influence clairement leur destin, tandis que leur comportement dynamique, comme en témoigne leur capacité à migrer dans et hors du compartiment du chapeau, suggère une flexibilité dans les décisions destinées au niveau de la cellule individuelle. Des études comparatives récentes ont établi que les thèmes régulateurs globaux des progéniteurs rénaux sont bien conservés entre la souris et l’humain 18,46,70,71,72, ce qui soutient également l’utilisation future de la culture d’organes.

La différenciation du néphron se produit à proximité immédiate de l’épithélium UB et commence lorsque les signaux provenant de l’UB, et possiblement du strome environnant, induisent les progéniteurs engagés du néphron à former une condensation cellulaire appelée agrégat prétubulaire (Figure 1)13,47. Ce groupe cellulaire subit ensuite une transition mésenchymale vers épithéliale pour former la vésicule rénale, une structure axialement polarisée avec des destins de segments proximaux et distaux de néphron établis. Cela signifie que la position de la cellule dans la vésicule détermine si elle deviendra partie intégrante du corpuscule rénal contenant des podocytes, une touffe glomérulaire et des cellules mésangiales, ou s’incorporera dans les segments plus distaux du tubule convoluté proximal, la boucle descendante de Henle, la boucle ascendante de Henle, la macula dense et le tubule convoluté distal. L’identité finale est déterminée par les signaux complexes émanant de l’UB, du stroma et de la vésicule elle-même, et inclut, par exemple, les voies NOTCH, RHO etWNT 19,21,73,74. La détermination du destin dans la vésicule rénale représente un exemple classique d’interactions inductives tissulaires se produisant dans un organe intact, qui ne peut être étudié sans organisation structurelle 3D.

Depuis la vésicule rénale, la néphrogenèse progresse à travers des étapes morphologiques bien décrites pour former des corps en forme de virgule et de S, où les identités régionales sont renforcées et où d’autres types cellulaires, comme les endothéliums, envahissent en formant des glomérulesen développement 48,75. Enfin, à l’arrêt de l’organogenèse, le réservoir de progéniteurs indifférenciés est utilisé pour fournir la capacité de filtration rénale pour la vie18,67. Les étapes anatomiques et morphologiques de la néphrogenèse, y compris l’innervation, sont bien représentées dans la néphrogenèse in vitro 76,77. Cependant, la vascularisation du rein ne se produit pas dans les systèmes classiques de culture rénale. Cet aspect peut être étudié avec certaines limitations par greffe rénale sur la membrane chorioallantoctoïqueaviaire 78,79.

En plus de la culture d’organes complets, il existe des méthodes pour générer des organoïdes ressemblant à des reins à partir de cellules pluripotentes. Différents protocoles mettant l’accent sur la création de néphronnes 80,81,82,83, bourgeons urétériques 84,85,86, et organoïdes avec des structures d’ordre supérieur 87, ainsi que des tubuloïdes, les cultures 3D du segment de néphron et l’épithélium du canalcollecteur 88,89, exister. Ce sont des outils précieux pour étudier la morphogenèse rénale, par exemple chez l’humain, où une quantité limitée de matière fœtale est disponible. Cependant, les méthodes organoïdes ne peuvent pas récapituler l’organogenèse intacte de la même manière que la culture d’organes in vitro. Dans cet article, nous fournissons des instructions détaillées pour établir des cultures rénales de type Trowell et des colonies cellulaires épithéliales primaires à partir de l’UB. Ces protocoles ont principalement été utilisés pour les reins embryonnaires de souris, mais servent également au développement des reins chez les rats. Nous démontrons que la culture de type Trowell est également efficace pour les reins embryonnaires de la souris épineuse (Acomys dimidiatus) – un modèle de rongeur novateur avec une capacité de régénérationexceptionnelle 90,91,92,93,94. L’avantage de la culture rénale embryonnaire réside dans sa facilité d’installation et son utilisation économique.

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Protocole

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives et réglementations nationales et européennes pertinentes. Le Comité pour les expériences animales de l’Université d’Helsinki a approuvé l’utilisation de rongeurs pour ces expériences sous les licences KEK22-016 (valide : 1.7.2022-30.6.2025) et KEK25-014 (valide : 1.7.2025-30.6.2028).

REMARQUE : Veillez à éliminer tous les objets tranchants et produits chimiques conformément aux directives institutionnelles et aux bonnes pratiques de laboratoire. Les cultures rénales peuvent être établies avec des rudiments rénaux précoces provenant d’embryons de rongeurs. Les étapes typiques de mise en place de la culture rénale sont E11.5 à E13.5. Plus l’orgue est tôt, plus il est difficile de le reconnaître. De plus, les rudiments rénaux très précoces (E10-11) se développent plus faiblement in vitro, car ils ne déclenchent souvent pas la morphogenèse ramifiée de l’UB. En revanche, la complexité de l’arbre épithélial UB augmente avec la croissance des reins, et il devient plus difficile par la suite d’établir des cultures cellulaires UB primaires, car cela nécessite à la fois une reconnaissance visuelle et une séparation soigneuse des extrémités du MM environnant. En fin de compte, la question scientifique abordée déterminera le stade de développement approprié du rein à utiliser dans l’expérience.

1. Culture rénale embryonnaire

  1. Collection de reins embryonnaires
    REMARQUE : Les femelles souris et rats présentent une caractéristique spécifique de la biologie reproductive où elles forment un bouchon vaginal, appelé bouchon, après conception. Le jour du plug vaginal est désigné comme 0,5 jour après la conception, également appelé jour embryonnaire 0,5 (E0,5)95. Après cette phase embryonnaire, les cultures rénales sont généralement établies à E11-12,5 en euthanasiant la souris enceinte, remplissant progressivement la chambre avec du CO2 suivi d’une luxation cervicale.
    1. Vaporisez la peau de l’abdomen avec 70 % d’éthanol (Figure 2A). Ouvrez la peau abdominale et les couches musculaires, localisez l’utérus contenant les embryons (Mus E11.5-E12,5, Acomys E18-E19) (Figure 2B), puis découpez-le. Placez l’utérus avec les embryons dans une boîte de Petri de 100 mm contenant le PBS de Dulbecco.
      REMARQUE : À titre de sécurité, la chambreCO2 doit être placée soit dans la hotte, soit utilisée dans une pièce bien ventilée afin d’éviter tout danger pour les utilisateurs. De plus, l’éthanol est facilement inflammable et ne doit pas être utilisé près d’une source potentielle d’étincelle ou de feu. À titre général, le PBS de Dulbecco est interchangeable avec un milieu indépendant de CO2, où les embryons et tissus sont bien protégés pour un stockage à court et long terme96. N’oubliez pas non plus d’utiliser toujours des outils de dissection propres et stériles pour éviter toute source de contamination.
    2. Maintenez l’utérus avec des pinces et ouvrez simultanément ses couches musculaires en les incisant avec des ciseaux.
    3. Retirez les embryons et arrachez-les des tissus extraembryonnaires et du placenta en tirant doucement avec de fines pinces (Figure 2C). Pour préserver au mieux les tissus, gardez tous les autres embryons sauf celui avec qui travaillent sur la glace pendant l’activité de dissection.
    4. En utilisant des aiguilles comme couteaux chirurgicaux, coupez l’embryon en deux moitiés en diagonale juste sous le foie (Figure 2D). Épargnez plus de tissu du côté dorsal que du côté ventral. Retirez les membres postérieurs, tout morceau résiduel de foie et l’intestin pour mieux observer les reins en développement. Pour faciliter l’orientation, aux stades de développement E11.5-E12.5, les reins sont situés bilatéralement de chaque côté de l’aorte dorsale et de la moelle épinière, ventral au tube neural et à la somite, au niveau des membres postérieurs.
    5. Ensuite, disséquez les reins de la cavité corporelle. Tout d’abord, retirez la peau dorsale et la moelle épinière. Ensuite, tournez l’embryon pour qu’il s’allonge sur le dos et retirez doucement les parois latérales du corps en faisant glisser les aiguilles vers les cavités latérales, tout en coupant soigneusement ces tissus supplémentaires. Les reins sont désormais situés en un seul bloc dans la fine bande de tissu, où le canal de Wolff est d’un côté et le MM de l’autre côté (Figure 2E).
    6. Coupez les tissus supplémentaires des extrémités postérieure et caudale de la bande, puis séparez enfin les deux reins l’un de l’autre en les tranchant entre eux du côté du canal de Wolff. Désormais, les deux reins sont libérés de l’embryon et l’un de l’autre (Figure 2F) et peuvent attendre dans le PBS de Dulbecco pour être placés sur la plaque de culture (1.2.2).
      REMARQUE : Lorsque vous étudiez des reins génétiquement modifiés, traitez toujours les reins par paires pour suivre leur origine et permettre leur génotypage. Cela peut se faire, par exemple, en plaçant les deux reins dans l’un des puits à plaques à 24 puits.
  2. Mise en place d’une culture rénale de type Trowell
    1. Préparez des plats de culture. Placez le filtre Transwell insert de 0,1 μm de pore dans le puits et ajoutez 1,5 mL de milieu de culture (DMEM/F12 complété avec 10 % de FBS, 1x pénicilline-streptomycine (100 U/mL pénicilline, 100 ug/mL de streptomycine) et 1x L-glutamine) au fond du puits (Figure 3A). Les bulles d’air peuvent perturber l’adsorption des nutriments et des réactifs du milieu. Assurez-vous qu’il n’y ait pas de bulles d’air qui pourraient être en contact avec le filtre. Pour faciliter cela, ajoutez le milieu de culture aux plaques Transwell en le pipotetant à travers les petits trous latéraux entre l’insert et la paroi de la vaisselle.
      REMARQUE : Les inserts commerciaux Transwell peuvent être remplacés par des grilles métalliques servant de support pour des pièces de membrane filtrante poreuse (taille des pores 0,1 μm). Avec des filtres supportés par grille, le système de culture peut être établi dans n’importe quel type de plat de culture cellulaire. Notez que les membranes filtrantes poreuses doivent être pré-rincées avec del’H2Odistillé et stockées à 70 % d’EtOH avant utilisation. Pour établir le système de culture, rincez bien les filtres avec del’H2Odistillé ou du PBS de Dulbecco et placez soit tout le filtre entier, soit de plus petites pièces découpées sur la grille. Utilisez un média juste assez pour qu’il soit en contact avec le filtre sans le couvrir. Cela garantira une bonne fixation du mouchoir pour éviter qu’il ne s’envole.
    2. Utilisez le capillaire ou une très petite pipette (0,5 à 10 μL) pour placer un rein à la fois sur le filtre (Figure 3B). Évitez l’excès de liquide lors de la pose du rein, et éliminez tout liquide visible autour du rein en le suçant doucement avec un capillaire. Évitez de frapper le mouchoir.
      REMARQUE : Il est extrêmement important de placer les reins sur un filtre dans un ordre précis lors de l’établissement de cultures rénales provenant des lignées de souris GM, car les informations sur le génotype au moment de la mise en place de la culture font défaut. L’ordre numéroté des reins sur le filtre permet leur reconnaissance pendant et après la culture. Avec les inserts Transwell en rotation libre, utilisez des marques sur le dessus du couvercle mais aussi sur les côtés de la plaque pour éviter de perdre l’orientation si l’insert Transwell tourne.
    3. Placez le(s) plat(s) de culture contenant les explantes rénales dans l’incubateur avec une température de +37 °C et 5 % deCO2 pour la culture du temps souhaité (Figure 3B).

2. Établissement de cultures épithéliales primaires de bourgeons utéraires

  1. Isolement des bourgeons utéraires et mise en place de la culture cellulaire
    1. Collectez les reins comme décrit à l’étape 1.1.
    2. Incubez les reins dans 4 mg/mL de collagénase dans D-MEM/F12 complétée avec un sérum fœtal de veau dépouillé à 10 % pendant 15 minutes à +37 °C. Pour épargner l’enzyme, pipettez une petite quantité (1 à 2 mL) de collagénase sur un plat sec et propre de 30 mm afin qu’elle forme une belle goutte et préchauffez à 37 °C. Ajoutez et retirez les reins à l’aide d’un capillaire en verre pour le traitement. Lorsqu’on utilise le traitement à la collagénase sur des plaques à 24 pouts, il est plus sûr d’ajouter et de retirer la solution plutôt que de déplacer les reins, qui deviennent collants lors de ce traitement.
    3. Arrêtez la fonction collagénase en ajoutant 25 U/mL de DNase dans DMEM/F12 + 10 % de FBS. Laissez les reins reposer 10 à 15 minutes sur la glace.
    4. Découple mécaniquement l’UB du MM. Pour cela, utilisez des aiguilles (par exemple, 26 G) pour gratter doucement le mésenchyme environnant. Pour l’isolement réussi des UB, il est extrêmement important de comprendre la morphologie précise du rein précoce, et surtout où se situe l’UB à l’intérieur du MM. Le UB est plus clairement visible dans les reins à stade précoce, où le MM n’est pas épais et le recouvre sous plusieurs angles. L’épithélium UB apparaît sous forme de tube creux en forme de bourgeon ou de bourgeon en T à E11-11,5, et la forme se répète à des stades ultérieurs mais sous une forme plus complexe.
      1. Commencez l’isolement de l’UB en pénétrant le mésenchyme avec des aiguilles à la zone de la tige du bourgeon. Retirez le MM en le repoussant, en partant de la tige et en allant vers les extrémités. La tige serait près du conduit de Wolff aux reins E11,5 et du côté médullaire aux reins E12,5. Comme l’arbre UB E12.5 est plus complexe en 3D, il peut être plus accessible et donc plus facile à atteindre depuis les extrémités que depuis la tige. Il est possible d’établir une culture cellulaire primaire UB uniquement à partir des pointes. Notamment, cela génère moins de cellules et est donc recommandé uniquement pour les reins E11.5 ou plus anciens.
        REMARQUE : Pour permettre des comparaisons, le nombre d’UB ou la quantité relative d’épithélium UB utilisée pour préparer la culture cellulaire primaire doit être aussi proche que possible de la même entre différents échantillons et/ou traitements. Cela établit des cultures comparables pour tout type d’analyse en aval.
    5. Ajoutez 0,5 à 0,75 mL de milieu de culture (DMEM/F12 complété avec 10 % de FBS, 1 x pénicilline-streptomycine et 1 x L-glutamine) complétés à l’avance avec GDNF (5 ng/mL), FGF2 (25 ng/mL) et HGF (50 ng/mL) sur la plaque de culture recouverte de fibronectine. Ensuite, placez les UB isolés au centre du puits recouvert de fibronectine (Figure 4A). Tous les bourgeons doivent être proches les uns des autres pour former une culture monocouche unique.
      REMARQUE : Des plaques prêtes à l’emploi recouvertes de fibronectine sont disponibles dans le commerce. Ces assiettes doivent être préchauffées au moins 30 minutes avant utilisation. Cependant, un revêtement interne avec de la fibronectine est une option moins coûteuse. Les plaques (ou lâches de verre, idéales pour l’imagerie) sont incubées avec 10 mg/mL de fibronectine pendant 1 h à température ambiante / 30 minutes à 37 °C. Pour éliminer l’excès de fibronectine, lavez avec un BSA à 0,2 % 3x 15 min à 37 °C, puis ajoutez un substrat de culture pour que les plaques soient prêtes à l’emploi.
    6. Placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire avec beaucoup plus de précaution pour ne pas déplacer les UB qui flottent facilement dans le puits. Soyez extrêmement prudent lorsque vous déplacez les plaques après que les UB ont été placées dans les puits. Adhérer les tissus/cellules à la fibronectine prend quelques heures, et tout mouvement brusque peut donc pousser les UB à flotter tout autour de la plaque. Cela peut provoquer la propagation des UB vers les bords de la plaque, ce qui n’est pas optimal pour documenter leur croissance et leur comportement pendant l’expérience.
    7. Laissez les UB s’installer et s’y accrocher. Au cours d’une culture de 42 à 48 heures, ils forment une monocouche (Figure 4B). Pour avoir une idée de l’endroit où les UB se déposent dans le puits, les cultures peuvent être surveillées une fois par jour pendant les 48 premières heures. Si les UB proviennent de milieux génétiques différents, il peut être utile de documenter leur processus de délamination par imagerie en accéléré afin d’estimer les différences possibles dans les propriétés adhésives ou la capacité de formation de monocouches.

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Résultats

La méthode de culture rénale ex vivo peut être utilisée pour répondre à un large éventail de questions de recherche liées au développement rénal, et le résultat de chaque expérience dépend de la configuration expérimentale. Cependant, avec l’utilisation d’échantillons témoins appropriés, il est important de s’assurer que les conditions de culture elles-mêmes n’affectent pas le développement. Idéalement, les échantillons témoins ex vivo reproduisent le développement rénal in vivo. La souris dome...

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Discussion

Le rein est un organe vital avec des fonctions importantes de filtration sanguine et d’équilibrage des fluides corporels. La base de la capacité fonctionnelle rénale se construit pendant la vie fœtale, lorsque tous les néphrons à vie sontformés 44,51,97. La compréhension à la fois de la croissance rénale par morphogenèse ramifiée et de la différenciation du néphron en soi a largement bé...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions Mme Agnés Viherä pour son aide technique experte dans toutes nos cultures de cellules rénales et épithéliales de l’UB. Les animaux étaient hébergés au Centre des animaux de laboratoire de l’Université d’Helsinki. Le travail a reçu un financement de la Fondation Aamu Pediatric Cancer ; HiLIFE et iCANDOC à l’Université d’Helsinki ; Fondation Väre pour le cancer pour enfants, Liv och hälsä et Perklén Foundations.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10X PBSLonza Biosciences512261X solution pour l’utilisation
Seringues de 1 mlThermo Fisher Scientific10564431
Aiguilles d’injection jetables de 23 à 25 GThermo Fisher Scientific10482792
Plaques à 24 puitsGreiner662160
Plaques CellStar à 6 puits   ;MerckM8562
70 % d’éthanol (EtOH), dilué dans du MilliQ-H2OTout fournisseur commercialUtilisé pour stériliser les surfaces et la peau
Albumine sérique bovine (BSA)Thermo FisherB14Concentration finale de 0,2 %
Colagnase & nbsp ;Invitrogen17018029Bouillon de 200 mg/ml dans PBS
DMEM/F12  ;Thermo Fisher31331028
DnaseFisher10649890
Micro distributeur Drummond Wiretrol II, 10-20 & micro ; lPipettes transcatDRMC064
Dulbecco » s PBS (avec Ca2+ et Mg2+)Thermo Fisher Scientific14040117Dulbecco » s PBS est interchangeable avec le milieu indépendant CO2 (Gibco/ThermoFisher), où les embryons et tissus sont bien protégés pour un stockage à court et long terme.  ;
E11.5 - Embryons de souris E12.5Tout éleveur commercial / propriétaire du bétailhttps://janvier-labs.com/en/Les embryons de souris sont généralement produits par plombage interne. Le jour où le plug vaginal apparaît est E0,5. Commercial & nbsp ; Des souris femelles avec prégrancies temporisées sont également disponibles.
Embryons de souris épineuses E18-19N/AN/AAlternative correspondante pour les embryons de souris.  ;
Sérum fœtal bovin (FBS)GibcoA5256801
FibronectineNovus Biologicals1030-FN-05M1 mg/ml de bouillon
Des vaisselles en verre ou en plastique (100mm, 60mm et 30mm).Gibco150476, 174888, 153066
GlutaMAXGibco35050061
Facteur de croissance des fibroblastes recombinants humains (rFGF2)PeproTech100-18B
Facteur neurotrophique dérivé de la lignée cellulaire gliale recombinante humaine (rGDNF)R& D212-GD-010/CF
Facteur de croissance hépatocytaire recombinant humain (rHGF)PeproTech100-39
Pénicilline-streptomycineGibco15140122
Petits ciseaux et pinces fines   ;Outils scientifiques finement14040-10, 11254-20N’utilisez que des outils de dissection propres et stériles pour éviter toute source de contamination.
StéréomicroscopeLeica MZ7.5 ou Olympus SZ x9https://www.leica-microsystems.com/
Supports perméables Transwell, inserts 24 mm   ;Fisher10619141

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