Pharmacologie en réseau et étude expérimentale sur cellules in vitro pour explorer le potentiel thérapeutique des dérivés de thiazolone dans le rhabdomyosarcome

Résumé

Nous présentons une étude qui étudie systématiquement le potentiel thérapeutique des dérivés de thiazolone contre le rhabdomyosarcome sur la base de la pharmacologie de réseau et de la chimie computationnelle, avec une validation et une évaluation effectuées par des expériences cellulaires in vitro .

Résumé

Le rhabdomyosarcome (DR) est une tumeur maligne provenant des rhabdomyoblastes, qui constitue une menace sérieuse pour la santé des enfants et des adolescents. Basée sur le potentiel des dérivés de thiazolone dans une variété d’activités biologiques, cette étude vise à explorer systématiquement les mécanismes des dérivés de thiazolone dans le traitement de la DR en combinant la pharmacologie en réseau et les expériences cellulaires in vitro . Grâce à la pharmacologie en réseau, des données à haut débit ont été intégrées pour prédire les cibles potentielles de la thiazolone. De plus, le logiciel AutoDock Vina a été utilisé pour calculer l’énergie de liaison du composé et de la molécule protéique cible, révélant ainsi sa voie de signalisation liée à la DR. Enfin, des expériences cellulaires in vitro ont permis de vérifier l’effet suppresseur de tumeurs des composés. La pharmacologie en réseau a été utilisée pour analyser les cibles des dérivés de thiazolone dans le traitement de la DR, et 172 gènes cibles ont finalement été obtenus par combinaison et déduplication. Cinq cibles protéiques à faible énergie de liaison ont été criblées par amarrage entre le composé et la molécule protéique cible, PIK3CD, AKT1, GSK3B, HSP90AB1 et ITGB1. Les résultats d’expériences de culture cellulaire in vitro ont montré qu’un dérivé spécifique de thiazolone avait un effet inhibiteur significatif sur les lignées cellulaires de DR, fournissant une base scientifique pour la découverte de nouvelles cibles et de composés efficaces pour le traitement de la DR. Cette étude a révélé les mécanismes des dérivés de thiazolone dans le traitement de la DR grâce à une combinaison de pharmacologie en réseau et d’expériences in vitro et a fourni une nouvelle perspective pour le développement de médicaments futurs et les stratégies de traitement.

Introduction

Le rhabdomyosarcome (DR), un sarcome des tissus mous pédiatriques très agressif qui représente une menace importante pour la santé pédiatrique, avec des options thérapeutiques limitées. Des études épidémiologiques indiquent que si la DR présente des taux d’incidence relativement faibles, sa malignité élevée et son mauvais pronostic présentent des défis cliniques importants. La RD est classée en quatre sous-types histologiques distincts : embryonnaire, alvéolaire, fusiforme/sclérosante et pléomorphe, le rhabdomyosarcome embryonnaire (ERMS) étant^{la forme la} plus répandue ^1,2,3. Les stratégies thérapeutiques actuelles pour les patients ERMS à faible risque nouvellement diagnostiqués impliquent principalement la résection chirurgicale de tumeurs localisées associée à des agents chimiothérapeutiques, notamment la vincristine, la dactinomycine et le cyclophosphamide. Les patients à haut risque reçoivent généralement des régimes de chimiothérapie multi-agents intensifiés incorporant de l’ifosfamide et de l’étoposide ^4,5. Bien que l’approche multimodale combinant la chirurgie, la chimiothérapie et la radiothérapie ait démontré son efficacité dans le contrôle local des tumeurs et l’éradication des micrométastases⁵, des défis importants subsistent. Les profils toxicologiques substantiels des agents chimiothérapeutiques actuels, y compris la neurotoxicité et les lésions rénales et vésicales irréversibles⁶, présentent des risques particuliers pour les patients pédiatriques et adolescents. De plus, l’hétérogénéité inhérente à la DR et sa propension à la rechute soulignent la nécessité cruciale de développer des agents thérapeutiques plus efficaces et ciblés⁷.

Dans ce contexte, la recherche se concentre ici sur une classe de dérivés de thiazolone ayant des propriétés pharmacologiques distinctes. Les dérivés de thiazolone présentent des activités anti-inflammatoires, antioxydantes et régulatrices de l’apoptose^{significatives 8}, démontrant une large activité biologique et un potentiel prometteur pour le développement de médicaments ^9,10. Les simulations d’amarrage moléculaire par Elgubbi et al. ont révélé de fortes affinités de liaison des dérivés de thiazolone à des cibles clés telles que l’anhydrase carbonique humaine IX (CA IX), une enzyme induite par l’hypoxie surexprimée dans les tumeurs agressives, suggérant un mécanisme pour leurs effets antiprolifératifs¹¹. L’étude computationnelle élucide les interactions moléculaires entre les dérivés de thiazolone et les protéines associées au cancer. En 2024, El-Helw et al. ont rapporté que les dérivés de thiazolone à base de benzoquinoléine présentent une activité puissante contre les lignées cellulaires cancéreuses, le thiazoléthione et les analogues du thiazole démontrant l’efficacité la plus élevée¹². Des études mécanistes^{suggèrent que ces} composés perturbent la viabilité des cellules tumorales par deux voies : (1) l’induction du stress oxydatif par la modulation de la voie antioxydante et (2) l’inhibition directe de la prolifération. Ces résultats ont mis en évidence le profil pharmacologique général des thiazolones, y compris les propriétés anti-inflammatoires et antimicrobiennes. Notamment, des composés tels que la pioglitazone¹⁴ et la troglitazone¹⁵ sont principalement utilisés dans le traitement du diabète de type 2¹⁶, tandis que les dérivés de la 4-thiazolone présentent des effets anti-prolifératifs contre les cellules leucémiques¹⁷ (Figure 1). Ces composés démontrent non seulement des promesses thérapeutiques significatives dans les études cliniques, mais ciblent également spécifiquement plusieurs voies de signalisation cellulaire, notamment l’inhibition de la prolifération des cellules tumorales, l’induction de l’apoptose et la régulation du cycle cellulaire. Les mécanismes anticancéreux des dérivés de la thiazolone impliquent plusieurs voies de signalisation qui entravent efficacement la croissance et la survie des cellules tumorales en modulant les voies critiques, telles que les voies PI3K/Akt et NF-κB. De plus, les dérivés de thiazolone ont également montré des effets régulateurs sur le microenvironnement tumoral, y compris l’inhibition de l’angiogenèse et la modulation des réponses immunitaires¹⁸. Les actions mécanistes à multiples facettes des dérivés de la thiazolone les positionnent comme des candidats idéaux pour le développement de nouvelles thérapies contre le cancer.

Dans des recherches antérieures, nous avons construit efficacement des dérivés de thiazolone avec des centres chiraux adjacents grâce à une réaction de propargylation asymétrique distale catalysée par le cuivre. En utilisant des esters de propargyle et des thiazolones comme substrats, la réaction a été catalysée par CuI en présence d’un ligand de pyridine bis(oxazoline) substitué par phényle. En optimisant les conditions de réaction, nous avons atteint une grande efficacité dans la synthèse de ces dérivés de thiazolones¹⁹. La pharmacologie en réseau, en tant qu’approche de biologie des systèmes, révèle des interactions complexes entre les médicaments, les cibles et les voies de la maladie, révolutionnant la compréhension et le développement de thérapies pour des maladies complexes comme le cancer²⁰. Cette étude vise à titre préliminaire à révéler la valeur thérapeutique potentielle de nouveaux dérivés de thiazolone dans le traitement de la DR. Grâce à la pharmacologie en réseau intégré et aux expériences cellulaires, des composés ayant une activité supérieure seront identifiés, qui peuvent exercer des effets thérapeutiques multicibles en régulant de manière coordonnée cinq cibles principales, dont PIK3CD et AKT1, influençant ainsi les voies de signalisation clés telles que PI3K-Akt. Des simulations d’amarrage moléculaire et de dynamique moléculaire seront utilisées pour démontrer les caractéristiques de liaison entre le composé et les protéines cibles. De plus, un modèle préliminaire de relation structure-activité sera établi, fournissant une référence pour l’optimisation structurelle ultérieure. Ces travaux offrent non seulement de nouvelles molécules candidates pour le développement de médicaments contre le rhabdomyosarcome, mais mettent également en évidence le rôle positif des stratégies multidisciplinaires dans l’exploration des mécanismes thérapeutiques multicibles des médicaments.

Protocole

Toutes les procédures de pharmacologie du réseau ont été effectuées conformément aux Lignes directrices pour les méthodes d’évaluation de la pharmacologie du réseau²¹. Le flux de travail complet de pharmacologie en réseau adopté dans cette étude est illustré schématiquement à la figure 2.

Synthèse de dérivés de thiazolone
Les dérivés de thiazolone dans cette étude ont été synthétisés dans nos travaux précédents¹⁹, par une réaction de propargylation asymétrique à distance catalysée par le cuivre. La réaction a utilisé CuI comme catalyseur et un ligand chiral Pybox (L1) comme noyau de stéréocontrôle, dans un système de base DIPEA et de solvant de méthanol à -10 °C pendant 48 h, obtenant un couplage énantiosélectif élevé entre les esters de propargyle et les thiazolones. Le produit cible a été obtenu avec un rendement allant jusqu’à 89 %, un rapport énantiomérique (re) de 97,8:2,2 et un rapport diastéréoisomérique (dr) de 17,8:1. Pour des informations détaillées sur les méthodes de synthèse de cette série de composés, veuillez vous référer aux études précédentes¹⁹. Cette méthode a démontré une large applicabilité de substrat, accueillant des aryles (ortho-, méta-, para-substituants), des chaînes aliphatiques et des esters de propargyle à cycle fondu, ainsi que divers thiazolones substitués, avec des rendements allant de 51 % à 98 %. Cette stratégie construit pour la première fois efficacement des cadres de thiazolone multi-chiraux dans un processus en une seule étape, offrant une approche hautement sélective et simple pour la synthèse de molécules médicamenteuses chirales avec des applications potentielles significatives en chimie médicinale.

Prédiction pharmacologique en réseau
Prédiction cible du dérivé du thiazolone : Les représentations structurelles des dérivés du thiazolone ont été générées à l’aide du logiciel KingDraw, et les fichiers structurels correspondants ont ensuite été convertis en SMILES ID via le logiciel Open Babel. Pour prédire les cibles thérapeutiques potentielles contre la DR, nous avons utilisé une approche computationnelle complète utilisant trois bases de données distinctes de prédiction de cibles : SwissTargetPrediction (http://swisstargetprediction.ch/), TargetNet (http://targetnet.scbdd.com) et SuperPred (https://prediction.charite.de). Pour l’analyse TargetNet, nous avons mis en place un critère de filtrage strict en sélectionnant des gènes dont la probabilité > 0. Dans la base de données SuperPred, nous avons appliqué des paramètres de sélection plus rigoureux, en ne retenant que les gènes présentant une précision du modèle > 90 % et une probabilité > 60 %, garantissant des prédictions cibles à haut niveau de confiance.

Prédiction des cibles de RD : Sur la base de la base de données GeneCards (https://www.genecards.org/) et de la base de données OMIM (https://omim.org/), nous avons effectué une recherche de rhabdomyosarcome. Pour les données provenant de la base de données GeneCards, nous avons filtré les résultats avec un score supérieur à 20 pour obtenir les gènes associés au rhabdomyosarcome.

Construction et analyse de réseaux d’interaction protéine-protéine (IPP) : Les cibles potentielles des dérivés de thiazolone et les gènes associés à la DR ont été recoupés. Les cibles potentielles pour le traitement du rhabdomyosarcome embryonnaire humain par des dérivés de thiazolones ont été téléchargées dans la base de données STRING (https://www.string-db.org/) pour l’analyse de la relation IPP (interaction protéine-protéine) cible à haut niveau de confiance. Le réseau PPI a été construit dans le logiciel Cytoscape (http://www.cytoscape.org/), et les cibles principales ont été sélectionnées en fonction des valeurs de degrés.

Construction d’un réseau de voies composé-maladie-cible : Le réseau de voies médicament-cible peut voir clairement les cibles des composés et des maladies et les voies impliquées dans ces cibles, afin d’identifier les cibles clés et les voies possibles pour la thérapie composée pour la DR. Tout d’abord, créez la table de réseau et la table attributaire dans la feuille de calcul. Le contenu de la table du réseau comprend principalement la correspondance entre le composé et la cible principale, la correspondance entre la cible principale et la voie impliquée, et la correspondance entre RD et la voie principale. Le contenu de la table attributaire consiste principalement à classer et à nommer toutes les informations de la table du réseau. Après cela, ouvrez le logiciel Cytoscape, téléchargez la netlist à l’emplacement de chargement, définissez le point de départ, le point d’arrivée, téléchargez la table attributaire et enfin modifiez la forme de l’image.

Annotation fonctionnelle intégrée et analyse pharmacologique en réseau - Construction Gene Ontology (GO) Enrichment, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) : L’analyse de l’enrichissement GO et KEGG des cibles principales a été réalisée par la base de données DAVID (https://david.ncifcrf.gov/). Selon l’ordre de la valeur P de petit à grand, les 10 principaux éléments du processus biologique (BP), du composant cellulaire (CC) et de la fonction moléculaire (MF) dans GO ont été sélectionnés pour l’analyse, et les 20 principaux éléments de KEGG ont été analysés, et les cartes à bulles GO et KEGG des cibles principales ont été créées sur la base de la plateforme de micro-bioinformation en ligne.

Amarrage moléculaire : Les protéines cibles du noyau ont été sélectionnées à partir de la base de données PDB (https://www.rcsb.org/), et les fichiers structurels des cibles du cœur ont été téléchargés. Initialement, les protéines ont été déshydratées à l’aide du logiciel PyMol, puis séparées des ligands et des récepteurs. Par la suite, les protéines ont été hydrogénées à l’aide du logiciel ADFRSuite, et les paramètres de la boîte de grille pour le logiciel d’amarrage moléculaire AutoDock ont été obtenus. Les fichiers pdbqt des dérivés de la thiazolidinone et des protéines cibles centrales ont été préparés à l’aide du logiciel AutoDock Vina. Des simulations d’amarrage moléculaire de dérivés de thiazolones et de protéines cibles centrales ont ensuite été réalisées. Enfin, les modèles d’amarrage moléculaire ont été visualisés à l’aide du logiciel PyMol.

Simulation de dynamique moléculaire : Le fichier PDB a été converti au format GRO compatible GROMACS en utilisant le champ de force amber99sb-ildn et le modèle d’eau TIP3P :
gmx pdb2gmx -f Pro.pdb -o Pro_temp_H.gro -ff amber99sb-ildn -water tip3p -ignh
Une boîte de délimitation périodique cubique a été ajoutée à une distance de 1,2 nm de la protéine :
gmx editconf -f Pro_temp_H.gro -o Pro_temp_H_box.gro -c -d 1.2 -bt cubique
La boîte était remplie de molécules d’eau TIP3P :
gmx solvate -cp Pro_temp_H_box.gro -o Pro_temp_H_box_water.gro -p topol.top
Le système a été neutralisé par l’ajout de nions :
gmx grompp -f ions.mdp -c Pro_temp_H_box_water.gro -p topol.top -ions.tpr
gmx genion -s ions.tpr -o Pro_temp_H_box_water_ion.gro -p topol.top -neutre
La minimisation de l’énergie a été effectuée :
gmx grompp -f minim.mdp -c Pro_temp_H_box_water_ion.gro -p topol.top -o em.tpr
gmx mdrun -v -deffnm em
L’équilibrage NVT a été effectué :
gmx grompp -f nvt.mdp -c em.gro -r em.gro -p topol.top -o nvt.tpr
gmx mdrun -deffnm nvt -v
L’équilibrage du TNP a été effectué :
gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -r nvt.gro -t nvt.cpt -p topol.top -o npt.tpr
gmx mdrun -deffnm npt -v
La simulation de la dynamique moléculaire de production a été initiée :
gmx grompp -f md.mdp -c npt.gro -t npt.cpt -p topol.top -o md_0_1.tpr
gmx mdrun -deffnm md_0_1 -v

Une fois les simulations terminées, les trajectoires résultantes ont été analysées à l’aide de la dynamique moléculaire visuelle (VMD) et de PyMOL, et l’analyse de l’énergie libre de liaison entre les protéines et les ligands de petites molécules a été effectuée à l’aide du programme g_mmpbsa.

Évaluation des effets des médicaments sur la viabilité des cellules de DR
Les cellules RD (cellule embryonnaire de rhabdomyosarcome ; STR Authenticated) dans la phase de croissance logarithmique ont été trypsinisés pour créer une suspension cellulaire à une concentration de 1 x10⁵ cellules/mL. Cette suspension a ensuite été ensemencée dans une plaque de 96 puits à une densité de 1 x 10⁴ cellules/puits (100 μL par puits) et incubée à 37 °C avec 5 % de CO₂ pour permettre l’adhésion cellulaire. Après l’adhésion, le milieu a été remplacé par 100 μL de milieu sans sérum contenant 1 % de FBS, et les cellules ont été affamées pendant 12 h. Ensuite, le milieu a été remplacé par 100 μL du milieu respectif contenant des concentrations variables de la substance d’essai. Les puits témoins ont été traités avec un milieu contenant du solvant ou un milieu normal, et les puits vierges contenant uniquement le milieu correspondant sans cellules ont été inclus. Les plaques ont été incubées à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 24 h (la durée a été déterminée par des expériences préliminaires comme étant optimale pour observer l’effet inhibiteur maximal de cette classe de composés sur les cellules RD. C’est-à-dire le temps nécessaire pour que la valeur OD de la densité cellulaire atteigne environ 1,0.). Par la suite, 10 μL de solution de CCK-8 ont été ajoutés à chaque puits, et les plaques ont été incubées pendant 1 à 4 h supplémentaires. Enfin, l’absorbance à 450 nm a été mesurée à l’aide d’un lecteur de microplaques. Les cellules traitées au solvant ont servi de groupe témoin, et les puits vierges ont été utilisés pour la correction de la ligne de base. La viabilité cellulaire a été calculée sur la base des lectures d’absorbance.

Taux de survie % = [(groupe témoin-blanc)-(groupe expérimental-blanc)]/(groupe témoin-blanc) x 100 %

Résultats

Dans cette étude, 13 dérivés de thiazolone (composés a-m ; Figure 3, Figure 4) ont été préalablement synthétisés,¹⁹ ont été sélectionnés pour l’évaluation de leur activité inhibitrice contre les cellules cancéreuses (Figure 5). Parmi ces composés, le composé m à 100 μM a montré le taux d’inhibition le plus élevé contre les cellules RD (cellule de rhabdomyosarcome embryonnaire) (STR authentifiée)

Discussion

La pharmacologie en réseau est couramment utilisée pour prédire et cribler des molécules actives potentielles dans des composants complexes de la médecine traditionnelle chinoise, et pour élucider les mécanismes synergiques des actions multi-composants, multi-cibles et multi-voies dans les formulations à base de plantes. Dans cette étude, nous avons appliqué une approche de pharmacologie en réseau pour étudier systématiquement le mécanisme potentiel de notre dérivé thiazolone nouvellemen...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kit d’analyse CCK-8	Beyotime Biotechnology Co., Ltd.	C0038	Un kit utilisé pour mesurer la viabilité et la prolifération cellulaires basé sur la réduction d’un sel tétrazolium soluble dans l’eau pour former un produit coloré.
Développé propre	Suzhou Antai Airtech Co., Ltd	SW-CJ-1FD	Une station de travail à flux d’air laminaire qui offre un environnement stérile pour la manipulation de cultures cellulaires et d’autres matériaux sensibles.
Incubateur CO2	Force de guérison	HF90	Un environnement contrôlé par la température, l’humidité et le CO2 sont utilisés pour la culture cellulaire afin de maintenir des conditions de croissance optimales.
DMEM Glucose élevé	Cytiva	SH30022.01	Un milieu de culture cellulaire avec une forte concentration de glucose (4,5 g/L), adapté à une variété de types cellulaires, y compris les cellules de mammifères à croissance rapide.
FBS	YEASEN	40130ES76	Un complément courant dans les milieux de culture cellulaire, fournissant des facteurs de croissance essentiels, des hormones et des nutriments pour la prolifération cellulaire.
Microscope inversé	OLYMPE	IX51	Un microscope conçu avec la lentille objective sous la scène, permettant d’observer les cultures cellulaires dans des flasques ou plaques depuis le dessous.
Lecteur de microplaques	Diatek	DR-200B	Un instrument utilisé pour détecter des événements biologiques, chimiques ou physiques dans des échantillons de microplaques en mesurant l’absorbance, la fluorescence ou la luminescence.
PBS	Jinuo Biomedical Technology Co., Ltd.	GNM20012	Une solution tampon est couramment utilisée en recherche biologique pour laver les cellules, diluer les solutions et maintenir la stabilité du pH.
RD (Cellule du rhabdomyosarcome embryonnaire) (STR authentifiée)	Shanghai FuHeng Biotechnology Co., Ltd.	FH0712	La lignée cellulaire a été authentifiée par analyse en tandem court (STR), possède un fond génétique bien défini et une identité cellulaire claire, garantissant ainsi la fiabilité et la reproductibilité des données expérimentales.
RMPI Moyen Modifié (1640)	Cytiva	SH30809.01	Un milieu de culture cellulaire largement utilisé, initialement développé pour les cellules leucocytaires humaines, est désormais appliqué à divers types cellulaires de mammifères.
Trypsine-EDTA	Jinuo Biomedical Technology Co., Ltd.	GNM25200	Une solution utilisée pour détacher les cellules adhérentes des surfaces de culture en digérant des protéines extracellulaires et en chélant les ions calcium.