Purification efficace des polypeptides de type élastine (ELP) à partir d’E. coli en utilisant une méthode d’extraction et de précipitation à base de solvant organique

Summary

Ce protocole décrit une méthode rapide et reproductible d’extraction et de précipitation à base de solvant organique pour purifier un polypeptide de type élastine (ELP) à partir d’Escherichia coli, offrant une alternative potentiellement évolutive aux méthodes conventionnelles de purification ELP.

Abstract

Les polypeptides de type élastine (ELP) sont des biopolymères conçus à partir de séquences répétitives de pentapeptides qui imitent des motifs trouvés dans la tropoélastine des mammifères. Leurs caractéristiques uniques en font des candidats idéaux pour un large éventail d’applications biomédicales, allant de la délivrance de médicaments et de gènes à l’ingénierie tissulaire et à l’imagerie moléculaire ciblée. Les approches de purification conventionnelles à partir de l’expression d’Escherichia coli (E. coli) peuvent être inefficaces pour l’ELP en raison de la formation de corps d’inclusion. D’autres méthodes, telles que le cycle inverse de transition (ITC), utilisent les propriétés de température critique de solution (LCST) plus basse de l’ELP pour la séparer des contaminants tels que les lipopolysaccharides (LPS), mais nécessitent généralement plusieurs étapes de chauffage et de refroidissement qui prennent du temps et peuvent entraîner de faibles récupérations selon la séquence, la concentration et le poids moléculaire du construct ELP. Pour relever ces défis, nous avons développé un flux de travail d’extraction-précipitation à base de solvant organique qui exploite l’hydrophobie intrinsèque de l’ELP afin de permettre une purification rapide, robuste et largement applicable directement à partir de granulés de cellules d’E. coli. Cette méthode utilise des solvants organiques polaires pour aider à la perturbation cellulaire et solubiliser sélectivement l’ELP en une seule étape. Une étape de précipitation ultérieure élimine efficacement les solvants organiques résiduels, les impuretés de faible poids moléculaire et les endotoxines, produisant un ELP très pur avec des niveaux de LPS inférieurs à 1 EU/mL en moins de 3 heures. Les données de microscopie à force atomique suggèrent que les protéines de fusion ELP-purifiées de cette manière peuvent s’auto-assembler en structures inversées de type micelle qui conservent la fonction des protéines de fusion. Cette méthode de purification rapide offre aux chercheurs un moyen simple et potentiellement évolutif de purifier l’ELP, créant de nouvelles possibilités pour utiliser l’ELP et leurs protéines de fusion comme blocs de construction flexibles pour des applications matérielles et biomédicales.

Introduction

Les polypeptides de type élastine (ELP) sont des biopolymères composés de motifs répétitifs (VPGXG)ⁿ 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Le résidu invité X dans l’unité pentapeptidique peut être n’importe quel acide aminé autre que la proline. Les variations de X peuvent être utilisées pour ajuster l’hydrophobie, le comportement de transition thermique ....

Protocol

1. Préparation des matériaux

1. Souche bactérienne : Utilisez des cellules chimiquement compétentes en Escherichia coli BL21(DE3) comme hôte d’expression.
   REMARQUE : Ils ont été sélectionnés en raison de leur grande efficacité de transformation et de leur adéquation à la production de protéines recombinantes.
2. Plasmide d’expression : Utilisez le vecteur pET21(+) codant pour la protéine de fusion ELP-I-Cm2 avec une ampicilline^{résistante 9}. Achetez le vecteur plasmidique chez addgene. Insérez le gène Cm2 à l’aide du site BsrG I à l’extrémité de l’inteine.
   REMARQUE....

Results

Après avoir parcouru les phases finales du protocole, l’étape suivante consiste à visualiser le résultat extraction-précipitation par analyse SDS-PAGE et coloration bleue de Coomassie. Lorsqu’il y a une étape de lyse avant l’extraction organique, une bande ELP proéminente doit être visible. Dans le cas de l’ELP-I-Cm2, cette bande apparaît à 100 kDa (Figure 3A).

Le criblage de différentes combinaisons de solvants organiques a démon.......

Discussion

L’ITC a déjà été utilisé pour la purification non chromatographique de^{l’ELP 19} ; cependant, cela peut être une méthode longue et à faible rendement. Dans les méthodes détaillées ci-dessus, nous décrivons une approche pour la purification rapide d’une protéine de fusion ELP-I-Cm2, démontrant comment la méthode d’extraction-précipité à base de solvant organique peut être utilisée efficacement pour purifier une grande variété de fusions ELP et ELP. Le protocole du so.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoéthanol	Bio-Rad	161-0710	Composant SDS-PAGE
30 % d’acrylamide/bis-acrylamide	TCI	A3218	Composant SDS-PAGE
Acétone	Fisher Scientific	A949	Solvant organique
Acétonitrile	Fisher Scientific	A996	Solvant organique
Ampiciline	Bio-Biotechnologie de l’or	A-301-25	Antibiotique
APS (Persulfate d’ammonium)	Bio-Rad	1610700	Composant SDS-PAGE
Butanol	Fisher Scientific	L13171	Solvant organique
EDTA	Bioréactifs de Fisher	BP118-500	Composant tampon de lyse
Éthanol	Laboratoires de décontamination	UN1170	Solvant organique
Acétate d’éthyle	Fisher Scientific	E195	Solvant organique
Glycérol	Produits de recherche International	G22020-0.5	Composant média Terrific Broth (TB)
Acide chlorhydrique	Fisher Scientific	A144SI-212	Composant tampon de lyse
Coloration instantanée de Coomasie	Abcam	ab119211	Composant SDS-PAGE
IPTG	Bio-Biotechnologie de l’or	12481C25	Composante d’expression protéique
Isopropanol	Fisher Scientific	A451-1	Solvant organique
K2HPO4 (Monobase de phosphate de potassium)	Science des Wards	470302-246	Partie 2 Composant tampon
KH2PO4 (phosphate dibasique de potasse)	Science des Wards	470302-254	Partie 2 Composant tampon
L-Proline	Produits de recherche International	P5200-500.0	Composant média Terrific Broth (TB)
Lysozyme	Bio-Biotechnologie de l’or	L-040-1	Composant tampon de lyse
Méthanol	Fisher Scientific	A452	Solvant organique
Tampon d’échantillonnage natif	Bio-Rad	161-0738	Composant SDS-PAGE
Échelle des protéines	Bio-Biotechnologie de l’or	P008-500	Composant SDS-PAGE
Tampon de gel de résolution	Bio-Rad	1610798	Composant SDS-PAGE
Sodim Dodécylsulfate (SDS)	Thermo Scientific	J18220-36	Composant SDS-PAGE
Hydroxyde de sodium	Fisher Scientific	S318-500	Composant tampon de lyse
Tampon gel d’empilement	Bio-Rad	1610799	Composant SDS-PAGE
TEMED	Bio-Rad	1610801	Composant SDS-PAGE
Tris Base	Bioréactifs de Fisher	BP-152	Composant tampon de lyse
Tryptone	Produits de recherche International	T60065-1000.0	Composant média Terrific Broth (TB)
Extrait de levure	Produits de recherche International	Y20025-1000.0	Composant média Terrific Broth (TB)