Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Purification efficace des polypeptides de type élastine (ELP) à partir d’E. coli en utilisant une méthode d’extraction et de précipitation à base de solvant organique

2.2K vues

⸱

DOI :

10.3791/69465

⸱

9 janvier 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Bindley Bioscience Center, Department of Chemistry, Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode rapide et reproductible d’extraction et de précipitation à base de solvant organique pour purifier un polypeptide de type élastine (ELP) à partir d’Escherichia coli, offrant une alternative potentiellement évolutive aux méthodes conventionnelles de purification ELP.

Résumé

Les polypeptides de type élastine (ELP) sont des biopolymères conçus à partir de séquences répétitives de pentapeptides qui imitent des motifs trouvés dans la tropoélastine des mammifères. Leurs caractéristiques uniques en font des candidats idéaux pour un large éventail d’applications biomédicales, allant de la délivrance de médicaments et de gènes à l’ingénierie tissulaire et à l’imagerie moléculaire ciblée. Les approches de purification conventionnelles à partir de l’expression d’Escherichia coli (E. coli) peuvent être inefficaces pour l’ELP en raison de la formation de corps d’inclusion. D’autres méthodes, telles que le cycle inverse de transition (ITC), utilisent les propriétés de température critique de solution (LCST) plus basse de l’ELP pour la séparer des contaminants tels que les lipopolysaccharides (LPS), mais nécessitent généralement plusieurs étapes de chauffage et de refroidissement qui prennent du temps et peuvent entraîner de faibles récupérations selon la séquence, la concentration et le poids moléculaire du construct ELP. Pour relever ces défis, nous avons développé un flux de travail d’extraction-précipitation à base de solvant organique qui exploite l’hydrophobie intrinsèque de l’ELP afin de permettre une purification rapide, robuste et largement applicable directement à partir de granulés de cellules d’E. coli. Cette méthode utilise des solvants organiques polaires pour aider à la perturbation cellulaire et solubiliser sélectivement l’ELP en une seule étape. Une étape de précipitation ultérieure élimine efficacement les solvants organiques résiduels, les impuretés de faible poids moléculaire et les endotoxines, produisant un ELP très pur avec des niveaux de LPS inférieurs à 1 EU/mL en moins de 3 heures. Les données de microscopie à force atomique suggèrent que les protéines de fusion ELP-purifiées de cette manière peuvent s’auto-assembler en structures inversées de type micelle qui conservent la fonction des protéines de fusion. Cette méthode de purification rapide offre aux chercheurs un moyen simple et potentiellement évolutif de purifier l’ELP, créant de nouvelles possibilités pour utiliser l’ELP et leurs protéines de fusion comme blocs de construction flexibles pour des applications matérielles et biomédicales.

Introduction

Les polypeptides de type élastine (ELP) sont des biopolymères composés de motifs répétitifs (VPGXG)n 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Le résidu invité X dans l’unité pentapeptidique peut être n’importe quel acide aminé autre que la proline. Les variations de X peuvent être utilisées pour ajuster l’hydrophobie, le comportement de transition thermique et les caractéristiques fonctionnelles du construct ELP afin de créer des matériaux biocompatibles modulaires largement explorés dans diverses applicationsbiomédicales 10,11,12.

Bien que la synthèse chimique puisse être utilisée pour produire des peptides courts, elle est peu adaptée aux ELP de haut poids moléculaire ou au maintien de la fonctionnalité des protéinesde fusion 13,14. Pour des raisons comme celles-ci, les ELP sont généralement exprimés de façon recombinante dans E. coli, permettant une production définie par séquence en grandes quantités. Cependant, cette approche peut aussi poser des défis. Lors de leur expression dans E. coli, les ELP s’accumulent souvent dans des corps d’inclusion denses, nécessitant des stratégies de récupération efficaces pour extraire la protéinefonctionnelle 15. De plus, l’expression bactérienne introduit des biomolécules indésirables telles que les protéines des cellules hôtes, les acides nucléiques et les lipopolysaccharides (endotoxines) qui doivent être séparés de l’ELP lors de la purification. Les stratégies traditionnelles de solubilisation utilisant des détergents (par exemple, le dodécyle sulfate de sodium (SDS) ou le Triton X-100) ou des agents chaotropes comme l’urée ont rencontré un succès limité pour nos séquences de fusion ELP. D’après notre expérience, Triton et l’urée n’ont pas réussi à extraire les ELP de la phase granule, tandis que la SDS permettait une solubilisation partielle mais interférait avec la purification d’affinité en aval et était difficile à éliminer complètement de la séquence ELP hydrophobe.

À ce jour, le cycle inverse de transition (ITC) reste la méthode de purification la plus utilisée pour les ELP. Cette technique exploite leur comportement LCST pour précipiter et résolubiliser sélectivement l’ELP à travers les gradients de température etde sel 16. Cependant, avec des protéines de poids moléculaire plus faible, la CTI est un processus long en plusieurs étapes, peu adapté aux ELP piégés dans les corps d’inclusion, nécessitant plusieurs cycles ITC pouvant entraîner une perte de protéines à chaqueétape 7,16.

Pour surmonter ces limites, nous avons adopté un flux de travail d’extraction et de précipitation à base de solvants organiques. Alors que Yakhnin et al. ont d’abord démontré une stratégie de partitionnement axée sur l’hydrophobie pour la purification de la GFP en utilisant des gradients d’éthanol et de sel en1998-17, la nouvelle méthode que nous avons développée utilise des mélanges de solvants organiques pour extraire directement les protéines de fusion ELP des cellules d’E. coli 7. Sweet et al. et Darji et al. ont adapté cette approche aux fusions ELP, montrant que l’extraction par solvant organique permet une récupération rapide des ELP fonctionnels tout en maintenant l’intégrité structurelle et la bioactivité 8,9. Cette approche utilise la sonication et des solvants organiques pour lyser les cellules bactériennes et extraire les ELP en une seule opération, tout en précipitant la plupart des protéines hôtes et des acides nucléiques. La récupération de la phase organique riche en ELP, suivie d’une précipitation rapide pour isoler les ELP des solvants et des impuretés solubilisées, donne des ELP très purs. Cette approche est également capable d’obtenir de l’ELP pur à partir de pellets d’E. coli avec des niveaux d’endotoxines inférieurs à 1 EU/mL en moins de troisheures 7,8.

Les études réalisées à ce jour montrent que cette méthode est capable de purifier les constructions ELP et les protéines de fusion ELP de poids moléculaire et de point isoélectrique variables, sans cycles ITC multiples ni étapes de solubilisation (Figure 1). La microscopie à force atomique (AFM) et la microscopie électronique en transmission (TEM) suggèrent que les protéines de fusion ELP-purifiées de cette manière forment des structures inversées de type micelle (Figure 2), aidant ainsi à préserver la structure et la fonction des domaines de fusion ELP lors de l’extraction par solvant organique. Ce flux de travail simplifié permet une purification ELP plus rapide et plus fiable pour diverses applicationsbiomédicales 7,8. Notamment, Aayush et al. ont rapporté que les constructions ELP purifiées par cette méthode conservaient la fonction de liaison au récepteur du facteur de croissanceépidermique 18, soulignant que cette méthode produit non seulement du matériel ELP pur, mais maintient également l’activité du domaine protéique de fusion.

Pour démontrer davantage l’utilité de cette méthode dans l’isolement d’une fusion ELP-enzyme, nous décrivons une méthode détaillée à base de solvant organique pour purifier une construction ELP-Intein-Chorismate mutase 2 (ELP-I-Cm2) (Figure 3). Cette méthode peut être utile pour la purification rapide d’autres ELP pour l’administration de médicaments et les applications des nanomatériaux.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. Préparation des matériaux

  1. Souche bactérienne : Utilisez des cellules chimiquement compétentes en Escherichia coli BL21(DE3) comme hôte d’expression.
    REMARQUE : Ils ont été sélectionnés en raison de leur grande efficacité de transformation et de leur adéquation à la production de protéines recombinantes.
  2. Plasmide d’expression : Utilisez le vecteur pET21(+) codant pour la protéine de fusion ELP-I-Cm2 avec une ampicillinerésistante 9. Achetez le vecteur plasmidique chez addgene. Insérez le gène Cm2 à l’aide du site BsrG I à l’extrémité de l’inteine.
    REMARQUE : La séquence d’ADN plasmidique de cette protéine est fournie dans le fichier supplémentaire 1.
  3. Média de croissance : préparation de média Terrific Broth (TB) pour un média de 1200 mL
    1. Préparez un milieu (Partie 1) en ajoutant 16 g de tryptone, 32 g d’extrait de levure, 16 g de proline, 6,8 mL de glycérol pour 1100 mL d’eau ultrapure. Mélangez soigneusement pour dissoudre tous les composants. Ajustez le volume final à 1200 mL avec de l’eau ultrapure.
    2. Préparez le tampon phosphate de potassium (Partie 2) en mélangeant 23,1 g de KH2PO4 et 125,4 g de K2HPO 4, puis portez le volume à 1 L avec de l’eau ultrapure.
    3. Autoclave les composants (Parties 1 et 2) séparément. Après l’autoclavage, assemblez le support en divisant la base TB en quatre aliquotes de 300 mL. Ajoutez 33 mL de tampon phosphaté à chaque aliquote en conditions stériles.
  4. Additifs pour l’expression
    1. IPTG : Effectuer l’induction à l’aide de l’IPTG à une concentration finale de 1,2 mM (par exemple, ajouter 396 μL de 1 M d’IPTG à 330 mL de culture).
    2. Antibiotique : Ajoutez de l’ampicilline à une concentration finale de 100 μg/mL pour assurer la sélection des plasmides.
  5. Tampon de lyse (pH 8,5) : Préparez le tampon de lyse avec 10 mM de Tris Base et 22 mM d’acide éthylénédiaminetétraacétique (EDTA). Ajustez le pH à 8,5 en utilisant HCl ou NaOH selon les besoins.
  6. Solvants organiques pour l’extraction
    1. Utiliser une variété de solvants organiques (Tableau 1) pour extraire la protéine de fusion ELP-I-Cm2 à partir des corps d’inclusion. Testez ces solvants individuellement et en combinaisons binaires (1:1 vol : vol) afin d’évaluer l’efficacité et la pureté de l’ELP.
      REMARQUE : Tous les solvants utilisés étaient de qualité HPLC, à l’exception de l’acétonitrile (grade Optima), de l’éthanol (grade USP) et du 1-Butanol (99 % de pureté).
      ATTENTION : Tous les solvants listés ci-dessus sont volatils et inflammables. Ils doivent être manipulés à l’intérieur d’une hotte chimique à l’aide d’équipements de protection appropriés (blouse de laboratoire, gants en nitrile et protection oculaire). De nombreux types de plastiques ne sont pas compatibles avec les solvants organiques. La vaisselle plastique polypropylène est fortement recommandée pour les expériences d’extraction-précipitation avec des solvants organiques ; Sinon, les plastiques à utiliser doivent être testés sans échantillon de valeur pour s’assurer qu’ils sont appropriés à l’utilisation. L’élimination des déchets solvants doit suivre les procédures définies dans les politiques institutionnelles pertinentes sur les déchets dangereux.

2. Lyse et préparation cellulaire (Figure 4A)

  1. Resuspension : Pèser 1 g de granule cellulaire et le resuspendre dans 4 mL de tampon de lyse fraîchement préparé. Vortex doucement jusqu’à ce que la pellete soit complètement dispersée et mélangée au tampon.
  2. Lyse enzymatique : Ajoutez ~5 mg de lysozyme pour aider à la digestion de la paroi cellulaire. Laissez la suspension incuber à 4 °C pendant 1 heure. Cela facilite une digestion enzymatique partielle pour renforcer la lyse cellulaire.
  3. Sonication : Après l’incubation, sonicez l’échantillon pour compléter la lyse cellulaire et cisaillez l’ADN génomique. Utilisez de courtes rafales de sonde micro-pointe (appareil 350 W, niveau de puissance 3) avec des intervalles pour éviter la surchauffe (par exemple, 5 s allumé/10 s éteint, répétés si besoin). Sonicez les échantillons sur la glace et appliquez l’énergie ultrasonique jusqu’à obtenir un lysat uniforme, sans particules visibles, généralement pendant environ 5 à 8 minutes.
    REMARQUE : Après la sonorisation, stockez une aliquote de 100 μL de l’échantillon (ou du lysat) pour une analyse d’expression ELP afin de surveiller la progression de la purification avant et après les étapes d’extraction et de précipitation.
  4. Centrifugation et analyse d’expression.
    1. Clarifiez le lysat par centrifugation à 10 000 g pendant 10 minutes à 20 °C, puis séparez soigneusement le surnageant (fraction soluble) du pellet (fraction insoluble/corps d’inclusion).
    2. Évaluer l’expression de l’ELP dans les deux fractions par SDS-PAGE : prétendre une aliquote (par exemple 10-20 μL) du surnageant et resuspendre une masse équivalente de pellets dans un tampon de lyse (50 mM pH 8,0 Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) au même volume ; mélangez chaque fois avec 4x tampon de Laemmli pour obtenir un dernier 1x, chauffez à 95 °C pendant 5 minutes, et chargez en quantités égales pour permettre une comparaison directe.
    3. Si l’ELP cible est principalement soluble, procéder à l’extraction au solvant organique à l’aide du surnageant clarifié. S’il est principalement insoluble (corps d’inclusion), il faut éliminer le surnageant et poursuivre le processus du corps inclusif (lavage/solubilisation et extraction) en traitant le pellet par extraction par solvant organique.
  5. Lavage et séchage des granulés (uniquement pour l’ELP dans les corps inclusifs) : Inversez les tubes de centrifugeuse pour permettre le drainage assisté par gravité de tout tampon de lyse résiduel. Une fois le liquide visible égoutté (~1-2 minutes), laissez sécher le pellet à température ambiante pendant 5 à 10 minutes, en vous assurant qu’il est exempt d’excès d’humidité avant de procéder à l’extraction organique.

3. Extraction organique (Figure 4B)

REMARQUE : Chaque ELP a sa propre condition de solvant préférée pour obtenir des extractions de haute pureté (par exemple, la performance AC à la Figure 1). Par conséquent, un criblage initial de 28 solvants organiques et leurs combinaisons doit être testé, et les isolats analysés par PAGE afin d’identifier les conditions optimales d’efficacité de solubilisation pour la construction d’intérêt.

  1. Criblage des solvants. Criblez les solvants individuels indiqués à l’étape 1.6 ainsi que leurs mélanges de solvants binaires 1:1 (v/v). Évaluer des mélanges supplémentaires (par exemple, 1:2, 2:1, 4:1) afin d’améliorer l’efficacité du procédé.
    REMARQUE : À l’heure actuelle, il n’existe aucune directive pour sélectionner rationnellement les solvants ou combinaisons les plus efficaces, il est donc nécessaire d’une campagne de dépistage pour sélectionner parmi les solvants ayant déjà réussi à solubiliser les agrégats de protéines hydrophobes. La sélection finale de l’extracteur de solvant organique à utiliser pour la purification doit se faire sur l’analyse SDS-PAGE des isolats obtenus à partir de ce criblage.
  2. Procédure d’extraction
    1. Ajout de solvant : Ajoutez 4 mL de solvant organique ou de mélange de solvant au granule/surnageant séché à l’air obtenu après la lyse. Pour les combinaisons mixtes, assurez-vous de rapports volumétriques précis (par exemple, 2 mL de chacun pour une combinaison 1:1).
    2. Vortex : Faites un vortex vigoureux sur la suspension pendant 1 minute pour assurer un mélange et une pénétration approfondis du solvant dans la pellete.
    3. Incubation (temps de rétention) : Laissez la suspension incuber à 20 °C pendant 5 minutes, assurant un temps d’interaction suffisant pour que les protéines extracellulaires s’aggrègent et sédimentent pendant que les ELP se solubilisent en phase organique.
    4. Centrifugation : centrifugez le mélange à 13 000 × g pendant 10 minutes à 20 °C afin de séparer les protéines solubilisées des débris insolubles résiduels.
    5. Collecte de surnageant : Collectez soigneusement le surnageant sans déranger la boule. Le surnageant contient l’ELP solubilisé, tandis que la pellete contient des protéines de la cellule hôte, des acides nucléiques et des lipides.
    6. Mesure de volume : Enregistrez précisément le volume du surnageant récupéré. Il faut veiller à ce que le surnageant soit exempt de particules de pellets. Cette mesure est cruciale pour l’étape de précipitation en aval.

4. Précipitation des protéines

  1. Ajout d’antisolvants : Ajoutez de l’acétone ou un acétonitrile au surnageant organique à 2,33 fois le volume mesuré du surnageant.
  2. Incubation : Faites éclore le mélange à 20 °C pendant 5 à 7 minutes.
  3. Centrifugation : centrifugeuse à 10 000 g pendant 10 minutes à 20 °C.
  4. Manipulation des granulés : Après centrifugation, jetez soigneusement le surnageant et laissez sécher l’échantillon à l’air libre en laissant le tube non tapé sous un doux jet d’azote pendant 10 à 15 minutes, ou incubez en plaçant les tubes de centrifugeuse non bouchés à l’envers sur des lingettes sans peluches dans une hotte pendant 1 heure à 20 °C (ne pas appliquer de chaleur).

5. Manipulation et resuspension des granulés de protéines

  1. Resuspension : Après précipitation et séchage à l’air, resuspendez la pellete protéique dans 50 μL de solution saline tamponnée phosphate (PBS). Faites doucement une pipette de haut en bas pour vous assurer que la pellete est complètement dissoute.
  2. Stockage : Conservez la protéine en suspension à -20 °C pour une utilisation à court et moyen terme. Évitez les cycles répétés de gel-dégel pour maintenir l’intégrité fonctionnelle des protéines.

6. Validation via SDS-PAGE

  1. Préparation de l’échantillon : Mélangez la protéine purifiée avec un tampon de chargement SDS-PAGE 4× dans un ratio 3:1 et un vortex brièvement pour assurer l’homogénéité.
  2. Conditions d’électrophorèse : Chargez sur un gel SDS-PAGE à 15 % pour ELP-I-Cm2 et faites fonctionner à 100-120 V jusqu’à ce que le colorant de suivi atteigne le fond.
    REMARQUE : Le pourcentage de réticulation dans le gel doit être basé sur la taille du construct ELP d’intérêt
  3. Coloration et visualisation : Teindre le gel avec une teinture Instant Blue Coomassie ou une autre teinture appropriée pendant 2 heures à 20 °C. Écartez en rinçant avec de l’eau déionisée jusqu’à obtenir un fond clair. Tester la protéine isolée lors des tests d’activité afin de valider que la rétention d’activité a eu lieu après le flux de travail d’extraction par solvant organique-purification par précipitation.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Après avoir parcouru les phases finales du protocole, l’étape suivante consiste à visualiser le résultat extraction-précipitation par analyse SDS-PAGE et coloration bleue de Coomassie. Lorsqu’il y a une étape de lyse avant l’extraction organique, une bande ELP proéminente doit être visible. Dans le cas de l’ELP-I-Cm2, cette bande apparaît à 100 kDa (Figure 3A).

Le criblage de différentes combinaisons de solvants organiques a démontré des efficacités d’extraction v...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

L’ITC a déjà été utilisé pour la purification non chromatographique del’ELP 19 ; cependant, cela peut être une méthode longue et à faible rendement. Dans les méthodes détaillées ci-dessus, nous décrivons une approche pour la purification rapide d’une protéine de fusion ELP-I-Cm2, démontrant comment la méthode d’extraction-précipité à base de solvant organique peut être utilisée efficacement pour purifier une grande variété de fusions ELP et ELP. Le protocole du so...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions l’Institut de recherche sur le cancer de l’Université Purdue et le programme NIH CCSG (CA23168) pour leur soutien à ce travail.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2-MercaptoéthanolBio-Rad161-0710Composant SDS-PAGE
30 % d’acrylamide/bis-acrylamideTCIA3218Composant SDS-PAGE
AcétoneFisher ScientificA949Solvant organique
AcétonitrileFisher ScientificA996Solvant organique
AmpicilineBio-Biotechnologie de l’orA-301-25Antibiotique
APS (Persulfate d’ammonium)Bio-Rad1610700Composant SDS-PAGE
ButanolFisher ScientificL13171Solvant organique
EDTABioréactifs de FisherBP118-500Composant tampon de lyse
ÉthanolLaboratoires de décontaminationUN1170Solvant organique
Acétate d’éthyleFisher ScientificE195Solvant organique
GlycérolProduits de recherche InternationalG22020-0.5Composant média Terrific Broth (TB)
Acide chlorhydriqueFisher ScientificA144SI-212Composant tampon de lyse
Coloration instantanée de CoomasieAbcamab119211Composant SDS-PAGE
IPTGBio-Biotechnologie de l’or12481C25Composante d’expression protéique
IsopropanolFisher ScientificA451-1Solvant organique
K2HPO4 (Monobase de phosphate de potassium)Science des Wards470302-246Partie 2 Composant tampon
KH2PO4 (phosphate dibasique de potasse)Science des Wards470302-254Partie 2 Composant tampon
L-ProlineProduits de recherche InternationalP5200-500.0Composant média Terrific Broth (TB)
LysozymeBio-Biotechnologie de l’orL-040-1Composant tampon de lyse
MéthanolFisher ScientificA452Solvant organique
Tampon d’échantillonnage natifBio-Rad161-0738Composant SDS-PAGE
Échelle des protéinesBio-Biotechnologie de l’orP008-500Composant SDS-PAGE
Tampon de gel de résolutionBio-Rad1610798Composant SDS-PAGE
Sodim Dodécylsulfate (SDS)Thermo ScientificJ18220-36Composant SDS-PAGE
Hydroxyde de sodiumFisher ScientificS318-500Composant tampon de lyse
Tampon gel d’empilementBio-Rad1610799Composant SDS-PAGE
TEMEDBio-Rad1610801Composant SDS-PAGE
Tris BaseBioréactifs de FisherBP-152Composant tampon de lyse
TryptoneProduits de recherche InternationalT60065-1000.0Composant média Terrific Broth (TB)
Extrait de levureProduits de recherche InternationalY20025-1000.0Composant média Terrific Broth (TB)

Références

  1. Despanie, J., Dhandhukia, J. P., Hamm-Alvarez, S. F., MacKay, J. A. Elastin-like polypeptides: therapeutic applications for an emerging class of nanomedicines. J Control Release. 240, 93-108 (2016).
  2. MacEwan, S. R., Chilkoti, A. Applications of elastin-like polypeptides in drug delivery. J Control Release. 190, 314-330 (2014).
  3. Jenkins, I. C., Milligan, J. J., Chilkoti, A. Genetically encoded elastin-like polypeptides for drug delivery. Adv Healthc Mater. 10 (13), e2100209(2021).
  4. Ju, Y., et al. Molecular targeting of immunosuppressants using a bifunctional elastin-like polypeptide. Bioconjug Chem. 30 (9), 2358-2372 (2019).
  5. Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 62 (15), 1479-1485 (2010).
  6. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally responsive polypeptides. Nat Biotechnol. 17 (11), 1112-1115 (1999).
  7. VerHeul, R., Sweet, C., Thompson, D. H. Rapid and simple purification of elastin-like polypeptides directly from whole cells and cell lysates by organic solvent extraction. Biomater Sci. 6 (4), 863-876 (2018).
  8. Sweet, C., Aayush, A., Readnour, L., Solomon, K. V., Thompson, D. H. Development of a fast organic extraction-precipitation method for improved purification of elastin-like polypeptides that is independent of sequence and molecular weight. Biomacromolecules. 22 (5), 1990-1998 (1990).
  9. Darji, S., Aayush, A., Estes, K. M., Strock, J. D., Thompson, D. H. Unravelling the mechanism of elastin-like polypeptide-enzyme fusion stabilization in organic solvents. Biomacromolecules. 25 (1), 272-281 (2024).
  10. Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. J Phys Chem B. 101 (51), 11007-11028 (1997).
  11. Guo, Y., Liu, S., Jing, D., Liu, N., Luo, X. The construction of elastin-like polypeptides and their applications in drug delivery system and tissue repair. J Nanobiotechnology. 21, 418(2023).
  12. Yi, A., Sim, D., Lee, S. -B., Sarangthem, V., Park, R. -W. Application of bioengineered elastin-like polypeptide-based system for targeted gene delivery in tumor cells. Biomater Biosyst. 6, 100050(2022).
  13. Clement, H., et al. Comparison between the recombinant expression and chemical synthesis of a short cysteine-rich insecticidal spider peptide. J Venom Anim Toxins Trop Dis. 21, 19(2015).
  14. Miranda, L. P., Alewood, P. F. Accelerated chemical synthesis of peptides and small proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (4), 1181-1186 (1999).
  15. Eweje, F., et al. Self-assembling protein nanoparticles for cytosolic delivery of nucleic acids and proteins. Nat Biotechnol. , (2025).
  16. Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Curr Protoc Protein Sci. 6 (11), 1-16 (2010).
  17. Yakhnin, A. V., Vinokurov, L. M., Surin, A. K., Alakhov, Y. B. Green fluorescent protein purification by organic extraction. Protein Expr Purif. 14 (3), 382-386 (1998).
  18. Aayush, A., Darji, S., Estes, K. M., Yeh, E., Thompson, D. H. Development of an elastin-like polypeptide-based nucleic acid delivery system targeted to EGFR+ bladder cancer cells using a layer-by-layer approach. Biomacromolecules. 25 (9), 5729-5744 (2024).
  19. Christensen, T., et al. Fusion order controls expression level and activity of elastin-like polypeptide fusion proteins. Protein Sci. 18 (7), 1377-1387 (2009).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Purification d'ELPextraction par solvant organiqueprécipitation des protéinesexpression chez E. colicorps d'inclusionélimination des endotoxinesanalyse par SDS-PAGEactivité de la protéine de fusionnanoparticules auto-assemblées
Purification efficace des polypeptides de type élastine (ELP) à partir d’E. coli en utilisant une méthode d’extraction et de précipitation à base de solvant organique
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.