Article de méthode

Détermination de la biomasse microbienne dans le sol à l’aide de la PCR numérique par gouttelettes (ddPCR)

DOI :

10.3791/69467

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24 avril 2026

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1Geography, Faculty of Environment, Science and Economy, University of Exeter

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude présente une méthode rapide ddPCR pour quantifier la biomasse microbienne du sol et les rapports fongique/bactérien. Bien que le carbone microbien dérivé de la ddPCR ne présente qu’une faible corrélation avec les estimations de fumigation au chloroforme, la méthode offre une approche moléculaire sensible et évolutive pour évaluer l’abondance microbienne sans prélèvement supplémentaire du sol ni utilisation de produits agressifs.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le sol représente le plus grand réservoir terrestre de carbone organique, mais plus de 133 Gt de carbone ont été perdus sur les sols au cours des deux derniers siècles. La quantification précise de la biomasse microbienne du sol, en particulier des champignons et bactéries, les principaux décomposeurs qui entraînent le cycle du carbone et des nutriments, est essentielle pour comprendre le fonctionnement écologique et la santé écologique du sol. Les approches conventionnelles, incluant l’extraction par fumigation au chloroforme et l’analyse de la PLFA, sont limitées par des besoins élevés en échantillons et incertitudes liées à la conversion des marqueurs biochimiques en estimations de biomasse microbienne. Nous présentons ici un flux de travail optimisé pour quantifier l’abondance bactérienne et fongique dans le sol en utilisant la PCR numérique numérique (ddPCR) ciblant les gènes 16S et 18S rRNA. La méthode permet la quantification absolue des copies de gènes microbiens, la conversion en nombre cellulaire via des facteurs de correction du nombre de copies génétiques, et l’estimation subséquente du carbone microbien de biomasse. Nous avons appliqué ce protocole à des sols de cinq systèmes agricoles répartis mondialement différenciant par la texture, l’utilisation des terres et la teneur en matière de matière organique. Les estimations dérivées de ddPCR ont été comparées aux estimations conventionnelles de fumigation au chloroforme du carbone de biomasse microbienne. DDPCR a fourni une quantification à haute résolution de l’abondance microbienne et a produit des estimations plus larges et plus sensibles des rapports F :B entre types de sols que le séquençage du génome entier. Bien que le MBC dérivé de ddPCR n’ait montré qu’une faible corrélation avec les valeurs de fumigation au chloroforme, cette méthode offre une approche moléculaire efficace pour évaluer la biomasse microbienne et des indicateurs écologiques tels que le rapport F :B. Ce protocole fournit une stratégie reproductible et évolutive pour intégrer des mesures d’abondance microbienne avec des analyses de composition afin d’améliorer l’évaluation de la santé des sols.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le sol est le plus grand réservoir de carbone organique terrestre, contenant plus de carbone que la végétation et le carbone atmosphériqueréunis 1. Plus de 133 gigatonnes (Gt) de carbone ont été perdus des sols au cours des 200 dernières années, et les efforts continus pour restaurer et maintenir les stocks de carbone du sol sont essentiels pour la santé mondialedes sols 2. Compte tenu de l’immense capacité de stockage du carbone des sols, déterminer avec précision les principaux contributeurs à ces stocks de carbone estfondamentalement important 3. Les microbes jouent un rôle fondamental dans le cycle des nutriments au sein du sol, et la biomasse microbienne représente une composante significative du carbone organique (SOC)3. Les champignons et les bactéries sont les principaux décomposeurs dans les environnements du sol et sont essentiels dans les cycles biogéochimiques de cesécosystèmes 4,5. Dans un sol dominé par des bactéries, la décomposition de la matière organique et la minéralisation des nutriments sont beaucoup plus rapides que dans un5 à majorité fongique. Le ratio fongique/bactérien (F :B) est de plus en plus utilisé comme indicateur de la santé du sol 6,7 ; par conséquent, une évaluation précise des champignons et des bactéries est cruciale.

Les estimations de la biomasse microbienne dans les sols reposent souvent sur des traitements chimiques perturbateurs, tels que la fumigation auchloroforme 8. D’autres approches ciblent sélectivement la communauté microbienne active via des techniques telles que la respiration induite par le substrat ou l’analyse des acides gras phospholipides (PLFA) 9. L’analyse PLFA a été largement utilisée pour évaluer la composition des communautés microbiennes et estimer le rapport F :B. Cependant, une variation significative de la taille cellulaire entre différentes espèces fongiques et bactériennes introduit une incertitude lors de la conversion des concentrations de PLFA en biomasse ou en rapports F :B basés sur la population, rendant ces estimations potentiellement peufiables 10. D’autres méthodes, telles que la cytométrie en flux, peuvent être utilisées pour augmenter le débit d’échantillons afin de déterminer l’abondance bactérienne dans les sols ; cependant, leur précision peut être réduite en raison de particules non microbiennes ayant une taille, une forme et des caractéristiques d’autofluorescence similaires à celles desmicrobes 11. La fumigation au chloroforme nécessite une quantité relativement importante de sol (>10 g) pour estimer la biomasse microbienne, tandis qu’une taille d’échantillon de 500 mg de sol suffit pour les méthodes basées sur l’ADN lors des extractions avec des kits commerciaux. Une comparaison antérieure entre les méthodes à base d’ADN et la fumigation au chloroforme a montré que, bien que les deux approches puissent estimer la biomasse microbienne, leur utilisation conjointe permettait d’évaluer plus robustement la biomasse microbiennedu sol 12.

Les évaluations des communautés microbiennes sont un indicateur sous-utilisé de la santé des sols qui a le potentiel de transformer notre manière de mesurer et de comprendre lessols 13. Les approches de métabarcoding sont conventionnellement utilisées pour déterminer la communauté microbienne du sol, les abondances relatives des bactéries étant évaluées en amplifiant les régions du gène 16S rRNA, tandis que les taxons fongiques sont ciblés en utilisant le gène 18S rRNA ou la région14 de l’espaceur interne transcrit (ITS). Les approches de métabarcoding pour les champignons peuvent reposer sur différentes régions cibles génomiques, affectant la diversité et l’abondance des espèces fongiques identifiées. La longueur inégale des ITS parmi les espèces fongiques peut favoriser une amplification préférentielle et un séquençage, ce qui entraîne une estimation incorrecte de leur abondance, conduisant à une évaluation erronée des communautés fongiques15. Les amorces Fungiquant ont été développées pour cibler des régions variables spécifiques au sein du gène 18S rRNA qui présentent une couverture complète de champignons divers et une spécificité par rapport à d’autreseucaryotes 16.

La plupart des bactéries et champignons possèdent plus d’une copie du gène ciblé, ce qui conduit à des estimations biaisées du nombre cellulaire. De plus, les champignons possèdent souvent des cellules multinucléées avec un nombre variable de noyaux parcellule 6. Il existe une variation considérable du nombre de copies du gène d’ARNr tant au sein qu’entre groupes taxonomiques, généralement moins de 15 copies chez les procaryotes, et estimée entre 28 et 511 pour le champignon17. En raison de cette variation, les techniques moléculaires utilisées pour analyser les structures de communautés microbiennes sont considérées comme semi-quantitatives, car elles peuvent fausser l’estimation de l’abondance relative des espèces dans une communauté18. Les numéros de copies de gènes mesurés (GCN) sont régulièrement convertis en abondances cellulaires en utilisant la moyenne estimée du GCN dans le groupe taxonomiqued’intérêt 18,19,20.

Certaines études ont utilisé des approches métagénomiques, car elles offrent plusieurs avantages par rapport au métabarding, notamment l’élimination du biais d’amplification et la capacité d’examiner de manière exhaustive l’ensemble de la communautémicrobienne 21. De plus, elles permettent la comparaison simultanée des compositions fongiques et bactériennes, ainsi que de leurs relationsentre elles 22. En général, la RT qPCR est couramment employée pour détecter le contenu microbien et la fonction23. La qPCR présente des limites comparée à la PCR numérique par gouttelettes (ddPCR) pour la quantification absolue, en raison de sa sensibilité aux inhibiteurs, car elle nécessite une normeexterne 24.

La ddPCR est une technologie révolutionnaire qui repose sur la partition des réactions d’amplification individuelles en gouttelettes séparées. Le modèle est ensuite amplifié par PCR dans chaque gouttelette sous forme de réaction distincte. La ddPCR présente une faible sensibilité aux inhibiteurs enzymatiques, une meilleure précision, répétabilité, sensibilité et stabilité dans la quantification bactérienne et fongique que laqPCR 25. De plus, c’est une méthode pouvant être utilisée pour la quantification absolue des bactéries et champignons dans le sol5. Puisque la ddPCR repose sur le même ADN extrait utilisé pour évaluer les variations de composition microbienne, les données d’abondance de la ddPCR peuvent être directement liées aux données de composition communautaire26 et utilisées pour quantifier la biomasse microbienne du sol.

Cette étude propose une méthodologie pour quantifier les champignons et bactéries dans les sols à l’aide de la PCR numérique par gouttelettes (ddPCR). Cette méthode optimisée a été appliquée à des sols de cinq lieux mondiaux différents et à des usages des sols. Les emplacements d’échantillons ont été sélectionnés pour englober un large spectre de propriétés du sol, de conditions environnementales et de pratiques de gestion, permettant ainsi d’évaluer la robustesse et la généralité de notre approche dans divers contextes. Ces données ont permis de déterminer le rapport F :B comme bioindicateur moléculaire de la qualité écologique des sols. Enfin, une comparaison de la biomasse microbienne estimée entre les données microbiennes ddPCR et les méthodes conventionnelles de fumigation au chloroforme a été réalisée.

Protocole

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Un schéma général de ces protocoles est présenté à la Figure 1. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Échantillonnage des sols

  1. Collectez des échantillons composites de sol arable (0–20 cm) dans cinq sites mondiaux, avec trois échantillons provenant de points sélectionnés au hasard dans une zone de 25 m de chaque emplacement.
    REMARQUE : Tous les échantillons ont été prélevés dans des systèmes agricoles représentatifs de l’utilisation régionale des terres dans lesquelles ils étaient situés. La texture du sol a été caractérisée à l’aide de diffraction laser, mesurée par un analyseur laser de taille de particules (Tableau 1). Les échantillons ont été transportés à température ambiante et stockés à 4 °C jusqu’à une analyse ultérieure.

2. Extraction d’ADN

REMARQUE : Effectuez l’extraction de l’ADN à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN du sol en suivant les instructions du fabricant. La température ambiante pour toutes les étapes était de 20 °C.

  1. Faites tourner brièvement le tube de 2 mL pour vous assurer que les billes se sont déposées au fond. Ajoutez 100 mg de terre et 800 μL de solution CD1. Vortex brièvement pour mélanger.
  2. Homogénéisez les échantillons en profondeur à l’aide d’un homogénéiseur à billes, avec des échantillons lysés pendant 40 s à 6 m s−1.
  3. Centrifugez un tube à battement de billes pour la lyse mécanique des cellules à 15 000 x g pendant 1 minute à température ambiante.
  4. Transférez le surnageant dans un tube propre de microcentrifuge de 2 mL.
    REMARQUE : Le surnageant peut encore contenir des particules de sol.
  5. Ajoutez 200 μL de solution CD2 et un vortex pendant 5 secondes.
  6. Centrifugez à 15 000 x g pendant 1 minute à température ambiante.
  7. Transférez jusqu’à 700 μL de surnageant dans un tube de microcentrifuge propre de 2 mL, en évitant la pellete. La pellete doit être visible.
  8. Ajoutez 600 μL de solution CD3 et faites un vortex pendant 5 s.
  9. Chargez 650 μL de lysat sur une colonne de rotation et centrifugez à 15 000 x g pendant 1 minute à température ambiante.
  10. Supprimez le flux et répétez l’étape 2.9 pour vous assurer que tout le lysat a traversé la colonne de spin.
  11. Placez la colonne de rotation dans un tube de collecte propre de 2 mL.
  12. Ajoutez 500 μL de solution EA à la colonne de spin. Centrifugez à 15 000 x g pendant 1 minute à température ambiante.
  13. Jetez le flux et remettez la colonne de rotation dans le même tube de collecte de 2 mL.
  14. Ajoutez 500 μL de solution C5 à la colonne de spin. Centrifugez à 15 000 x g pendant 1 minute à température ambiante.
  15. Jetez le filtre de passage et placez la colonne de rotation dans un nouveau tube de collecte de 2 mL.
  16. Centrifugez jusqu’à 16 000 x g pendant 2 minutes à température ambiante.
  17. Placez la colonne de rotation dans un nouveau tube d’élution de 1,5 mL.
  18. Ajoutez 50 à 100 μL de solution C6 au centre de la membrane blanche filtrante.
  19. Centrifugez à 15 000 x g pendant 1 minute à température ambiante. Jetez la colonne de rotation et conservez l’élute à -20 °C.

3. Quantification de l’ADN purifié

REMARQUE : L’ADN purifié a été quantifié à l’aide d’un fluoromètre et d’un kit de test double brin (dsDNA) Wide Range (BR) conformément aux instructions du fabricant.

  1. Préparez une solution fonctionnelle en utilisant un ratio tampon sur réactif de 199:1.
  2. Ajoutez 10 μL de chaque standard d’ADN à 190 μL de la solution de travail.
  3. Ajouter 1 à 20 μL d’ADN purifié à 180 à 199 μL de solution de travail. Le volume final doit être de 200 μL et incuber des échantillons standards et d’ADN à température ambiante pendant 2 minutes.
  4. Analysez les standards avant les échantillons d’ADN sur le fluoromètre en suivant les instructions à l’écran.

4. Choix de l’amorce

  1. Pour l’analyse des micro-organismes du sol, sélectionnez des amorces spécifiques en fonction des références pertinentes. Pour les bactéries, les amorces 16S rRNA ont étéutilisées 25, 27, et pour les champignons, 18S rRNA16.
  2. Effectuer l’amplification à l’aide du mélange maître PCR en temps réel (qPCR) basé sur un colorant de liaison à l’ADN et d’un cycle thermique. Les séquences d’amorce sont fournies dans le Tableau 2.

5. Quantification microbienne utilisant ddPCR

  1. Dégel et vortex sont tous des réactifs sur la glace.
  2. Configurez la réaction ddPCR comme suit : 0,1 μL (10 μM) en avant et 0,1 μL (10 μM) en arrière en amorce 16S ou 18S, 10 μL ddPCR Evagreen Supermix, 0,5 ng de DNA en gabarit X μL, en utilisant de l’eau sans nucléase (NFW) pour ajuster le volume final de la réaction à 22 μL. Créez un contrôle négatif en ajoutant NFW au lieu du gabarit pour chaque colonne.
  3. Placez le DG8 dans le porte-cartouche.
  4. Placez un total de 20 μL du mélange de réaction dans les puits d’échantillonnage de la cartouche.
  5. Ajoutez 70 μL d’huile de génération de gouttelettes pour Evagreen dans la cartouche bien étiquetée « huile ».
  6. Placez la cartouche dans le générateur de gouttelettes et couvrez la cartouche avec un joint d’eau.
  7. Transférez 40 μL des gouttelettes générées sur une plaque de 96 puits (semi-jupe) pour une amplification par PCR.
  8. Scellez la plaque à 96 puits à l’aide du scellant de plaques (température, 180 °C pendant 5 s).
  9. Utilisez les conditions de cyclage suivantes avec un couvercle chauffé réglé à 105 °C.
    REMARQUE : (a) Bactéries : 98 °C pendant 5 min, 40 cycles de ; 94 °C pendant 30 s, 61 °C pendant 60 s, 5 min à 4 °C, 10 min à 98 °C. (b) Champignons : 95 °C pendant 5 min, 40 cycles de ; 95 °C pendant 30 s, 55 °C pendant 1 min, 72 °C pendant 30 s, 5 min à 4 °C, et 5 min à 90 °C.
  10. Transférez la plaque à 96 puits au lecteur de plaques.
  11. Évaluer la concentration de copie de chaque puits à l’aide de la version 1.2 de QuantaSoft. Ajuster le seuil d’amplitude pour séparer les gouttelettes négatives et positives.
  12. Calculez le nombre de copies géniques par ng d’ADN lors de la réaction en multipliant les copies/μL par le volume final de réaction (20 μL) et en divisant par le total d’ADN modèle apporté dans la réaction comme suit : (copies μL-1 x volume de réaction) / ADN total apporté dans la réaction.
  13. Calculez le nombre total de copies géniques par ng d’ADN extrait en multipliant les copies génétiques par ng par l’ADN total extrait (ng) comme suit : (copies de gènes par ng x ADN total extrait).
  14. Calculez les copies géniques par gramme en divisant le total des copies géniques par ng d’ADN extrait par la quantité de poids sec du sol traité lors de l’extraction (g), comme suit :
    Copies géniques par gramme = (nombre total de copies géniques par NG extrait / gramme de poids sec du sol (GDW) de sol traité lors de l’extraction).
  15. Calculez le nombre de cellules par GDW en convertissant les copies géniques en utilisant le nombre moyen de copies de gènes (GCN) suivant l’équation :
    Nombre de cellules = copies de gènes par gramme / Copies moyennes de gènes cellule-1).
  16. Convertir les nombres cellulaires en carbone microbien de biomasse (MBC) en utilisant l’équation suivante :
    MBC pour 16S (mg C g-1 sol) = cellules gdw-1 × (100 fg cellule-1) × 10−15 (g fg-1) × 103(mg g-1)28
    MBC pour 18S (mg C g-1 sol) = cellules gdw-1 × (6 fg cellule-1) x 10−12 (g fg-1) × 103 (mg g-1)29
    Le processus complet est expliqué à la Figure 2.
    REMARQUE : La copie moyenne du gène 16S rRNA (moyenne ± SD) pour 46 phylumsbactériens 20 a été calculée et utilisée comme facteur de correction pour les bactéries, avec une valeur finale de 2,48. Tandis que pour les champignons, le nombre de copies du gène a été calculé avec un facteur de correction de 113 selon Lofgren et al.17. Le carbone de biomasse microbienne (MBC) a été estimé à partir des décomptes cellulaires dérivés de ddPCR, en utilisant des teneurs en carbone cellulaire supposées de 100 fg par cellulebactérienne 28, et 6 pg par cellulefongique 29.

6. Analyse moléculaire du sol à partir du séquençage du génome entier

  1. Préparez la bibliothèque de séquençage en suivant le protocole Oxford Nanopore Technologies SQK-NBD114, en utilisant le Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24) (voir le tableau des matériaux). Veillez à utiliser un code-barres, fourni dans le kit, pour chaque échantillon.
  2. Séquencez la bibliothèque préparée à l’aide d’une cellule de flux Oxford Nanopore Technologies R10.4.1.
  3. Effectuez l’appel de base dans MinKnow pendant la séquence en sélectionnant le modèle super précision (SUP) et en sélectionnant le découpage de code-barres « ON ». Version Dorado : 0.7.2+9ac85c6.
  4. Effectuer la classification taxonomique des lectures de séquences d’ADN en utilisant le classificateur taxonomique Kraken2 (v2.1.3)30 avec la base de données NCBI des protéines non redondantes (nr), confiance 0,05.
  5. Inspectez les fichiers de rapports Kraken2 pour détecter les classifications totales de bactéries et champignons.
  6. Calculez l’abondance relative des bactéries et des champignons pour chaque échantillon.

7. Estimation du carbone de la biomasse microbienne du sol par fumigation au chloroforme

  1. Pesez les échantillons de sol frais dans des moules pré-pesées et laissez-les sécher au four à 105 °C pendant 24 heures.
  2. Calculez la teneur en humidité du sol en soustrayant le poids sec du sol frais et en divisant la différence par le poids du sol frais.
    Teneur en humidité ( %) = (W humide –W sec)/ Wsec) × 100
  3. Utilisez la teneur en humidité pour calculer la matière sèche du sol.
    Matière sèche ( %) = 100 – Teneur en humidité ( %)
  4. Ajoutez 5 g de terre à deux tubes centrifugeuses individuels de 50 mL, marqués non fumigé et fumigé.
  5. Ajoutez un total de 25 mL de 0,5 MK 2SO4 au tube étiqueté non fumigé.
  6. Secouez les échantillons non fumigés dans un shaker orbital pendant 1 heure à température ambiante.
  7. Ajoutez 2 mL de chloroforme sans éthanol directement dans le sol dans les tubes marqués comme fumigés. Fermez et sécurisez les couvercles avec du parafilm, puis faites éclore dans le noir pendant 24 heures à température ambiante.
  8. Centrifugez l’échantillon non fumigé pendant 10 minutes à 2 500 x g à température ambiante.
  9. Décolorez le surnageant à partir de l’échantillon non fumigé, filtrez à travers un filtre cellulose de 0,45 μm, puis stockez à -20 °C.
  10. Retirez les couvercles des échantillons fumigés et évacuez la hotte pendant 2 heures, puis effectuez l’extraction K2SO 4 (répétant les étapes 5 à 9) et stockez à -20 °C.
  11. Mesurez la concentration de carbone de l’extrait pour les échantillons « fumigés » et « non fumigés », à l’aide d’un analyseur de carbone organique total.
  12. Calculer le carbone microbien de biomasse (MBC) en utilisant l’équation suivante : MBC = (Teneur en C fumigé - Teneur en C non fumigé)/0,45. Normaliser pour le sol par gramme de poids sec.

8. Estimation de la teneur en matière organique du sol

  1. Faites sécher un creuset en porcelaine dans un four à convection à 105 °C pendant 30 minutes, puis pesez-le après refroidissement à 20 °C (WC).
  2. Placez jusqu’à 2 g de terre dans le creuset séché et pesez à nouveau.
  3. Séchez les échantillons de sol dans le creuset rempli dans un four à convection à 105 °C pendant 24 heures.
  4. Placez-le dans un dessicateur scellé pour refroidir et peser à nouveau (WS).
  5. Préchauffez un four à étouffement à 550 °C, puis placez le creuset contenant la terre dans le four pendant 4 heures.
  6. Retirez le creuset avec de la terre du four et placez-le dans un dessiccateur pour le refroidir.
  7. Peser le creuset avec de la terre (WA).
  8. Mesurez le pourcentage de SOM en calculant la différence de poids sec du sol avant et après l’incubation à 550 °C.
    SOM LOI = [(WS –W A)/(WS –W C)] × 100

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des échantillons de sol ont été prélevés dans cinq sites, et la teneur en matière organique du sol a été déterminée par perte à l’allumage. La teneur en matière organique du sol variait de 3,38 % à 10,34 % pour chacun des sols utilisés dans l’étude (Tableau 1). Des extractions d’ADN ont été effectuées sur chaque échantillon de sol en tripliqué, avec des rendements d’ADN résultants allant de 32 ng à 4 590 ng par gramme de sol sec (Figure 3A).

La concentration d’ADN différait significativement entre les sols avec une teneur variable en matière organique (ANOVA unidirectionnelle p < 0,0001, R2=0,97). Le sol avec la plus faible teneur en matière organique, le sol A, n’a pas présenté la plus faible concentration d’ADN. Cependant, le sol E, qui avait la plus grande teneur en matière organique, avait une concentration significativement plus élevée d’ADN provenant de tous les autres sols (A–D, p < 0,0001), tandis que le sol B avait le plus faible, différant significativement de A et D (p < 0,05). Le protocole ddPCR a été réalisé sur l’ADN purifié à partir de chacun des échantillons de sol à l’aide des amorces pour gènes rRNA 16S et 18S. Le nombre de copies de gènes par gramme de poids sec de sol pour chacun des gènes 16S (Figure 3B) et 18S rRNA (Figure 3C) a été déterminé à l’aide de la ddPCR. Dans tous les échantillons de sol, il y avait moins de copies du gène 18S rRNA que du gène 16S rRNA. Les tests post-hoc de Tukey ont révélé que le sol B possédait le moins de copies des gènes 16S et 18S rRNA, avec une moyenne de 8,8 x 107 et 4,6 x 10gènes 6, respectivement, par gramme de sol sec. Le sol E différait significativement de tous les autres sols et présentait le plus grand nombre de copies des gènes rRNA 16S et 18S, avec respectivement 4,4 x 109 et 2,5 x 10 9 par gramme de sol sec. Les copies fongiques dans les sols A–D ne différaient pas significativement les unes des autres, tandis que les copies bactériennes dans les sols D différaient significativement des sols B et E.

Le séquençage du génome entier (WGS) a été utilisé sur l’ADN purifié de chaque échantillon, et les classifications taxonomiques ont été réalisées avec Kraken2 dans la base de données nr NCBI. Le nombre total de lectures de séquences d’ADN classées contre les bactéries et champignons a été utilisé pour calculer le ratio fongique :bactérien (F :B) de chaque sol et comparé aux rapports fongique :bactérien calculés à partir du nombre de copies de gènes estimé par ddPCR (Figure supplémentaire 1). Les valeurs du rapport F :B obtenues avec ddPCR variaient de 0,022 à 0,66 sur tous les échantillons de sol et étaient supérieures à celles obtenues par séquençage du génome entier. La moyenne la plus élevée de F :B a été observée dans le sol E, avec un F :B de 0,56 pour la ddPCR et 0,038 pour les méthodes WGS. De plus, une plus grande plage de valeurs F :B a été identifiée dans les échantillons de sol utilisant ddPCR plutôt que WGS. De plus, une corrélation positive a été observée entre le rapport F :B déterminé par la méthode ddPCR et les données WGS (r = 0,59, R2 = 0,35, p = 0,019), comme montré dans la Figure supplémentaire 1.

Un nombre moyen de copies de gènes pour les bactéries et les champignons a été utilisé pour convertir les copies génétiques calculées en nombre de cellules bactériennes et fongiques dans les échantillons d’origine (Figure supplémentaire 2). Ces données ont été combinées pour estimer le nombre total de cellules microbiennes dans le sol (Figure 3D) et différaient significativement entre les sols (ANOVA unidirectionnelle p < 0,0001). L’analyse comparative par paires de Tukey a montré que la teneur microbienne la plus élevée était observée dans le sol E, tandis que la plus faible teneur microbienne a été trouvée dans les échantillons prélevés dans le sol B, différant significativement de A, D et E.

Une fumigation au chloroforme a été réalisée sur chaque échantillon de sol en triple pour estimer le carbone total de biomasse microbienne (MBC) dans chaque échantillon (Figure 4A). Entre 3,6 et 9,6 mg de carbone par gramme de sol sec ont été identifiés dans les sols utilisés, sans différences significatives observées entre les échantillons (ANOVA unidirectionnelle p = 0,266). Une teneur moyenne en carbone pour les cellules bactériennes et fongiques a été utilisée pour convertir le nombre de cellules microbiennes estimé par ddPCR en une estimation du carbone total de biomasse microbienne. Ces estimations dérivées de la ddPCR ont été comparées à la méthode de fumigation au chloroforme (Figure 4B). Pour évaluer la relation entre la MBC mesurée par fumigation au chloroforme et la méthode ddPCR, une corrélation de Pearson a été réalisée (n = 15). Une corrélation positive a été trouvée entre les deux méthodes (r = 0,43, R2 = 0,18, valeur p = 0,05). Les valeurs aberrantes du sol E, caractérisées par la teneur en matière organique la plus élevée, ont probablement contribué de manière disproportionnée à ce résultat marginalement significatif (Figure 4B).

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Figure 1 : Aperçu du traitement des échantillons de sol. La figure illustre les méthodes moléculaires utilisant l’ADN du sol pour la quantification microbienne et les méthodes conventionnelles pour mesurer la biomasse microbienne, le carbone et la matière organique du sol. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Organigramme du processus de comptage cellulaire depuis les copies ddPCR pour les 16S et 18S, jusqu’à l’estimation finale du carbone de biomasse microbienne, montrant les étapes 5.11 à 5.16 du protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Quantification microbienne des sols. (A) La concentration moyenne d’ADN purifiée à partir de chaque échantillon de sol. (B) Nombre total moyen de copies du gène 16S rRNA par gramme de poids sec de sol utilisant ddPCR. (C) Nombre moyen total de copies du gène 18S rRNA par gramme de poids sec de sol utilisant ddPCR. (D) Nombre total moyen de cellules microbiennes par gramme de poids sec à travers les échantillons de sol. Toutes les barres d’erreur affichent l’erreur standard de la moyenne. Une ANOVA unidirectionnelle suivie d’un test post-hoc de Tukey pour les comparaisons par paires ont été réalisées, et les différences significatives sont montrées à l’aide d’un affichage compact en lettres (seuil de signification = 0,05). Les échantillons sont classés du plus faible au plus haut pourcentage d’OM Origine du sol (OM %) A : Pays-Bas (3,38), B : Irak (5,14), C : Chine (6,41), D : Royaume-Uni (8,19) et E : Royaume-Uni (10,34). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Carbone de biomasse microbienne mesuré par extraction par fumigation au chloroforme et estimations cellulaires basées sur des gènes. (A) MBC extrait par fumigation au chloroforme – disposé de faible à élevé en matière organique. Les barres d’erreur affichent l’erreur standard de la moyenne. Une ANOVA unidirectionnelle suivie d’un test post-hoc de Tukey pour les comparaisons par paires ont été réalisées, et les différences significatives sont montrées à l’aide d’un affichage compact en lettres (seuil de signification = 0,05). (B) MBC estimé à partir de l’abondance cellulaire (gdw cellulaire -1) dérivé du nombre de copies de gènes ddPCR et converti en carbone de biomasse, tracé par rapport à la matière organique totale pour le même échantillon. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

ExempleOrigine du solpHPourcentage de teneur en humiditéMatière organique %TextureUtilisation des terres
ATexel, Pays-Bas7.1619.043.38Terre sableuseHorticulture
BNajaf, Irak7.588.335.14Limon limieuxRiz
CJiangxi, Chine4.118.456.41Limon limieuxSésame/Graines de colza
DCambridge, Royaume-Uni6.8121.88.19Limon limieuxBlé
EExeter, Royaume-Uni5.4420.2710.34Limon limieuxPrairie

Tableau 1 : Propriétés physiochimiques et caractéristiques d’utilisation des terres de cinq échantillons de sol (A–E), pour la détermination de la biomasse microbienne.

CibleBPEn avantReversRéférence
16S rRNA1805′- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG5′- ATTACCGCGGCTGCTGG(Le Geay et al., 2024 ; Ovreås et al., 1997)
18S rRNA3515′-GGRAAACTCACCAGGTCCAG5′-GSWCTATCCCCAKCACGA(Liu et al., 2012)

Tableau 2 : Paires d’amorces sélectionnées pour cibler les gènes 16S et 18S rRNA à l’aide de la ddPCR.

Figure supplémentaire 1 : Une corrélation entre le rapport F :B pour tous les échantillons de sol, déterminée par la méthode ddPCR et WGS. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Nombre de cellules dans différents échantillons de sol mesuré à l’aide de la méthode ddPCR ciblant : (A) bactéries ; et (B) champignons. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les microbes du sol sont les principaux décomposeurs des écosystèmes terrestres et jouent un rôle essentiel dans le cycle des nutriments et le stockage du carbone dans le sol. Malgré l’importance des microbes du sol, quantifier précisément leur abondance absolue par des méthodes basées sur la copie génétique est difficile. Cela est dû à de nombreux facteurs, comme le nombre variable de gènes cibles chez différentes espèces. Cette étude démontre comment la biomasse microbienne du sol peut être quantifiée par ddPCR en ciblant les procaryotes et eucaryotes à l’aide des régions codantes des gènes rRNA 16S et 18S. Le rapport F :B le plus élevé dans le sol E a été observé, où cet échantillon présentait également le pourcentage de matière organique le plus élevé. Le deuxième rapport F :B le plus élevé a été observé dans l’échantillon C, ce qui correspondait à l’acidité élevée de ces sols. Cela était attendu pour les échantillons C et E, car la croissance fongique augmente avec un pH plusbas de 31. Le séquençage du génome complet a été effectué sur les mêmes extraits d’ADN utilisés pour les méthodes ddPCR. Le rapport F :B entre WGS et ddPCR a été comparé. Le ratio F :B calculé à partir des données WGS était plus faible pour tous les échantillons analysés que le rapport F :B calculé à partir des données ddPCR. Cependant, la tendance globale du rapport F :B entre les échantillons était visuellement comparable entre chaque méthode. Cela a donné des ratios F :B plus élevés sur les échantillons de sol comparé au séquençage du génome entier et a démontré une plus grande variabilité du rapport F :B selon les types de sols. Le rapport F :B plus faible observé dans les données WGS est probablement dû aux différences de taille du génome entre champignons et bactéries, et les séquences fongiques peuvent être sous-représentées sans enrichissement32. De plus, bien que le sol A ait la teneur en matière organique la plus faible, il n’a pas présenté le plus faible nombre de copies microbiennes ni de carbone microbien, ce qui souligne que la teneur en matière organique n’est pas toujours directement corrélée à la biomasse microbienne. Notamment, les tendances observées entre la concentration d’ADN d’origine (Figure 3A) et les cellules microbiennes totales (Figure 3D) étaient visuellement similaires, ce qui suggère que la concentration d’ADN est un bon indicateur de la biomasse microbienne.

ddPCR permet une quantification précise du nombre de copies de gènes dans des échantillons de sol, et cette méthode peut être utilisée pour estimer le total des cellules microbiennes. Cependant, il existe des limites à prendre en compte. Le nombre de copies des gènes 16S et 18S de l’ARNr varie considérablement entre les taxonsmicrobiens 23. En conséquence, l’utilisation d’un seul facteur de correction pour le nombre de copies de gènes peut conduire à une surestimation ou à une sous-estimation de l’abondance microbienne dans unéchantillon 33. Cette limitation peut être corrigée en intégrant des connaissances préalables de la communautémicrobienne 18, en utilisant des données de séquençage du génome complet, et en appliquant des corrections appropriées du nombre de copies de gènes qui sont représentatives du microbiote spécifique du sol. Bien que les méthodes moléculaires fournissent toujours une estimation plutôt qu’un décompte exact, elles offrent une prédiction plus précise de l’abondance microbienne. Combinée aux données de composition des communautés, cette approche permet des interprétations qui vont au-delà de l’abondance relative seule19,34.

Le carbone de biomasse microbienne (MBC), estimé par fumigation au chloroforme, n’a montré aucune différence significative entre les échantillons analysés, bien que de forts degrés de variation en MBC aient été observés parmi les échantillons A–D. En revanche, des différences significatives ont été détectées dans le nombre total de cellules microbiennes mesuré à l’aide de la méthode ddPCR, indiquant que cette approche moléculaire peut offrir une résolution supérieure aux techniques conventionnelles. Cependant, le calcul du carbone de biomasse microbienne à partir des nombres cellulaires a ses propres limites. La variabilité de la taille cellulaire peut influencer la conversion des nombres cellulaires en biomasse. De manière similaire à l’utilisation d’un seul facteur de conversion pour le nombre de copies de gènes, l’utilisation d’un seul facteur de conversion pour la teneur en carbone bactérien et fongique peut conduire à une surestimation ou à une sous-estimation du carbone microbien de biomasse.

De plus, les méthodes basées sur l’ADN peuvent être particulièrement problématiques lorsqu’elles sont comparées entre sols présentant de grandes différences de dominance entre bactéries et champignons. Le rendement ADN et le GCN peuvent également être affectés par le choix de la méthode d’extraction de l’ADN et de la conception del’amorce 35,36, rendant les comparaisons inter-laboratoiresdifficiles 37. De plus, les méthodes GCN et de production d’ADN peuvent être vulnérables à la surestimation en raison du soi-disant « ADN relique », c’est-à-dire de l’ADN dans des organismes morts ou lié à desargiles 14,38. Bien que les méthodes ddPCR aient montré une meilleure précision et une meilleure répétabilité, certains inconvénients incluent ses processus complexes, les coûts élevés et l’utilisation de colorants ADN non spécifiques, lors de l’utilisation de la chimieEvagreen 5. Cela peut créer de faibles faux positifs, rendant difficile la séparation des gouttelettes positives des gouttelettes négatives, et un léger désajustement du seuil pourrait affecter le rapport F :B lorsque les copies géniques sont à faible14. Pour augmenter le nombre d’échantillons pouvant être traités avec cette méthode ddPCR, l’automatisation avec robotique de manipulation de liquides peut être utilisée pour les extractions d’ADN et la mise en placede la réaction 39. De plus, le nouveau système ddPCR permet une plus grande multiplexation, générant simultanément des gouttelettes pour 96 échantillons.

Il est important de noter que toutes les mesures de biomasse microbienne sont des estimations et impliquent des facteurs de conversion généralisés pour déterminer leschiffres 37. Par conséquent, les comparaisons entre les méthodes doivent être faites avec prudence, car on ignore lesquelles sont les plus précises. Malgré cela, les méthodes d’extraction par fumigation au chloroforme ont été largement utilisées ces dernières décennies, s’appuyant sur les vapeurs de chloroforme pour fumiger le sol. Cela a soulevé de nombreuses inquiétudes en raison de sa toxicité pour l’homme et de l’environnement, ainsi que de son efficacité dans la lyse des cellules microbiennesdu sol 40. De plus, la fumigation au chloroforme peut entraîner une surestimation de la MBC produite à partir de sources non vivantes, telles que les résidusvégétaux 41. Enfin, cette méthode repose également sur des quantités relativement importantes de sol comparée à d’autres méthodes moléculaires nécessitant de très faibles quantités de sol (<500 mg).

Cette étude apporte des preuves que les méthodes basées sur ddPCR pour mesurer la biomasse microbienne des sols sur une gamme de sols sont robustes et ne sont pas affectées par différents types de sols ni par les inhibiteurs potentiels. Le succès de cette méthode est influencé par l’échantillon d’ADN d’origine, et il est donc essentiel d’assurer une purification efficace de l’ADN à partir des échantillons. Cette méthode montre un potentiel pour la détection et la quantification microbienne dans divers types et textures de sols, complétant les méthodes existantes d’estimation de la biomasse microbienne et permettant des applications précieuses futures pour la surveillance de la santé et de l’évolutivité des sols pour la surveillance régionale ou mondiale du microbiome.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent ne pas exister de conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions le Dr Nina Lindstrom-Friggens, le Dr Liz Cressey, le Dr Joanna Zaragoza-Castells, Angela Elliott, le Dr Kees Jan van Groenigen et le Professeur Iain Hartley. Nous tenons également à remercier les propriétaires fonciers pour avoir fourni les sols pour cette étude. Cette recherche a été financée par Shell Research Ltd (CW648947-PT34767). Les ensembles de données générés lors de l’étude actuelle sont disponibles dans le dépôt NCBI Sequence Read Archive PRJNA1305539.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Bettersizer S3 Plus & nbsp ;Bettersize, ChineBT-803
CentrifugeuseThermoscientifique & nbsp ;SL16  ;
Chloroforme  ;ThermoScientificL14759. AU  ;
Plaques ddPCR à 96 puitsBio-Rad, Watford, Royaume-Uni12001925
ddPCR Huile de lecteur de gouttelettes   ;Bio-Rad, Watford, Royaume-Uni1863004
Dessicator  ;Davisil
Porte-cartouche DG8Bio-Rad, Watford, Royaume-Uni1863051
Cartouches DG8 pour générateur de gouttelettes QX200/QX100Bio-Rad, Watford, Royaume-Uni1864008
Joints DG8 pour générateur de gouttelettes QX200/QX100Bio-Rad, Watford, Royaume-UniQ33265
Kit DNeasy Power Soil pro & nbsp ;Qiagen, Allemagne47017
Kit de test double brin (dsDNA) Broad Range (BR)Invitrogen, AllemagneQ33230
FastPrep-24 5G  ;MP Biomédicales, Royaume-Uni116005500
GridION  ;Oxford Nanopore Technologies, Royaume-UniGRD-MK1CAPX
K2SO4Merck, Royaume-Uni7778-80-5
Billes magnétiques Mag-BindOmega Bio-tek, États-UnisM1378-01
Pile de flux MinIONOxford Nanopore Technologies, Royaume-UniFLO-MIN114
Fournaise étoufféeCarbolite  ;AAF1100
Kit de code-barres natif 24Oxford Nanopore Technologies, Royaume-UniSQK-NBD114.24
Scellement thermique de la plaque PCR, feuille d’aluminium, perceable   ;Bio-Rad, Watford, Royaume-Uni1814040
Scellant de plaques PCR PX1Bio-Rad, Watford, Royaume-Uni1814000
Fluoromètre à qubitsInvitrogen, AllemagneQ33226
Système PCR numérique à gouttelettes QX200Bio-Rad, Watford, Royaume-Uni1864001
QX200 ddPCR EvaGreen SupermixBio-Rad, Watford, Royaume-Uni186-4033
Huile de génération de gouttelettes QX200 pour EvaGreen & nbsp ;Bio-Rad, Watford, Royaume-Uni1864005
QXDx Générateur de gouttelettes   ;Bio-Rad, Watford, Royaume-Uni12001049
SENSOQUEST LABCYCLER  ;Geneflow, Allemagne1120280125

Références

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