Imagerie calcique basée sur la fluorescence dans les cultures épithéliales primaires des voies respiratoires humaines utilisant la segmentation cellulaire automatisée

Résumé

L’imagerie cellulaire vivante de la signalisation calcique est largement utilisée pour étudier la mobilisation du calcium dans les lignées cellulaires stables cultivées en monocouches. Ce protocole décrit l’imagerie par fluorescence vivante de la signalisation calcique à l’aide de colorants cellulaires vivants sur des tissus primaires complexes, et utilise également des logiciels d’apprentissage automatique pour quantifier simultanément l’intensité de fluorescence de milliers de cellules individuelles, simplifiant ainsi les analyses.

Résumé

La signalisation calcique est essentielle dans de nombreux processus biologiques, renforçant la nécessité de développer des méthodes pour étudier le flux calcique dans les tissus primaires. L’étude de la signalisation calcique à résolution unicellulaire dans les cultures épithéliales primaires complexes est complexe et reste donc peu étudiée. Cette étude présente des méthodes adaptées pour surveiller la signalisation calcique vivante dans les cultures épithéliales primaires des voies respiratoires ainsi que de nouvelles approches pour des analyses basées sur l’apprentissage automatique. En utilisant des cultures épithéliales primaires des voies respiratoires dérivées du patient, différenciées à l’interface air-liquide (ALI) chargées d’un colorant indicateur fluorescent extrinsèque, la mobilisation du calcium a été mesurée à une résolution unicellulaire à l’aide d’un microscope épifluorescent. Nous avons développé un logiciel novateur qui utilise la segmentation cellulaire basée sur l’apprentissage automatique pour attribuer des intensités de fluorescence à différentes cellules au fil du temps. Dans l’ensemble, la configuration d’imagerie adaptée et le logiciel permettent une approche rapide et impartiale pour analyser les cellules individuelles au sein des cultures épithéliales primaires. Le protocole étape par étape présenté ici permettra l’étude future du calcium dans les cellules individuelles et les types cellulaires qui composent les cultures épithéliales primaires.

Introduction

Les modifications de la mobilisation intracellulaire du calcium dictent une grande variété de processus cellulaires, notamment des modifications de l’expression génique et la modulation des réponses immunitaires^{innées 1,2}. Les niveaux de calcium intracellulaires peuvent être modifiés par la libération des réserves de calcium intracellulaires, telles que le réticulum endoplasmique et^les mitochondries ^1,2,3. L’afflux extracellulaire de calcium dans l’espace intracellulaire peut également modifier le calcium cytosolique par transport passif^{et actif 2}. L’imagerie cellulaire vivante de la mobilisation du calcium est principalement analysée par des colorants intracellulaires ou des colorants génétiquement codés, GCaMP (Multimère/Protéine activée par le calcium vert)⁴. On trouve souvent dans la littérature les colorants conjugués AM (acétoxyméthyl), qui permettent au colorant de pénétrer la membrane^plasmique 5,6,7,8. En pénétrant dans la cellule, la moitié AM est clivée par des estérases intracellulaires endogènes, et le colorant gagne une charge négative, ce qui le piége dans l’espace^{cytosolique 9}. Grâce à cette charge acquise, le colorant peut être pompé par des canaux anioniques organiques résident dans la membrane plasmique. Par conséquent, le probénécide, un inhibiteur des transporteurs d’efflux d’anions organiques, est ajouté pour empêcher l’efflux cellulaire du colorant et conserver un signal cytosolique optimal^10,11. Les études utilisent couramment Fura-2 AM, un colorant ratiométrique, et Fluo-4AM, un colorant intensitométrique, pour tester la signalisation calcique sur des lignées cellulaires stables cultivées en monocouche. Cette étude utilise un protocole adapté à l’imagerie épifluorescente de cultures multicouches cultivées à l’interface air-liquide en utilisant le colorant calcium intensitométrique récemment développé, Cal-520 AM, qui présente une sensibilité accrue par rapport au Fluo-4 AM. Ainsi, il est approprié de visualiser robustement des signaux subtils à une résolution cellulaire unique à partir de cultures épithéliales primaires complexes. La littérature actuelle est riche en imagerie calcique vivante des réponses en vrac provenant de lignées cellulaires stables. Cependant, il est désormais communément admis qu’in vivo, les tissus constituent un paysage cellulaire diversifié soutenant différents rôles spécifiques à chaque type cellulaire dans le maintien de l’homéostasie^tissulaire 12,13,14,15. Malgré cette connaissance commune, les mécanismes par lesquels des types cellulaires distincts coordonnent les signaux calciques et régulent l’homéostasie des ions calcium restent inconnus. Ainsi, les méthodes présentées ici permettront la détection unicellulaire de la signalisation calcique et augmenteront le débit des analyses en aval dans les tissus primaires des voies respiratoires.

Nous utilisons nos modèles de culture épithéliale primaire de l’épithélium humain précédemment publiés et rigoureusement validés comme outil pour imager le calcium cytosolique cellulaire vivant dans un modèle 16,17,18 plus pertinent sur le plan biologique. En résumé, les cellules épithéliales sont isolées des brosses nasales des patients et cultivées sur une membrane semi-perméable d’un transwell, qui est suspendu dans un puits de culture afin de maintenir une interface air-liquide (ALI). Cette interface, couplée à des milieux spécialisés, a été rigoureusement testée à l’aide de techniques orthogonales pour détecter différents types^cellulaires 16,17,18. De plus, il a été démontré que les méthodes actuelles sont transférables à des cultures bronchiques primaires cultivées de manière similaire à nos cultures nasales^{primaires 19}.

Cet article présente une méthode adaptée pour mesurer et analyser la signalisation calcique vivante à une résolution unicellulaire dans ces cultures épithéliales primaires des voies respiratoires. Ces cultures à plusieurs couches sont difficiles à visualiser à la microscopie ; Cependant, la configuration actuelle nous permet de nous concentrer de manière fiable sur des couches uniques au sein des cultures multicouches, ce qui nous permet de détecter la mobilisation du calcium provenant de ces couches spécifiques. Cette installation présente plusieurs avantages, car elle ne nécessite pas de système de perfusion, souvent coûteuse et difficile à adapter à moins d’utiliser des microscopes spécialisés. La microscopie à épifluorescence a été employée, offrant une meilleure résolution temporelle par rapport à l’imagerie confocale. L’utilisation de diodes électroluminescentes (LED) minimise la phototoxicité par rapport aux systèmes confocaux basés sur des lasers. Des colorants intensiométriques extrinsèques sont utilisés dans le protocole présenté ici car ils permettent des changements rapides et relatifs de calcium à travers toute la population cellulaire et sont compatibles avec la plupart des systèmes de microscopie à fluorescence. Cela est avantageux par rapport aux colorants ratiométriques courants, qui nécessitent une excitation ultraviolette profonde (UV) peu disponible sur de nombreux microscopes. De plus, la GCaMP nécessite une transfection ou une transduction, ce qui renforce la technique pour une imagerie calcique plus ciblée dans des types cellulaires spécifiques. En raison de la faible efficacité de transduction et de transfection dans les cultures épithéliales primaires, la technique est peu adaptée à la surveillance de l’ensemble de la population cellulaire.

De plus, cette étude a développé un logiciel spécialisé et innovant basé sur l’apprentissage automatique permettant la segmentation monocellulaire basée sur la coloration nucléaire vivante. Le logiciel est alors capable d’enregistrer les valeurs d’intensité de fluorescence pour chaque cellule au fil du temps. Une lignée cellulaire épithéliale stable (Calu-3) a été initialement utilisée pour l’optimisation des méthodes. Ensuite, ces méthodes ont été traduites pour étudier la mobilisation du calcium unicellulaire dans des cultures épithéliales primaires. Des variables telles que la concentration du colorant calcique et du probénécide, le moment des étapes d’incubation, ainsi que la configuration d’imagerie, ont été optimisées. Ici, la signalisation calcique est enregistrée à une fréquence d’images par seconde de 0,2 fps (images par seconde), ce qui convient à la surveillance de la signalisation calcique. Le taux d’images par seconde peut être augmenté afin de mesurer des transitoires calciques plus^{rapides 20}. Les variables optimales ont ensuite été appliquées et optimisées davantage dans des cultures nasales primaires plus complexes.

Protocole

Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Entretien et culture des cellules Calu-3

1. Maintenir les cellules de Calu-3 dans des flasques T-25 dans des milieux de culture EMEM complétés avec 20 % de FBS et 1 % de pénicilline/streptomycine. Préchauffez le substrat et changez-le les jours alternés (5 mL/flasque).
2. Lorsque les cellules sont confluentes à 70 % dans la fiole, aspirez le milieu dans la fiole.
3. Rince la fiole avec 5 mL de solution physiologique tamponnée phosphate (PBS).
4. Ajoutez 1 mL de TrypLE directement dans les cellules pendant 10 à 15 minutes à 37 °C, 5 % de CO₂. Assurez-vous que toutes les cellules se sont détachées du fond de la fiole et sont dissociées en suspension unicellulaire.
5. Neutralisez la réaction avec 4 mL de milieu de culture frais (étape 1.1), puis mélangez bien les cellules avec une pipette sérologique pour assurer un ensemencement uniforme.
6. Placez les cellules sur une plaque de 96 puits à une confluence de 90 % à 100 % (environ 40 000 cellules/puits).
   1. Pour semer les puits, ajoutez 200 μL/puits de suspension à cellules bien mélangées.
   2. Laissez les cellules adhérer à la plaque à 96 puits toute la nuit.
7. Changez le milieu chaque jour (200 μL/puits) jusqu’à ce qu’il soit prêt pour les expériences.
8. Laissez 2 à 5 jours après la confluence dans les puits pour commencer les expérimentations avant de réaliser des expériences afin de permettre la différenciation.

2. Protocole pour charger les cellules Calu-3 avec Cal 520 AM ou Fluo-4 AM

ATTENTION : Fluo-4 AM et Cal-520 AM sont dissous dans le DMSO, considéré comme dangereux. Probenecid est classé comme un danger aigu. Veuillez porter des gants et une blouse de laboratoire lors de la manipulation de produits chimiques afin d’éviter le contact avec la peau. Jetez tous les produits chimiques dans des bacs à déchets chimiques désignés.

1. Le jour de l’expérience, retirez les milieux des puits en pipettant et en lavant les cellules deux fois (200 μL/puits) dans un tampon de calcium préchauffé (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM_{MgCl 2} 2 mM_{CaCl 2 et} 10 mM Hepes, ajustés au pH 7,38 (NaOH) 291 mOsm), pour éliminer les cellules mortes.
2. Incuber les cellules avec 200 μL/puits d’un cocktail de 3 μM de Cal-520 AM, 2,5 mM de probénécide et 1:5000 de coloration nucléaire Hoechst dans tampon calcium (étape 2.1) pendant 1 h dans un incubateur réglé à 37°C et 5 % de CO₂.
   1. Pour les expériences Fluo-4 AM, incubez les cellules avec 200 μL/puits d’un cocktail de 3 μM Fluo-4 AM, 2,5 mM de probénécide et 1:5000 de coloration nucléaire Hoechst dans tampon calcium (étape 2.1) pendant 1 h à 37 °C et 5 % de CO₂.
      REMARQUE : Gardez les tubes de colorant dans l’obscurité en les recouvrant de papier aluminium.
3. Pendant l’incubation, préparez la thapsigargine dans un tampon de calcium (étape 2.1). Ajustez les concentrations intermédiaires du stock pour garantir des concentrations finales appropriées dans le puits.
   REMARQUE : Ici, 50 μL de médicament sont ajoutés à 100 μL du tampon de calcium existant. Par conséquent, un stock intermédiaire 3x de 6 μM a été préparé.
4. Après 1 heure, aspirez le colorant en pipettant et lavez le colorant extracellulaire avec un tampon de calcium (étape 2.1) deux fois (200 μL/puits).
5. Après les lavages, ajoutez 100 μL/puits de probénécide de 2,5 mM dilué dans un tampon de calcium (étape 2.1) pour maintenir le colorant dans l’espace cytoplasmique.
6. Enveloppez la plaque dans du papier aluminium pour la protéger de la lumière. Les cellules sont maintenant prêtes à être photographiées.

3. Mise en place de la microscopie pour la lignée cellulaire stable Calu-3

1. Utilisant le microscope à épifluorescence équipé d’un objectif SuperFluor, d’une source lumineuse stable à semi-conducteurs et d’une caméra à fluorescence CMOS (taille de 6,5 μm en pixel). L’intensité d’éclairage est réglée à 500 mW.
2. Placez la plaque de cellules sur l’étage à l’aide de l’adaptateur à plaque à 96 puits. Avec Brightfield, concentrez-vous sur la couche cellulaire à faible grossissement pour trouver la monocouche de cellules (utilisez 5 à 10 fois l’objectif de l’air).
   REMARQUE : Cette étape est optionnelle, mais utile pour obtenir une attention initiale efficace sur la couche cellulaire.
3. Une fois la couche cellulaire identifiée, utilisez Brightfield et passez à un grossissement plus élevé (objectif air 20x) et refocalisez sur la couche cellulaire.
   REMARQUE : Assurez-vous de faire bonne mise au point sur la monocouche avec Brightfield ; Les limites cellulaires doivent être claires.
4. Identifiez le signal du colorant calcique à l’aide de la GFP (LED 475 nm). Assurez-vous que la puissance des LED se situe entre 5 % et 10 % pour éviter le photoblanchiment, et le temps d’exposition est adapté pour visualiser le signal vert de base sans sursaturer le signal, généralement entre 300 et 500 ms.
   REMARQUE : Pour garantir la reproductibilité et même la charge en colorants, analysez qualitativement la couche cellulaire ; La plupart des cellules devraient afficher la même luminosité. Concentrez-vous sur les champs de vision avec peu de cellules mortes, qui fluorescent intensément avant d’ajouter un stimulant. L’intensité relative de fluorescence de base peut être mesurée à l’aide de Fiji (étape 7.9). La variation de fluorescence de base entre cellules devrait être proche de 10 % à 15 % si le colorant a été chargé uniformément (étape 7.9).
5. Identifiez la teinture nucléaire Hoechst à l’aide de la LED DAPI (405 nm). La puissance des LED devrait être comprise entre 2 % et 5 %, avec un temps d’exposition compris entre 50 et 100 ms.
   REMARQUE : Si les cellules sont nettes, les noyaux doivent apparaître avec des contours nets. Assurez-vous que le signal nucléaire n’atteigne pas la saturation, car les noyaux peuvent interférer avec le canal vert.

4. Acquisition de vidéos de calcium en direct

1. Commencez une vidéo en direct avec un intervalle d’une image toutes les 5 secondes (0,2 fps) pendant 10 minutes.
   REMARQUE : Capturez chaque canal fluorescent (DAPI 405 nm et GFP 475 nm) à chaque image.
2. Une fois la vidéo lancée, laissez une lecture de base de 5 minutes avant d’ajouter des agonistes.
3. À l’aide d’une pipette P200, ajoutez 50 μL de thapsigargine à un stock intermédiaire 3x dans le puits contenant 100 μL de probénécide de 2,5 mM dans un tampon calcique (étape 2.1). Resuspendez doucement 1 à 2 fois dans le puits pour assurer une répartition uniforme du médicament. Continuez à lire pendant 5 minutes après l’ajout du thapsigargin.
   REMARQUE : L’étape d’ajout de médicaments est cruciale ; La pointe de la pipette ne doit pas entrer en contact avec la plaque pour déplacer le plan de mise au point. À la place, faites flotter la pointe de la pipette pour ne toucher que le tampon à l’intérieur du puits. Si les médicaments sont mélangés trop vigoureusement, les cellules peuvent se détacher de la plaque et interférer avec le signal.
   REMARQUE : Veillez à noter le cadre dans lequel le médicament est ajouté pour l’analyse en aval.
4. Enregistrez la vidéo et l’instantané pris avant l’expérience. Passez à l’analyse des données.

5. Protocole pour charger les cellules des voies aériennes primaires avec Cal 520 AM ou Fluo-4 AM

1. Le jour de l’expérience, retirez le milieu basolatéral du puits trans et lavez deux fois les côtés apical et basolatéral de l’insert à l’aide de 750 μL de basolatéral et 300 μL d’apical du tampon de calcium (étape 2.1).
2. Incubez les cellules avec 600 μL de basolatéral et 200 μL apical des colorants Cal-520 AM ou Fluo-4 AM pendant 1 h à 37 °C et 5 % de_CO-2. Préparez le colorant de la même manière que pour les cellules Calu-3, pour Cal-520 AM, 3 μM Cal-520 AM, 2,5 mM probénécid, et 1:5000 Hoechst dans tampon calcique (étape 2.1). Pour Fluo-4 AM, 3 μM Fluo-4 AM, 2,5 mM de probénécid, et 1:5000 Hoechst dans le même tampon calcium.
3. Pendant la période d’incubation, préparer la thapsigargine à un stock intermédiaire de 3× pour une concentration finale de 2 μM (6 μM de stock intermédiaire).
4. Ensuite, aspirez le colorant et lavez les cellules deux fois avec un tampon apical de 300 μL et un tampon basolatéral contenant du calcium à 750 μL (étape 2.1).
5. Après les lavages, ajoutez 100 μL d’apical et 500 μL de basolatéral de probénécide de 2,5 mM dans un tampon de calcium (étape 2.1).
6. En gardant la transmission bien dans la plaque, enveloppez-la dans du papier aluminium. Les cellules sont maintenant prêtes pour l’imagerie.

6. Installation de la microscopie pour les inserts nasaux primaires

1. Procurez-vous une boîte de Pétri à fond de verre adaptée à l’imagerie, des pinces à épiler et un ruban de masquage fin. Assurez-vous que la boîte de Petri est propre en l’essuyant rapidement avec 70 % d’éthanol et en la laissant sécher complètement.
2. Placez la boîte de Petri à fond de verre dans le petit adaptateur circulaire du microscope à épifluorescence.
3. À l’aide d’une pince à épiler, placez soigneusement l’insert au centre du plat à fond de verre.
   REMARQUE : Faites attention à ne pas renverser le tampon, qui est placé dans le compartiment apical de l’insert.
4. Pour éviter que l’insert ne bouge lors des ajouts de médicaments, utilisez du ruban adhésif pour fixer le dessus du plastique de l’insert sur les côtés du plat à fond en verre.
5. Placez l’adaptateur avec l’insert fixé sur la scène du microscope et commencez par focaliser les cellules à l’aide de l’objectif 10x de champ lumineux d’air.
6. Identifiez le signal du colorant calcique à l’aide de la GFP (LED 475nm). Assurez-vous que la puissance des LED se situe entre 5 % et 10 % pour éviter le photoblanchiment, et le temps d’exposition est adapté pour visualiser le signal vert de base sans le sursaturer, généralement entre 300 et 500 ms.
   REMARQUE : Veuillez consulter la NOTE sous l’étape 3.4 pour garantir une bonne charge en colorant calcique.
7. Identifiez la teinture nucléaire Hoechst à l’aide de la LED DAPI (405 nm). La puissance des LED devrait être comprise entre 2 % et 5 %, avec un temps d’exposition compris entre 50 et 100 ms.
   REMARQUE : Si les cellules sont au foyer, les noyaux doivent apparaître avec des contours clairs et définis. Concentrez-vous sur la couche la plus apicale des cellules. Ajustez l’axe z du microscope pour identifier le plan focal le plus élevé où les cellules restent nettes. Assurez-vous que les noyaux n’atteignent pas la saturation du signal, car le signal nucléaire peut interférer avec le canal vert.
8. Pour obtenir la vidéo en direct sur le calcium, suivez les étapes 5.1 à 5.4. Pendant l’étape d’ajout de médicaments, ajoutez au centre de l’insert et resuspendez lentement à l’aide d’une pipette P200.
   REMARQUE : Veillez à noter le cadre dans lequel le médicament est ajouté pour l’analyse en aval.

7. Analyse utilisant le logiciel fidjien

1. Ouvrez l’application Fiji et sélectionnez Fichier \ Ouvrir, téléchargez le fichier vidéo, et dans la fenêtre contextuelle qui en résulte, conservez tous les paramètres par défaut.
2. Si désiré, sous Image \ Ajuster \ Luminosité/Contraste, modifiez la luminosité et le contraste des canaux de fluorescence distincts afin d’avoir la meilleure vue possible des cellules.
3. Pour faciliter le traçage des cellules, fusionnez les canaux de coloration nucléaire ou de champ clair à l’aide des canaux Image \ Couleur \ Fusion et sélectionnez les fichiers appropriés pour chaque canal individuel dans la fenêtre contextuelle.
4. Pour tracer des cellules spécifiques en fonction des limites cellulaires et de la coloration nucléaire, utilisez Analyze \ Tools \ ROI Manager et cochez à la fois afficher tout et étiqueter dans la fenêtre contextuelle résultante.
5. Tracez soigneusement les cellules à l’aide de l’outil de sélection à main levée et appuyez sur t pour ajouter une cellule.
   REMARQUE : Assurez-vous que les cellules sont tracées dans les 4 coins et au centre de la vidéo.
6. Une fois toutes les cellules tracées avec précision, dans l’onglet ouvert avec tous les ROI, cliquez sur Plus \ Multi Mesures, puis appuyez sur OK sur la fenêtre contextuelle résultante.
7. Copiez toute la feuille dans la fenêtre contextuelle résultante intitulée Résultats dans un fichier Excel.
   REMARQUE : La feuille résultante comportera 6 sous-titres (Area1, Mean1, Min1, Max1, IntDen1, RawIntDen1) pour chaque ROI avec une valeur numérique après chacun, correspondant à la cellule correspondante à tracée. La valeur importante pour l’analyse en aval sera la moyenne de chaque ROI.
8. Afin de surveiller la variation entre l’intensité de fluorescence, calculez la fluorescence moyenne au cours de la référence pour chaque cellule, et calculez la variance en pourcentage. Les expériences présentent généralement une variance comprise entre 20 % et 30 %.
   
9. Normalisez toutes les lectures en divisant les valeurs moyennes d’intensité par la première lecture de la ligne de base pour chacune des cellules tracées.
10. Créez une colonne supplémentaire pour le temps en secondes, la première image correspondant à l’image 0 et les points temporels suivants augmentant de 5, ce qui correspond à l’intervalle de 0,2 fps.
11. Copiez les données dans un logiciel d’analyse et de graphisme et générez une courbe de variation de fluorescence sur la ligne de base au fil du temps.
    REMARQUE : Pour générer des graphiques de maxima à cellule unique, utilisez la fonction =MAX() dans Excel pour trouver le référentiel auquel l’intensité maximale de fluorescence est atteinte pour chaque cellule et tracez avec GraphPad Prism.

8. Analyse utilisant la suite calcique

1. En utilisant Fiji, ouvrez le fichier vidéo et suivez les étapes 8.1 et 8.2.
2. Une fois les canaux nucléaire et vert optimisés pour la vision, dupliquez une seule image de la vidéo en cliquant sur Image \ Dupliquer. Dans la fenêtre contextuelle résultante, désélectionnez la pile Duplique Hyper. Dans la même fenêtre contextuelle, sous canaux, type 1. Enregistrez-le comme fichier image PNG.
3. Répétez l’étape 9.2 et sous les canaux, tapez 2.
   Fusionnez les deux images en suivant l’étape 8.3. Téléchargez l’image dans l’interface graphique Cell-Pose (interface graphique) pour générer un masque cellulaire.
4. Téléchargez l’image dans l’interface graphique Cell-pose, et segmentez en utilisant la coloration nucléaire (Canal 1) et les colorations cytoplasmiques (Canal 2) en sélectionnant le modèle Cyto3.
5. Enregistrez l’image en fichier PNG, puis ouvrez le fichier PNG aux Fidji et convertissez-le en fichier TIFF.
   REMARQUE : L’interface graphique en position cellulaire produit un fichier PNG en noir et blanc.
6. Ouvrez à la fois le fichier masque et le fichier vidéo dans la Calcium Suite en glissant-déposant, puis cliquez sur Analyser les données pour générer un graphique téléchargeable, ainsi qu’un fichier .csv téléchargeable contenant les valeurs d’intensité normalisées et brutes pour toutes les cellules comptées par le logiciel.

Résultats

Pour mesurer la mobilisation du calcium dans les cellules vivantes, des cellules de Calu-3 ou cultures nasales primaires différenciées sont incubées avec un colorant intracellulaire. Le changement relatif du signal dépendant du calcium est mesuré par une augmentation de la mobilisation du calcium, soit depuis les réserves de calcium intracellulaires, soit par l’espace extracellulaire dans le cytosol. Une augmentation soutenue du calcium dans le cytosol est représentée par une augmentatio...

Discussion

Cet article a présenté des méthodes pour analyser la signalisation calcique unicellulaire dans des cultures nasales primaires vivantes ainsi qu’une lignée cellulaire épithéliale stable. Les rapporteurs calcium Cal-520 AM et Fluo-4 AM sont tous deux des indicateurs utiles pour le calcium dans les deux configurations. Le Cal-520 AM est plus sensible car il a un rendement quantique plus élevé de 0,75 comparé à 0,16 du Fluo-4 AM et une affinité légèrement plus élevée pour le calcium (le Kd d...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque à 24 puits   ;	Thermofisher & nbsp ;	142475
Inserts transwell à 24 puits   ;	Corning  ;	CLS3470-48EA
Microplaques à fond plat transparent noir traité TC à 96 puits	Corning  ;	3603
Cal-520 AM	AAT Bioquest  ;	21130	Attribué et stocké à -20°rés ; C, dissous dans le DMSO
Logiciel Calcium Suite	Le code peut être demandé en contactant notre groupe de laboratoire
EMEM, 1xs	Wisent  ;	320-005-CL	Stocké à 4°ré ; C  ;
Sérum fœtal bovin   ;	Wisent  ;	080-450	Attribué et stocké à -20°rés ; C
Fluo-4 AM & nbsp ;	AAT Bioquest  ;	20550	Attribué et stocké à -20°rés ; C, dissous dans le DMSO
HEPES	Bioshop	HEP001.5	Stocké à température ambiante
Hoechst  ;	Thermofisher & nbsp ;	H3570	Stocké à 4°ré ; C  ;
Lignée cellulaire de l’adéoncarcinome colorectal épithélial humain   ;	ATCC	HTB-55
Chlorure de magnésium & nbsp ;	Sigma  ;	7786-30-3	Stocké à température ambiante
Micro-antenne 35 mm, fond en verre bas	Ibidi  ;	80137	Conservé à température ambiante   ;
Solution de pénicilline-stramtomycine	Wisent  ;	450-200-EL	Stocké à 4°ré ; C
Solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS)	Wisent  ;	3111-010-CL	Conservé à température ambiante   ;
Chlorure de potassium   ;	Sigma  ;	7447-40-7	Conservé à température ambiante   ;
Probenecid  ;	Thermofisher	P36400	Attribué et stocké à -20°rés ; C, soluble dans l’eau   ;
Chlorure de sodium & nbsp ;	Bioshop  ;	SOD004	Conservé à température ambiante   ;
Thapsigargin & nbsp ;	Thermofisher	T7458	Attribué et stocké à -20°rés ; C dissous dans DMSO  ;
Enzyme TripLE Express (1X), phénol rouge   ;	Thermofisher	12605010	Stocké à 4°ré ; C