Ce protocole démontre l’injection de veines temporales pour la délivrance par voie intraveineuse de cellules cancéreuses pédiatriques à des souris néonatales, permettant une modélisation précise et reproductible des réponses immunitaires précoces contre le cancer. La méthode permet d’évaluer l’impact des interventions, telles que l’immunomodulation ou la thérapie, lorsqu’elles sont appliquées pendant la période néonatale.
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Article de méthode
Un modèle de transplantation intraveineuse néonatale pour l’évaluation des activités immunitaires précoces contre les cellules cancéreuses
Dans cet article
Résumé
Résumé
Plus de la moitié des cancers pédiatriques sont initiés in utero, la progression vers une maladie manifeste se poursuivant pendant la période néonatale. Bien que les immunothérapies offrent désormais de nouvelles options de traitement pour de nombreux enfants atteints de cancer, la manière dont l’immunité précoce influence la progression du cancer et la réponse thérapeutique reste incomplètement comprise. Pour combler cette lacune, il faudra évaluer les interventions thérapeutiques durant la période néonatale, lorsque les réponses immunitaires diffèrent fondamentalement de celles de la fin de l’enfance et de l’âge adulte.
Ici, nous décrivons un modèle de transplantation néonatale qui s’intègre à l’imagerie bioluminescente in vivo afin d’étudier l’impact de la modulation immunitaire précoce sur les cancers pédiatriques.
L’injection veineuse temporale de cellules marquées à la luciférase issues de deux cancers in utero a permis une implantation tumorale reproductible chez des receveurs syngéniques âgés de 1 à 2 jours, sans mortalité liée à la procédure et avec un succès procédural élevé, comme confirmé par l’imagerie bioluminescente. En utilisant la modulation immunitaire due à l’infection comme variable expérimentale, nous montrons ensuite qu’une infection intrapéritonéale par cytomégalovirus murien cinq jours après la greffe entraîne une réduction marquée de la charge de la leucémie lymphoblastique aiguë (LLA), mais pas du neuroblastome (NB). Cette plateforme permet d’étudier les différences spécifiques au cancer en réponse à la modulation immunitaire en début de vie et souligne l’importance du contexte tumoral lors de la modélisation des interactions immunitaire-cancer dans la petite enfance.
Collectivement, cette méthodologie offre une plateforme polyvalente et hautement reproductible pour interroger les mécanismes immunitaires néonatals pertinents pour l’immunosurveillance du cancer, la modulation immunitaire par infection et l’intervention thérapeutique. Au-delà de la LLA et du NB, cette approche peut être adaptée à d’autres cancers pédiatriques et à des stratégies immunomodulatrices, soutenant les études mécanistes et l’évaluation préclinique des interventions oncologiques précoces.
Introduction
Les avancées récentes en immunothérapie ont nettement amélioré les résultats pour certains patients atteints de cancer, mais leur application optimale chez les jeunes enfants nécessite une compréhension approfondie de la manière dont le système immunitaire en développement identifie et éradique les cellules cancéreuses. Bien qu’environ 50 % des cancers infantiles aient leur origine in utero, y compris la leucémie lymphoblastique aiguë à cellules B (B-ALL) et NB, des preuves croissantes suggèrent que les événements postnataux influencent de manière critique l’évolution de la maladie et le résultatclinique 1,2.
Les réponses immunitaires néonatales diffèrent quantitativement et qualitativement de celles des adultes3. En l’absence d’une immunité adaptative pleinement développée, la protection des nouveau-nés repose fortement sur les anticorps maternels et les cellules immunitaires innées. Cependant, ces effecteurs innés sont fonctionnellement moins efficaces que leurs homologues adultes en raison de l’hypo-réactivité intrinsèque des cellules et de l’activation accrue des voies immunosuppressives, rendant les nouveau-nés particulièrement vulnérables àl’infection 4,5,6. Cependant, l’impact de ces caractéristiques sur la capacité du système immunitaire immature à produire des réponses anticancéreuses efficaces reste peu compris.
Modéliser l’immunité anticancéreuse au début de la vie nécessite la délivrance précise et reproductible des cellules cancéreuses et des modulateurs immunitaires ou agents pathogènes durant la courte fenêtre postnatale, lorsque la fonction immunitaire est limitée. L’injection veineuse temporale est une méthode d’administration intraveineuse (IV) néonatale qui répond le mieux à ces exigences et offre un succès procédural élevé, une faible mortalité, un stress minimal de manipulation et une compatibilité avec des interventions séquentielles, telles que le défi infectieux ou l’administrationthérapeutique 7,8,9,10.
Dans cette étude, nous avons développé et modifié des techniques d’administration intraveineuse néonatales précédemment validées ainsi que la polyvalence de l’imagerie bioluminescente in vivo pour décrire un modèle de transplantation visant à étudier l’impact des infections précoces sur la progression des cellules cancéreuses pédiatriques. Cette approche permet la délivrance intraveineuse de cellules B-ALL ou NB marquées par luciférase à des petits de 1 à 2 jours, suivie d’une modulation immunitaire par administration intrapéritonéale (i.p.) de cytomégalovirus murien (mCMV) au jour postnatal 7 (P7). La progression du cancer a ensuite été évaluée 10 jours après l’infection (P17).
Bien que l’accès à la veine temporale soit limité à une fenêtre postnatale limitée (P0–P3), cette méthodologie améliore la reproductibilité et le contrôle expérimental, offrant une plateforme polyvalente pour étudier l’influence des mécanismes immunitaires précoces sur l’immunosurveillance du cancer, les interactions infection–cancer et les réponses à l’immunothérapie. De plus, cette approche favorise le homing efficace des cellules transplantées, permettant ainsi l’établissement reproductible de modèles de maladies pour des recherches mécanistiques.
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Protocole
Toutes les procédures (Figure 1) ont été menées conformément aux directives du Conseil canadien de la protection des animaux et ont été approuvées par le Comité des soins aux animaux de l’Université de la Colombie-Britannique (protocole A23-0169).
1. Génération de cellules leucémiques marquées à la luciférase
- Isolement des cellules leucémiques de souris leucémiques Eμ-Ret
- Anesthésiez les souris dans une chambre d’induction de 1 L avec 5 % d’isoflurane et 1 L·min-1 d’oxygène jusqu’à obtenir un plan chirurgical profond (perte du réflexe de redressement et respiration lente et régulière).
- Une fois l’anesthésie profonde confirmée, arrêtez l’isoflurane et administrez du dioxyde de carbone (CO₂) à un débit élevé (3 à 4 fois le débit progressif standard ; par exemple, 6-8 L·min pour une chambre de 10 L) sans transférer l’animal entre les chambres. Maintenir une exposition au CO₂ pendant au moins 5 minutes après la fin de la respiration pour assurer la mort.
- Ventilez et récupérez les gaz résiduels avant d’ouvrir la chambre.
- Confirmer la mort par absence de battement cardiaque et de respiration, puis effectuer une luxation cervicale comme méthode physique secondaire conformément à l’institution.
- Transférez la carcasse dans un cabinet de biosécurité, confirmez à nouveau le décès, notez le sexe et le poids corporel, et pulvérisez l’extérieur avec 70 % d’éthanol.
- Réaliser une incision abdominale médiane, réfléchir la peau et la paroi péritonéale, puis exciser la rate dans un PBS stérile de 5 mL.
- Disséquez les tibias et les fémurs des deux jambes, en retirant l’excès de tissu, puis excisez la rate dans des conditions stériles. Transférez immédiatement la rate dans une solution stérile de solution de phosphate tamponné (PBS) de 5 mL pour préserver la viabilité cellulaire.
- Traitez la rate.
- Homogénéisez le tissu de rate dans 1 mL de tampon de lyse de 1× globules rouges (globules rouges) (utilisez 2 mL pour la rate > 200 mg). Incubez pendant 2 à 3 minutes à température ambiante.
- Tremper la lyse en ajoutant 10 mL de PBS + 2 % de sérum bovin fœtal (FBS) (tampon FACS), filtrer à travers une passoire de 40 μm, puis centrifuger à 350 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
- Resuspendez la pellete de rate dans un tampon FACS de 5 mL.
- Traiter la moelle osseuse.
- Retirez les deux épiphyses et rincez chaque os avec un tampon FACS de 1 mL à l’aide d’une seringue de 1 mL équipée d’une aiguille calibre 29 dans un tube de 15 mL.
- Centrifugez la suspension cellulaire, jetez le surnageant et resuspendez les cellules dans 1 mL de tampon de lyse à 1× globules rouges, incubez pendant 2 minutes à RT, puis trempez la lyse en ajoutant 10 mL de tampon FACS, filtrez à travers un tamis de 40 μm, puis centrifugez à 350 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
- Jetez le surnageant et resuspendez la pastille BM dans un tampon FACS de 1 mL en pipettant vers le haut et le bas.
- Utilisez doucement le vortex et filtrez à travers une passoire de 40 μm si besoin.
- Resuspendre 0,5 × 10^6 cellules leucémiques dans des milieux de culture cellulaire de 200 μL (par exemple le Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco) complétés avec 20 % de FBS et d’interleukine-7 (IL-7 ; 250 pg·mL-1).
Point de pause : Laissez les suspensions cellulaires sur glace jusqu’à 2 heures avant la teinture.
- Transduction lentivirale des cellules leucémiques :
- Semez les cellules stromales issues de la moelle osseuse murines à 1 × 10^5 cellules par puits dans une plaque de 24 puits 24 heures avant la transduction afin de permettre l’adhérence et atteindre une confluence de 70 à 80 %.
- Les cellules leucémiques à plaques (0,5 × 10^6 cellules dans un volume final de 200 μL) dans une plaque à 24 puits traitée non en culture tissulaire.
- Ajoutez un vecteur lentiviral auto-inactivant (SIN) codant pour un reporter de double fusion composé de luciférase rouge de scarabée clic (CBR) et de protéine fluorescente verte améliorée (eGFP), entraîné par un promoteur constitutif d’ubiquitine, avec la multiplicité de l’infection (MOI) : 10–20, titre viral : ≥ 1 × 10^8 TU·mL-1 (unités transductrices par millilitre) dans un volume de transduction final de 200 μL avec polybrene (8 μg·mL-1 ; Sigma, H9268-5G).
ATTENTION : La polybrene est cytotoxique à haute concentration. Ne pas dépasser 8 μg·mL-1. Manipuler le lentivirus sous confinement de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). - Scellez la plaque avec du parafilm et centrifugeuse à 1 200 × g pendant 20 minutes à température ambiante (RT).
- Après la spinoculation, transférez les cellules leucémiques transduites sur une monocouche stromale et cultivez pendant 24 heures à 37 °C, 5 % de CO₂ dans le DMEM + 20 % FBS + IL-7 (250 pg·mL-1) pour soutenir la survie cellulaire et l’expression du rapporteur.
REMARQUE : Les antibiotiques peuvent être ajoutés après 24 heures si nécessaire, mais doivent être évités lors de la transduction virale. - Après 24 heures, collectez les cellules leucémiques non adhérentes et lavez deux fois avec du sérum stérile tamponné phosphate (PBS), 350 × g pendant 20 minutes à 4 °C, pour éliminer les résidus du virus et du polybrene.
- Resuspendre les cellules dans un PBS stérile à 1 × 10^7 cellules·mL-1 pour la transplantation.
Point de pause : Après lavage, les cellules peuvent être maintenues dans la même condition de culture jusqu’à 48 heures avant la transplantation si nécessaire.
- Transplantation chez des souris adultes NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rg tm1Wjl/SzJ)
- Utilisez des souris NSG de 4 à 6 semaines comme receveur.
- Chauffez la souris pendant 5 minutes à l’aide d’un tapis chauffant ou d’une lampe chauffante pour dilater les nervures de la queue.
- Maîtrisez la souris avec un retenue en acrylique.
- Injectez 1 × 10^6 cellules dans un PBS stérile de 100 μL via une veine de la queue latérale à l’aide d’une seringue d’insuline de calibre 29. Aucune anesthésie requise (sauf indication des directives institutionnelles)
- Appliquez une pression douce sur le site d’injection pour éviter les saignements.
ATTENTION : Évitez l’extravasation. Une injection intraveineuse réussie ne provoque aucun gonflement visible. - Surveillez les souris deux fois par semaine pour détecter le développement de la maladie.
- Tri des cellules leucémiques GFP+
- Au début de la maladie, prélèvez la semote ou la rate sur des souris leucémiques NSG.
- Préparez une suspension à cellule unique comme décrit ci-dessus.
- Cellules de teinture avec un colorant de viabilité (7-AAD).
- Utilisez le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour trier les cellules leucémiques GFP+.
- Pour le tri, utilisez un trieur de cellules à haute vitesse et suivez la stratégie de diffusion directe (FSC) vs diffusion latérale (SSC) → exclure les débris, FSC-A vs FSC-H → sélectionnez les singlets, colorant de viabilité négatif → sélectionnez des cellules vivantes, grille GFP+ → isolez les cellules leucémiques rapporteur-positives.
- Collectez les cellules triées dans des tubes contenant du DMEM + 20 % de FBS. Pureté cible après tri : ≥ 95 % de cellules GFP+.
Point de pause : Les cellules triées peuvent être conservées sur la glace jusqu’à 2 heures avant la cryopréservation.
- Cryopréservation des cellules triées
- Resuspendez les cellules triées à 5 × 10^6 cellules/mL dans un milieu de congélation contenant 90 % de FBS et 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO).
- Aliquote 1 mL par cryovial et place les fioles dans un récipient congelant à base d’isopropanol, puis conserve à −80 °C toute la nuit (12–18 h).
- Transférer les fioles dans de l’azote liquide (LN₂) pour un stockage à long terme.
ATTENTION : Le DMSO est toxique et facilement absorbé par la peau. Manipulez avec des gants et travaillez rapidement.
Point de pause : Les cellules peuvent être stockées à long terme dans de l’azote liquide jusqu’à leur utilisation dans des expériences de transplantation néonatale.
2. Génération de cellules NB marquées à la luciférase
REMARQUE : Les souris transgéniques TH-MYCN développent des tumeurs NB spontanées et ont été maintenues selon des protocoles de soins institutionnels approuvés. Le vecteur lentiviral utilisé est le même que décrit à la Section 1.2.
- Prélèvement tumoral et dissociation tissulaire
- Euthanasiez les souris porteuses de tumeurs TH-MYCN selon les directives approuvées pour les soins aux animaux.
- Prélève des tumeurs NB sous-cutanées ou abdominales dans des conditions stériles.
- Pèser le tissu tumoral et réduire en fragments de ~1 à 2 mm à l’aide de ciseaux stériles.
- Transférer le tissu dans environ 5 mL de tampon digestif par tissu tumoral de 0,5 g dans un tube conique de 15 mL, composé de DMEM, de désoxyribonucléase I (DNase I ; 50–100 U·mL-1) et d’un mélange enzymatique à base de collagénase (concentration finale de 10 μg·mL-1 ).
- Incubez à 37 °C dans un incubateur secoué à 150 tr/min pendant 30 minutes.
ATTENTION : Les réactifs digestifs enzymatiques peuvent provoquer des irritations de la peau et des yeux. Portez des gants et une protection oculaire. - Après la digestion, pipetez doucement de haut en bas pour dissocier davantage les tissus. Filtrez la suspension à travers un filtre de cellules de 70 μm dans un tube frais.
- Centrifugez à 300 × g pendant 5 minutes à température ambiante (20–22 °C).
- Jetez le surnageant et remettez le pellet en suspension dans du DMEM complété avec 10 % de FBS.
- Effectuer la lyse des globules rouges en utilisant le tampon de lyse RBS comme décrit précédemment à la Section 1.1.
- Centrifugez à 300 × g pendant 5 minutes et remettez le pellet dans du DMEM à haute teneur en glucose de 10 mL complétés avec un FBS à 10 % et 50 μM de 2-mercaptoéthanol.
ATTENTION : Le 2-mercaptoéthanol est toxique et volatil. Effectuez la manipulation dans une hotte chimique.
Point de pause : Les cellules peuvent être maintenues sur la glace jusqu’à 1 heure avant la transduction.
- Transduction lentivirale
- Pellet 2 × 10^6 cellules NB à 300 × g pendant 5 minutes et retirez complètement le surnageant.
- Resuspendez directement la pellete cellulaire dans un vecteur lentiviral concentré de 14 μL (même vecteur décrit à la Section 1.2 ; titre viral ≥ 1 × 10^8 TU·mL-1, MOI approximatif : 10–20).
- Incubez le mélange cellule-virus pendant 5 minutes à 37 °C dans un incubateur humidifié ( % CO₂).
- Ajoutez 200 μL de DMEM à haute glycémie + 10 % de FBS et poursuivez l’incubation pendant 2 heures à 37 °C, 5 % de CO₂.
ATTENTION : Les vecteurs lentiviraux doivent être manipulés dans des conditions BSL 2. - Laver les cellules transdudues quatre fois avec du DMEM à haute glycémie pour éliminer les résidus du virus.
- Compter les cellules viables en utilisant l’exclusion du bleu de trypan.
IMPORTANT : Gardez la préparation matricielle sur la glace en permanence pour éviter une gélification prématurée.
- Implantation sous-cutanée dans des souris NSG
- Resuspendre les cellules à 5 × 10^6 cellules par 100 μL dans une préparation de matrice membranaire à membrane basale froide (matrice extracellulaire réduite par facteur de croissance).
- Anesthésiez des souris NSG âgées de 6 à 8 semaines (voir Section 1.1) en utilisant de l’isoflurane inhalé (2 à 3 % en oxygène).
- Mélange de cellule de charge-matrice dans une seringue pré-refroidie de 1 mL équipée d’une aiguille de calibre 27.
- Injecter 5 × 10^6 cellules dans un volume total de 100 μL par voie sous-cutanée dans la région du flanc.
- Surveillez les souris jusqu’à la récupération complète de l’anesthésie.
REMARQUE : Injectez immédiatement après avoir été mixé avec la matrice pour éviter la solidification à l’intérieur de la seringue. - Laissez les tumeurs atteindre ~1 cm de diamètre.
- Tri des cellules
- Prélever les tumeurs et générer des suspensions unicellulaires comme décrit aux sections 2.1 à 2.2.
- Enrichir les cellules marquées à la luciférase par FACS basé sur l’expression de la GFP, en suivant la stratégie de gating décrite à la Section 1.4.
- Effectuez deux cycles de tri consécutifs pour atteindre ≥ pureté positive à 95 % de GFP.
- Cryoconservation
- Cellules triées par cryoconservation comme décrit à la Section 1.5.
Point de pause : Les cellules peuvent être stockées à long terme dans de l’azote liquide pour de futures expériences de transplantation.
- Cellules triées par cryoconservation comme décrit à la Section 1.5.
3. Préparer la suspension cellulaire pour l’injection de la veine temporale
- La cryopophée a prévauvé rapidement les cellules leucémiques marquées à la luciférase ou cellules NB dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à ce qu’il reste un petit cristal de glace.
- Désinfectez immédiatement l’extérieur du flacon avec 70 % d’éthanol, puis transférez le contenu dans 9 mL de milieu DMEM préchauffé + 10 % FBS dans un tube conique de 15 mL.
- Centrifugez à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C, aspirez le surnageant, puis remettez le pellet dans un PBS stérile et glacé.
- Déterminez la viabilité à l’aide d’exclusion du bleu de trypan et d’un hémocytomètre (ou compteur cellulaire automatisé). N’utilisez que des suspensions avec ≥ 80 % de viabilité.
- Faites passer la suspension de la cellule à travers un tamis de 40 μm pour enlever les ammeubles.
ATTENTION : Les amas cellulaires augmentent les injections ratées et les lésions tissulaires. - Ajustez la concentration pour préparer 20 μL par nouveau-né contenant 1 × 10^4 cellules leucémiques (pour la transplantation leucémique), ou 5 × 10^4 cellules NB (pour la transplantation NB).
- Gardez la suspension des cellules sur la glace et mélangez doucement immédiatement avant de charger la seringue pour maintenir l’homogénéité.
Point de pause : Laissez les cellules sur la glace jusqu’à 2 heures avant l’injection si la viabilité reste ≥ 80 %.
4. Injection de veine temporale (petits P1–P2)
REMARQUE : L’injection de veine temporale néonatale peut être réalisée sans anesthésie. Cependant, une immobilisation hypothermique brève est couramment utilisée pour réduire les mouvements et améliorer la précision de l’injection. L’utilisation de l’immobilisation hypothermique n’est pas autorisée par certains comités institutionnels de soins aux animaux – les enquêteurs doivent consulter leur comité institutionnel concerné avant d’effectuer cette procédure. Si approuvé par votre établissement, les étapes suivantes sont efficaces pour l’immobilisation hypothermique.
- Préparez un petit récipient doublé d’une serviette stérile et pré-refroidissez en le posant sur de la glace.
- Placez les petits (jours postnatals 1–2 ; P1–P2) sur la serviette à l’intérieur du récipient pour l’immobilisation hypothermique pendant 2–3 minutes jusqu’à ce que les mouvements spontanés soient nettement réduits.
IMPORTANT : N’autorisez pas les chiots à toucher directement la glace (utilisez en permanence le contenant et la barrière de serviette). - Chargez 60 μL de la suspension à cellules dans une seringue en verre de 100 μL et fixez une aiguille de calibre 30. Expulsez la suspension dans le tube pour remplir le volume mort de la seringue et de l’aiguille. Une fois le volume mort amorcé, aspirez 20 μL de suspension cellulaire pour injection, en veillant à ce qu’aucune bulle d’air ne soit présente. Utilisez des souris BALB/c et TH-MYCN comme receveurs de cellules leucémiques et NB, respectivement.
- Préparez une scène trans-illuminée en plaçant une source de lumière froide sous une plateforme en plexiglas.
- Portez des lunettes grossissantes (ou utilisez un stéréomicroscope) pour visualiser le site d’injection.
- Placez une serviette stérile avec un trou central sur la scène et placez le chiot de façon à voir la veine temporale.
- Placez un petit morceau de pâte à modeler (pâte à modeler) à côté de la tête du chiot pour aider à stabiliser l’aiguille pendant l’injection.
- Insérez le biseau à aiguille dans la veine temporale visible et injectez lentement la suspension cellulaire, en observant le remplissage vasculaire pour confirmer la réussite de l’administration intraveineuse.
- Après l’injection, appliquez une pression douce sur le site d’injection à l’aide d’un coton-tige stérile. Placez le chiot sur une surface de récupération chauffée (environ 37 °C, par exemple un coussin chauffant à faible température avec une barrière anti-serviette) jusqu’à ce que le mouvement normal et la coloration rose reviennent.
- Surveillez le chiot pendant 5 à 10 minutes après la récupération, puis ramenez-le à la mère.
ATTENTION : Évitez de surchauffer pendant la récupération. Utilisez une couche barrière et surveillez en continu. - Rincez immédiatement la seringue avec du PBS, puis avec une solution nettoyante à la seringue, et terminez avec 70 % d’éthanol.
5. Préparation du virus et infection
- Effectuer toutes les procédures impliquant le cytomégalovirus murien (mCMV) sous confinement BSL-2 conformément aux autorisations institutionnelles de biosécurité et aux soins aux animaux.
- Manipuler les stocks de virus dans un cabinet de sécurité biologique certifié de classe II et effectuer les infections animales dans les zones de procédure BSL-2 désignées.
- Effectuer la préparation et la manipulation du virus dans un cabinet de sécurité biologique certifié Classe II, et effectuer les infections animales dans les zones désignées pour la procédure BSL-2.
- Portez des équipements de protection adaptés, y compris une blouse de laboratoire ou une blouse jetable, des gants et une protection oculaire. Considérez tous les matériaux contenant un virus (seringues, literie, cages et surfaces) comme potentiellement infectieux.
- Minimisez l’utilisation des objets tranchants et jetez immédiatement les aiguilles dans des contenants approuvés pour biohazard. Décontaminez les surfaces de travail et les équipements après utilisation. Éliminer tous les déchets solides et liquides comme déchets bio-dangereux selon les procédures institutionnelles.
- Infecter les souris à P7 (5 à 6 jours après la greffe de cellules leucémiques).
- Décongelez un virus aliquote sur glace, mélangez doucement par inversion, puis laissez-le sur glace pendant la préparation. Évitez les cycles répétés de gel-dégel (utilisez des aliquotes à usage unique).
- Préparez la mCMV à 2 × 10^5 unités formant plaque (PFU)/mL dans PBS et injectez les pups intrapéritonéalement (i.p.) avec 1 × 10^4 PFU dans un PBS de 50 μL à l’aide d’une aiguille de calibre 30. Injectez dans le quadrant inférieur droit de l’abdomen à un angle faible pour éviter les organes abdominaux.
ATTENTION : le mCMV est infectieux (BSL-2). Utilisez un confinement et une décontamination appropriés. - Notez l’identification de l’animal, l’âge, le groupe expérimental, la dose du virus, le volume et les détails de l’injection.
6. Imagerie par bioluminescence (BLI)
REMARQUE : Effectuer la BLI à P7 (5–6 jours après l’injection cellulaire et avant l’infection) et à P17 (10 jours après l’infection) comme décrit ci-dessous.
- Dissoudre la D-Luciférine dans le PBS à 10 μg·μL-1. Filtrez-stérilisez à l’aide d’un filtre de 0,22 μm, aliquote, puis conservez à −20 °C à l’abri de la lumière.
ATTENTION : La D-luciferine est sensible à la lumière. Minimisez l’exposition à la lumière pendant la préparation et l’utilisation. - Injectez de la D-luciférine i.p. à 50 μL par chiot à l’aide d’une aiguille de calibre 30.
- Anesthésiez les petits avec de l’isoflurane (induction 3–4 %, maintien 1,5–2 %) en oxygène (0,8–1,0 L·min-1). Maintenez la température corporelle sur une plateforme d’imagerie réchauffée (environ 37 °C).
ATTENTION : L’isoflurane est un anesthésique volatil. Utilisez un vaporisateur et un système de récupération approuvés. - Placez les chiots anesthésiés dans un système d’imagerie pour petits animaux (détails de l’instrument fournis dans le tableau des matériaux).
- Acquérir des images bioluminescentes et aux rayons X en utilisant des réglages d’exposition constants 10 minutes après l’injection de D-luciférine (réglages BLI : temps d’exposition 120 s pour les images P7 et 30 s pour P17, binning B4 pour P7 et B4 pour P17, champ de vision (FOV) 25, diamètre 1,2, hauteur de l’objet 1,5 et réglages rayons X : résolution élevée, puissance élevée).
Pause Point : Stocker les fichiers images immédiatement après l’imagerie ; L’analyse peut être réalisée ultérieurement. - Analysez les images à l’aide d’un logiciel d’imagerie BLI approprié en définissant les régions d’intérêt (ROI) englobant l’ensemble du corps de chaque souris et en quantifiant la lumière émise sous forme de photons·s⁻1·cm⁻2·sr⁻1.
- Exportez les valeurs de ROI quantifiées pour une analyse statistique en aval.
7. Prélèvement de cellules leucémiques sur des souris transplantées en cellules
- Prélèvez les cellules leucémiques et générez des suspensions monocellulaires comme décrit à la Section 1.1.
8. Coloration et acquisition par cytométrie en flux
- Comptez les cellules et les suspensions centrifugeuses à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C et resuspendez à 1 × 10^7 cellules·mL-1 dans le tampon FACS.
- Transférer 100 μL (1 × 10^6 cellules) dans des tubes de cytométrie à flux en polystyrène.
- Ajoutez un anticorps bloqueur des récepteurs Fc (anti-CD16/32 ; 1 μL par tube) et incubez pendant 5 minutes à température ambiante.
- Préparez le mélange maître d’anticorps dans un tampon FACS et ajoutez à chaque tube CD19-FITC, BP1-PE, B220-APC et marqueurs négatifs de lignée (TER119-PerCP, CD3-PerCP, CD11b-PerCP), 1 μL de chaque anticorps par 1 x 10^6 cellules dans un tampon FACS de 100 μL.
- Incubez pendant 20 minutes à température ambiante dans le noir.
- Laver avec un tampon FACS de 5 mL, centrifuger et resuspendre dans un tampon FACS de 200 μL contenant 7-AAD (3 μL) et des billes de comptage (6 μL ; 6 000 billes).
- Préparez des contrôles de compensation à coloration unique à l’aide de billes ou cellules de capture d’anticorps et obtenez des contrôles en même temps que des échantillons expérimentaux.
- Prélever des échantillons sur un cytomètre à débit en utilisant les réglages standards du détecteur FITC/PE/APC/PerCP et un débit moyen. Collectez des événements jusqu’à ce que 1 000 perles soient acquises.
- Exportez les fichiers FCS et analysez à l’aide d’un logiciel d’analyse de cytométrie en flux (listé dans le tableau des matériaux) en utilisant la stratégie de verrouillage établie (Figure 2D).
- Calculez le nombre absolu de cellules par rate ou moelle osseuse en utilisant des billes de comptage en multipliant le nombre d’événements cibles acquis à 1 000 billes par un facteur d’échelle de 6 (6 000 billes ajoutées), et en normalisant à la cellularité totale des organes en fonction de la fraction de cellules colorées (1 × 10^6 cellules).
9. Tracé de graphiques et analyse statistique
REMARQUE : Générez des graphiques et effectuez des analyses statistiques pour les données de BLI et cytométrie en flux à l’aide d’un logiciel statistique (listé dans le tableau des matériaux).
- Présenter les données comme moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM).
REMARQUE : Aucun animal n’a été exclu de cette étude. - Pour le BLI, comparez séparément les groupes PBS et mCMV à P7 et P17 en utilisant des tests de Mann–Whitney non appariés, avec une correction de Holm–Šídák appliquée pour ajuster les comparaisons multiples à travers les temps.
- Analysez les résultats de la cytométrie en flux à l’aide d’un test de Mann–Whitney non apparié à deux queues.
- Définissez la signification statistique comme p < 0,05.
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Résultats
L’injection veineuse temporale permet une implantation néonatale efficace des cellules leucémiques et neuroblastomes
Pour modéliser l’impact de l’infection précoce sur la progression du cancer pédiatrique, des cellules B-ALL marquées à la luciférase dérivées de souris adultes leucémiques Eμ-Ret ou des cellules NB issues de souris Th-Mycn moribundes ont été administrées par voie intraveineuse via la veine temporale à des petits syngéniques âgés de 1 à 2 jours. Le succè...
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Discussion
Comprendre comment le développement immunitaire précoce influence la progression du cancer est essentiel pour concevoir des stratégies immunomodulatrices adaptées à l’âge. Dans cette étude, nous décrivons une plateforme de transplantation néonatale reproductible qui permet un contrôle temporel précis de l’implantation des cellules cancéreuses et de la modulation immunitaire durant une fenêtre critique d’immaturité immunitaire postnatale. En combinant l’accouchement intraveineux médié par...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par des subventions opérationnelles des Instituts canadiens de recherche en santé à G.S.D.R. (MOP-126122). A.F. a reçu une bourse postdoctorale du Michael Cuccione Childhood Cancer Research Program (MC3RP).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 100µL, Microliter Syringe, Luer Tip | Hamilton | 80601 | - |
| 30 G Needle | BD | 305106 | - |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | - |
| Ami-X imaging system | Spectral Instruments Imaging | - | - |
| anti-mouse B220- APC | Biolegend | 103212 | - |
| anti-mouse CD19-FITC | Biolegend | 152404 | - |
| anti-mouse CD3ε- PerCP | Biolegend | 100326 | - |
| anti-mouse Ly-51-PE | Biolegend | 108308 | Also called BP1 |
| anti-mouse TER119- PerCP | Biolegend | 116226 | - |
| anti-mouse/human CD11b- PerCP | Biolegend | 101230 | - |
| Aura software | Spectral Instruments Imaging | - | version 4.0.8 |
| BD Accuri C6 | BD | - | - |
| BD Fortessa X-20 | BD | - | - |
| Cleaning solution | Hamilton | 18310 | - |
| CountBright Absolute Counting Beads | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 2770930 | 6 µL contains 6000 beads |
| D-Luciferin | GoldBio | eLUCK-1G | - |
| DMEM | Gibco | 11965092 | - |
| DNase I | Sigma | 1.13E+10 | - |
| Falcon 40µm Cell Strainer, Blue, Sterile, Individually Packaged | FALCON | 352340 | - |
| FBS | Gibco | A5256701 | - |
| FlowJo software | BD | - | v10.8 |
| GeltrexTM | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | - |
| GraphPad Prism software | Dotmatics | - | v10.4.1 |
| LE.5209 Cold light source | Euromex | - | - |
| Liberase™ TM Research Grade | Sigma | 5.4E+09 | - |
| NSG mice | Jackson Labrotary | 5557 | NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ |
| Polybrene | Sigma | H9268-5G | - |
| Purified anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | 101301 | - |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | - |
Références
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Réimpressions et autorisations
