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Article de méthode

Approche multimodale pour évaluer la régénération osseuse et la performance de l’échafaudage

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DOI :

10.3791/69483

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13 février 2026

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1Institute of Biomedical Sciences, Federal University of Rio de Janeiro, 2Department of Condensed Matter, Applied Physics and Nanoscience, Brazilian Center for Research in Physics, 3Alberto Luiz Coimbra Institute for Graduate Studies and Research in Engineering (COPPE), Federal University of Rio de Janeiro, 4Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM)

Dans cet article

Résumé

Nous proposons un protocole pour évaluer la régénération osseuse à différents niveaux hiérarchiques. Cette approche multimodale permet une analyse structurelle sur différentes échelles de longueur, répondant efficacement aux défis de la préparation de l’échantillon. Il offre également un flux de travail fiable pour évaluer l’efficacité des biomatériaux dans la promotion de la régénération osseuse.

Résumé

Le succès clinique d’un implant dépend en grande partie de sa capacité à favoriser la réparation osseuse et à faciliter l’ostéointégration. Bien que des avancées significatives aient été réalisées dans la conception de nouveaux échafaudages, une évaluation approfondie du succès des implants à différentes échelles de longueur osseuse n’a pas été suffisamment étudiée. L’os est un tissu hiérarchiquement organisé, avec une structure complexe allant de l’organisation des fibrilles de collagène et de leur minéralisation aux échelles nanométriques et micrométriques à l’organisation macroscopique de l’os compact et cancelleux. Cette organisation hiérarchique est cruciale pour assurer la fonction osseuse et la performance mécanique. Dans ce contexte, une évaluation complète des effets des biomatériaux sur la réparation osseuse à plusieurs échelles de longueur est essentielle pour évaluer l’efficacité et la sécurité des matériaux implantés. Cependant, préparer des échantillons pour des analyses multimodales intégrées pose un défi technique. Dans ce travail, nous présentons un protocole conçu pour évaluer la régénération osseuse à différents niveaux hiérarchiques et analyser l’interface entre l’os nouvellement formé et l’échafaudage implanté. Cette approche offre une méthode robuste pour évaluer l’efficacité des échafaudages dans l’induction de la réparation osseuse. La combinaison de techniques sélectionnées d’imagerie 3D et 2D est cruciale pour une évaluation correcte du tissu minéralisé complexe qui se forme lors du processus de cicatrisation osseuse

Introduction

L’os est un tissu complexe, hiérarchiquementorganisé 1,2. Comprendre son organisation structurelle est essentiel pour répondre aux questions fondamentales liées à la contribution des cellules à l’architecture tissulaire et à l’impact des changements structurels sur la fonction mécanique3. Dans ce contexte, le remodelage osseux après une blessure reste un sujet central d’étude. La guérison des fractures est un processus complexe en plusieurs étapes, débutant par une réponse inflammatoire initiale, suivie de l’angiogenèse et de la différenciation des cellules progénitrices en chondrocytes et ostéoblastes 4,5. Beaucoup de débats ont fait l’objet du rôle des biomatériaux pour stimuler l’ostéointégration, notamment sur la biocompatibilité et leur capacité à prévenir l’encapsulationfibreuse 6.

Une méthode couramment adoptée pour évaluer l’ostéointégration stimulée par les biomatériaux est la microscopie optique, qui permet des analyses histologiques quantitatives et qualitatives. Cette approche s’est avérée être un moyen fiable et efficace d’évaluer le succès des implantsosseux 7,8. Néanmoins, plusieurs questions liées à l’organisation hiérarchique osseuse ne peuvent pas être explorées en utilisant une seule approched’imagerie, en particulier la méthode histologique, qui est limitée au moins en partie par la restriction de grossissement de la méthode.

Les avancées en imagerie tridimensionnelle se sont avérées essentielles pour comprendre l’organisation hiérarchique des os. Des techniques telles que la tomodensitométrie (microCT ; soit par rayonnement synchrotron, soit par sources conventionnelles de laboratoire à rayons X) 9,10,11, la microscopie électronique à balayage à double faisceau (FIB-SEM) associée à la tomographie découpe-et-vue 12,13,14 et la tomographie électronique en transmission 15,16 ont apporté de nouvelles perspectives sur l’architecture osseuse à plusieurs échelles.

Basé sur différentes approches d’imagerie 3D, un modèle d’organisation hiérarchique osseuse a été proposé, identifiant initialement neuf niveaux distincts d’organisation structurelleosseuse 1. Ce schéma a récemment été révisé et élargi pour englober environ 12 niveaux hiérarchiques, servant de référence précieuse pour explorer la relation entre structure et fonction dans le tissuosseux 2,17. Il est important de noter que ce modèle hiérarchique proposé fournit une base pour évaluer le succès de la réparation osseuse après une blessure. Évaluer si le tissu osseux régénéré reproduit la structure hiérarchique native est une norme clé pour évaluer la qualité de la cicatrisation osseuse, en particulier lorsque des biomatériaux sont utilisés sur le site endommagé.

Bien que l’utilisation de multiples techniques d’imagerie pour étudier l’organisation osseuse ait étédiscutée 6,7,18,19,20, peu d’études ont été explorées concernant un flux de travail intégrant différentes modalités d’imagerie pour évaluer l’organisation minérale osseuse sur plusieurs échelles spatiales. Comme mentionné, l’os est un tissu composite complexe, composé d’une phase organique (cellules, collagène et macromolécules) et d’une matrice minéralisée. Du point de vue de la préparation de l’échantillon, cette complexité présente des défis techniques concernant la perméation du solvant à travers l’échantillon, la coupe d’un échantillon dur et l’intégration de différentes stratégies d’imagerie sur un même échantillon.

L’innovation clé dans ce travail est la mise en place d’un flux de travail d’imagerie reproductible, corrélatif et multi-échelles utilisant l’imagerie tridimensionnelle et des techniques complémentaires. Comme illustré à la Figure 1A, le flux de travail est conçu de manière à ce que le même échantillon puisse être examiné séquentiellement à l’aide de différentes modalités d’imagerie. Comme certaines de ces techniques sont destructrices ou nécessitent une coupe, le flux de travail suit un ordre qui commence par des méthodes non destructives et évolue vers des approches impliquant la coupe ou le retrait des matériaux.

Ce flux de travail de préparation et d’analyse d’échantillons est largement applicable aux spécimens durs ou minéralisés, y compris les os corticaux et trabéculaires, les échafaudages préimplantatoires, ainsi que l’évaluation de l’interface os/biomatériaux après implantation. En combinant des modalités d’imagerie couvrant différents champs de vision et plages de résolution (Figure 1B), le flux de travail permet l’analyse d’échantillons de l’échelle du centimètre jusqu’aux échelles micrométrique et nanométrique. Bien que la séquence soit optimisée pour soutenir l’analyse corrélative d’un seul spécimen, chaque technique peut également être appliquée indépendamment selon l’objectif expérimental. Cette approche permet une évaluation détaillée de l’ostéointégration des biomatériaux ainsi que de la régénération de la croissance osseuse dans la zone de cicatrisation.

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Protocole

Les résultats présentés dans ce protocole ont été obtenus à partir d’une procédure expérimentale menée dans une étudeprécédente 21. Toutes les procédures ont été réalisées conformément aux directives éthiques du Comité d’éthique pour l’utilisation et le soin des animaux expérimentaux de l’Université fédérale Fluminense, Brésil (CEUA/UFF : 779). En résumé, 20 rats Wistar mâles pesant entre 300 et 400 g ont été répartis au hasard en deux groupes : l’implantation simulée et l’implantation par microsphère cHA. Tous les animaux ont subi une intervention chirurgicale au cours de laquelle un défaut de 2 mm a été créé dans la diaphyse tibiale. Le groupe Sham servait de contrôle des caillots pour évaluer la régénération osseuse dans un défaut non critique, tandis que le groupe expérimental recevait des microsphères CHA37 implantées dans le site du défaut. Après 7 et 21 jours, les animaux ont été euthanasiés avec une surdose d’anesthésie générale, et des blocs d’os tibiaux de chaque groupe et à chaque moment (7 et 21 jours) ont été prélevés. La qualité osseuse et l’étendue de l’os nouvellement formé ont été évaluées à l’aide de microscopie optique et de microtomodensitométrie.

1. Fixation d’échantillons et incorporation de résine

  1. Immédiatement après l’euthanasie, retirez le tibia contenant le biomatériau implanté et transférez-le dans un flacon contenant une solution fixative de Karnovsky (2,5 % de glutaraldéhyde, 4 % de formaldéhyde dans un tampon cacodylate de 0,1 M). Conservez l’échantillon à -4 °C pendant au moins 1 jour.
    REMARQUE : Préparez et manipulez le fixateur sous une hotte pour éviter toute exposition à des substances volatiles. Toute manipulation chimique doit être effectuée à l’aide d’équipements de protection individuelle (EPI) appropriés, et des mesures techniques supplémentaires de sécurité doivent être mises en place chaque fois que cela est nécessaire.
  2. Transférez l’échantillon du fixateur vers un flacon contenant 0,1 M de tampon cacodylate. Gardez l’échantillon en douce rotation, en changeant le tampon deux fois à intervalles de 10 minutes. À ce stade, taillez les bords de l’échantillon à l’aide d’une petite scie pour faciliter l’infiltration de la résine. Lors de la coupe de l’échantillon, gardez-le humide dans le tampon cacodylate de 0,1 M pour éviter qu’il ne sèche.
    REMARQUE : Gardez toujours l’échantillon dans un volume tampon d’au moins deux fois le volume de l’échantillon. Cela doit être respecté pour toutes les solutions et résine utilisées dans ce protocole. Lorsque vous manipulez les composants chimiques mentionnés ci-dessus, travaillez à l’intérieur d’une hotte et portez des EPI appropriés. Collectez la solution fixatrice et les déchets tampons cacodylates dans des contenants clairement étiquetés et chimiquement compatibles, avec des bouchons correctement ajustés. Suivez les procédures opérationnelles standard institutionnelles (SOP) pour le stockage et l’élimination en toute sécurité des déchets chimiques dangereux.
  3. Commencez le processus de déshydratation en augmentant les concentrations d’acétone (10 %, 30 %, 50 %, 70 %, 90 % et 100 %). Maintenez l’échantillon en rotation pendant 30 minutes à chaque concentration. Répétez l’étape à 100 % d’acétone anhydre trois fois.
    REMARQUE : Lors de la manipulation de l’acétone, travaillez à l’intérieur d’une hotte et portez des EPI appropriés. Après l’avoir utilisé, collectez tout solvant résiduel dans des contenants à déchets clairement étiquetés et chimiquement compatibles, avec des bouchons correctement ajustés. Suivez les procédures opérationnelles standard institutionnelles pour le stockage et l’élimination sécurisés des déchets chimiques dangereux.
  4. Infiltrer avec la résine d’éperon en transférant l’échantillon à travers une série de rapports acétone/résine gradués : 2:1, 1:1, 1:2, et finalement de la résine pure. Chaque étape doit durer 12 h et être effectuée en rotation à température ambiante. Après une infiltration graduée de l’acétone à la résine, changez la résine pure deux fois. Enfin, transférez l’échantillon dans un moule contenant de la résine pure et polymérisez l’échantillon à 70 °C pendant 24 heures.
    REMARQUE : La résine a été préparée selon la fiche technique pour obtenir une dureté moyenne. Lors de la manipulation de la résine d’éperon, travaillez à l’intérieur d’une hotte et portez des équipements de protection appropriés. Après utilisation, collectez tout résidu dans des contenants à déchets clairement étiquetés et chimiquement compatibles, avec des bouchons correctement ajustés. Suivez les procédures opérationnelles standard institutionnelles pour le stockage et l’élimination sécurisés des déchets chimiques dangereux.

2. Visualisation d’échantillons à l’aide de la tomodensitométrie à rayons X (microCT)

REMARQUE : le microCT est utilisé pour évaluer le positionnement de l’implant et la régénération osseuse. Cela aide également à identifier les régions d’intérêt potentielles pour une analyse plus approfondie. Cette étape doit être réalisée avec l’échantillon intégré dans la résine.

  1. Utilisez un porte-échantillon fourni par le fabricant comme base, afin de garantir que l’échantillon est bien positionné afin d’éviter tout mouvement pendant le scan. Utilisez des matériaux à faible densité pour le support, tels que le polystyrène, la gaze ou les tubes de microcentrifuge.
  2. Visualisez en utilisant les paramètres de balayage optimaux suivants : tension/courant du tube = 60 kV/133 mA ; pas angulaire = 0,33° ; moyenne des frames = 5 ; taille du voxel = 5 μm ; mode de rotation = 180°. Pour les échantillons contenant des implants métalliques, utilisez une rotation de 360° et un filtre aluminium de 0,5 mm.
    REMARQUE : Lors de la régénération osseuse, l’épaisseur de l’os tissé de type trabéculaire reste généralement dans les limites de résolution de l’imagerie microCT conventionnelle. Pour quantifier avec précision les paramètres morphométriques conventionnels de l’os trabéculaire, tels que l’épaisseur, la séparation et le nombre du trabéculaire, il est recommandé d’utiliser la plus petite taille de voxel (5 μm comme spécifié). Si la Région d’Intérêt (ROI) dépasse le Champ de Vision (FOV) à cette résolution nominale, utilisez d’abord la fonction multiscan pour tuiser le ROI. Envisagez d’augmenter la taille du voxel uniquement en dernier recours si le ROI ne peut pas être capté via multiscan.
  3. Après le numérisage, les données brutes d’acquisition consistent en une série de fichiers image numérotés. Effectuer la reconstruction à l’aide du logiciel fourni par le fabricant, en se concentrant sur la minimisation des artefacts dans la région d’intérêt de l’échantillon.
    REMARQUE : Il est courant de rencontrer des artefacts d’images le long des bords des images, en particulier dans les zones qui ne seront pas analysées. Le volume final peut être recadré à l’aide du logiciel du fabricant pour éliminer ces zones.
  4. Analysez le volume reconstruit à l’aide de diverses options de logiciels de visualisation 3D, telles qu’Avizo, VGStudio Max, CTVox et Dragonfly22. Appliquez des filtres d’image numérique pour éliminer les artefacts. Dans ce cas, utilisez la méthode de dénoising par moyens non locaux à ceteffet 19.
    REMARQUE : Les valeurs de lissage du filtre de débruit non locales doivent être maintenues aussi basses que possible, pour ne pas entraver les détails importants de l’interface.

3. Préparation de l’échantillon pour la microscopie optique

  1. Sélectionnez la direction de coupe de l’échantillon selon l’objectif expérimental. Le tibia peut être sectionné soit transversalement, soit longitudinalement le long de l’axe long de l’os. Utilisez la coupe transversale pour produire des sections en série couvrant l’ensemble du volume du défaut. La coupe longitudinale est appropriée pour évaluer la régénération osseuse selon la direction de l’axe long. Cependant, cette approche ne fournit qu’une seule section du défaut.
    1. Utilisez un disque diamanté à basse vitesse pour sectionner l’échantillon en tranches de 1 mm, en suivant la stratégie expérimentale.
      REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser un disque diamanté d’une épaisseur de 0,006 à 0,012 pouces. Les lames plus fines permettent des coupes très précises, avec une perte minimale de matériau due à l’épaisseur de la lame.
    2. Remplissez le réservoir de liquide jusqu’à ce que le niveau de liquide couvre le bord inférieur de la pale.
      REMARQUE : L’eau distillée convient pour les échantillons d’os. Cependant, si un chauffage excessif est prévu, comme pour des échantillons contenant des implants métalliques, utilisez l’huile fournie par le fabricant de l’équipement pour remplir le réservoir.
    3. Fixez l’échantillon au support de l’échantillon et fixez-le au bras de l’instrument. Assurez-vous que l’échantillon est stable et horizontal à la surface du disque. Utilisez les boutons de positionnement pour ajuster la région de coupe de l’échantillon au disque.
    4. Commencez à couper l’échantillon en utilisant des réglages de vitesse plus élevés (210 - 250 tr/min) et appliquez une faible pression jusqu’à ce qu’une marque se forme sur l’échantillon. Ensuite, réduisez la vitesse (à 93 - 124 tr/min) pour compléter la section en douceur et éviter des vibrations excessives.
    5. Arrêtez la scie immédiatement après la coupe. Ajustez correctement le système pour s’assurer que la coupe cesse dès que l’échantillon est détaché de son bloc d’origine.
  2. Examinez l’échantillon à l’aide d’un stéréomicroscope. Commencez à faible grossissement (par exemple, 5x-10x) pour inspecter l’échantillon entier, puis augmentez le grossissement (par exemple, 20x-40x) pour sélectionner la région d’intérêt selon la question scientifique. La plage de grossissement exacte peut varier selon l’instrument utilisé. Dans ce travail, des régions présentant une densité plus élevée d’interfaces entre l’os nouvellement formé et le biomatériau ont été sélectionnées pour une analyse approfondie.
  3. Montage d’échantillon pour diluer
    1. Montez l’échantillon sur un support pour faciliter une manipulation correcte pendant le polissage. Si l’échantillon est destiné uniquement à l’analyse par microscopie optique, fixez-le directement sur une gaine plastique à l’aide de superglue sur le côté précédemment poli.
      REMARQUE : Les lames en plastique sont recommandées en raison de leur meilleure adhérence. Des lames en verre peuvent également être utilisées (après un lavage approfondi avec du savon neutre). Cependant, les lames en verre augmentent le risque de décollement de l’échantillon lors du polissage.
    2. Pour les échantillons qui seront analysés davantage par approche corrélative, montez-le sur un ensemble de tubes en aluminium en deux parties. Dans ce protocole, un ensemble de tubes en aluminium maison a été développé, composé d’un cylindre interne solide d’un diamètre de 2,5 cm et d’un cylindre creux extérieur fournissant un support mécanique lors du polissage. L’échantillon est fixé au cylindre solide intérieur.
    3. Placez le cylindre intérieur en aluminium sur une plaque chauffante et chauffez-le à une température adaptée à la fusion de la cire (généralement autour de 60-70 °C, selon le type de cire utilisé).
      REMARQUE : La cire d’abeille est également adaptée. Lors de la manipulation de la cire de montage, travaillez à l’intérieur d’une hotte de fumée et portez des équipements de protection adaptés. Après utilisation, collectez les résidus dans des contenants à déchets clairement étiquetés et chimiquement compatibles, avec des bouchons correctement ajustés. Suivez les procédures opérationnelles standard institutionnelles pour le stockage et l’élimination sécurisés des déchets chimiques dangereux.
    4. Appliquez une petite quantité de cire sur la surface du cylindre et laissez-la fondre complètement.
    5. Une fois fondu, placez l’échantillon avec la surface d’intérêt sur la surface recouverte de cire et pressez-le doucement pour assurer un contact complet.
      REMARQUE : La surface d’intérêt doit faire face à la surface du cylindre afin que l’amincissement soit effectué du côté opposé. Évitez d’utiliser trop de cire, car cela peut entraîner un montage inégal et nuire à la qualité du polissage.
    6. Retirez le cylindre de la plaque chauffante et laissez la cire se solidifier à température ambiante.
  4. Surveillance de l’épaisseur de l’échantillon pendant le polissage
    1. Pour surveiller l’épaisseur de l’échantillon pendant le polissage, utilisez la microscopie de réflexion à faible à intermédiaire grossissement (par exemple, 10x-20x). Un schéma illustrant l’étalonnage du microscope et la mesure de l’épaisseur de l’échantillon est montré à la Figure 2.
    2. Calibrez l’axe Z du microscope avec un couverdissage standard, généralement d’environ 150 μm d’épaisseur. Marquez un côté de la planche avec un marqueur rouge et une zone adjacente de l’autre côté avec un marqueur bleu. Montez la gaine sur une glissière en verre.
    3. En utilisant le bouton de mise au point fin et l’échelle micrométrique, concentrez-vous d’abord sur la surface inférieure de la toile de couverture puis sur la surface supérieure.
    4. Notez la valeur de déplacement Z. Cette valeur correspond à l’épaisseur du couvercle (environ 150 μm) et sert de référence.
    5. Lors du polissage de l’échantillon, utilisez périodiquement cette calibration de l’axe Z pour estimer l’épaisseur de l’échantillon sans la retirer du cylindre en aluminium.
      REMARQUE : Cette technique permet une estimation rapide et non destructive de l’épaisseur lors du polissage. Alternativement, l’échantillon peut être retiré du support et mesuré à l’aide d’un étrier ou d’un micromètre numérique.
  5. Dilution et polissage
    1. Commencez le polissage grossier et intermédiaire avec du papier de verre avec des grains de 1200, 2500 et 4100. L’objectif de cette étape est de réduire l’épaisseur de l’échantillon à environ 0,15 mm tout en supprimant les irrégularités significatives de surface.
    2. Commencez avec du papier de verre grain 1200, puis progressez vers un grain 2500. Appliquez une légère pression pendant ce processus. Surveillez périodiquement l’épaisseur de l’échantillon à l’aide de microscopie de réflexion pendant le polissage.
    3. Une fois l’épaisseur souhaitée atteinte, polissez les deux côtés de l’échantillon avec du papier sablé de grain 4100. Le polissage peut être effectué manuellement ou avec une machine semi-automatique réglée sur une vitesse de rotation basse. Nettoyez soigneusement l’échantillon à l’eau distillée en continu à chaque étape de polissage.
      REMARQUE : Garder les échantillons et papiers de verre humides pendant le polissage aide à réduire la chaleur et à éviter la contamination de surface par les papiers de verre plus rugueux.
    4. Pour le polissage final, appliquez une petite quantité de pâte diamantée (par exemple, 6 μm ou 3 μm) sur un chiffon de polissage en feutre monté sur un disque de polissage. Sélectionnez la taille de la particule de pâte de diamant selon la rugosité de surface de l’échantillon.
      REMARQUE : Une pâte de 6 μm convient pour le polissage fin préliminaire, tandis qu’une pâte de 3 μm est recommandée pour le polissage final au miroir. Lorsque possible, utiliser les deux pâtes séquentiellement donne les meilleurs résultats. Néanmoins, un polissage satisfaisant peut encore être obtenu uniquement avec la pâte de 6 μm.
    5. Polir doucement les deux côtés de l’échantillon avec une pression minimale. Utilisez de l’air comprimé ou du coton pour sécher la surface polie de l’échantillon avant les examens microscopiques.
    6. Pour détacher l’échantillon du cylindre, chauffez la cire à l’aide d’une plaque chauffante et nettoyez toute cire résiduelle de l’échantillon à l’aide d’acétone anhydre.
      REMARQUE : Lorsque vous manipulez de la cire de montage et de l’acétone anhydre, travaillez à l’intérieur d’une hotte à fumées et portez des équipements de protection adaptés. Après utilisation, collectez les résidus dans des contenants à déchets clairement étiquetés et chimiquement compatibles, avec des bouchons correctement ajustés. Suivez les procédures opérationnelles standard institutionnelles pour le stockage et l’élimination sécurisés des déchets chimiques dangereux.
    7. Montez l’échantillon entre une lame en verre et un abri de couverture en utilisant de l’huile d’immersion comme support de montage et évaluez l’orientation des fibres de collagène à l’aide d’une microscopie à lumière polarisée. Commencez par un faible grossissement (par exemple, 5x-10x) pour examiner l’échantillon, puis augmentez jusqu’à un grossissement intermédiaire (par exemple, 20x-40x) afin d’identifier les régions potentielles pour une exploration ultérieure à l’aide de la microscopie électronique.
      REMARQUE : Pour procéder au flux de travail corrélatif et à l’analyse ultérieure de l’échantillon par microscopie électronique à balayage, il est conseillé de ne pas sceller l’échantillon.

4. Préparation de l’échantillon pour la microscopie électronique à balayage

  1. Retirez soigneusement l’échantillon de la lame en verre. Faites doucement glisser la gaine de couverture hors de la glissière en verre à l’aide d’une pointe de pipette. Utilisez du papier filtre pour éliminer l’excès d’huile d’immersion. Lavez l’échantillon avec un savon neutre. Effectuez le lavage dans un petit récipient pour éviter une perte accidentelle d’échantillon.
    REMARQUE : Si de l’huile d’immersion résiduelle est encore présente sur l’échantillon, nettoyez doucement la surface à l’aide d’un coton-tige légèrement humidifié à 70 % d’éthanol.
  2. Laissez l’échantillon sécher à l’air libre sur un papier filtrant. L’air comprimé ou le coton peuvent également être utilisés pour sécher l’échantillon. Une fois complètement sec, fixez l’échantillon sur un moignon à l’aide de ruban carbone. Appliquer un sputter couche d’or de 10 nm sur l’échantillon pour éviter la charge lors de l’imagerie.
  3. Utilisez le microscope FIB-SEM à double faisceau pour explorer l’échantillon par différentes méthodes.
    1. En mode SEM (microscopie électronique à balayage), en utilisant soit des électrons secondaires, soit des électrons rétrodiffusés, on évalue la morphologie de l’échantillon, le biomatériau et l’interface osseuse nouvellement formée dans les régions précédemment sélectionnées par microscopie optique.
    2. En mode microscopie électronique à balayage à faisceau d’ions focalisé (FIB-SEM), réalisez la tomographie de découpe et de vue.
  4. En mode SEM avec le détecteur d’électrons secondaire, sélectionnez les zones précédemment analysées à l’aide de la microscopie à lumière polarisée et du SEM pour procéder à l’acquisition par tomographie en tranche et vision.
  5. Ajustez les paramètres du volume de la tranchée, de la taille des pixels et de l’épaisseur de la tranche en fonction des caractéristiques d’intérêt. Dans notre installation, la tomographie tranchante et vue a été réalisée avec un volume de tranchée de 15 μm x 10 μm x 10 μm, une taille de pixel de 20 nm et une épaisseur de tranche de 60 nm. Il est recommandé d’utiliser une taille de voxel isométrique chaque fois que possible pour une meilleure qualité d’imagerie sur les trois dimensions (XYZ).
    REMARQUE : Ces paramètres peuvent varier selon le système FIB-SEM spécifique. Consultez l’opérateur de l’équipement pour déterminer les conditions optimales en fonction de vos besoins analytiques et des capacités du système.

5. Alignement, traitement filtré et segmentation de la tomographie découpe-et-vue FIB-SEM

  1. La tomographie par découpe et vue génère une série d’images numérotées séquentiellement. Pour procéder à l’alignement, convertissez la série en fichier MRC, communément appelé pile.
  2. Effectuer la génération de fichiers MRC et l’alignement de la pile d’images à l’aide du logiciel IMOD.
    REMARQUE : D’autres logiciels, tels qu’Avizo et FIJI/ImageJ, proposent également des plugins d’alignement de pile. Pour des conseils détaillés, consultez chaque documentation spécifique à chaque logiciel. De plus, les travaux de Peddie etal. 23. propose un aperçu des approches adoptées lors de l’alignement de la pile.
  3. Pour générer le fichier MRC, ouvrez le terminal ou l’invite de commande, allez dans le dossier contenant la séquence d’images, et exécutez la commande suivante : tif2mrc imagerootfile*.tif stackname.mrc
    1. Pour les images qui ne sont pas au format TIFF, utilisez plutôt raw2mrc. Ajoutez -g (par exemple, tif2mrc -g) pour convertir les images RVB 24 bits en niveaux de gris 8 bits. Cela réduira considérablement le temps de calcul.
  4. Lance Etomo depuis le terminal et sélectionne l’option Aligner les sections en série. Suivez la séquence pour aligner la pile : (1) Chargez la pile non alignée dans une seule trame. (2) Onglet d’algin utilisant l’alignement automatique initial. (3) Créer un onglet de pile en utilisant Créer une pile alignée, puis ouvrir la pile alignée.
    REMARQUE : Ce processus peut prendre plusieurs minutes, selon la taille de la pile et les performances du système.
  5. Une fois terminé, examinez le résultat. Le fichier de pile aligné sera nommé stackname_ali.mrc.
    REMARQUE : Cette procédure utilise les paramètres par défaut du système pour l’alignement de la pile. Cependant, les paramètres liés à l’alignement initial et à la génération finale de la pile peuvent être modifiés selon les préférences de l’utilisateur. Pour des conseils détaillés, consultez la documentation de l’IMOD : https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html.https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html.
  6. Effectuez un filtrage d’image supplémentaire à l’aide du logiciel Avizo. Ouvrez la pile alignée et appliquez séquentiellement les filtres suivants : Filtre à transformée rapide de Fourier (FFT), disponible dans le plugin Sandbox Filter (sélectionnez l’option d’orientation de bande verticale, valeur de tolérance : 2), assistant correction d’ombrage (ajuster la sélection du masque pour couvrir toute la zone d’ombre de l’image, utiliser un facteur de normalisation de 100), Égalisation d’histogramme (configuration par défaut), et Moyennes non locales (ajuster les valeurs à 5 ; 0,1 ; 10 ; 3).
    REMARQUE : Des filtres équivalents sont disponibles dans d’autres logiciels d’analyse d’image. Dans FIJI/ImageJ, nous recommandons la séquence suivante : filtre FFT, Soustraction de l’arrière-plan, Amélioration du contraste local (CLAHE) et filtre des moyennes non locales.
  7. Procédez à la segmentation d’image et au rendu 3D avec le logiciel. Différentes stratégies de segmentation sont disponibles, notamment la segmentation manuelle et la segmentation basée sur des seuils. Des outils supplémentaires, tels que l’algorithme Watershed, peuvent aider à automatiser le processus et à réduire le temps nécessaire à la segmentation.

6. Préparation de l’échantillon pour la microscopie électronique en transmission

  1. Préparez les lamelles à l’aide de la microscopie électronique à faisceau d’ions focalisé (FIB-SEM) pour évaluer l’interface os/biomatériau.
    REMARQUE : Si le biomatériau implanté n’est ni céramique ni métallique, comme dans cette étude, des sections ultrafines adaptées à la microscopie électronique en transmission (TEM) peuvent être préparées à l’aide d’un ultramicrotome. Cependant, il est important de noter que la coupe des matériaux minéralisés peut réduire considérablement la durée de vie du couteau diamanté.
  2. Posposez la coloration des sections ultrafines pendant 20 minutes dans une solution aqueuse à 5 % d’acétate d’uranyle.
    REMARQUE : Lors de la manipulation de l’acétate d’uranyle, travaillez à l’intérieur d’une hotte à fumée et portez des EPI appropriés. Après utilisation, collectez tout solvant résiduel dans des contenants à déchets clairement étiquetés et chimiquement compatibles, avec des bouchons correctement ajustés. Suivez les procédures opérationnelles standard institutionnelles pour le stockage et l’élimination sécurisés des déchets chimiques dangereux.
  3. Analysez les sections en utilisant TEM. Pour une analyse complète, combinez l’imagerie avec la diffraction électronique de zone sélectionnée (SAED), la spectroscopie des rayons X à dispersion d’énergie (EDS) et la tomographie électronique.

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Résultats

L’analyse initiale des échantillons intégrés à la résine est réalisée à l’aide de la tomodensitométrie (microCT). Cette technique non destructive facilite la visualisation 3D de l’ensemble de la zone de défaut, permettant à la fois des analyses quantitatives et qualitatives de l’échantillon. Le contraste en imagerie microCT provient principalement des différences de densité des matériaux présents dans l’échantillon. La figure 1 illustre l’analyse microCT d’u...

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Discussion

Différentes techniques d’imagerie ont été employées pour étudier l’architecture osseuse et évaluer l’efficacité des biomatériaux dans l’induction de l’ostéointégration 7,21,22,23,24. Dans ce protocole, nous avons établi un flux de travail intégrant la microtomographie aux rayons X, la microscopie optique et la microscopie élec...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs affirment qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrent ou relation personnelle connue qui aurait pu influencer le travail rapporté dans cet article.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions accordées aux auteurs par les agences brésiliennes suivantes : Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq/Brésil) et Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ). Nous remercions LABNANO/CBPF et CENABIO/UFRJ pour les installations de microscopie électronique. L’affinement du langage et la révision grammaticale ont été réalisés à l’aide de ChatGPT (OpenAI, GPT-5.1, 2025). Toutes les modifications ont été examinées et vérifiées par les auteurs.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acétone   ;Merck67-64-1
Cylindre en aluminiumFaits maisonN/D
Version Avizo 2022.1ThermoFisherN/Dlogiciels pour le filtrage d’images, la segmentation et la visualisation 3D
Acide cacodylique, sel de sodium, trihydrateTed Pella18851poudre pour le tampon cacodylate. Préparez une solution d’origine de 0,2 M
Composé de polissage diamanté 3 & micro ; Taille mTed Pella895-8
Composé de polissage diamanté 6 & micro ; Taille mTed Pella895-9
Roue en diamant x.006Technologie South BayDWH 3063
Roue en diamant x.012Technologie South BayDWH 4122
Tissu de polissage en feutreTed Pella816-20
Capsules d’embélération plateEMS70021
Engourdi de couvercle en verreKnittelN/D
Culasse en verreKnittelN/D
Glutaraldéhyde, 25 % de grade EMTed Pella18426/18427
Sputter en or K550XEMITECHN/D
ImageJInstituts nationaux de la santé (NIH)logiciels pour l’ajustement, le filtrage, la segmentation et la visualisation 3D d’images
IMOD version 5.1Université du Coloradologiciels pour l’ajustement d’images, la segmentation et la visualisation 3D
Machine de polissage à lapisTechnologie South BayModèle 910
Scie à roue diamantée à basse vitesse   ;Technologie South BayModèle 650
Kit d’embedding à faible viscositéEMS14300kit pour la résine SPURR. Préparez-vous selon les spécifications de la fiche technique   ;
Micro-CT Skyscan 1273  ;BrukerN/D
Microscope Jeol 2100F 200kV  ;JeolN/D
Microscope Olympus BX51OlympeN/D
Microscope Tescan Lyra3TescanN/D
Microscope Zeiss AxioplanZeissN/Déquipée d’une plaque lambda de premier ordre
Paraformeldéhyde, EM GradeSigmaP6148Poudre pour la solution de formaldéhyde. Préparez une solution stock de 16 %
Culasse en plastiqueExakt41500
Cire de montage QuickStick 135Technologie South BayN/D
Papiers de verre   ; Tailles de grain 1200N/DN/D
Papiers de verre   ; Tailles de grain 2500N/DN/D
Papiers de verre   ; Grains 4100N/DN/D
Super GlueLoctiteN/D
Liquide de refroidissement soluble dans l’eau & nbsp ;Technologie South BayN/D
Papier filtre Whatmann de grade 1sigmaWHA1001150

Références

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