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Article de méthode

Culture ovarienne néonatale de souris et quantification du follicule monté entier : une approche in vitro efficace pour étudier la régulation du follicule primordial

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DOI :

10.3791/69498

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19 décembre 2025

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1Department of Obstetrics, Gynecology, and Women's Health, University of Missouri School of Medicine, 2Division of Biological Sciences, University of Missouri

Dans cet article

Résumé

Cette étude présente des protocoles pour la culture postnatale des ovaires de souris sur des inserts membranaires et pour la quantification des follicules montés entiers dans un ovaire entier. Les résultats ont démontré que la manipulation technique lors de la culture ovarienne affecte significativement le nombre de follicules primordiaux, soulignant l’importance de maintenir la cohérence pour minimiser la variation non biologique.

Résumé

Chez les mammifères femelles, les follicules primordiaux se forment lors du développement ovaral fœtal et servent de seule source pour le maintien de la fonction ovarienne adulte. Les mécanismes sous-jacents à la façon dont les follicules primordiaux s’assemblent, maintiennent leur dormance, s’activent pour le développement folliculaire et subissent la mort cellulaire sont importants pour comprendre la physiologie ovarienne et les pathologies. Cette étude présente un protocole pour la culture des ovaires de souris postnatales sur des inserts membranaires, une approche permettant la culture et le traitement pharmaceutique d’ovaires intacts pendant jusqu’à 10 jours, selon le stade de développement de l’ovaire. Des changements dans les conditions de culture peuvent être obtenus en transférant des inserts contenant des ovaires cultivés entre des puits sur une plaque, évitant ainsi toute interférence physique avec les tissus pendant la culture. Les ovaires P5 ont été isolés et cultivés sur un insert de 12 mm dans une plaque à 24 puits, par exemple. Chaque ovaire a été séparé dans une gouttelette de milieu DMEM/F12 complétée avec un flux de liquide à 10 %, 3 mg/mL de BSA, 10 mIU/mL de FSH et un antibiotique-antimycotique, puis délicatement stabilisé sur l’insert membranaire. Le support changeait tous les deux jours, et la culture était maintenue pendant un total de cinq jours. Après la culture, les ovaires ont été fixés à 4 % de paraformohyde pendant 2 heures et traités pour une coloration complète par anticorps du marqueur ovucytaire DDX4. Les follicules ont été stadés et quantifiés en fonction de la taille des ovocytes et de la morphologie nucléaire des cellules folliculaires somatiques. Les résultats ont montré que le nombre de follicules primordiaux dans chaque ovaire était significativement affecté par le placement correct des tissus sur l’insert membranaire. De plus, les différences dans le nombre d’ovaires sur chaque insert peuvent introduire des variations non biologiques et doivent être évitées.

Introduction

L’oogenèse est un processus hautement régulé et complexe qui aboutit à la production d’ovocytes matures. Chez les mammifères, l’oogenèse s’initie dans les ovaires fœtals, où les cellules germinales primordiales (PGC) se différencient en ovocytes primaires. Chaque ovocyte primaire est entouré d’une couche de cellules prégranuleuses squameuses, formant un follicule primordial. La plupart de ces follicules primordiaux deviennent dormants après formation, servant de réserveovarienne 1,2,3. Dans l’ovaire adulte, l’activation périodique des follicules primordiaux pour le développement folliculaire, appelée folliculogenèse, est essentielle pour maintenir la production d’ovocytes matures et d’hormones stéroïdes ovariennes 4,5. En l’absence de signaux d’activation, les follicules primordiaux humains peuvent rester immobiles jusqu’à 50 ans. La dormance prolongée peut contribuer à une diminution de la qualité des ovocytes, ainsi qu’à une augmentation du taux de perte folliculaire primordiale chez les ovairesvieillissants 6. Les mécanismes sous-jacents à l’activation d’un réservoir spécifique de follicules tandis que d’autres restent silencieux et subissent une mort cellulaire périodique restent des questions ouvertes.

Le processus d’oogenèse est fortement conservé chez les mammifères, faisant des souris un modèle idéal pour étudier l’oogenèsedes mammifères 7. Chez la souris, la formation des follicules primordiaux est complète au jour postnatal 4 (P4). Une faible proportion de follicules primordiaux subit un développement folliculaire immédiatement après leur formation. Au cours du développement folliculaire, l’ovocyte augmente de taille grâce à une organogenèse accrue, ainsi qu’à la synthèse d’ARNm et de protéines4. Les cellules granuloses squameuses passent en cellules granuloses cuboïdes et deviennentprolifératives 8. Ces follicules en développement atteignent le stade ovulatoire vers le 21e jour, date à laquelle les souris atteignent la puberté. Cette phase du développement folliculaire des ovaires postnataux est communément appelée « folliculogenèse de première vague ». Puisque la folliculogenèse de première vague reflète de près le processus de développement des follicules, les ovaires de souris postnatales fournissent un modèle idéal pour étudier la régulation folliculaire primordiale et la foliculogenèseovarienne 9.

La classification des follicules ovariens repose principalement sur la morphologie nucléaire des cellules somatiques des follicules et la taille de l’ovocyte. Dans les ovaires de souris, le follicule primordial dormant est identifié par une seule couche de cellules prégranuleuses squameuses qui entourent un ovocyte primaire, d’un diamètre d’environ 20 μm. Les follicules en développement peuvent être classés en follicules primaires, secondaires, tertiaires et antrales. Le follicule primaire contient un ovocyte généralement de plus de 25 μm de diamètre et est entouré d’une seule couche de cellules de granulose cuboïdales (Figure supplémentaire 1). Le follicule secondaire comporte deux couches de cellules de granulosa, tandis que le follicule tertiaire comprend trois couches ou plus de cellules de granulosa. Le follicule antral est plus grand que le follicule tertiaire, contient plusieurs couches de cellules de granulosa et possède une cavité remplie de liquide appelée antrum. Au fur et à mesure que les follicules se développent, l’ovocyte prend de grosseur, atteignant environ 80 μm au moment de l’ovulation. De plus, les follicules en développement sont entourés de plusieurs couches de cellules thèques fines, situées à l’extérieur des cellulesgranuloses 10, 11, 12.

La taille relativement petite des ovaires de souris postnatales fait de la culture des ovaires entiers une approche pratique pour la recherche. Cette méthode permet efficacement l’étude du développement ovarien et folliculaire au sein d’un ovaire intact, car elle préserve les microenvironnements physiques et physiologiques tout en minimisant les interférences des tissusenvironnants 12. Cette approche permet des expériences qui seraient difficiles à mener dans des modèles in vivo. Parmi les exemples figurent l’imagerie en temps réel du développement ovarien, les traitements multimédicamenteux contrôlés dans le temps, et l’analyse de l’activité sécrétoire ovarienne par profilage protéique du milieu de culture13,14. De plus, cette approche peut être appliquée pour étudier l’effet des facteurs sécréteurs sans interaction directe cellule-cellule via des expériences de co-culture. Dans ces expériences, différents types de tissus peuvent être placés sur des inserts membranaires séparés au sein d’un milieupartagé 15. De plus, l’utilisation conditionnelle des ovaires de souris à élimination génétique in vitro pourrait aider à élucider les mécanismes clés impliqués dans l’activation et la croissance des follicules primordiaux.

Dans cet article, nous présentons des méthodes pour cultiver des ovaires de souris postnatales à l’aide d’inserts membranaires et pour la quantification des follicules montés entiers dans un ovaire entier (Figure 1). Les techniques présentées ici incluent 1) la dissection des ovaires de souris néonatales, 2) la culture des ovaires de souris néonatales, 3) le changement du milieu pendant la culture, 4) la fixation tissulaire et la coloration complète des anticorps, et 5) l’imagerie tissulaire et la quantification des follicules. De plus, cette étude a utilisé la doxorubicine pour induire expérimentalement la perte folliculaire primordiale, fournissant un modèle pour étudier les mécanismes sous-jacents à l’épuisement de la réserve ovarienne. Les résultats ont montré que le nombre d’ovaires par insert et leur position dans l’insert pendant la culture influençaient le nombre de follicules primordiaux. Cela souligne l’importance de maintenir une installation de culture cohérente afin d’éviter des variations non biologiques dans les résultats expérimentaux.

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Protocole

Les souris mâles et femelles CD-1 étaient hébergées ensemble à un ratio de 1:1 en tant que couples reproducteurs. La date de naissance des nouveaux petits était désignée comme jour 0 postnatal. Toutes les expériences animales ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université du Missouri (numéro de protocole : 36647).

1. Réactifs et médias culturels

  1. Tous les réactifs utilisés dans cette étude sont listés dans le tableau des matériaux. Préparez tous les matériaux et supports avant la culture des ovaires.
  2. Milieux de culture : Fabriquez ~5 mL de milieux DMEM/F-12 complétés avec 3 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA), 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 10 mIU/mL d’hormone folliculaire-stimulante (FSH).
    REMARQUE : Les supports doivent être préparés fraîchement en ajoutant les stocks de BSA (30 mg/mL), FBS et FSH (10 UI/mL) au média DMEM/F-12. Équilibrez le milieu dans une boîte de Petri pendant environ 30 minutes dans un incubateur à 5 % deCO-2 à 37 °C. Conservez les bouillons à -20 °C et décongelez-les immédiatement avant utilisation. Des stocks en volume approprié pour éviter les gels et dégels répétés des stocks.

2. Culture des ovaires

  1. Euthanasiez les souris P5 par décapitation. Retirez les ovaires et le tissu bursain attaché à l’aide de ciseaux chirurgicaux et de pinces. Placez les ovaires dans une boîte de Petri de 60 mm contenant du sérum sulfureux phosphate tamponné (DPBS) pré-refroidi contenant un antibiotique-antimycotique (Figure 2A,B).
  2. À l’aide d’une paire de seringues à insuline (1 mL), disséquez et retirez le tissu bursain de l’ovaire sous stéréoscopie (Figure 2C,D). Transférez les ovaires à l’aide d’une pipette de 1 mL dans une boîte de Petri de 30 mm contenant 3 mL de milieu culturel et placez la plaque dans un incubateur à CO2.
    REMARQUE : Évitez de piquer ou de presser les ovaires. Réaliser des incisions propres et uniformes à travers la bourse ovarienne en utilisant des seringues d’insuline pour libérer l’ovaire. Pré-remplir la pointe de la pipette avec environ 50 μL de milieu, placer la pointe à côté de l’ovaire, puis aspirer la pointe pour le transfert.
  3. Sous la hotte à écoulement laminaire, préparez la plaque en plaçant 400 μL de média et un insert dans chaque puits (figure 2E, E'). Le média est à l’extérieur de l’insert, et la membrane de l’insert devient opaque une fois qu’il est imbibé par le substrat.
  4. Pour la culture avec traitement Dox 24h, préparez un média contenant Dox à une concentration de 0,1 mg/mL fraîchement en diluant le stock Dox (10 mg/mL) avec le milieu.
    REMARQUE : Les supports contenant des Dox doivent être éliminés correctement conformément aux directives des comités institutionnels pour la biosécurité et la santé et sécurité environnementales.
  5. Sous stéréoscope, transférez jusqu’à trois ovaires vers un insert à l’aide d’une pipette de 1 mL (Figure 2F,G). Minimisez la quantité de média transférée dans l’insert et retirez immédiatement tout excédent de média après le transfert. Une fois les ovaires délicatement placés dans l’insert, utilisez une pipette de 200 μL pour transférer environ 200 μL de milieu du puits vers l’insert, afin de garantir que la membrane est entièrement recouverte par le milieu. Transférez le milieu dans le puits et centrez les ovaires sur la membrane. Remplissez la pointe de la pipette avec un substrat de culture pour empêcher l’ovaire d’être aspiré dans la pointe lors de la centralisation. Veillez à laisser suffisamment d’espace entre les ovaires et à les stabiliser sur l’insert membranaire (Figure 2H), plutôt que de rester en suspension dans le milieu (Figure 2I). Faites attention à ne pas toucher les ovaires ni la membrane.
  6. Dans une culture de 5 jours, changez de milieu tous les deux jours en retirant 200 μL de milieu (la moitié de la quantité totale) du puits et en réajoutant 200 μL de milieux de culture frais (Figure 2J).
  7. Pour la culture avec traitement médicamenteux de 24 heures, transférez l’insert avec les ovaires dans un nouveau puits contenant 400 μL de milieux de culture frais après les 24 heures initiales, en suivant les étapes suivantes :
    1. Retirez l’insert contenant les ovaires du puits à l’aide d’une pince.
    2. Rincez brièvement le fond de l’insert en le plongeant dans un plat de 60 mm avec un substrat de culture frais.
    3. Tapotez doucement le fond de l’insert sur une antenne vide de 60 mm pour retirer l’excès de substrat sur l’insert. Placez l’insert dans le puits avec un substrat de culture frais.
      REMARQUE : Retirez l’excès de substrat de l’insert afin de s’assurer que les ovaires sont stabilisés sur la membrane immédiatement après le changement de milieu ou le transfert de l’insert.

3. Fixation et immunocoloration à montage complet

  1. Pour fixer les ovaires cultivés, retirez l’insert de la plaque à l’aide d’une pince et placez-le dans une boîte de Petri de 60 mm contenant 5 mL de DPBS. Transférez environ 100 μL de DPBS à côté des ovaires et resuspendez-les à l’aide d’une pipette de 1 mL.
  2. À l’aide d’une pipette de 1 mL, transférez les ovaires de l’insert dans un tube Eppendorf de 1,5 mL. Retirez le DPBS du tube et ajoutez 500 μL de paraformoldéhyde à 4 %. Fixez les ovaires à 4°C pendant 2 heures.
    REMARQUE : L’extrémité de la pointe de la pipette peut devoir être élargie pour éviter d’endommager les tissus si les ovaires sont trop gros pour passer à travers.
  3. Lavez les ovaires fixes avec 1 mL de PBST2 (PBS, 0,1 % Tween [v/v], 0,5 % Triton [v/v]) au moins trois fois, 1 h chacun sur un shaker rotatif. Il est recommandé de laisser les tissus dans PBST2 toute la nuit (12-16 h) à 4 °C pour renforcer la pénétration des anticorps.
    REMARQUE : Cela peut être un point d’arrêt ; les tissus peuvent être stockés dansPBST 2 jusqu’à trois jours avant l’incubation primaire des anticorps.
  4. Incuber les ovaires avec de l’hélicase anti-dead-box 4 (DDX4) dans 100 μL de tampon de dilution d’anticorps (1 % de BSA [v/v], 10 % de sérum d’âne [v/v], 0,1 M de glycine, 0,1 % de préadolescent et 0,5 % de Triton dans PBS) à une dilution de 1/400 (2,3 μg/mL) à 4 °C pendant 12 à 16 heures.
  5. Le lendemain, retirez l’anticorps primaire et ajoutez 1 mL de PBST2 dans la trompe. Lavez les mouchoirs au moins trois fois, 1 h chacun sur un shaker rotatif.
    REMARQUE : Cela peut être un point d’arrêt ; les tissus peuvent rester enPBST 2 jusqu’à trois jours après l’incubation primaire des anticorps.
  6. Diluez l’anticorps secondaire anti-lapin AF488 à 1/500 (1,5 μg/mL) dansPBST 2. Incubez le tissu avec au moins 100 μL de l’anticorps secondaire dilué à 4 °C pendant 12 à 16 heures.
  7. Le lendemain, lavez les mouchoirs en profondeur dans PBST2 au moins trois fois, 1 heure chacun sur un shaker rotatif. Il est recommandé de laver les mouchoirs jusqu’à 8 heures pour réduire le fond. Veillez à recouvrir les tubes de papier aluminium pour les protéger de la lumière de cette étape suivante.
  8. RetirezPBST 2 et ajoutez 100 μL de DAPI à une dilution de 1/1000 (1 μg/mL) dans PBS dans le tube. Incubez les tissus dans du DAPI pendant 30 minutes à température ambiante.
  9. Lavez les ovaires dans PBST2 une fois pendant 30 minutes et montez-les sur une lame microscopique avec un espaceur d’imagerie. Transférez les ovaires au centre de l’entretoise à l’aide d’une pipette de 1 mL et retirez l’excès dePBST 2. Ajoutez environ 5 μL de milieu de montage antifondu et placez une lame de microscope sur le dessus de l’entretoise. Scellez les bords de l’entretoise avec du vernis transparent pour un stockage à long terme.
    REMARQUE : Avant d’imaginer les lames, assurez-vous que le vernis est complètement sec et qu’il n’y a pas de support de montage à l’extérieur de la couche de couvercle. Ces réactifs peuvent endommager les objectifs du microscope. De plus, évitez d’utiliser un excès de support de montage, car les ovaires doivent rester immobiles pendant l’imagerie.
  10. Imagez les ovaires avec un microscope confocal à un grossissement de 10x avec une taille de pas en Z de 10 μm. Ajustez les réglages et utilisez la compensation Z (gain d’excitation) pour imager l’ensemble de l’ovaire. Cela peut se faire en suivant les étapes suivantes :
    1. Ajustez la puissance d’excitation et le gain du détecteur en surveillant la saturation du signal à l’aide de l’histogramme, car elle peut varier selon les tissus. Commencez avec une faible puissance laser et augmentez progressivement selon les besoins.
    2. Pour l’imagerie des régions plus profondes, activez la compensation Z pour le détecteur de gain, car l’intensité du signal peut diminuer avec la profondeur. Utilisez une moyenne d’images d’au moins 10 et activez le balayage X bidirectionnel à une vitesse de 600 Hz.
      REMARQUE : Avec ces réglages, l’imagerie ne doit pas dépasser 10 minutes par ovaire (~200 μm). La coloration immunofluorescente intégrale des ovaires avec de l’anti-DDX4 est généralement robuste et provoque rarement un photoblanchiment.

4. Quantification des follicules

  1. Pour quantifier les follicules de chaque ovaire, ouvrez les images avec le logiciel ImageJ. À l’ouverture, assurez-vous que le mode couleur est sélectionné comme colorisé et que les canaux séparés sont cochés dans la case sous séparé en fenêtres séparées. Sélectionnez l’image qui vous intéresse, puis utilisez l’outil image/transformation/rotation pour placer l’ovaire de façon symétrique dans l’image.
    REMARQUE : Les images acquises par un confocal peuvent être visualisées et analysées en 3D à l’aide du logiciel Imaris (Figure 3A, B) ou du logicielImageJ 16.
  2. Utilisez l’outil d’analyse/outils/grille pour diviser l’ovaire en grilles (Figure 3C,C').
  3. Utilisez les plugins/analyses/compteurs de cellules pour marquer toutes les grilles couvrant l’ovaire (Figure 3D, D', grilles indiquées par 4). Parmi ces grilles, marquez toutes les deux grilles de chaque ligne pour la quantification des follicules (Figure 3E, E', grilles indiquées par 8). Les grilles sur le bord de l’ovaire contenant moins de 10 ovocytes ne sont pas incluses pour la quantification des follicules.
    REMARQUE : Initialisez le compteur de cellules et choisissez les types de compteurs que vous jugez faciles à lire.
  4. Les ovocytes peuvent être identifiés par la présence d’une structure en forme d’anneau positive à DDX4 entourant un noyau positif pour DAPI. Les follicules primordiaux possèdent des ovocytes d’environ 20 μm de diamètre entourés de cellules somatiques squameuses. Les follicules en développement possèdent des ovocytes de plus de 25 μm de diamètre et entourés d’une ou plusieurs couches de cellules cuboïdes de granulosa (Figure supplémentaire 1).
  5. Comptez les follicules primordiaux dans chaque grille marquée (comme on le voit à la Figure 3E, E' avec le compteur de type 8). Examinez les follicules en utilisant des sections/piles optiques dans la grille, et marquez-les respectivement avec l’outil de compteur cellulaire. Veillez à ne pas compter deux fois les follicules primordiaux sur deux sections/empilements optiques consécutifs. Comptez les follicules en développement dans toutes les grilles marquées par le contre-type 4.
    REMARQUE : Utilisez l’option zoom pour aider à visualiser et compter les ovocytes à travers les piles.
  6. Calculez le nombre de follicules primordiaux dans l’ensemble de l’ovaire (nf) en multipliant le nombre moyen de follicules primordiaux par grille (nfgrid) par le nombre de grilles englobant l’ovaire (ngrids). nf = Grille NF × NgridS.
    REMARQUE : Des analyses statistiques ont été réalisées, et des graphiques générés à l’aide du logiciel Prism 10.2.0 (GraphPad Software, version 10, Inc., CA). Les différences entre les groupes ont été évaluées à l’aide d’une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA), puis du test de comparaison multiple de Tukey. La signification statistique a été prise en compte à p < 0,05. Les données sont présentées comme la moyenne ± l’erreur standard (SE).

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Résultats

Dans cet article, nous démontrons les méthodes de culture ovalaire néonatale, de coloration par anticorps montées en entier, d’imagerie confocale et de quantification des follicules afin d’évaluer si le nombre et la position des ovaires dans l’insert pendant la culture influencent le résultat expérimental, en particulier le nombre de follicules dans l’ovaire. Nous avons cultivé des ovaires avec les configurations suivantes : un, deux ou trois ovaires par insert pour la culture stabilisée, et trois ovaires par insert pour...

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Discussion

Dans cette étude, nous avons démontré des méthodes pour la culture d’ovaires de souris néonatale et pour la quantification des follicules ovariens montés sur l’ensemble de l’ovaire. L’approche en culture peut soutenir les follicules primordiaux et en développement précoce in vitro. La méthode de quantification des follicules montés entiers nécessite un traitement tissulaire minimal, ce qui permet de gagner du temps et de préserver l’intégrité des tissus, garantissant une quantification p...

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Déclarations de divulgation

Il n’y a pas de conflits d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Les recherches rapportées dans cette publication ont été soutenues par le National Institute of General Medical Sciences des National Institutes of Health sous le numéro de R35GM158131. L’EADM a été soutenue par la Fondation Lalor. Les auteurs remercient chaleureusement le Noyau Avancé de Microscopie Optique de l’Université du Missouri pour leur soutien et leur assistance dans ce travail

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaques de culture cellulaire à 24 puitsFisher Scientific & nbsp ;09-761-146  ;
Alexa Fluor 488 Anti-Lapin ÂneLaboratoires de recherche immunologique Jackson711-546-152
Anti-Anti (100X)Gibco15240-062
Albumine sérique bovineSigma-AldrichA1470-25G
Souris CD-1 IGSLaboratoires Charles River & nbsp ;022Souris
Inserts en culture cellulaireMilliporePICM01250
Seringue à insuline Comfort Point avec aiguille 1cc 28G x 1/2Exel26027
DAPIThermo Scientific62248
DDX4 Rabbit mAbAbcamab13840
DMEM/F12 (1:1) (1X)Gibco11320-033
Chlorhydrate de doxorubicine   ;Sigma-AldrichPHR1789
DPBS (1X)Gibco14190-144
Sérum fœtal bovinSigma-AldrichF0926-500ML
Fiji-ImageJNIH, États-Unis (https://imagej.net/ij/)ImageJ 1.52p
Mélangeurs nutants Fisherbrand - Vitesse variableFisher Scientific & nbsp ;88-861-043Shaker
Hormone folliculo-stimulanteSigma-AldrichF4021-10UG
Forma Steri-Cycle i160Thermo Scientifique et Commerce ;i160Incubateur à CO2
GlycineFisher Scientific & nbsp ;BP381-500
Imaris  ;Oxford Instruments (https://imaris.oxinst.com/)Imaris 10.2
Leica TCS SP8Leica MicrosystemsSN 8100001409Confocal
Sérum d’âne normalLaboratoires de recherche immunologique Jackson017-000-121
Olympus SZ61Olympus MicroscopesSZ61Stéréoscope
Paraformeldéhyde  ;Fisher Scientific & nbsp ;15714
Espaceur d’imagerie SecureSealLaboratoires biologiques Grace654002
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500ML
PRÉADOLESCENT 20Sigma-AldrichP1379-500ML
Médium de montage antifade VECTASHIELDLaboratoires VectorH-1000

Références

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