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Séries monoplaques de tests de stress de mito et de glycolyse utilisant des cellules adhérentes ou non adhérentes

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DOI :

10.3791/69504

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22 mai 2026

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1Department of Biochemistry, Cancer Biology, Neuroscience and Pharmacology, School of Medicine, Meharry Medical College, 2Department of Biomedical Sciences, School of Graduate Studies, Meharry Medical College, 3Host-Tumor Interactions Research Program, Vanderbilt-Ingram Comprehensive Cancer Center, Vanderbilt University School of Medicine, 4Vanderbilt Institute for Infection, Immunology and Inflammation, Vanderbilt University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Cette étude présente des protocoles optimisés pour réaliser simultanément des tests de stress de Mito et de glycolyse en temps réel sur la même plaque. Les procédures sont adaptées à la fois aux cellules adhérentes (BMDM) et non adhérentes (lymphocytes), permettant une évaluation précise, reproductible et parallèle de la fonction mitochondriale et glycolytique des cellules d’intérêt.

Résumé

L’analyse métabolique en temps réel permet des mesures sans étiquetage de la respiration mitochondriale et de la glycolyse, permettant aux chercheurs de relier le métabolisme énergétique cellulaire aux mécanismes de la maladie et aux réponses thérapeutiques dans divers domaines. Lorsqu’on compare le métabolisme énergétique entre différentes souris, autres animaux, humains ou cellules sous différents traitements, il est crucial d’effectuer des mesures en une seule course afin d’assurer des résultats précis et fiables. De plus, la conception expérimentale doit prendre en compte le type cellulaire analysé, par exemple s’il s’agit d’adhérence, comme les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM), ou non adhérents, comme les lymphocytes. Par conséquent, un protocole a été développé permettant la réalisation simultanée des tests de stress de Mito et de la glycolyse sur la même plaque, malgré le fait que les tests nécessitent des injections de médicaments distinctes et des programmes analytiques. Des protocoles de manipulation distincts ont été optimisés pour l’analyse à la fois des cellules fortement adhérentes (par exemple, les BMDM) et des cellules « flottantes » non adhérentes (par exemple, les lymphocytes T et autres lymphocytes). Ici, des protocoles détaillés pour mener ces essais de manière efficace et reproductible sont présentés.

Introduction

L’analyseur XF Seahorse est un instrument unique qui permet de mesurer en temps réel la respiration mitochondriale et la glycolyse dans de nombreux types cellulaires. En quantifiant simultanément le taux de consommation d’oxygène (OCR) et le taux d’acidification extracellulaire (ECAR), cette technologie permet une dissection précise des voies bioénergétiques dans des conditions physiologiques ou de stress. Sa polyvalence l’a rendu indispensable dans divers domaines de recherche, notamment le cancer1,les neurosciences 2,l’immunologie 3,le vieillissement 3, 4, 5 et la découvertede médicaments 6, où la reprogrammation métabolique est une caractéristique de la progression de la maladie et de la réponse thérapeutique. En reliant la bioénergétique fonctionnelle aux phénotypescellulaires 7,8, l’analyse offre une plateforme puissante pour découvrir des mécanismes, identifier les vulnérabilités métaboliques et évaluer les effets des interventions génétiques ou pharmacologiques.

Dans de nombreuses disciplines, la comparaison des effets immédiats des médicaments, petites molécules, cytokines ou composés naturels sur le métabolisme cellulaire est préférable dans des conditions expérimentales identiques, la même plaque, le même temps d’incubation, les paramètres environnementaux et le même moment de la journée. En conséquence, cette approche consiste à plaquer des cellules avec différents traitements ou fondements génétiques sur la même plaque et à analyser simultanément plusieurs paramètres métaboliques. Cette stratégie assure la comparaison la plus précise possible des changements liés aux médicaments ou à la génétique dans le métabolisme énergétique cellulaire.

De nombreux types cellulaires se comportent différemment en culture. Les lymphocytes restent en suspension et ne s’attachent jamais à la plaque9, les macrophages adhèrent fortement ce qui les rend difficiles à transférer, et les cellules cancéreuses prolifèrent rapidement mais à des rythmes variables selon la lignée. Ces différences posent des défis pour l’analyse métabolique en temps réel ; par conséquent, chaque type de cellule de l’expérience nécessite un protocole adapté.

Cet article propose des protocoles étape par étape pour réaliser ces essais en utilisant une analyse métabolique en temps réel, garantissant efficacité et reproductibilité. Ces protocoles peuvent être appliqués à toutes les versions d’analyseurs disponibles sur le marché.

Protocole

Les souris ont été soignées conformément aux procédures définies dans le protocole du Comité des National Institutes of Health and Institutional Animal Care and Use (IACUC) au Meharry Medical College. Cet établissement est accrédité par l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International et respecte la politique du Service de santé publique concernant le traitement et l’utilisation des animaux de laboratoire dans des conditions exemptes d’agents pathogènes. Les détails des réactifs et des équipements utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Optimisation pour la densité cellulaire

REMARQUE : Chaque type cellulaire présente des caractéristiques métaboliques uniques et une variation considérable de taille. Les deux facteurs sont cruciaux pour déterminer le nombre approprié de cellules à charger par puits afin d’obtenir des résultats optimaux. Avant de réaliser un test expérimental initial, préparez et exécutez une plaque d’essai avec les cellules d’intérêt choisies placées à densités variables.

  1. Pour les cellules adhérentes (par exemple, les cellules cancéreuses), testez les densités de semis allant de 20 000 à 100 000 cellules par puits. Pour les cellules très métaboliques et/ou de grande taille (par exemple, les cellules cancéreuses humaines ou les fibroblastes), l’optimisation de la densité commence à 10 000 cellules ou moins par puits.
  2. Pour les cellules non adhérentes (par exemple, les lymphocytes), optimisez la densité de semis dans une fourchette de 100 000 à 500 000 cellules par puits. Pour tous les types cellulaires, visez une monocouche monocellulaire uniforme afin d’obtenir des résultats optimaux (voir la Figure 1 pour l’exemple de la disposition des plaques des échantillons).
  3. Effectuez le test de contrainte de Mito (comme ci-dessous). Les données de ce test préliminaire peuvent être utilisées pour déterminer la densité cellulaire optimale pour l’expérience principale. Sélectionnez la densité qui montre la plus grande différence entre les conditions de test.
    REMARQUE : Ce protocole ne s’applique pas à l’analyse d’échantillons 3D (par exemple, sphéroïdes cellulaires, organoïdes). Il peut cependant être modifié pour tenir compte de l’épaisseur de l’échantillon et de la surface inégale.

2. Préparation de l’essai

  1. La veille de l’essai, soulevez doucement la cartouche capteur hors de la plaque utilitaire et ajoutez 200 μL d’eau sans RNAase/ADNase dans chaque puits de la plaque utilitaire, puis descendez la cartouche capteur dans la plaque jusqu’à ce que les capteurs soient complètement immergés dans l’eau.
    REMARQUE : Le niveau d’eau doit être suffisamment élevé pour que les capteurs soient complètement immergés toute la nuit, car les fluorophores de la cartouche de capteur ne fonctionneront pas s’ils ne sont pas correctement hydratés. Si vous utilisez un XF Hydrobooster pour hydrater la cartouche, celle-ci peut être placée directement dans une solution calibrante et l’étape d’hydratation de l’eau exclue.
  2. Placez la cartouche de capteur/plaque utilitaire hydratée dans un incubateur à 37 °CCO-less pendant la nuit. Pour éviter l’évaporation de la plaque, placez également un récipient contenant de l’eau double distillée dans l’incubateur.
  3. Le jour de l’analyse, retirez la cartouche capteur/plaque utilitaire de l’incubateurCO-less 2 et retirez doucement la cartouche capteur de la plaque utilitaire, en plaçant la cartouche côté capteur vers le haut sur le banc.
  4. Éliminez l’eau de la plaque utilitaire et séchez les gouttelettes lâches en secouant, puis ajoutez 200 μL de solution calibrante XF à chaque puits.
  5. Replacez doucement la cartouche de capteur dans la plaque utilitaire afin que les capteurs soient complètement immergés dans une solution calibrante, puis replacez-la dans l’incubateur à 37 °CCO-less 2.

3. Préparation des médias d’analyse

  1. Préparation des médias Mito Stress :
    1. Dans un tube de 50 mL, ajoutez ce qui suit à 45 mL de milieu RPMI XF : 500 μL de 100 x pyruvate de sodium (concentration finale : 1 mM), 500 μL de 100x L-glutamine (concentration finale : 2 mM), et 550 μL de solution de glucose à 45 % (concentration finale : 25 mM)
  2. Ajustez le pH à 7,4. Ajoutez XF RPMI medium à un volume final de 50 mL. Gardez le milieu préparé dans un bain-marie ou un bain sec à 37 °C avant de l’utiliser.
  3. Préparation du média pour le test de glycolyse :
    1. Dans un tube de 50 mL, ajoutez 250 μL de 100x L-glutamine à 45 mL de médium RPMI XF.
  4. Ajustez le pH à 7,4, puis complétez avec un médium XF RPMI jusqu’à un volume final de 50 mL. Gardez le milieu préparé dans un bain d’eau à 37 °C ou sec avant de l’utiliser.
    REMARQUE : Le pH des milieux de test Mito Stress et Glycolyse doit être réajusté à 7,4 après ajout de compléments modifiant le pH, car même de petites écarts peuvent avoir un impact significatif sur les résultats des tests.

4. Lavage des cellules et changement de milieu avant analyse

REMARQUE : L’étape de lavage des microplaques de culture cellulaire XFe96/XF Pro variera selon l’utilisation de types cellulaires adhésifs ou non. Veuillez consulter l’étape 9, Cellules adhérentes (cellules cancéreuses, cellules primaires BMDM) et cellules non adhérentes (lymphocytes T et autres lymphocytes), pour déterminer la meilleure méthode de lavage adaptée au type cellulaire utilisé.

  1. Retirez 160 à 180 μL de milieu de croissance de chaque puits à l’aide d’un multi-pipetteur, en travaillant une rangée/colonne à la fois pour empêcher les cellules de sécher. Évitez de toucher le fond des puits.
  2. À l’aide d’un pipetman à pointe unique, retirez les 20 à 30 μL restants des puits, évitant de toucher la couche cellulaire au fond du puits.
  3. Ajoutez 180 μL de milieux de test de glycolyse ou de contrainte de Mito (voir étape 3) à chaque puits, en suivant la disposition de la Figure 1. Pour éviter de perturber la couche cellulaire, distribuez doucement le média le long de la paroi latérale de chaque puits jusqu’à ce que tous les puits soient remplis. Les deux tests sont sur la même plaque.
    REMARQUE : Les puits qui ne contiennent pas de cellules et qui contrôlent les puits doivent également être remplis avec des milieux d’essai.
  4. Placez la microplaque dans un incubateur à 37 °C CO-less pendant 40 à 45 minutes avant de commencer l’analyse, puis commencez à préparer les médicaments.

5. Préparation du médicament et chargement de la cartouche

ATTENTION : Certains médicaments (FCCP, Antimycine A/ Roténone, Oligomycine) sont dangereux et doivent être manipulés avec précaution. Des mesures appropriées sont nécessaires pour protéger le personnel ; cela inclut l’utilisation de gants et d’autres équipements de protection individuelle (EPI) ainsi que l’élimination des matériaux dans une poubelle ou un conteneur à déchets chimiques approuvé par l’institution.

REMARQUE : La concentration optimale de FCCP/oligomycine dépend du type cellulaire et, avant l’analyse, est titrée empiriquement lorsqu’on travaille avec des cellules particulièrement sensibles. Les concentrations finales peuvent varier pour les médicaments selon le type cellulaire. Préparez les médicaments et les supports de test frais le jour de l’utilisation. Ne congelez pas et ne réutilisez pas. La préparation du médicament par test peut être réalisée dans cette période de 45 minutes pour des résultats optimaux.

  1. En utilisant le milieu préchauffé du test de stress et de glycolyse de Mito de l’étape 3, diluez les composés selon le tableau 1 et/ou le tableau 2 aux concentrations appropriées à chaque type cellulaire. Préparez chaque composé dans un tube séparé de 15 mL (si vous utilisez les six composés, six tubes seront nécessaires).
  2. Retirez la cartouche de capteur/plaque utilitaire de l’incubateur2-less CO à 37 °C et retirez le couvercle, en plaçant soigneusement le guide de chargement XF fourni avec le kit, le guide de chargement XF correspondant à la sortie d’injection (Guide A pour le port A) bien au-dessus du dessus de la cartouche capteur (voir la Figure 2).
  3. En utilisant un piquet multicanal et un réservoir de réactif pour chaque médicament, ajoutez lentement le volume nécessaire au port correspondant (voir les Tableaux 1 et Tableau 2 pour le volume). Maintenez la pipettrice strictement droite lors du chargement des médicaments (voir la Figure 2).
  4. Changez ou réutilisez après avoir bien rincé et séché le guide de chargement selon les besoins pour chaque port (ports A, B, C et D) et jetez les pointes de pipette après chaque chargement.
    REMARQUE : Les embouts de pipette doivent s’adapter fermement dans le port guide, mais pas trop serré, car les pointes de pipette risquent de rester coincées dans le guide ! Il est recommandé de tester les embouts de pipette/pipette utilisés sur les guides avant de charger les composés afin d’éviter un mauvais chargement des échantillons.
  5. Après avoir chargé tous les composés dans leurs ports respectifs, retirez le guide, confirmez visuellement que tous les ports sont remplis, et fixez la cartouche avec son couvercle. Les médicaments doivent correspondre au test dans chaque partie de la même plaque (Figure 1).
    REMARQUE : Les concentrations finales recommandées pour le stress de Mito sont de 1 μM d’oligomycine, 1 μM de FCCP et 0,5 μM de roténone/antimycine ; pour la glycolyse, 10 mM de glucose, 1 μM d’oligomycine et 50 mM de 2-DG.

6. Installation de l’analyseur Seahorse XFe96

  1. Allumez l’analyseur et ouvrez le logiciel WAVE (voir la Figure 3).
  2. Sélectionnez XF Mito Stress Test.
    REMARQUE : Tant que les milieux et composés appropriés sont utilisés, l’analyseur peut effectuer simultanément des tests mitochondriaux et de glycolyse sur la même plaque à l’aide du test de stress de Mito XF.
  3. Sélectionnez le nombre de « Groupes » en fonction de la configuration des plaques et étiquetez chaque groupe. Passez à l’onglet suivant pour assigner les puits à la carte des plaques (voir la Figure 3). Les deux tests sont réalisés sur la même plaque.
  4. Mettez en évidence les puits de chaque groupe en fonction de la façon dont la plaque est chargée.
  5. Ajustez le programme selon le type de cellule et l’objectif expérimental. Par exemple, si la configuration inclut un groupe préactivé avant l’analyse ou si un activateur est ajouté pendant la course, prolongez le temps d’incubation à chaque cycle pour permettre l’activation.
  6. Sélectionnez l’onglet suivant, « Exécuter un essai », et remplissez les informations nécessaires pour sauvegarder le fichier de données.
  7. Chargez la cartouche pré-hydratée avec des médicaments (à partir de l’étape 5) dans la machine lorsque cela est indiqué pour l’initialisation. L’étape d’initialisation indiquera si les capteurs sont correctement hydratés et fonctionnels.
  8. Commencez l’essai et chargez et déchargez les plaques comme indiqué par les indications pendant le programme.
    REMARQUE : Lorsque vous chargez la cartouche ou la microplaque dans l’analyseur, assurez-vous que tous les couvercles sont retirés ! Alors que certains modèles d’analyseurs disposent d’une fonction de sécurité capable de détecter les couvercles, les modèles plus anciens n’en ont pas. Cela peut endommager la machine si le couvercle reste intact lors d’un passage de plaque.

7. Méthodes de normalisation : (SRB) et comptage nucléaire (coloration et imagerie DAPI)

ATTENTION : Certains réactifs du kit de test SRB sont corrosifs et peuvent brûler s’ils sont en contact avec la peau. Le DAPI peut provoquer une réaction cutanée allergique. L’utilisation de gants et d’autres EPI est recommandée, tout comme l’élimination des matériaux dans une poubelle ou un contenant à déchets chimiques approuvé par l’institution.

REMARQUE : Sélectionnez la méthode de normalisation en fonction des caractéristiques et des prétraitements des cellules analysées. L’une ou l’autre méthode convient pour comparer des cellules avec des taux de prolifération différents, car les deux méthodes tiennent compte de telles variations. Cependant, si les traitements médicamenteux induisent la sénescence, arrêtant la prolifération tout en augmentant la taille cellulaire, la coloration DAPI est l’approche de normalisation privilégiée. La DAPI peut ne pas convenir aux types cellulaires où la coloration nucléaire est difficile à visualiser (c’est-à-dire adipocytes, érythrocytes) ou les cellules peuvent être multinucléées (c’est-à-dire hépatocytes parenchymateux, myocytes).

  1. Pour normaliser les cellules à l’aide du test SRB (kit de test de cytoxicité des cellules B à la sulfohodamine) après une analyse métabolique en temps réel, retirez la plaque de la machine et ajoutez 1/4 du volume du milieu (par exemple, 50 μL dans 200 μL de milieu de culture) de la solution de fixation à chaque puits.
    1. Incubez à température ambiante pendant 1 h ou toute la nuit à 4 °C.
    2. Retirez la solution et lavez doucement les puits trois fois avec 200 μL d’eau sans RNase/DNase, en veillant à ne pas perturber la couche cellulaire. Pour un stockage à court terme (si nécessaire), remplacez le lavage final par du PBS et conservez à 4 °C.
    3. Pour une normalisation immédiate à l’aide du test SRB, retirez la solution de lavage et laissez la plaque sécher complètement à l’air à température ambiante.
    4. Ajoutez 25 μL de solution SRB à chaque puits et colorez pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité ou enveloppez la plaque dans du papier aluminium pendant la période d’incubation.
      REMARQUE : La solution SRB est sensible à la lumière, et cette partie de l’expérience doit être réalisée dans une zone de faible luminosité.
    5. Retirez la solution de tache et ajoutez 100 μL de solution de lavage 1x pour laver chaque puits 2 à 3 fois.
    6. Lavez-vous le plus rapidement possible pour éviter la décoloration et retirez les solutions de lavage autant que possible par aspiration sous vide.
    7. Ajoutez 100 μL de 1x solution de solubilisation dans chaque puits et placez la plaque sur un shaker pendant 10 minutes à température ambiante.
    8. Mesurez la densité optique (O.D.) à 565 nm sur un lecteur de plaques pour déterminer la densité du puits en fonction de la saturation des couleurs (voir Figure 3 pour référence visuelle).
    9. Exportez les données des valeurs O.D. sous forme de fichier Excel. Ce tableau sera collé dans le logiciel WAVE pour la normalisation (étape 8).
      REMARQUE : Si une couleur intense est observée (> O.D. 3,5) due à une surcharge cellulaire, une longueur d’onde sous-optimale (par exemple, 490–530 nm) peut être utilisée pour ramener les lectures dans la plage linéaire de l’instrument. Corrigez le fond en soustrayant l’overdose du contrôle contenant uniquement le milieu de culture (puits de contrôle de fond) de toutes les lectures des échantillons.
  2. Pour la teinture DAPI, diluez la solution DAPI d’origine à 300 nM dans 1x PBS.
    1. Lavez chaque puits de la plaque cellulaire 3 fois doucement avec 200 μL 1x PBS.
      REMARQUE : S’il y a des cellules non adhérentes, centrifugez la plaque à 200 x g pendant 3 minutes sans freinage pour garantir que les cellules sont suspendues au fond de chaque puits après chaque étape de lavage.
    2. Fixer les cellules dans un PFA à 2 % à 4 % dilué dans 1x PBS pendant 10 à 15 minutes à température ambiante.
    3. Lavez chaque puits de la plaque cellulaire 3 fois doucement avec 200 μL 1x PBS.
    4. Ajoutez environ 150 μL de cette solution de coloration DAPI diluée à chacune, en veillant à ce que les cellules soient complètement recouvertes dans chaque puits.
    5. Incubez 1 à 5 minutes à température ambiante dans un endroit peu lumineux (ou une plaque de couverture dans du papier aluminium).
    6. Retirez la solution de teinture DAPI de chaque puits.
    7. Lavez chaque puits de la plaque cellulaire 3 fois doucement avec 200 μL 1x PBS.
    8. Retirez tout PBS restant.
    9. Imagez les cellules à n’importe quelle excitation/émission entre 358–461 nm ou sous n’importe quel réglage de filtre DAPI au microscope.
    10. Exportez les données des valeurs d’émission sous forme de fichier Excel. Ce tableau sera collé dans le logiciel WAVE pour la normalisation (étape 8).

8. Analyse et normalisation des données

REMARQUE : Pour l’analyse des données, « Wave » ou un autre logiciel peut être utilisé. Le protocole fourni est applicable au logiciel Wave.

  1. Ouvrez les résultats de l’analyse dans Wave (voir Figure 3). La normalisation est effectuée à partir des valeurs obtenues à partir du fichier Excel généré par le lecteur de microplaques après la coloration SRB (étape 7).
  2. Cliquez sur « Normaliser ».
  3. Dans la fenêtre ouverte, choisissez « sélectionner tout » suivi de « coller » pour coller les données copiées du tableau Excel généré lors de l’étape de normalisation. Cliquez sur « Postuler ». Cette procédure a automatiquement normalisé toutes les données expérimentales.
  4. Pour générer un rapport, cliquez sur « Exporter vers », dans le panneau qui s’ouvre à droite, sélectionnez « Générateur de rapport de test de stress Mito pour XF Cell ». Sauvegardez le fichier généré. Lors de l’analyse, sélectionnez uniquement les puits attribués au test de contrainte de Mito (voir la Figure 3).
  5. Pour générer un rapport, cliquez sur « Exporter vers », dans le panneau qui s’ouvre à droite, sélectionnez « Générateur de rapports du test de résistance à la glycolyse cellulaire XF ». Sauvegardez le fichier généré. Lors de l’analyse, sélectionnez uniquement les puits assignés au test de stress de glycolyse (voir la Figure 3).

9. Cellules adhérentes vs. non adhérentes

REMARQUE : Les cellules adhérentes et non adhérentes diffèrent dans leur comportement de croissance, leur attache de surface et leurs besoins de manipulation. Les cellules adhérentes (par exemple, cellules cancéreuses, BMDM) s’attachent à la surface de la culture, donc le plaque et le lavage ne nécessitent pas de précautions particulières. Les cellules non adhérentes (par exemple, les lymphocytes T, autres lymphocytes) restent en suspension et nécessitent différentes méthodes de centrifugation, de resuspension et de plaque. Comprendre ces différences est crucial pour un ensemencement cellulaire précis, un traitement médicamenteux et la cohérence des essais.

  1. Assurez-vous que toutes les cellules utilisées pour l’expérience sont cultivées dans un milieu et un récipient de culture cellulaire de choix juste avant la réalisation du test, puis transférez sur la microplaque pour effectuer le test.
    REMARQUE : Bien que le milieu XF RPMI soit recommandé pour les types cellulaires décrits dans ce protocole, pour d’autres types cellulaires, consultez le fabricant afin de vérifier que le milieu approprié est utilisé.
  2. Pour les cellules adhérentes (cellules cancéreuses, cellules BMDM), ensemencer les cellules sur la microplaque de culture XFe96/XF Pro Cell Culture 4 à 5 h avant le test à une densité cellulaire optimisée (voir étape 1) dans le milieux à volume 200 μL et placer dans un incubateurCO2 à 37 °C.
    REMARQUE : Les cellules BMDM peuvent être placées jusqu’à 24 heures avant le test, car elles ne prolifèrent pas et maintiennent la même densité cellulaire. Pour les cellules adhérentes à croissance rapide, comme les lignées cellulaires cancéreuses, il est conseillé de plaquer le jour du test si aucun traitement supplémentaire n’est nécessaire, puis de les analyser dès que les cellules sont attachées afin d’éviter une croissance cellulaire supplémentaire. Si cette conception n’est pas possible, la normalisation en quantité/puits protéique ou en nombre de noyaux/puits est une étape nécessaire.
  3. Assurez-vous que les puits d’angle pour chaque quatre coins de la microplaque sont exempts de cellules mais remplis de milieux, car cela se mesure comme les puits de contrôle blancs.
  4. Après 3 à 5 heures d’incubation, observez la microplaque pour vous assurer que les cellules sont attachées à la plaque de manière uniforme au fond de chaque puits.
  5. Si les cellules ne sont pas encore attachées, la plaque peut être placée dans l’incubateur à 37 °CCO2 pendant un temps supplémentaire jusqu’à ce que les cellules soient bien attachées.
  6. Ensuite, préparez la microplaque avec les cellules adhérentes pour le lavage comme mentionné à l’étape 4 pour poursuivre l’essai.
  7. Pour les cellules non adhérentes (lymphocytes T et autres lymphocytes), enduire la microplaque de poly-D-Lysine avant d’ajouter les cellules à la plaque.
    REMARQUE : Bien qu’un revêtement poly-D-Lysine soit recommandé dans ce protocole, selon le type cellulaire, un autre revêtement de plaque (par exemple, collagène, fibronectine, gélatine) peut être plus adapté. Si vous utilisez un revêtement alternatif, veuillez suivre les instructions du fabricant.
  8. Pour recouvrir la microplaque, préparez 2,5 mL d’une solution de poly-D-Lysine de 20 μg/mL (dilution 50x de 1 mg/1 mL de solution aqueuse) dans 0,1 M bicarbonate de sodium, pH 8,0 (le bicarbonate fournit le pH optimal pour l’adsorption par adhésif). Cette étape peut être effectuée avant la réalisation du test ou le jour même.
  9. Appliquez 25 μL de la solution dans chaque puits de la plaque et incubez sur le banc ou sur un basculement à plaque à température ambiante pendant 20 à 30 minutes.
  10. Aspirez ou pipettez toute solution restante et lavez chaque puits deux fois à l’aide de 200 μL d’eau sans ARNase/ADN.
  11. Attendez que les puits soient secs (1 à 2 heures) avant d’ensemencer les cellules sur la microplaque.
  12. Ensuite, préparez la microplaque avec des cellules non adhérentes pour l’étape de lavage en centrifugant la plaque à 200 x g pendant 3 minutes sans freinage pour garantir la suspension des cellules au fond de chaque puits.
  13. Passez à l’étape 4 et poursuivez le reste du test comme mentionné aux étapes 5 à 7.

Résultats

Ce protocole combiné a été développé pour permettre la réalisation des deux tests sur la même plaque. Par exemple, cette méthode a été utilisée pour élucider la signalisation de diaphonie mGluR1−TCR sur la maîtrise métabolique des lymphocytes T CD8+ lors de l’activation10. Cela visait à évaluer l’impact de l’inhibition de mGluR1 sur la transition vers la glycolyse et les modifications de la respiration mitochondriale, processus essentiels au fonctionnement optimal des lymphocytes T, tout en minimisant le nombre de lymphocytes T utilisés dans chaque expérience. La même technique à plaque unique a également été appliquée efficacement à d’autres types cellulaires, tels que les macrophages dérivés de la moelle osseuse adhésive (BMDM ; Figure 4 et Figure 5), ainsi qu’aux cellules non adhérentes, telles que les cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PMBC ; Figure 3). Il a été démontré que le blocage de signalisation mGluR1 sur les cellules T CD8+ activées affecte la production d’énergie mitochondriale et non mitochondriale. En revanche, les cellules naïves n’ont montré aucun changement significatif dans leur profil énergétique métabolique (Figure 6A,B). Le test de stress de Mito des lymphocytes T CD8+ activés a montré une respiration basale et maximale élevée ainsi qu’une capacité de réserve respiratoire élevée (Figure 6C). Les lymphocytes T traités avec CPCCOEt, un antagoniste non compétitif qui bloque la signalisation en aval lors de la liaison du glutamate à mGluR1, présentaient une consommation d’oxygène (OCR) réduite comme les cellules naïves et entraînait une production d’ATP diminuée (Figure 6C). Le test de glycolyse a également montré que seules les cellules T CD8+ activées non traitées produisaient de l’ATP par glycolyse, et que le traitement par CPCCOE présentait une activité métabolique comparable à celle de la naïve (Figure 6D). Ces résultats confirment que la signalisation mGluR1 est essentielle au bon fonctionnement des cellules T CD8⁺ lors de son activation.

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Figure 1 : Cette figure illustre l’aperçu de la configuration des plaques de la microplaque qui inclut le test de stress de Mito et de glycolyse dans la même plaque. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 2 : Chargement de la cartouche de médicament. (A) Une carte détaillée des capteurs et des ports à l’arrière et à l’avant de la cartouche, indiquant quel médicament doit être chargé dans quel port. (B) L’orientation recommandée des guides sur le dessus de la cartouche pour charger les ports correspondants et le positionnement recommandé pour utiliser la pipette multicanal au-dessus des guides. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 3 : Utilisation du programme WAVE pour exécuter et analyser l’analyse. (A) Le processus de mise en place du programme inclut la sélection du type de test, l’attribution des groupes, la création de la carte des plaques et la programmation des ports de médicaments. (B) L’ordre des médicaments à charger dans les ports correspondants dépend du fait que l’échantillon soit Mito Stress ou Glycolyse. (C) Un gros plan de la coloration SRB lors de la dernière étape de la normalisation. (D) Après normalisation, les données de la plaque peuvent être exportées séparément sous forme de glycolyse et de test de contrainte de Mito pour la même plaque. (E) Les données pour la contrainte de Mito peuvent être sélectionnées en modifiant la sélection actuelle uniquement pour les échantillons de contrainte de Mito. (F) Les données pour la glycolyse peuvent être sélectionnées en modifiant la sélection actuelle uniquement pour les échantillons de glycolyse. Les données exemples utilisées dans cette figure proviennent d’une analyse des cellules mononucléaires du sang périphérique humain. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 4 : Performance simultanée de Mito Stress exécutée sur la même plaque. Des macrophages dérivés de la moelle osseuse issus de souris WT et Tusc2 KO âgées de 2 mois ont été soumis à ces deux types d’analyses. Les cellules étaient soit laissées non traitées (sham), soit stimulées avec LPS (100 ng/mL) pendant 5 heures avant le placage (30 000 cellules/puits). Des tests de stress de Mito et de glycolyse ont été réalisés en parallèle pour permettre une comparaison précise, comme montré à la Figure 1. (A) Profils de contrainte de Mito pour différents types de cellules (WT et KO) et conditions (naïves et activées), générés à l’aide du logiciel Wave. La normalisation a été réalisée par coloration par SRB comme décrit à l’étape 7. (B) Des graphiques à barres comparatifs des paramètres analysés dans chaque test. ∗ p ≤ 0,05, ∗∗p ≤ 0,005, test T de l’étudiant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 5 : Exécution simultanée des tests de stress de glycolyse effectués sur la même plaque. Des macrophages dérivés de la moelle osseuse issus de souris WT et Tusc2 KO âgées de 2 mois ont été soumis à ces deux types d’analyses. Les cellules étaient soit laissées non traitées (sham), soit stimulées avec LPS (100 ng/mL) pendant 5 heures avant le placage (30 000 cellules/puits). Des tests de stress de Mito et de glycolyse ont été réalisés en parallèle pour permettre une comparaison précise, comme montré à la Figure 1. (A) Profils de stress en glycolyse pour différents types cellulaires (WT et KO) et conditions (naïves et activées), générés à l’aide d’un logiciel Wave. La normalisation a été réalisée par coloration par SRB comme décrit à l’étape 7. (B) Des graphiques à barres comparatifs des paramètres analysés dans chaque test. ∗ p ≤ 0,05, ∗∗p ≤ 0,005, test T de l’étudiant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 6 : Tests de stress de Mito et de glycolyse sur une seule plaque utilisant des cellules T CD8⁺ purifiées à partir de splénocytes de souris. (A) Profils représentatifs du test de stress mitochondrial comparant les variations dépendantes du taux de consommation d’oxygène (OCR) des cellules T CD8+ réalisés avec les groupes naïfs, activés et activés + inhibiteurs de mGluR1. (B) Profils représentatifs du test de glycolyse comparant les variations dépendantes du médicament dans le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) des cellules T CD8+ réalisés sur les groupes inhibiteurs naïfs, activés et activés + + inhibiteurs. (C) Graphiques à barres montrant des changements quantitatifs dans différents paramètres de la respiration mitochondriale des lymphocytes T CD8+ dans les groupes inhibiteurs naïfs, activés et activés + + inhibiteurs. Les barres représentent la moyenne ± SEM (n = 4). (D) Graphiques à barres montrant des changements quantitatifs dans différents paramètres de glycolyse chez les cellules T CD8+ naïves, activées et activées + inhibiteur de la mGluR1. Les barres représentent la moyenne ± SEM (n = 4). ∗p ≤ 0,05, ∗∗p ≤ 0,005, Test T de l’étudiant. Cette figure est adaptée d’Aquino et al.10. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Puits final (μM)Volume de solution de stock (μL)Volume média (uL)10x port (μM)Volume ajouté au port (μL)
Oligomycine Port A0.51502850520
1.545025501520
2.563018902520
Port B FCCP0.12537.52962.51.2522
0.257529252.522
0.51502850522
130027001022
260024002022
Port C Roténone/Antimycine0.53002700524

Tableau 1 : Préparation du composé pour le chargement des cartouches de capteurs XFe96 pour Mito Stress.

Puits finalVolume de solution de stock (μL)Volume de médias (μL)Port 10xVolume ajouté au port (μL)
Port A Glucose250 mM100240020
Oligomycine port B0,5 μM15028505 uM22
1,5 μM450255015 uM22
2,5 μM630189025 uM22
Port C 2-DG50 mM30000500 mM24

Tableau 2 : Préparation du composé pour le chargement des cartouches de capteurs XFe96 pour la glycolyse.

Discussion

Le protocole présenté ici permet des comparaisons précises et fiables de deux voies majeures de production d’énergie, la phosphorylation oxydative (production mitochondriale d’ATP) et la glycolyse anaérobie (production d’ATP hors des mitochondries, sans nécessiter d’oxygène), ainsi que deux tests de contrainte différents lors d’une seule exécution. De plus, le plan expérimental prend en compte le type de cellules analysées, permettant une compréhension plus large de l’analyse du métabolisme cellulaire, tout en minimisant la quantité d’échantillons et de réactifs utilisés.

Les différences entre les tests de stress de Mito et de stress de glycolyse réalisés sur des protocoles d’analyse métabolique en temps réel conçus et vendus par Agilent, Inc. sont importantes. Ces deux tests nécessitent des supports de test distincts, des médicaments spécifiques et des systèmes d’instruments différents. Le test de stress de Mito utilise des milieux de test contenant du glucose, de la L-glutamine et du pyruvate, tandis que le test de résistance à glycolyse utilise des milieux sans glucose complétés uniquement par la L-glutamine. Les tests sont examinés avec différents composés : oligomycine → FCCP → antimycine A + roténone pour le test de stress de Mito, et oligomycine → glucose → 2-DG pour le test de stress de glycolyse. Par conséquent, ces tests sont généralement effectués sur des plaques séparées à des moments différents, car l’analyseur métabolique en temps réel ne peut accueillir qu’une seule plaque à la fois.

Pour remédier à ces limitations, un protocole combiné a été développé permettant de réaliser les deux tests sur la même plaque en utilisant la configuration des tests de stress Mito dans un précédent article10. Sont fournies des recommandations pour analyser différents types cellulaires, y compris les cellules immunitaires, les cellules cancéreuses, les cellules adhérentes et les cellules en suspension. Ces directives peuvent être appliquées individuellement ou en combinaison, offrant une flexibilité selon les objectifs de l’expérimentateur et les ressources disponibles.

La normalisation des cellules par test SRB ou DAPI permet également une plus grande flexibilité, dans le cas de l’utilisation de plusieurs types cellulaires avec des taux de croissance ou une tailledifférents, 9,11. De plus, comme cette technique ne nécessite qu’une seule plaque pour deux tests, elle peut être combinée avec une variété de types d’échantillons pour mesurer les processus métaboliques.

Facteurs influençant le succès de la méthode : (1) nombre optimal de cellules par puits ; (2) attachement efficace des cellules ; et (3) un chargement soigneux des cartouches, car deux ensembles distincts de médicaments doivent être chargés dans des sections séparées de la cartouche.

Les avantages scientifiques et expérimentaux de la méthode incluent la comparaison directe dans le même contexte biologique. L’utilisation des mêmes cellules sous des conditions de culture identiques élimine la variabilité entre plaques ou filets et permet une comparaison plus précise des fonctions mitochondriales et glycolytiques dans un même échantillon. Il inclut également une vision intégrée du métabolisme cellulaire. Mesurer simultanément la phosphorylation oxydative (OXPHOS) et la glycolyse offre un instantané complet du métabolisme énergétique global d’une cellule et de sa flexibilité à passer d’une voie à l’autre. Ce test parallèle réduit également la variabilité biologique. Les différences de densité de plaque cellulaire, de nombre de passages ou de conditions environnementales sont minimisées puisque les deux tests sont réalisés sur la même population cellulaire, ce qui conduit à une meilleure reproductibilité. Effectuer les deux tests simultanément réduit la variabilité d’une série à l’autre due à l’étalonnage des cartouches de capteur, aux variations de température ou à la préparation des réactifs.

Les avantages techniques de cette technique incluent une efficacité accrue grâce à la combinaison des tests, ce qui permet d’économiser du temps, des réactifs et des consommables sur plaques, ce qui la rend importante pour les études à grande échelle ou à haut débit. Cela permet d’obtenir des besoins en échantillonnage plus faibles. Une seule plaque cellulaire est nécessaire, ce qui est avantageux lorsqu’on travaille avec des cellules primaires limitées ou rares (par exemple, lymphocytes, cellules dérivées du cerveau). Une meilleure normalisation entre les tests est obtenue puisque les deux tests utilisent la même plaque, la normalisation (par exemple, selon la teneur en protéines ou le nombre de cellules), et est plus cohérente et fiable. Grâce à cette cohérence, la corrélation des données est renforcée. L’association directe des paramètres mitochondriaux et glycolytiques du même échantillon facilite le profilage métabolique et les analyses statistiques.

La seule limitation connue de cette technique est que la combinaison de deux protocoles sur une seule plaque réduit le nombre de réplications de puits disponibles. Il est recommandé de limiter le nombre de conditions par plaque afin d’assurer au moins 8 puits répliqués par condition.

Remerciements

Cette recherche a été financée par le National Institute on Minority Health and Health Disparities (NIMHD), subvention numéro 5U54MD007586-37, projet pilote d’A. Ivanova ; Le projet de recherche 2, PI-Ivanova, également un certain soutien du NHGRI Diversity Center for Genome Research UG3HG013248, PI-Ivanova, a également été apporté par Genprex Inc.  De plus, cette recherche a été menée dans les installations centrales du Meharry Medical College, qui bénéficient d’un soutien des subventions NIH MD007586, CA163069 et S10RR025497.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes centrifuge de 15 mL, sacs avec bouchon à vis, stériles, 500 tubes/unitéGenesee Scientific21-408B
Pointes pipette Biologix-200 & mu ; l Étendu (Pack, Stérile)Biologix USASKU 21-0200
BioTek Synergy H1BIOSPX
Microscope à fluorescence BZ-X700Keyence
Corning  ; Réservoirs stériles de réactifs jetables CostarFisher4873
Solution D-(+)-glucose à 45 % dans l’H2OSigmaG9769
DAPI, hydrochlorure & nbsp ;Thermofisher ScientificD1306
Centrifugeuse Eppendorf 5810 REppendorf
GenClone Sérum fœtal bovin inactivé par la chaleurGenesee Scientific25-514H
L-Glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081
Olympus Plastics 22-284, microtubes Olympus 1,7 ml, polypropylène transparent et stérile, Bouillonproof, ster, 50/sac, 250 tubes/unitéGenesee Scientific22-284
Olympus Plastics 28-108, tubes centrifugeuses coniques de 50 ml, polypropylène en vrac, stériles, 20 sacs de 25 tubes, 500/unitéGenesee Scientific28-108
Solution paraformaldéhyde 16 % de qualité EMScience de la microscopie électronique15710
Poly-D-Lysine hydrobromure lyophiliséeSigmaP6407
Bain d’eau Precision 180Precision Scientific51221060
Incubateur Precision Scientific GCA Modèle 26Thelco51221091
QBI 120-095-671 Mélange de Pénicilline/Streptomycine, 100x Mélange Pen/Streptocoque, 10 x 10 mL/unitéGenesee Scientific25-827
QBI PBS, 1x, sans Ca, Mg, Phénol Rouge, 0,1 um Stérile filtréGenesee Scientific25-507B
RPMI 1640, avec L-GlutamineGenesee Scientific25-506
Seahorse XF RPMI medium, pH 7,4, 500 mLAgilent103576-100
Analyseur Seahorse XFe96Agilent
Seahorse XFe96/XF Pro FluxPakAgilent103792-100comprend 18 cartouches de capteurs XFe96/XF Pro, 18 microplaques de culture cellulaire XFe96/XF Pro, 1 flacon de Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL et 3 paires de guides de chargement XF
Sodium BicarbonateSigmaS6014
Pyruvate de sodium (100 mM) 100XGibco11360-070
Essai SRB (kit de test Sulfurhodamine B)Abcamab235935
Pipetteur VWR Signature Ergonomique Haute Performance MulticanalAvantor89079-956
Kit de test de stress Mito pour cellules XFAgilent103015-100
Kit de test de taux glycolytique XFAgilent103344-100

Références

  1. Caines, J. K., Barnes, D. A., Berry, M. D. The use of Seahorse XF assays to interrogate real-time energy metabolism in cancer cell lines. Methods Mol Biol. 2508, 225-234 (2022).
  2. Marinangeli, C., Kluza, J., Marchetti, P., Buee, L., Vingtdeux, V. Study of ampk-regulated metabolic fluxes in neurons using the Seahorse XF Analyzer. Methods Mol Biol. 1732, 289-305 (2018).
  3. Tan, W. J. T., Santos-Sacchi, J., Tonello, J., Shanker, A., Ivanova, A. V. Pharmacological modulation of energy and metabolic pathways protects hearing in the fus1/tusc2 knockout model of mitochondrial dysfunction and oxidative stress. Antioxidants (Basel). 12 (6), 1225(2023).
  4. Sure, V. N., et al. A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice. Geroscience. 40, 365-375 (2018).
  5. Hammoud, S., et al. Tubular CPT1a deletion minimally affects aging and chronic kidney injury. JCI Insight. 9 (6), e171961(2024).
  6. Wei, C., Heitmeier, M., Hruz, P. W., Shanmugam, M. Evaluating the efficacy of glut inhibitors using a Seahorse extracellular flux analyzer. Methods Mol Biol. 1713, 69-75 (2018).
  7. Zhu, Y., et al. The role of PKM2-mediated metabolic reprogramming in the osteogenic differentiation of BMSCs under diabetic periodontitis conditions. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 186(2025).
  8. Liu, J., Zhang, X., Fan, X. Liensinine reshapes the immune microenvironment and enhances immunotherapy by reprogramming metabolism through the AMPK-HIF-1α axis in hepatocellular carcinoma. J Exp Clin Cancer Res. 44 (1), 208(2025).
  9. Van Der Windt, G. J. W., Chang, C. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Curr Protoc Immunol. 113 (3), 3.16B.1-3.16B.14 (2016).
  10. Teresa P de Aquino, M., et al. Glutamate receptor–TCR signaling potentiates full CD8+ T cell activation and effector function in tumor immunity. iScience. 28 (10), 112772(2025).
  11. Hammoud, S., Kern, J., Mukherjee, S. Assays to enhance metabolic phenotyping in the kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 328 (4), 563-577 (2025).

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