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Article de méthode

Isolement primaire, culture et vérification phénotypique des chondrocytes articulaires du genou du rat

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DOI :

10.3791/69509

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7 novembre 2025

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1Department of Orthopedics, Longfu Hospital, 2Department of TCM Rheumatology, China-Japan Friendship Hospital, 3Beijing Key Lab for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, China-Japan Friendship Hospital

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit l’isolement et la culture de chondrocytes articulaires primaires du genou de rat à l’aide d’une digestion enzymatique séquentielle. La méthode produit des chondrocytes avec des caractéristiques phénotypiques validées, offrant aux chercheurs une approche fiable pour les applications de recherche sur le cartilage.

Résumé

Les lésions cartilagineuses résultant d’un traumatisme, du vieillissement ou d’affections inflammatoires restent un défi clinique important en raison de la capacité de régénération intrinsèquement limitée des tissus. Les chondrocytes, étant le seul composant cellulaire du cartilage, sont responsables du maintien de la structure et de la fonction de la matrice extracellulaire, ce qui les rend essentiels à la compréhension de la physiologie, de la pathologie et de la régénération du cartilage. La présente étude présente un protocole complet et standardisé pour l’isolement, la culture et la vérification phénotypique des chondrocytes articulaires primaires du rat provenant de l’articulation du genou. La procédure utilise de jeunes rats allaitants pour assurer une viabilité cellulaire maximale et utilise une digestion enzymatique séquentielle avec de la trypsine et de la collagénase de type II pour une extraction cellulaire efficace. Le phénotype des chondrocytes est vérifié par immunofluorescence du collagène de type II, analyse cytométrique en flux et tests de stimulation de l’interleukine (IL)-1β pour confirmer l’identité cellulaire et la réponse inflammatoire. Ce flux de travail optimisé et reproductible permet de générer des cultures de chondrocytes de haute pureté adaptées au criblage de médicaments, aux investigations mécanistes et aux applications d’ingénierie tissulaire, faisant ainsi progresser la recherche sur la biologie du cartilage.

Introduction

Le cartilage est un type spécialisé de tissu conjonctif qui remplit plusieurs fonctions cruciales, notamment le soutien, l’amorti et l’absorption des chocs1. Il joue un rôle essentiel dans le maintien de la stabilité structurelle et la mobilité au sein du système squelettique 2,3. Des blessures mécaniques, des changements dégénératifs, une inflammation ou des anomalies métaboliques peuvent endommager le cartilage 4,5,6. En raison de son manque inhérent de vaisseaux sanguins et de nerfs, combiné à la capacité de prolifération limitée des chondrocytes, la réparation du cartilage présente des défis importants. Des maladies telles que l’arthrose (due à des changements dégénératifs et à des lésions mécaniques) et la polyarthrite rhumatoïde (causée par des réponses inflammatoires auto-immunes) peuvent causer des lésions irréversibles du cartilage, diminuant considérablement la qualité de vie des patients 7,8,9. En tant que type cellulaire exclusif dans le tissu cartilagineux, les chondrocytes sont responsables de fonctions clés telles que la sécrétion et le maintien de la matrice extracellulaire, le soutien du développement squelettique, la participation à l’amortissement et à la réparation des articulations, et la régulation centrale de la croissance et du métabolisme du cartilage 10,11,12.

Les chondrocytes sont confinés dans des lacunes de la matrice avasculaire, ce qui entraîne une capacité sévèrement limitée de prolifération et de réparation tissulaire13,14. L’état fonctionnel des chondrocytes détermine directement la santé du tissu cartilagineux15. Le dysfonctionnement des chondrocytes, causé par le vieillissement, l’inflammation, un traumatisme ou des facteurs génétiques, entraîne une diminution de la synthèse matricielle et une dégradation accrue16,17. Ce processus pathologique entraîne une dégénérescence du cartilage (comme dans l’arthrose), entraînant une altération de ses fonctions essentielles de soutien, d’amortissement et de lubrification. La capacité régénérative limitée du cartilage est la raison principale de l’important défi de sa réparation et constitue un domaine de recherche clé en orthopédie moderne et en médecine régénérative. La recherche actuelle sur le cartilage est devenue un objectif majeur dans le domaine, les interventions médicamenteuses, l’ingénierie tissulaire et la thérapie génique nécessitant toutes l’isolement des chondrocytes pour des études in vitro 18,19,20,21,22,23,24,25. Par conséquent, l’isolement et l’identification des chondrocytes constituent une étape critique dans de nombreuses approches expérimentales. Bien que des lignées cellulaires immortalisées de type chondrocytes telles que SW1353 soient utilisées comme substituts pratiques dans certaines études, elles manquent de l’expression de marqueurs phénotypiques critiques, notamment le collagène de type II, qui est essentiel à la fonction authentique des chondrocytes et à la formation de la matrice26. Par conséquent, les chondrocytes primaires restent l’étalon-or pour la recherche nécessitant une pertinence physiologique. Par rapport aux protocoles précédemment publiés nécessitant plusieurs combinaisons d’enzymes ou une manipulation mécanique étendue, l’approche simplifiée de la digestion enzymatique réduit la complexité et le temps de traitement par rapport aux méthodes nécessitant plusieurs combinaisons d’enzymes ou une manipulation mécanique étendue. De plus, l’intégration d’étapes de validation complètes garantit une identification cohérente des chondrocytes fonctionnels et améliore la reproductibilité entre les expériences et les laboratoires.

Les chondrocytes se caractérisent par leur sécrétion de collagène de type II, tandis que sous la stimulation de facteurs inflammatoires, ils synthétisent et libèrent largement des métalloprotéinases matricielles (MMP)27. Par conséquent, après l’isolement des chondrocytes, les cellules ont été identifiées par immunofluorescence de collagène de type II, et la pureté des chondrocytes a été évaluée à l’aide de la cytométrie en flux. Et stimulés avec de l’interleukine (IL)-1β pour confirmer leur synthèse caractéristique et la sécrétion de métalloprotéinases matricielles. Cette étude décrit le processus d’extraction et de caractérisation des chondrocytes chez des souris néonatales, établissant ainsi une base pour des expériences ultérieures liées aux chondrocytes.

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Protocole

L’utilisation de sujets animaux dans cette étude a été approuvée par le comité d’éthique des soins et du bien-être des animaux expérimentaux de l’hôpital de l’amitié Chine-Japon (n° zryhyy21-21-05-16). Les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Animaux d’expérimentation et travaux préparatoires

REMARQUE : Le cartilage des articulations des rats, des lapins et des humains après une arthroplastie totale du genou peut être utilisé pour l’isolement des chondrocytes. Cependant, en raison de leur viabilité plus élevée, des rats allaitants ont été utilisés pour l’extraction des chondrocytes dans cette étude.

  1. Transporter les rats de lait de l’installation de production d’animaux de laboratoire au laboratoire à l’aide de conteneurs de transfert spécialisés.
  2. Euthanasier les rats allaitants par asphyxie au CO2 (selon les protocoles approuvés par l’établissement) et rincer les surfaces de leur corps avec une solution stérile.
  3. Immergez les rats de lait euthanasiés dans de l’éthanol à 75 % pendant 10 min pour désinfecter les contaminants de surface.
  4. Transférez les rats allaitants désinfectés dans une enceinte de biosécurité et placez-les dans des boîtes de Pétri stériles.
    REMARQUE : Le nettoyage minutieux des surfaces et l’immersion dans l’éthanol des rats allaitants sont des étapes essentielles pour prévenir la contamination bactérienne ou fongique, qui peut nuire aux expériences ultérieures.

2. Isolement du tissu cartilagineux articulaire

REMARQUE : Le cartilage néonatal se présente sous la forme d’une couche translucide, blanc bleuâtre, recouvrant l’épiphyse osseuse. Des techniques d’asepsie strictes doivent être suivies au cours de cette étape afin d’éviter une contamination susceptible de compromettre les expériences ultérieures.

  1. Isolez l’articulation du genou du rat allaitant à l’aide d’un scalpel et de ciseaux ophtalmiques, puis retirez le tissu cutané sus-jacent.
  2. Transférez l’articulation du genou disséquée dans une nouvelle boîte de Pétri stérile et remplacez le scalpel et les ciseaux ophtalmiques.
  3. Prélevez le cartilage articulaire de l’articulation du genou à l’aide d’un scalpel, puis coupez soigneusement le tissu conjonctif environnant avec des ciseaux ophtalmiques.

3. Digestion du tissu cartilagineux

REMARQUE : Utilisez de la trypsine pour digérer les tissus conjonctifs entourant le cartilage, suivie de 0,2 % de collagénase II pour la digestion de la matrice cartilagineuse.

  1. Ajouter le cartilage prélevé à 3 volumes de trypsine à 0,25 % et incuber dans un agitateur thermostatique à 37 °C avec agitation pendant 30 min.
  2. Terminez la digestion en ajoutant du PBS contenant 10 % de sérum de bovin fœtal. Retirez les tissus adhérents du cartilage à l’aide de ciseaux ophtalmiques. Centrifuger (4 °C, 500 × g, 5 min) et jeter le surnageant.
  3. Remettre le tissu cartilagineux en suspension dans le PBS, centrifuger (4 °C, 500 × g, 5 min) et jeter le surnageant. Répétez cette étape de lavage 3 fois.
  4. Ajoutez 0,2 % de collagénase II au tissu cartilagineux traité et digérez dans un agitateur thermostatique à 37 °C avec agitation pendant 4 h.

4. Isolement et culture de chondrocytes

REMARQUE : Toutes les procédures doivent être effectuées dans des conditions stériles dans une enceinte de sécurité biologique. Des gants stériles doivent être portés lors de la dissociation mécanique du tissu cartilagineux à l’aide d’un piston de seringue sur la crépine cellulaire pour éviter toute contamination expérimentale. Dans des conditions de culture standard, les chondrocytes primaires ont généralement besoin d’environ 2 à 3 jours pour atteindre une confluence de 80 à 90 % lors du premier passage.

  1. Placez une passoire cellulaire de 200 μm sur une boîte de culture stérile et filtrez la suspension de cartilage digérée à travers le grillage.
  2. Broyez les fragments de cartilage résiduels sur la passoire à l’aide d’un piston de seringue stérile, puis rincez la passoire avec un milieu DMEM complet.
  3. Prélever tous les filtrats, centrifuger (4 °C, 500 × g, 5 min) et jeter le surnageant.
  4. Remettre la pastille en suspension dans du PBS, centrifuger (4 °C, 500 × g, 5 min) et jeter le surnageant.
  5. Remettre les cellules en suspension dans un milieu DMEM complet et les transférer dans une fiole de culture T25.
  6. Incuber le ballon dans un incubateur humidifié (37 °C, 5 % CO2).
  7. Cellules de passage à cette confluence en utilisant la trypsine-EDTA et la sous-culture dans un rapport de 1:2.

5. Coloration par immunofluorescence du collagène de type II pour l’identification des chondrocytes

REMARQUE : Les chondrocytes adhérents sont caractérisés par une morphologie fusiforme et polygonale. Toutes les analyses de biomarqueurs présentées dans cette étude ont été effectuées à l’aide de cellules au passage 2. Les chondrocytes au passage 3 commencent à présenter une dédifférenciation plus prononcée, caractérisée par un décalage vers une morphologie en forme de fuseau, semblable à celle des fibroblastes, et une décélération du taux de prolifération. Ce changement phénotypique devient plus évident après le passage 4. Au passage 6, la grande majorité des cellules adoptent une forme allongée, semblable à celle d’un fibroblaste. Les dilutions des anticorps ont été déterminées sur la base des recommandations du fabricant et validées par nos expériences préliminaires pour garantir une spécificité et une intensité de signal optimales.

  1. Ensemencer les chondrocytes dans une plaque de 24 puits et cultiver pendant 24 h pour permettre l’adhésion cellulaire.
  2. Jetez le milieu de culture et lavez les cellules 3 fois avec du PBS (ajoutez du PBS dans chaque puits, incubez pendant 5 min, puis aspirez).
  3. Fixez les cellules avec 4 % de paraformaldéhyde pendant 10 min, puis lavez 3 fois avec du PBS.
  4. Perméabiliser les cellules avec 0,3 % de Triton X-100 (préparé dans du PBS) pendant 10 min.
  5. Laver les cellules 3 fois avec du PBS, puis bloquer avec une solution de blocage sans animaux (150 μL/puits, diluée 5× dans du PBS) à température ambiante pendant 1 h.
  6. Retirer la solution bloquante et incuber avec l’anticorps primaire (anti-Col II, dilution 1:200) pendant la nuit à 4 °C.
  7. Récupérez l’anticorps primaire et lavez les cellules 3 fois avec du PBS.
  8. Ajouter l’anticorps secondaire IgG anti-lapin conjugué à Alexa Fluor 488 (dilution 1:50) et incuber à 37 °C pendant 1,5 h dans l’obscurité.
  9. Retirez l’anticorps secondaire et lavez les cellules 3 fois avec du PBS.
  10. Monter avec un produit anti-décoloration contenant du DAPI et sécher à l’obscurité pendant 10 min.
  11. Observez et capturez des images à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée.

6. Analyse cytométrique en flux de la pureté des chondrocytes

REMARQUE : Les chondrocytes se caractérisent par leur capacité à synthétiser et à sécréter du collagène de type II, qui sert de marqueur définitif pour l’identification. La lignée cellulaire de chondrosarcome SW1353, bien qu’elle présente certaines caractéristiques chondrocytaires, n’a pas de capacité de sécrétion de collagène de type II et sert donc de contrôle négatif dans cette expérience.

  1. Digérez les chondrocytes et les cellules SW1353 à l’aide de trypsine sans EDTA.
  2. Neutralisez la digestion avec un milieu DMEM complet et remettez les cellules en suspension dans le PBS.
  3. Incuber les cellules avec une solution de fixation/perméabilisation pendant 15 min, puis ajouter 1 mL de tampon de lavage.
  4. Centrifuger (500 × g, 5 min), jeter le surnageant et incuber avec 100 μL d’anticorps anti-collagène de type II (dilution 1:100) pendant 15 min à l’abri de la lumière, puis ajouter 1 mL de tampon de lavage.
  5. Centrifugez (500 × g, 5 min), jetez le surnageant et incubez avec l’anticorps secondaire IgG anti-lapin conjugué à Alexa Fluor 488 pendant 30 min à l’abri de la lumière, puis ajoutez 1 mL de tampon de lavage.
  6. Centrifuger (500 × g, 5 min), jeter le surnageant, remettre chaque échantillon en suspension dans un tampon de lavage de 200 μL et analyser par cytométrie en flux.

7. Stimulation des chondrocytes par l’IL-1β

REMARQUE : La production de métalloprotéinases matricielles (MMP) en réponse à la stimulation de l’IL-1β est une caractéristique caractéristique des chondrocytes. Par conséquent, cette étude utilise la stimulation de l’IL-1β pour valider cette caractéristique phénotypique dans des chondrocytes isolés.

  1. Digérer les chondrocytes des flacons de culture et les remettre en suspension dans un milieu DMEM complet.
  2. Comptez les cellules et ajustez la concentration à 5 × 10à 5 cellules/ml à l’aide d’un DMEM complet.
  3. Placez les cellules dans une plaque à 6 puits (24 puits au total), avec 12 puits désignés comme groupe témoin à blanc et 12 puits comme groupe de stimulation IL-1β.
  4. Incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire pendant 12 h.
  5. Ajouter 10 ng/mL d’IL-1β au groupe de stimulation après adhésion cellulaire complète.
  6. Prélever les surnageants de culture cellulaire après 24 h pour l’analyse ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).
  7. Lavez les cellules deux fois avec du PBS.
  8. Lyse 6 puits témoins et 6 puits stimulés par l’IL-1β avec tampon RIPA pour l’analyse ultérieure par transfert Western.
  9. Extrayez l’ARN de 6 puits de contrôle et de 6 puits stimulés par l’IL-1β à l’aide de TRIzol pour l’analyse qPCR.

8. Analyse quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR)

REMARQUE : Toutes les expériences liées à l’ARN ont été réalisées à l’aide de consommables traités au DEPC. Brièvement, les tubes et les pointes ont été trempés dans du DEPC à 0,1 % pendant 12 h, lavés à l’autoclave (121 °C, 20 min) pour inactiver les RNases et le DEPC résiduel, et séchés au four avant utilisation.

  1. Ajouter 1 mL de trizol à la pastille cellulaire et homogénéiser à l’aide d’un homogénéisateur. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
  2. Ajouter 0,2 mL de chloroforme et agiter vigoureusement pendant 30 s. Incuber à température ambiante pendant 3 min.
  3. Centrifugeuse à 4 °C, 12 000 × g pendant 15 min. Transférez la phase aqueuse incolore dans un nouveau tube de microcentrifugation et ajoutez un volume égal d’isopropanol.
  4. Bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 10 min. Centrifugeuse à 4 °C, 12 000 × g pendant 10 min. Jetez le surnageant et conservez la pastille d’ARN.
  5. Ajouter 1 ml d’éthanol à 75 % pré-refroidi à la pastille d’ARN. Agiter abondamment et centrifuger à 4 °C, 12 000 × g pendant 5 min. Jetez le surnageant et conservez la pastille d’ARN.
  6. Faites sécher la pastille d’ARN à l’air libre dans une enceinte de biosécurité. Dissoudre l’ARN dans 20 μL d’eau exempte de RNase.
  7. Mesurez la concentration et la qualité de l’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre Nanodrop.
  8. Transcrivez inversement l’ARN total en ADNc à l’aide d’un kit de transcription inverse.
  9. Préparez le mélange réactionnel contenant 1 μg d’ARN total, 4 μL de solution de chlorure de magnésium, 2 μL de mélange dNTP, 0,5 μL d’inhibiteur de RNase, 0,6 μL de transcriptase inverse AMV, 1 μL d’amorces aléatoires et de l’eau exempte de RNase pour ajuster le volume final à 20 μL.
  10. Incuber la réaction à 42 °C pendant 15 min, puis à 95 °C pendant 5 min. Refroidir à 4 °C pendant 5 min, puis diluer l’ADNc avec de l’eau sans RNase.
  11. Préparez le mélange réactionnel PCR contenant 2 μL d’ADNc, 10 μL de SYBR Green Real-time PCR Master Mix, des amorces directes et inverses (Tableau 1) à une concentration finale de 0,2 μmol/L chacune, et de l’eau exempte de RNase jusqu’à un volume final de 20 μL.
  12. Réglez les conditions de PCR comme suit : pré-dénaturation à 95 °C pendant 1 min, suivie de 40 cycles de 95 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 15 s et 72 °C pendant 45 s. Collectez les données de fluorescence pendant l’étape d’extension à 72 °C.
  13. Après la réaction, notez les valeurs CT de chaque échantillon et la référence interne. Calculer les niveaux d’expression relatifs des gènes cibles à l’aide de la méthode 2-ΔΔCT.

9. Dosage ELISA

REMARQUE : Préparez la solution de travail d’anticorps biotinylés et la solution de travail conjuguée d’enzyme fraîche avant utilisation.

  1. Sortez le kit ELISA du réfrigérateur 30 minutes à l’avance et laissez-le s’équilibrer à température ambiante.
  2. Préparez toutes les solutions requises selon les instructions du kit.
  3. Ajouter 100 μL d’échantillons ou de solutions étalons (à des concentrations variables) dans les puits désignés (les puits zéro ne contiennent que du tampon de dilution d’étalon/échantillon). Scellez la plaque avec un film adhésif et incubez à 37 °C pendant 90 min (à l’exclusion des puits de contrôle à blanc).
  4. Jetez le liquide et lavez chaque puits avec un tampon de lavage de 350 μL. Incuber pendant 30 s, jeter le liquide et éponger sur du papier absorbant épais. Répétez le lavage 4 fois.
  5. Ajouter 100 μL de solution de travail d’anticorps biotinylés dans chaque puits. Sceller la plaque et incuber à 37 °C pendant 60 min (à l’exclusion des puits témoins à blanc).
  6. Jetez le liquide et lavez chaque puits 4 fois comme décrit à l’étape 4.
  7. Ajouter 100 μL de solution de travail conjuguée enzymatique dans chaque puits. Sceller la plaque et incuber à 37 °C pendant 30 min (à l’exclusion des puits de contrôle à blanc).
  8. Jetez le liquide et lavez chaque puits 4 fois comme décrit à l’étape 4.
  9. Ajouter 100 μL de solution de substrat dans chaque puits. Protéger de la lumière et incuber à 37 °C pendant 15 min.
  10. Ajouter 100 μL de solution d’arrêt dans chaque puits, bien mélanger et mesurer immédiatement la densité optique (DO) à 450 nm.
  11. Générez une courbe standard à l’aide du logiciel CurveExpert et calculez les concentrations de l’échantillon.

10. Analyse par transfert Western

REMARQUE : Avant l’expérience, préparez à l’avance le tampon d’électrophorèse, le tampon de transfert, le TBST, le lait écrémé à 5 % et coupez à l’avance la membrane PVDF à la taille appropriée. Par la suite, capter les signaux chimiluminescents à l’aide d’un système d’imagerie par chimiluminescence. Réglez l’instrument en mode automatique ou manuel pour l’exposition en dégradé, qui dure généralement de 10 s à 5 min, afin de garantir la capture des signaux dans la plage dynamique linéaire et d’éviter la saturation des pixels. Après la capture du signal, sélectionnez l’image d’exposition où les bandes cibles sont claires et l’arrière-plan faible pour une analyse quantitative ultérieure.

  1. Préparez le tampon de lyse RIPA (contenant 1 % de PMSF et 1 % d’inhibiteur de la phosphatase) et ajoutez le tampon de lyse RIPA à raison de 250 μL par puits d’une plaque à 6 puits.
  2. Lyser les cellules à l’aide d’un perturbateur à ultrasons (3 cycles de 7 à 10 s chacun) et incuber sur glace pendant 30 min.
  3. Centrifuger le lysat à 4 °C, 12 000 × g pendant 10 min, puis prélever le surnageant pour la quantification de la protéine.
  4. Déterminer la concentration en protéines à l’aide du dosage de l’acide bicchoninique (ACB).
  5. Ajustez les concentrations de protéines au même niveau à l’aide du tampon de lyse RIPA.
  6. Ajoutez 5× tampon de chargement aux échantillons selon un rapport de 4:1 (échantillon : tampon).
  7. Faire bouillir les échantillons pendant 10 min, puis centrifuger à 4 °C, 12 000 × g pendant 10 min, et recueillir le surnageant pour l’électrophorèse.
  8. Assemblez le gel SDS-PAGE dans la chambre d’électrophorèse et remplissez-le de tampon d’électrophorèse jusqu’à ce que le peigne soit immergé.
  9. Retirez le peigne, chargez les échantillons dans les puits et ajoutez l’échelle de protéines aux couloirs de référence.
  10. Exécutez l’électrophorèse jusqu’à ce que le colorant bleu de bromophénol atteigne le fond du gel, puis démontez l’appareil et récupérez le gel.
  11. Assemblez le « sandwich » de transfert et effectuez le transfert humide à tension constante.
  12. Bloquer la membrane PVDF avec 5 % de lait écrémé dans du TBST pendant 1 h à température ambiante.
  13. Incuber avec un anticorps primaire dilué pendant une nuit à 4 °C.
  14. Récupérez l’anticorps primaire et lavez la membrane avec du TBST (5 × 5 min).
  15. Incuber avec un anticorps secondaire conjugué à la HRP pendant 90 min à température ambiante.
  16. Récupérez l’anticorps secondaire et lavez la membrane avec du TBST (5 × 5 min).
  17. Préparez la solution de substrat ECL et conservez-la à l’abri de la lumière.
  18. Appliquez le substrat ECL sur la membrane et capturez les signaux chimiluminescents à l’aide d’un système d’imagerie avec exposition à gradient.
  19. Analysez les intensités de bande à l’aide du logiciel ImageJ et calculez les niveaux d’expression relatifs des protéines pour une analyse plus approfondie.

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Résultats

La coloration par immunofluorescence du collagène de type II a montré que les chondrocytes isolés étaient fortement positifs (Figure 1A). L’analyse par cytométrie en flux a en outre démontré que plus de 98 % des cellules étaient positives pour le collagène de type II (Figure 1B), tandis que les cellules de contrôle négatives SW1353 étaient négatives (Figure 1C). Après une stimulation avec 10 ng/ml d’IL-1β pendant 24 h, le Western bl...

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Discussion

Le protocole décrit ici offre plusieurs avantages clés pour l’isolement et la culture de chondrocytes articulaires primaires de rat. L’utilisation de rats allaitants est essentielle pour obtenir un rendement cellulaire et une viabilité optimaux, car le cartilage des jeunes animaux contient plus de chondrocytes prolifératifs et moins de matrice minéralisée que le cartilage adulte. Cette sélection de l’âge améliore considérablement l’efficacité de la digestion enzymatique et de la récupéra...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts dans ce travail.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par le National High-Level Hospital Clinical Research Funding and Elite Medical Professionals Initiative de l’Hôpital de l’amitié Chine-Japon (NO. ZRJY2025-QM05).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
4 % de paraformaldéhydeSolarbioP1110
5 et fois ; Tampon de chargementSolarbioP1040
IgG anti-lapin conjugué Alexa Fluor 488Zhongshan Jingqiao BiotechnologieZF-0511
Solution de blocage sans animauxTechnologie de signalisation cellulaire15019
Anticorps anticollagène IIAbcamab34712
Kit de test protéique à l’acide bicinchoninique (BCA)SolarbioPC0020
Colaganase IIYeasen Biotechnologie40508ES60
Milieu de montage fluorescent contenant du DAPIZhongshan Jingqiao BiotechnologieZLI-9556
Eagle Medium modifié de DulbeccoSolarbio11995
Sérum fœtal bovin (FBS)SolarbioS9010
Peroxydase de raifort (HRP) - Anti-IgG conjuguée de chèvreZhongshan Jingqiao BiotechnologieZB-2301
IL-1 & bêta ;Peprotech400-01B
MMP13 Rabbit mAbABclonalA11148
MMP3 Rabbit mAbABclonalA11418
Lait sec écréméSolarbioD3840
Solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS)SolarbioP1020
PVDF MembraneThermo Fisher Scientific88518
Rat MMP-13 ELISA KitNouvsNBP3-06931
Rat MMP-3 ELISA KitNouvsNBP3-06894
Kit de transcription inverséePromegaA3500
Tampon de lyse RIPASolarbioR0010
Eau sans RNaseSolarbioR1600
SDS-PAGE GelÉpizymePG112
SYBR Mix Maître PCR en temps réel vertToyoboQPK-201
Triton X-100SolarbioT8200
TrizolSolarbio15596026
TrypsineSolarbioT1320
Kit de substrat de chimiluminescence ECL ultra-sensibleNCM BiotechP10300
&bêta ;-Actin Rabbit mAbABclonalAC026

Références

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