Un flux de travail modulaire pour l’analyse quantitative, structurelle et fonctionnelle des biofilms de Leptospira

Summary

Ce protocole propose un flux de travail modulaire BSL-2 combinant des tests de biomasse cristalline-violet, des cinétiques à contraste de phase en accéléré, une cartographie confocale 3D/matricielle, une ultrastructure SEM, et un module d’infection à hamster in vivo pour cultiver, quantifier, caractériser et étudier le rôle fonctionnel du biofilm Leptospira , permettant une évaluation standardisée des mutants et des interventions anti-biofilm à travers les laboratoires.

Abstract

Ici, nous présentons un ensemble intégré de protocoles pour la culture, la surveillance quantitative, ainsi que la caractérisation structurelle et fonctionnelle des biofilms des espèces de Leptospira au fil du temps. Ce flux de travail combine des tests de microtiter violet cristal pour mesurer la biomasse de biofilm à plusieurs points temporels, avec une approche de fractionnement résolu dans le temps qui distingue les populations bactériennes attachées (biofilm) et non attachées (phase liquide), l’imagerie à contraste de phase en accéléré pour l’observation cinétique non destructive, la microscopie laser confocale pour générer des reconstructions 3D complètes avec des lectures de sonde matricielle, et la microscopie électronique à balayage à balayage par membrane pour l’analyse ultrastructurale. Parallèlement, nous détaillons une procédure standardisée pour la récolte des agrégats biofilms intacts et leur préparation à l’injection intrapéritonéale dans le modèle sensible du hamster syrien doré, permettant une évaluation directe de la virulence associée au biofilm in vivo aux côtés de contrôles planctoniques appariés.

Optimisé pour la souche pathogène Leptospira interrogans Manilae L495, chaque module est facilement transférable à d’autres espèces de Leptospira et aux bibliothèques mutantes pour comparer la capacité de formation de biofilms. Ensemble, ces modules coordonnés fournissent une base solide pour le dépistage des stratégies anti-biofilms, l’étude des déterminants génétiques et la clarification de la contribution des biofilms à la persistance et à la pathogenèse des Leptospira .

Introduction

Les biofilms sont des communautés microbiennes structurées dans lesquelles les cellules sont intégrées dans une matrice de substance polymère extracellulaire (EPS) auto-sécrétée composée de polysaccharides, protéines, acides nucléiques et^{lipides 1}. Cette matrice assure une stabilité mécanique, médiatise l’adhésion aux surfaces et améliore la survie microbienne en conférant une tolérance aux stress environnementaux tels que la dessiccation, le stress oxydatif et les^{antimicrobiens 2,3}. Dans les bactéries pathogènes, les biofilms favorisent la persistance, l’évasion immunitaire et l’infection^{chronique 4,5}.

Comparées aux cellules planctoniques, qui sont libres et métaboliquement plus homogènes, les cellules associées au biofilm présentent une expression génique modifiée, des taux de croissance et une activité^{métabolique 6}. Ces différences confèrent une tolérance accrue aux défis environnementaux, aux antibiotiques et aux défenses de l’hôte, tout en permettant des comportements coordonnés tels que la détection du quorum, la rétention des nutriments et l’organisation^{spatiale 7,8}.

La formation de biofilms a été largement caractérisée chez des organismes modèles tels que Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus et Vibrio cholerae, qui ont collectivement façonné notre compréhension des bases génétiques, structurelles et physiologiques du mode de vie des biofilms. Des études sur Pseudomonas ont révélé que les exopolysaccharides et la détection du quorum agissent ensemble pour façonner des architectures complexes de biofilms^{tridimensionnels 9,10}. La recherche sur le Staphylococcus a mis l’accent sur le rôle des protéines de surface et de l’ADN extracellulaire dans l’amélioration de la cohésion du biofilm et de la tolérance aux^{antibiotiques 11,12}. Les recherches sur les espèces de Vibrio ont également mis en lumière la remarquable diversité des morphologies de biofilms et leur importance écologique dans les environnements aquatiques¹³. Collectivement, ces systèmes ont fourni un cadre conceptuel et méthodologique solide pour la recherche sur les biofilms, renforcé par les protocoles^{standardisés 14} et des évaluations critiques des techniques^{existantes 15,16}, qui soulignent ensemble la nécessité d’approches harmonisées lors de l’étude de la formation de biofilms chez des bactéries moins étudiées telles que Leptospira.

Les membres du genre des spirochetes Leptospira, agents responsables de la leptospirose, étaient longtemps présumés être principalement planctoniques. Des études récentes ont démontré expérimentalement la formation robuste de biofilms chez plusieurs espèces¹⁷. Si certaines études suggèrent la formation de biofilms dans les contextes environnementaux¹⁸ et associés^{à l’hôte 19}, d’autres ont démontré expérimentalement la capacité des leptospides à former un biofilm dans les tubules rénaux de Rattus norvegicus²⁰ et dans l’humeur vitrée des^{chevaux 21}, ainsi que la détection d’espèces de leptospirales dans les biofilms environnementaux^22,23. Déchiffrer les conditions et mécanismes qui régissent les biofilms de Leptospira est donc essentiel pour comprendre la transmission environnementale, la persistance des réservoirs et la pathogenèse des^{maladies 24,25}.

Les tests existants sur les biofilms sur Leptospira sont fragmentés, allant des observations microscopiques^{qualitatives 17,26} aux colorations colorimétriques ou violettes cristallines^{finales 27,28}. Bien que ces études aient fourni des informations précieuses sur la formation des biofilms, elles manquent souvent à la fois de la résolution cinétique nécessaire pour surveiller la maturation et la dispersion du biofilm en temps réel, ainsi que du contexte ultrastructurel fourni par la microscopie confocale ou électronique. La surveillance continue et l’analyse structurelle 3D sont considérées comme essentielles pour capturer la nature dynamique de la formation et de la dispersion des biofilms^14,15. Ces limitations entravent la comparabilité entre les études et limitent l’évaluation systématique des facteurs ou interventions affectant la formation et la dispersion des biofilms, soulignant la nécessité d’un flux de travail standardisé et multi-lectures qui capture à la fois la dynamique structurelle et fonctionnelle des biofilms Leptospirde manière reproductible et complète.

Pour combler ces lacunes, nous avons développé un flux de travail intégré et modulaire qui unifie six lectures complémentaires issues de la même série culturelle. Premièrement, un test de microtitrage CV à haut débit quantifie la biomasse attachée à plusieurs moments précis. Deuxièmement, un test de fractionnement résolu dans le temps dans des plaques à 96 puits partitionne les populations totales, en phase liquide (non attachées ou partiellement détachées) et attachées (biofilm) par OD₄₀₅ afin de suivre leur évolution lors de la formation et de la dispersion. Le terme phase liquide est utilisé ici pour englober à la fois les cellules planctoniques et détachées, reconnaissant le continuum dynamique entre les phénotypes libres et associés à la^{surface 29,30}. Troisièmement, l’imagerie à contraste de phase en accéléré fournit une cinétique non destructive d’adhésion, de motilité agrégée et de coalescence. Quatrièmement, la microscopie laser confocale (CLSM) permet des reconstructions 3D complètes avec des lectures en direct/mort et des lectures par sonde matricielle, permettant une viabilité dépendante de la profondeur et une cartographie matricielle. Cinquièmement, la microscopie électronique à balayage (SEM) soutenue par membrane ou par un couvercle résout l’architecture extracellulaire et la polarité basale-apicale à haute résolution. De plus, un module in vivo a été intégré pour évaluer la virulence en utilisant l’injection intrapéritonéale d’agrégats de biofilms dans le modèle sensible du hamster syrien doré, un modèle sensible et bien établi pour la leptospirose 31,32,33. Cette approche relie les phénotypes du biofilm au potentiel pathogène, fournissant un contexte fonctionnel qui complète les analyses in vitro.

Comparée aux approches monomodales, cette plateforme offre plusieurs avantages : (i) lectures quantitatives synchronisées (CV et OD fractionné) et structurelles (CLSM/SEM) ; (ii) la surveillance cinétique non destructive de l’adhésion précoce, de la croissance, de la maturation et de la dispersion ; (iii) viabilité 3D et caractérisation matricielle à l’aide de sondes ciblées ; (iv) visualisation ultrastructurelle de l’architecture de la matrice extracellulaire ; et (v) évaluation fonctionnelle directe de la virulence associée au biofilm versus la planctonique dans un modèle de hamster sensible, chacun réalisable avec une infrastructure BSL-2 standard. En exploitant des formats multi-puits et des substrats amovibles en verre ou en polycarbonate, le flux de travail permet de reproduire les écrans de variables environnementales, de composés antimicrobiens ou de bibliothèques mutantes tout en maintenant la stérilité, le débit et la validation croisée entre modules.

Les laboratoires axés sur l’écologie, la persistance, les interactions hôte-pathogène ou la découverte d’anti-biofilms peuvent adopter des modules individuels ou l’ensemble du pipeline. Les ressources nécessaires se limitent à un lecteur de plaques, un microscope inversé avec contrôle environnemental pour le time-lapse, l’accès à un microscope confocal et à une installation SEM, ainsi qu’à des installations animales standard pour le modèle hamster, permettant une adoption large et des comparaisons reproductibles entre les études.

Protocol

Déclaration d’éthique :
Cette recherche a été approuvée par le Comité de Soins et d’Utilisation des Animaux de l’Institut Pasteur de Nouvelle-Calédonie et menée conformément aux directives établies par le Comité de Soins et d’Utilisation des Animaux de l’Institut Pasteur de Paris, ainsi qu’à la Recommandation européenne 2007/526/CE. Numéro d’enregistrement de l’Expérience de recherche animale : IPNC-2018-ARE-001

REMARQUE : Toutes les procédures impliquant des cultures vivantes de Leptospira doivent être réalisées dans un laboratoire de biosécurité de niveau 2 (BSL-2), conformément aux directives institutionnelles de biosécurité. Toutes les manipulations de culture doivent être effectuées dans un cabinet de sécurité biologique afin d’assurer la sécurité de l’opérateur et de prévenir la contamination environnementale.

La souche L495 de Leptospira interrogans sérovar Manilae utilisée dans cette étude a été initialement obtenue dans la collection de l’Institut Pasteur (Paris, France) et est conservée à l’Institut Pasteur de Nouvelle-Calédonie. Pour préserver la virulence, la souche est périodiquement réisolée à partir de hamsters infectés. Pour toutes les expériences in vitro , les cultures n’ont pas été maintenues au-delà de six sous-cultures après la récupération de l’hôte animal.

Toutes les procédures animales doivent être réalisées conformément aux directives institutionnelles et approuvées par les comités appropriés de soins et d’utilisation des animaux. Les expériences doivent respecter les réglementations européennes sur le bien-être animal (directive européenne 2010/63) et les recommandations du Service de santé publique, afin de garantir que l’utilisation des animaux soit à la fois justifiée et éthiquement réglementée.

1. Préparation de l’inocule bactérien

1. Cultivez les cellules de Leptospira à 30 °C dans un milieu^{EMJH 34} dans des conditions aérobies et sans secousses, dans des tubes en verre à fond plat à bouchon vissé jusqu’à ce que la culture atteigne la phase logarithmique moyenne. Dans ces conditions, la souche sérodaire de Manilae L495, L. interrogans et à faible passage régulièrement maintenue in vivo par des hamsters, atteint généralement la densité cellulaire appropriée en 3 à 5 jours. Assurez-vous que les cultures atteignent une OD de 0,2-0,4 à 405 nm (2 à 5 x 10⁸ cellules/mL) avant dilution dans un milieu EMJH frais et vérifiez la motilité et l’absence d’agglomérations par microscopie en champ sombre à un grossissement de 20 x.
   REMARQUE : EMJH a une absorbance intrinsèque. Blanchissez le spectrophotomètre avec EMJH stérile et soustrayez cette valeur de toutes les lectures. L’inoculum peut être standardisé soit en mesurant la densité optique, soit par un comptage cellulaire direct à l’aide d’une chambre de Petroff-Hausser. Une dilution 1:100 d’une culture mi-log vérifiée donne généralement un OD₄₀₅ = 0,02 (≈ 1 x 10⁶ cellules/mL). Mélangez doucement par inversion ; Ne faites pas de vortex.
2. Examinez une aliquote de 10 μL sous microscopie en champ noir à un grossissement de 20 x. Assurez-vous que ≥ 90 % des cellules sont très mobiles et qu’aucune masse visible n’est présente. Diluez la culture moyenne vérifiée 1:100 en EMJH fraîche pour obtenir OD₄₀₅ = 0,02 (≈ 1 x 10⁶ cellules/mL). Mélangez doucement par inversion ; Ne faites pas de vortex.
   REMARQUE : Un inoculum fonctionnel prend en charge tous les tests en aval détaillés dans ce protocole (Figure 1). Préparez 36 mL pour ensemencer une plaque à 24 puits (1 mL/puits) ou 20 mL pour ensemencer une plaque à 96 puits (200 μL/puits). Ajustez les volumes pour correspondre au nombre de plaques requises.

Figure 1. Flux de travail mondial pour l’analyse de biofilms de Leptospira . Les cultures de Leptospira à croissance exponentielle sont d’abord évaluées pour leur croissance et standardisées par densité optique. Les cultures sont ensuite distribuées en plaques contenant du verre ou des membranes, en micro-antennes de microscopie ou en plaques à 96 puits. Le flux de travail comprend sept modules : (1) préparation des inoculations ; (2) coloration violette cristalline pour la quantification de la biomasse ; (3) imagerie ultrastructurelle par MEB ; (4) la surveillance dynamique du biofilm par microscopie à contraste de phase en accéléré ; (5) visualisation 3D par CLSM avec coloration vivante/morte ; (6) la quantification résolue dans le temps des fractions attachées et non attachées lors de la formation du biofilm via la densité optique ; et (7) l’étude du rôle fonctionnel du biofilm lors de l’infection chez les hamsters syriens. Cette approche intégrée permet une analyse multimodale du développement, de la structure et de la pathogenicité du biofilm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

2. Crystal Violet - Quantification basée sur les biofilms sur les couversets ou membranes

1. À l’intérieur d’une hotte de biosécurité BSL2, utilisez des pinces stériles pour poser une gaine de revêtement en verre stérile de 12 mm ou une membrane hydrophile polycarbonate stérile de 0,1 μm à plat au fond de chaque puits, dans une plaque stérile à 24 puits avec couvercle. Pré-trempez la membrane/gouverneuse en verre pendant 2 heures à 30 °C avec 1 mL d’EMJH stérile.
   REMARQUE : Bien que ce ne soit pas indispensable, le pré-trempage du substrat dans EMJH améliore l’humidification et améliore légèrement l’adhérence bactérienne.
2. Retirez la solution de trempage et ajoutez 1,5 mL de suspension bactérienne diluée (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ cellules/mL) dans chaque puits. Assurez-vous que la membrane ou la membrane reste bien positionnée en bas.
3. Incubez la plaque à 30 °C dans des conditions statiques dans une atmosphère humide, maintenues en plaçant un plateau rempli d’eau à l’intérieur de l’incubateur pour éviter l’évaporation du milieu de culture. Pour les souches à croissance lente, une incubation de 3 semaines est recommandée afin de permettre la formation d’un biofilm mature et adhérent.
4. Au moment souhaité, retirez soigneusement autant de milieu de culture que possible de chaque puits sans perturber le biofilm. Rincez doucement chaque puits avec 1 mL de solution physiologique stérile tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer les cellules résiduelles non adhérentes, en maintenant le cache-couche à plat contre le fond du puits pour éviter de détacher les cellules fragiles de biofilm. Dans ces conditions, la croissance du biofilm se produit principalement sur la surface supérieure du manteau de recouvrement, avec une croissance minimale sur le dessous, de sorte que le rinçage sans soulèvement suffit à enrichir les cellules attachées à la surface pour les analyses en aval.
   REMARQUE : Les biofilms sont extrêmement fragiles à ce stade et peuvent facilement être aspirés par erreur. Le pipet doit être effectué lentement et précisément le long de la paroi du puits afin d’éviter de perturber le biofilm.
5. Fixez les échantillons de biofilm en ajoutant 1 mL de paraformodéhyde (PFA) à 4 % dans le PBS à 37 °C pendant 30 minutes. Retirez le fixateur et rincez soigneusement deux fois avec 1 mL de PBS.
   REMARQUE : Pour la fixation, une solution de formaldéhyde à 4 % a été fraîchement préparée (16 % de stock sans méthanol dilué à 1:4 dans PBS) puis jetée après utilisation, car la polymérisation en paraformaldéhyde réduit l’activité de réticulation.
6. Ajoutez 1 mL de solution de violet cristal (CV) à 0,1 % (v/p) dans chaque puits et incubez à température ambiante pendant 15 minutes, en veillant à ce que la membrane ou la gaine de couverture soit entièrement recouverte.
7. Jetez le colorant et rincez deux fois avec 1 mL de sac de seau.
   REMARQUE : Le violet cristallin et le paraformoldéhyde (PFA) sont toxiques et peuvent irriter la peau et les yeux. Portez toujours des gants et manipulez les deux produits chimiques avec précaution, de préférence dans une hotte à fumée. Éliminer les déchets dans des contenants désignés pour les colorants dangereux ou les déchets chimiques conformément aux directives de sécurité institutionnelles.
8. Inclinez la plaque et videz le liquide résiduel. Séchez les puits à température ambiante à l’air libre jusqu’à ce que le substrat soit complètement sec (≥ 4 heures, de préférence toute la nuit).
   REMARQUE : À ce stade, des structures en forme de points ou réticulées peuvent être visibles sur la surface de la membrane ou du couvercle (Figure 2A).
9. Ajoutez 500 μL de tampon d’élution (50 % d’éthanol, 50 % d’acide acétique glaciaire (vol/vol)) à chaque puits. Faites couver l’assiette pendant 15 minutes. Pipette de haut en bas pour dissoudre complètement le violet cristallin lié au biofilm.
10. Transférez 200 μL de chaque échantillon dans une microplaque optiquement claire de 96 puits et mesurez l’absorbance à 570 nm. Soustrayez un blank uniquement sur substrat préparé en traitant une membrane ou une membrane non inoculée par fixation, coloration CV, lavis et élution pour éliminer la liaison intrinsèque/le fond. Notez la moyenne ± l’écart-type pour au moins trois réplications techniques. Diluez les échantillons avec un tampon d’élution si l’absorbance dépasse la plage linéaire du spectrophotomètre.

3. Visualisation de biofilms à l’aide de la microscopie électronique à balayage (SEM)

1. À l’intérieur d’une hotte de biosécurité BSL2, utilisez des pinces stériles pour poser une gaine de revêtement en verre stérile de 12 mm ou une membrane hydrophile polycarbonate stérile de 0,1 μm à plat au fond de chaque puits, dans une plaque stérile à 24 puits avec couvercle. Pré-trempez la membrane/gouverneuse en verre pendant 2 heures à 30 °C avec 1 mL d’EMJH stérile.
2. Retirez la solution de trempage et ajoutez 1,5 mL de suspension bactérienne diluée (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ cellules/mL) dans chaque puits. Assurez-vous que la membrane ou la membrane reste bien positionnée en bas.
3. Incubez la plaque à 30 °C dans des conditions statiques dans un incubateur de contrôle de l’humidité pour éviter l’évaporation du milieu de culture. Pour les souches à croissance lente, une incubation de 3 semaines est recommandée afin de permettre la formation d’un biofilm mature et adhérent
4. Au moment souhaité, retirez soigneusement autant de milieu de culture que possible de chaque puits sans perturber le biofilm.
5. Rincez ensuite délicatement chaque puits avec 1 mL de PBS stérile pour éliminer les cellules résiduelles non adhérentes, en maintenant la gaine de couverture à plat contre le fond du puits pour éviter de détacher les cellules biofilms fragiles. Dans ces conditions, la croissance du biofilm se produit principalement sur la surface supérieure du manteau de recouvrement, avec une croissance minimale sur le dessous, de sorte que le rinçage sans soulèvement suffit à enrichir les cellules attachées à la surface pour les analyses en aval.
   REMARQUE : Les biofilms sont extrêmement fragiles à ce stade et peuvent facilement être aspirés par erreur. Le pipet doit être effectué lentement et précisément le long de la paroi du puits afin d’éviter de perturber le biofilm.
6. Ajouter une solution de paraformoldéhyde à 4 % (PFA) et de glutaraldéhyde à 1 % dans un tampon cacodylate de sodium (0,2 M, pH 7,4) directement dans le puits pour fixer le biofilm.
7. Incubez pendant 30 minutes à 37 °C, puis retirez le fixateur et rincez la gaine ou la membrane deux fois avec du PBS. Cette approche préserve le biofilm fixé à la surface tout en minimisant le décollement, car la plupart des croissements de biofilms se produisent sur la surface supérieure de la couche de couverture dans nos conditions.
   REMARQUE : Pour la fixation, une solution de formaldéhyde à 4 % et de glutaraldéhyde à 1 % a été fraîchement préparée (stock sans méthanol à 16 % dilué à 1:4 dans un tampon cacodylate de sodium) puis jetée après utilisation, car la polymérisation en paraformaldéhyde réduit l’activité de réticulation.
8. Immergez le substrat dans du tétroxyde d’osmium à 1 % (OsO₄) dilué dans du PBS pendant 1 heure pour améliorer le contraste du SEM. Rincez deux fois avec du PBS.
9. Déshydratez les échantillons en les immergeant séquentiellement dans des séries d’éthanol gradué de concentration croissante : 25 %, 50 %, 70 %, 90 % et 100 % (v/v), chacun pendant 10 minutes.
10. Ajoutez 500 μL d’hexaméthyldisilazane et faites éclore pendant 5 minutes, puis remplacez par un HMDS frais et incubez 5 minutes supplémentaires. Retirez l’excès de l’HMDS et laissez l’échantillon sécher complètement à l’air sous la hotte à fumées.
    REMARQUE : Le glutaraldéhyde, le PFA, le cacodylate de sodium, le tétroxyde d’osmium et l’hexaméthyldisilazane sont toxiques et doivent être manipulés sous une hotte chimique avec un équipement de protection individuelle approprié.
11. Montez les échantillons séchés sur des bûches de SEM à l’aide d’un ruban carbone conducteur double face. Enduit les échantillons par pulvérisation d’une fine couche (~10 nm) d’or ou de platine, fournissant un contraste électronique suffisant pour l’imagerie MEB. Cela permet une visualisation haute résolution de l’architecture du biofilm, y compris les contacts cellule, la morphologie, la densité et l’hétérogénéité de la matrice extracellulaire, sans avoir besoin de colorants ou de colorations supplémentaires.
12. Chargez les stubs dans le SEM en utilisant le porte-échantillon approprié. Évacuez la chambre pendant la nuit, lorsque possible, pour améliorer la qualité d’imagerie, puis acquérez des images électroniques secondaires à 5 - 15 kV et des grossissements appropriés pour révéler l’ultrastructure du biofilm (Figure 2).

4. Imagerie en contraste de phase en accéléré du biofilm en croissance

1. Pipette 500 μL de l’inoculum de travail (_{DO 405} = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ cellules/mL ; voir Section 1) dans une antenne Hi-Q4 à fond vitré stérile de 35 mm équipée d’un couvercle plan parallèle pour éliminer la distorsion du ménisque. Évitez d’introduire des bulles et fermez immédiatement le plat.
   REMARQUE : Le plat Hi-Q4 à fond de verre de 35 mm contient 4 zones de culture distinctes qui peuvent être utilisées pour imager simultanément 4 conditions différentes. Allouez un compartiment à un milieu EMJH stérile comme contrôle négatif et les 3 autres aux réplications techniques ou à différentes souches/mutants.
2. Placez l’antenne sur la scène environnementale d’un microscope inversé équipé d’optiques à contraste de phase, d’un entraînement motorisé (Biostation IMQ) et d’un boîtier humidifié réglé à 30 °C et 95 % d’humidité relative. Ces conditions aident à minimiser l’évaporation lors d’une imagerie prolongée (jusqu’à 8 jours).
3. Lancez l’application BioStation IMQ, et dans l’interface principale, ouvrez la fenêtre Nouveaux paramètres en time-lapse pour accéder au panneau de configuration. Avant de commencer l’expérience, vérifiez les paramètres environnementaux sur l’affichage de statut, en vous assurant que les indicateurs de la chambre et de température de l’eau affichent Stable afin d’éviter la dérive du cadre lors de l’acquisition.
4. Sur l’écran Nouveau Réglage en Accéléré, sélectionnez l’onglet Live , et configurez les paramètres d’imagerie dans le panneau Condition d’observation en choisissant Contraste de phase (Ph) comme filtre et en réglant le Grossissement à 20 X.
5. En mode manuel, ajustez l’intensité lumineuse et le temps d’exposition pour optimiser le contraste tout en évitant la saturation. Vérifiez cela avec le bouton Saturation Control. Définissons quatre points d’acquisition correspondant aux centres des quatre compartiments.
6. Positionnez la scène séquentiellement au-dessus de chaque compartiment à l’aide du cadran Jog ou en cliquant directement dans l’affichage d’images d’observation en direct .
7. Affinez la mise au point avec les boutons de mise au point, et enregistrez chaque position en cliquant sur le bouton Time-lapse Experiment Point Registration. Les points enregistrés apparaissent sous forme de cadres bleus numérotés dans l’affichage de vérification du point d’observation et sont confirmés dans l’onglet Points.
8. Programmez le calendrier d’acquisition en ouvrant l’onglet Temps et en cliquant sur Nouveau pour accéder à la boîte de dialogue Timelapse, où le cycle d’acquisition est fixé à 30 minutes et le temps total à 7 jours.
9. Après avoir cliqué sur Appliquer, le logiciel calcule automatiquement le nombre de tours d’acquisition. Activez l’autofocus en cliquant droit sur la barre de titre, en sélectionnant Préférences, puis en activant le mode AF pour garantir un refocus à chaque position de stage. Vérifiez la cohérence des réglages d’exposition, du gain et de l’intensité lumineuse sur tous les points, puis enregistrez toute la configuration en utilisant le bouton Sauvegarder .
10. Commencez l’acquisition en cliquant sur Démarrer Time-lapse. Le logiciel passe automatiquement aux images en accéléré, permettant une surveillance continue de l’avancement de l’acquisition et de la stabilité de la chambre tout au long de l’expérience de 7 jours. Toutes les images sont automatiquement sauvegardées au format TIFF dans le dossier expérimental créé par le logiciel.
11. Traiter et quantifier la série d’images en important les piles d’images dans FIJI (Figure 3A, B, C).
12. Ouvrez les piles d’images correspondant à chaque position via File > Import > Sequence d’images, en veillant à ce que les images soient chargées dans l’ordre chronologique.
13. Convertir les piles alignées en niveaux de gris 8 bits en utilisant le type d’image > > 8 bits pour standardiser l’intensité des pixels.
14. Appliquez le seuil à l’aide de l’image > ajustez > seuil pour isoler les régions de biofilms bactériens. Appliquez des paramètres de seuil cohérents sur toutes les trames en sélectionnant Appliquer, puis enregistrez le résultat sous forme de masque binaire en utilisant Process > Binary > Make Binary.
15. Effectuer la quantification avec Analyse > Analyse des particules, en enregistrant des paramètres tels que la surface, le pourcentage de surface et l’intensité moyenne.
16. Exportez automatiquement les résultats de chaque image dans un tableau Excel via la fenêtre des résultats (Fichier > enregistrer comme > .csv) pour l’analyse cinétique. Exprimez toutes les mesures en proportion de la surface de champ couverte par le biofilm (couverture de surface).

5. Visualisation de biofilms utilisant la microscopie laser à balayage confocal (CLSM)

1. Inoculez 1,5 mL de l’inoculum en activité (_{DO 405} = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ cellules/mL ; voir Section 1) dans un plat stérile à fond vitré de 35 mm. Incubez statiquement dans une boîte humidifiée contenant un réservoir d’eau dans un incubateur à 30 °C jusqu’à ce que le stade de développement souhaité soit atteint (jusqu’à 21 jours).
2. Au moment choisi, aspirez soigneusement le milieu lentement le long de la paroi de la vaisselle sans perturber le biofilm. Rincez une fois avec 2 mL de PBS stérile pour éliminer les cellules planctoniques, en prenant très attention à ne pas se détacher ou perturber le biofilm.
3. Préparez des solutions colorantes nécessitant une incubation avec des biofilms non fixés (vivants) (à effectuer avant la fixation).
   1. Pour la coloration vivante/morte, ajoutez 3 μL de coloration fluorescente verte SYTO9 (1,67 mM) et 3 μL d’iodure de propidium (18,3 mM) à 10 mL de PBS pour créer une solution colorante. Ajoutez 200 μL de la solution colorante directement sur le biofilm formant des bactéries, puis incubez pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité, et rinçez une fois dans le PBS.
   2. Le traceur de cellules vivantes peut également être utilisé pour colorer les cellules avant la fixation. Incubez les cellules vivantes avec un traceur CFDA/SE de 10 μM pendant 30 minutes. On peut également marquer les membranes avec FM4-64 à une concentration de 5 μg/mL. Rincez une fois dans PBS.
4. Fixez le biofilm en ajoutant 2 mL d’une solution de paraformaldéhyde à 4 % dans le PBS et en incubant pendant 30 minutes à 37 °C. Retirez le fixateur et rincez deux fois avec du PBS.
5. Ajoutez une goutte de substrat antidécolorant pour recouvrir le biofilm et éviter les bulles.
6. Acquérir des piles Z sur un microscope confocal inversé équipé d’un laser à lumière blanche accordable (WLL) et d’un objectif à immersion à l’huile HC PL APO CS2 63×/1,4 NA. Pour CFDA/SE, réglez l’excitation à 488 nm et collectez l’émission entre 500 et 550 nm, en utilisant un trou d'1 unité d’Airy (UA). Pour FM4-64, réglez l’excitation à 561 nm et détectez l’émission entre 630 et 700 nm, également avec un trou d’épingle de 1 UA.
7. Acquérir des piles Z à des intervalles de 0,5 à 1,0 μm sur toute l’épaisseur du biofilm. Ajustez la puissance du laser et le gain du détecteur pour maximiser la plage dynamique tout en évitant la saturation (<1 % de pixels saturés).
8. Utilisez la moyenne de ligne (2-4×) pour améliorer le rapport signal/bruit et maintenir tous les paramètres d’imagerie (puissance laser, bande passante du détecteur, taille du trou d’épingle, vitesse de balayage) constants sur les échantillons.
9. Sauvegardez les piles d’images sous forme de fichiers 12 bits et exportez-les au format .lif pour une analyse quantitative dans FIJI (ImageJ).
   REMARQUE : Avant l’imagerie, assurez-vous que les réglages du microscope (par exemple, puissance laser, gain du détecteur, taille du trou d’épingle) sont standardisés à l’aide d’échantillons témoins colorés avec les mêmes colorants. Cette étape d’étalonnage est essentielle pour minimiser la variabilité entre les acquisitions et permettre une comparaison fiable entre expériences.
10. Traiter et quantifier les piles d’images confocales en utilisant FIJI équipé du plugin COMSTAT (ou d’un logiciel d’analyse 3D équivalent)¹⁰. Mesurez le biovolume, l’épaisseur moyenne et maximale, la couverture de surface et les rapports vivants/morts (ou autres métriques prédéfinies). Exportez les vues orthogonales représentatives et les projections d’intensité maximale à des fins d’illustration (Figure 3D, E).

6. Quantification résolue dans le temps des fractions attachées et non attachées lors de la formation de biofilms dans des tests micro-titrés à 96 puits

1. Inoculez 200 μL de l’inoculum fonctionnel (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ cellules/mL ; voir Section 1) dans les puits d’une plaque à 96 puits. Incubez statiquement à 30 °C jusqu’au moment souhaité (jours 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17 ou 21).
   REMARQUE : Les effets de bordure et l’évaporation sont fréquents lors de l’utilisation de plaques à 96 puits, surtout si l’incubateur ne contrôle pas l’humidité. Pour minimiser ces effets, ajoutez 200 μL d’eau distillée stérile à tous les puits périphériques. De plus, des plaques ont été placées à l’intérieur d’une boîte humidifiée contenant un réservoir d’eau, qui est ensuite positionné dans l’incubateur afin de réduire davantage l’évaporation et de maintenir une humidité constante à travers les puits.
2. À chaque moment, préparez trois types d’échantillons :
   1. Suspension totale - Homogénéisez l’ensemble du contenu d’un puits contenant le biofilm en pipettant doucement plusieurs fois vers le haut et vers le bas, évitant la formation de bulles. Cette fraction représente la population bactérienne totale, incluant à la fois les leptospires non attachées et celles situées dans le biofilm semi-adhérent. Cette étape d’homogénéisation aide à disperser les agrégats cellulaires qui pourraient interférer avec les mesures d’absorbance ultérieures.
   2. Phase liquide - D’un second puits, retirez soigneusement 180 μL du surnageant sans perturber la couche de biofilm. Transférez dans un puits vide et ajoutez 20 μL de milieu EMJH frais. Pipeter doucement plusieurs fois de haut en bas pour disperser les agrégats cellulaires. Cette fraction représente les cellules non attachées présentes dans la phase liquide, qui peuvent inclure à la fois des leptospiches librement suspendues et des agrégats de biofilm détachés.
   3. Biofilm - Dans le même puits utilisé pour l’étape 2.2, resuspendez le biofilm restant en ajoutant 180 μL de milieu EMJH frais et en pipettant doucement plusieurs fois vers le haut. Cette fraction correspond aux leptopspires à l’intérieur du biofilm.
3. Mesurez l’absorbance de chaque suspension à 405 nm à l’aide d’un spectrophotomètre, après avoir vérifié que chaque puits a été complètement homogénéisé, et tracez les valeurs pour générer un graphique représentatif (Figure 4A).

7. Étude du rôle fonctionnel du biofilm lors de l’infection de l’hôte

1. Inoculez 200 μL de l’inoculum fonctionnel (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ cellules/mL ; voir Section 1) dans les puits d’une plaque à 96 puits. Incubez statiquement à 30 °C jusqu’à ce que le stade de développement souhaité soit atteint (jusqu’à 21 jours).
2. Pour déterminer la concentration d’inocule, il faut dédier des puits spécifiques de « contrôle du biofilm » qui seront utilisés uniquement pour le suivi de la croissance et non pour l’injection animale. Une fois le biofilm visible macroscopiquement, retirez doucement 180 μL de surnageant d’un puits de contrôle sans perturber le biofilm. Remplacer par 180 μL de milieu EMJH frais, resuspendre soigneusement les agrégats de biofilms sans générer de bulles, et mesurer l’OD₄₀₅ pour estimer la concentration bactérienne.
   REMARQUE : En principe, laver les puits avant la quantification pourrait aider à éliminer les cellules non adhérentes. Cependant, comme les biofilms de Leptospira présentent une faible adhésion dans les plaques à 96 puits, le lavage entraînerait une perte incontrôlée de matière biofilm. Pour cette raison, l’étape de resuspension a été réalisée sans lavage préalable afin d’assurer la reproductibilité entre les puits et des concentrations bactériennes constantes.
   Les puits de contrôle du biofilm contiennent généralement ~2 x 10⁸ leptospires, ce qui a été choisi comme inoculum standard pour les expériences d’infection aux hamsters. Cette concentration définit également le nombre cible de leptospires planctoniques utilisées comme témoins. Lorsqu’ils sont inclus, les contrôles planctoniques sont préparés en subcultivant fraîchement Leptospira dans un milieu EMJH sous des conditions de secouement à 30 °C pendant jusqu’à 5 jours, correspondant à la phase de croissance exponentielle moyenne à tardive qui donne une densité cellulaire similaire.
3. Pour l’inoculation animale, utilisez des puits de biofilm séparés (pas les puits témoins). Retirez soigneusement 180 μL de surnageant des puits pour éliminer la plupart des leptospières en phase liquide.
4. Collectez les granulats restants contenant 20 μL de biofilm à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL pour éviter de perturber la structure.
   REMARQUE : Le biofilm est fragile. Veillez à ce que les granulats soient visibles avant et après la collecte. Préparez des puits supplémentaires au cas où la répétition serait nécessaire.
5. Transférez les agrégats dans une seringue préremplie avec 300 μL de milieu EMJH frais. Laissez les agrégats se déposer par gravité.
6. Fixez une aiguille de 21 G et expulsez doucement l’excès d’EMJH jusqu’à atteindre un volume final de 200 μL. Veillez à ce qu’aucune bulle d’air ne reste et que les agrégats de biofilm restent visibles.
   REMARQUE : Attendre que les agrégats se stabilisent minimise la perte lors de l’ajustement du volume. Avant l’utilisation in vivo , vérifiez que les granulats restent intacts après passage à travers une aiguille de 21 G (Figure 4C, D).
7. Effectuer une injection intrapéritonéale de 2 leptophéres de 10⁸ dans un milieu EMJH de 200 μL.
   REMARQUE : Utilisez des hamsters syriens dorés âgés de 7 à 8 semaines (des deux sexes), entretenus dans des conditions de logement standard. Pour les témoins négatifs, injectez seulement 200 μL de milieu EMJH (un animal par réplication).
8. Surveillez les animaux deux fois par jour pendant jusqu’à 21 jours pour détecter des signes cliniques de leptospirose (pelage ébouriffé, prostration et réponse réduite à la stimulation). Euthanasiez immédiatement par inhalation de dioxyde de carbone si la souffrance est observée et notez l’heure de l’euthanasie comme l’heure du décès.
9. Au jour 21, euthanasiez tous les animaux survivants.
   REMARQUE : Effectuez trois réplications biologiques indépendantes avec des cultures préparées à des dates différentes. Chaque réplication comprend deux animaux par condition et un animal témoins négatif.

Results

Lorsque l’inoculum est correctement préparé, les cultures entrent en phase mi-logarithmique en 3 à 5 jours et présentent des valeurs de l’OD₄₀₅ de ~ 0,2-0,4 avec des champs lumineux et très mobiles sous microscopie en champ sombre (≥ 90 % des cellules mobiles) et aucun amas visible. Les préparations sous-optimales se manifestent par des bactéries lentes et une motilité hétérogène à travers le champ ; De telles cultures produisent fréquemment des biofilms faibles et doivent être jetées. En pratique, confirmer la motilité et l’OD côte à côte juste avant le seeding minimise les échecs de la sortie. L’établissement de ces portes de contrôle qualité au stade de l’inocule est le meilleur prédicteur de succès dans les applications en aval. Bien que la méthodologie ait été optimisée pour L. interrogans serovar Manilae L495, les mêmes procédures ont également été appliquées à la souche de Leptospira biflexa Patoc afin de démontrer l’applicabilité inter-espèces. L. biflexa forme généralement des biofilms moins cohésifs et plus fins que L . interrogans, mais la séquence de développement caractéristique et les caractéristiques structurelles restent détectables avec des ajustements appropriés des paramètres. L’inclusion des deux espèces souligne donc l’adaptabilité du flux de travail aux Leptospira pathogènes et saprophytes.

Après 21 jours d’incubation statique à 30 °C dans une chambre humidifiée (ou la durée appropriée pour les espèces de Leptospira utilisées), les biofilms deviennent visibles à l’œil nu à la fois sur les gaines de verre et sur les membranes en polycarbonate hydrophiles. Une croissance réussie produit des motifs CV caractéristiques après 2-3 semaines, tels que des empreintes en forme de points, ramifiées ou réticulées fixées à la surface (Figure 2A).

Dans une course typique, L. interrogans de type sauvage Manilae L495 atteint ~ 50 % de couverture de surface à la semaine 3, tandis que les mutants à faible biofilm plafonnent autour de ~ 20 % et que les phénotypes à haut biofilm approchent ~ 70-80 %, établissant une plage dynamique pratique pour le dépistage. L’étendue de la formation du biofilm peut également varier selon l’espèce et la souche de Leptospira ; par exemple, la souche de L. biflexa Patoc développe des biofilms visibles plus rapidement, des études antérieures considérant les structures dès 120 heures après l’inoculation comme étant des biofilms^{matures 35}.

La coloration violette cristalline offre une méthode fiable et reproductible pour quantifier la biomasse du biofilm. Dans les biofilms bien développés, la coloration entraîne une coloration violette foncée localisée à la zone du recouvrement ou de la membrane, indiquant des niveaux élevés de biomasse attachée (Figure 2A). Les indices visuels lors des étapes de coloration et de solubilisation fournissent également des indicateurs utiles du succès du protocole. Par exemple, une répartition inégale du CV ou une tache pâle peut être due à un sous-ensemencement, à une évaporation ou à un lavage agressif qui détache les premiers biofilms.

Les lectures d’absorbance à 570 nm reflètent la quantité de coloration retenue, et donc la densité relative du biofilm (Figure 2B). Dans des expériences représentatives, les cultures de L. interrogans cultivées dans des conditions optimales montrent des lectures OD₅₇₀ cohérentes et reproductibles à travers les réplications, reflétant une formation stable de biofilms. En revanche, de grandes variations entre les réplications sont souvent observées lorsque les échantillons subissent une pipetage excessive lors des changements de milieu, indiquant une mauvaise adhérence ou un décollement partiel du biofilm. Une telle variabilité doit être considérée comme un signe de problèmes techniques, et les échantillons concernés doivent être exclus ou le protocole soigneusement examiné. Notamment, L. biflexa Patoc forme des biofilms plus étendus sur les couvertures de verre et les membranes en polycarbonate dans des conditions similaires, ce qui se reflète dans des valeurs d’absorption CV plus élevées, démontrant que le protocole est adaptable et efficace pour les espèces de Leptospira .

Une préparation réussie du MEB permet de révéler des dépôts de matrices extracellulaires dès le troisième jour, suivis d’une architecture fortement polarisée dans les biofilms matures : une face basale rugueuse et canalisée (souvent avec > canaux de 5 μm) qui ancre une structure interne poreuse, et une face apicale plus lisse où les spirochètes sont enchevêtrés dans une matrice dense (Figure 2C, D, E, F). Les champs à forte grossissement capturent fréquemment des filaments extracellulaires ramifiés et des protubérances occasionnelles semblables à des champignons ; caractéristiques correspondant à la dynamique de coalescence observée par le time-lapse (vidéo supplémentaire 1). Dans des préparations sous-optimales, des matrices effondrées, des charges et des contours de cellules indistincts peuvent être observés, reflétant généralement une post-fixation inadéquate, un revêtement conducteur insuffisant ou un séchage insuffisant. Lorsque la polarité basale-apicale et les canaux omniprésents sont visibles, les lectures du MEB correspondent étroitement aux estimations confocales d’épaisseur et de porosité, confirmant ainsi la réussite de la préparation et de l’imagerie.

Dans les séries en accéléré efficace, les points isolés apparaissent entre 24 et 72 heures et se regroupent progressivement en agrégats plus grands qui balayent la surface avant que les limitations d’espace ne ralentissent leur mouvement (Figure 3A, B, C). La segmentation quantitative entraîne une augmentation monotone de la surface totale couverte, tandis que les comptages agrégés augmentent, atteignent un pic, puis diminuent à mesure que les collisions et fusions dominent entre ~12 et 216 h. Ces cinétiques (surface haute, agrégats en nombre inférieur) indiquent une accrétion active plutôt qu’une simple sédimentation. Les essais ratés ou à la limite manquent de points précoces, présentent des courbes de surface plates sur le temps, ou subissent une dérive de mise au point liée à une température ou humidité instables. Maintenir un environnement stabilisé à 30 °C avec 95 % d’humidité et utiliser l’autofocus à chaque moment rétablit généralement des trajectoires claires adaptées à la comparaison de mutants ou de traitements.

Les piles Z représentatives de biofilms matures montrent une architecture multicouche en mousse, typiquement supérieure à 50 μm d’épaisseur, la plupart des cellules colorant vivantes (SYTO 9-positif) et des vides centraux occasionnels indiquant des réarrangements collectifs lors de la croissance (Figure 3D). Les sondes matricielles peuvent être utilisées pour étudier la composition matricielle : le WGA met en lumière les épitopes polysaccharides, le BOBO-3 marque l’ADN extracellulaire abondant, et les colorations sélectives protéiquement contribuent peu en dehors du signal cellulaire associé (Figure 3E). Les résultats sous-optimaux incluent des empilements minces ou discontinus dominés par l’iodure de propidium, un photoblanchiment fort ou des réglages de gain incohérents, qui sapent la comparabilité quantitative. Interpréter ensemble l’épaisseur, le biovolume et les rapports vivant/mort (tout en maintenant la puissance laser, le gain du détecteur et le trou d’épingle constants selon les conditions) confirme le statut de maturation et permet des comparaisons directes avec l’ultrastructure SEM et la biomasse CV.

Le processus de formation du biofilm de Leptospira suit généralement des phases distinctes, bien que les moments et les valeurs exacts puissent varier selon l’espèce ou la souche. En utilisant la souche de L. interrogans Manilae L495 comme référence, la progression attendue sur 21 jours comprend une phase initiale (jours 0-3) où les bactéries restent majoritairement planctoniques avec un biofilm minimal (Figure 4A). Cela est suivi d’une phase de croissance exponentielle (jours 3-7) durant laquelle les bactéries planctoniques et associées au biofilm augmentent, atteignant environ 9 x 10⁸ cellules/mL, accompagnées de formation et d’expansion d’agrégats de biofilms. Entre les jours 7 et 12, les bactéries planctoniques diminuent significativement, tandis que les cellules associées au biofilm atteignent leur pic, représentant environ 80 % de la population. Enfin, pendant la phase de maturation (jours 12-21), le nombre de bactéries biofilms diminue sans augmentation des cellules planctoniques, mais la taille et la complexité du biofilm continuent de croître. L’observation de cette séquence de changements indique que le protocole capture efficacement le développement dynamique et la maturation des biofilms de Leptospira .

Lorsqu’il est correctement réalisé, le protocole d’infection utilise des inocules contenant ~2 x 10⁸ leptopspires en 200 μL d’EMJH, préparées à partir de cultures planctoniques bien définies (5 jours) ou biofilms (21 jours). Bien que ces deux types de cultures représentent des états physiologiques distincts, cette différence est intentionnelle, car l’expérience vise à déterminer si les biofilms de Leptospira — caractérisés par une activité métabolique réduite et une différenciation structurelle — conservent la capacité d’initier une infection. Ce contraste est confirmé par des études transcriptomiques montrant des changements majeurs dans l’expression génique entre la planctonie et le biofilm Leptospira^35,36. Les granulats de biofilm sont soigneusement récoltés pour préserver leur structure et rester intacts après passage à travers une aiguille de 21 G, comme confirmé avant l’injection (Figure 4C, D). Après une injection intrapéritonéale, les hamsters syriens dorés présentent généralement des signes cliniques de leptospirose dans les 3 à 5 jours (par exemple, léthargie, pelage ébouriffé, prosternation). Les témoins négatifs injectés uniquement avec un médium EMJH ne montrent aucun signe de maladie. La progression et la gravité des signes cliniques, ainsi que le délai avant l’euthanasie, varient selon l’inoculum : les bactéries planctoniques induisent souvent des symptômes plus précoces et plus aigus, tandis que les agrégats dérivés du biofilm peuvent provoquer une infection retardée mais persistante (Figure 4B). Un suivi deux fois par jour pendant jusqu’à 21 jours permet de saisir l’évolution complète de la maladie.

Figure 2. Coloration violette cristalline, quantification et imagerie ultrastructurelle des biofilms de Leptospira. (A) Coloration violet cristal (CV) des biofilms cultivés sur différents substrats. La coloration CV permet de visualiser l’architecture du biofilm et les schémas d’attache initiaux pour différentes espèces et substrats. i. L. interrogans sur le filtre en polycarbonate ; ii. L. biflexa sur filtre en polycarbonate ; iii. L. interrogans sur une toile de verre ; iv. L. biflexa sur bâton de verre de protection. (B) Exemple de formation quantitative de biofilm évaluée par absorption CV (OD570 nm) au fil du temps pour L. interrogans et L. biflexa. Cette lecture cinétique capture à la fois la dynamique précoce de l’adhésion et de l’accumulation de biomasse, mettant en lumière les différences de croissance du biofilm entre les espèces pathogènes et saprophytes. Ce chiffre a été modifié par rapport^{à 27}. (C-E) Microscopie électronique à balayage (SEM) des biofilms de L. interrogans : (c) biofilm vieux de 3 jours montrant la formation précoce de microcolonies et le dépôt initial de la matrice extracellulaire ; (d) un biofilm vieux de 14 jours présentant une architecture mature avec une organisation matricielle et tridimensionnelle étendue ; (e-f) Biofilm vieux de 3 semaines illustrant la consolidation structurelle et la maturation de la matrice sur une culture prolongée. Cette combinaison de coloration CV, de mesures quantitatives de l’OD et d’imagerie SEM offre une vue d’ensemble complète du développement du biofilm, de l’attache précoce à l’organisation ultrastructurale mature, permettant une comparaison directe entre espèces et durées de culture. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3. Visualisation de la formation de biofilms de Leptospira . Les images en contraste de phase acquises avec une BioStation montrent un développement du biofilm à (A) 48 h, (B) 96 h et (C) 144 h. (D) reconstruction CLSM d’un biofilm Leptospira affichant un biovolume total avec des tranches orthogonales pour une visualisation 3D. (E) Coloration confocale d’un biofilm mature avec DAPI (vert) et WGA (rouge), mettant en lumière les cellules bactériennes et les composants de la matrice extracellulaire. Ce chiffre a été modifié par rapport^{à 37}. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4. Quantification résolue dans le temps des fractions planctoniques et de biofilms et évaluation fonctionnelle des biofilms de Leptospira . (A) Cinétique de formation de biofilms mesurée par absorption à 405 nm. Pour chaque point temporel, des relevés ont été effectués sur le puits total, la fraction de biofilm et le surnageant contenant des leptospires planctoniques, permettant de distinguer les bactéries attachées et les bactéries nageant librement. (B) Exemples de courbes de survie de hamsters injectés avec des agrégats de biofilms, des leptospières planctoniques ou un contrôle EMJH. Les animaux injectés au biofilm présentent une virulence réduite, certains survivant 21 jours, tandis que les leptospires planctoniques provoquent une mortalité rapide. (C-D) Validation préliminaire de l’intégrité du biofilm : les granulats sont visibles dans la seringue avant l’injection (C) et restent intacts après le passage à travers une aiguille de 21 G (D, flèches blanches), confirmant que la structure du biofilm est préservée lors de la manipulation. Ce chiffre a été modifié par rapport^{à 36}. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Discussion

Ce protocole présente un flux de travail modulaire et intégratif pour étudier les biofilms de Leptospira, intégrant la biomasse quantitative (violet cristallin^)9,27, la dynamique (contraste de phase en accéléré), la composition tridimensionnelle (microscopie laser confocale à balayage avec sondes ciblées⁾³⁸, l’ultrastructure (microscopie électronique à balayage) et l’évaluation fonctionnelle (infection de hamster). En utilisant la même série de cultures entre modules, les effets batch sont minimisés et la validation croisée en expérience est activée, ce qui est particulièrement important pour les spirochètes fragiles à croissance lente. Chaque module complète les autres : le CV quantifie « combien », le time-lapse montre « la rapidité », CLSM révèle « ce qu’il y a à l’intérieur », SEM résout « comment il est construit », et les tests in vivo fournissent une « preuve de fonctionnement ». L’inclusion de L. biflexa démontre une adaptabilité entre espèces, mettant en évidence une formation de biofilms plus rapide et plus dense et mettant l’accent sur la flexibilité^{méthodologique 35}.

Le succès de chaque module dépend de la qualité de l’inoculum et de l’état physiologique. Les cultures planctoniques de milieu de logaritme (3 à 5 jours), très mobiles et exemptes d’agrégats, offrent une adhésion reproductible et un développement de biofilms. Seuls les isolats à faible passage doivent être utilisés pour assurer une formation robuste de biofilms et une reproductibilité.

Le test CV ancre le flux de travail grâce à sa vitesse, sa scalabilité et son débit ^9,27. Il permet un dépistage rapide des mutants, des milieux ou des composés anti-biofilms. Cependant, comme les biofilms de Leptospira sont fragiles et hétérogènes, une manipulation douce et une validation de la réplication sont essentielles. La CV ne peut pas distinguer les architectures compactes des poreuses ni détecter la composition matricielle — d’où son rôle de porte de filtrage pour des analyses structurales plus profondes.

L’imagerie en accéléré comble cet écart en révélant la cinétique du biofilm en temps réel. Il capture l’émergence, la coalescence et l’immobilisation des agrégats mobiles, exposant des phénomènes transitoires que les tests de fin ne manquent pas. La stabilité environnementale (température, humidité, autofocus) est cruciale. Ces enregistrements ont montré que même lorsque la biomasse CV semble stable, la dynamique peut diverger — indiquant des réarrangements structurels ou une perte de viabilité dans les couches plus profondes.

Le CLSM fournit une analyse volumétrique et chimique sans artefacts de^{déshydratation 39}. La coloration vivante/morte révèle des gradients de viabilité cellulaire au sein du biofilm, cohérents avec des rapports de diffusion de l’oxygène limitée et de stratification^{métabolique 6,40}. Les lectines et les colorants d’acides nucléiques exposent une abondance d’ADN extracellulaire et de motifs glycaniques spécifiques, permettant la quantification et la caractérisation des composants^{matriciels 41,42}. Les données CLSM révèlent fréquemment des vides internes, faisant écho aux réarrangements collectifs observés dans le^{time-lapse 38}. Cependant, les limitations incluent la spécificité de la sonde, le photoblanchiment et la résolution axiale limitée par la diffraction ; Par conséquent, les réglages du microscope et la performance des colorants doivent être standardisés et testés à l’avance afin d’assurer des résultats fiables et comparables entre les expériences.

Le SEM propose la résolution ultrastructurale complémentaire⁴³. Aux premiers stades, elle résout les agrégats naissants ; à maturité (≈ 15-21 jours), elle révèle une architecture polarisée : une couche basale rugueuse et canalisée pour l’ancrage et l’échange, et une surface plus lisse riche en matrice^{apicale 37}. Une fixation soignée, un séchage HMDS et une corrélation avec les données confocales atténuent les artefacts dus à la déshydratation ou à l’effondrement⁴⁴.

Ensemble, ces quatre modules permettent une validation interne : lorsque CV, CLSM et SEM convergent, les conclusions sont solides ; lorsqu’elles divergent, les divergences elles-mêmes sont informatives — révélant, par exemple, une biomasse accrue avec une viabilité réduite ou une biomasse inchangée avec une composition matricielle modifiée.

Plusieurs limitations intrinsèques subsistent. Les biofilms de Leptospira sont hétérogènes et fragiles, ce qui les rend sensibles à la manipulation et à la déshydratation. CV intègre la biomasse totale mais pas la^{viabilité 16} ; Le CLSM ne peut pas dépasser les limites^{optiques 38} ; Le SEM risque de préparer les artefacts. La mortalité dans les strates plus profondes est attendue en raison des gradients^{d’oxygène 6}, mais ce biais est systématique et comparable entre les conditions. La maturation du biofilm atteint un plateau vers 15 à 21 jours, associé à des signatures transcriptionnelles de limitation des^{nutriments 36}. Les étapes ultérieures restent peu caractérisées.

Les tests in vivo fournissent un contexte fonctionnel. L’injection d’agrégats intrapéritonéale teste si les cellules dérivées du biofilm diffèrent en virulence ou persistance des homologues planctoniques. Bien que l’inoculation intrapéritonéale ne soit pas une voie naturelle, elle propose un modèle comparatif^{contrôlé 36}. L’hétérogénéité globale introduit une certaine variance, mais une manipulation constante et une taille d’inocule correspondante atténuent cela. Il est important de noter que les caractéristiques de persistance du biofilm (par exemple, la tolérance au stress médiée par la MCE) ne se traduisent pas nécessairement par une virulence aiguë accrue, soulignant le rôle écologique plutôt que pathogène de la formation^{du biofilm 24}.

La conception modulaire permet une utilisation évolutive. Pour un dépistage rapide, le CV et le time-lapse suffisent. Pour une compréhension mécanistique, CLSM et SEM ajoutent une résolution compositionnelle et architecturale. Les modules peuvent intégrer des perturbations enzymatiques ou chimiques (DNase, glycosidase), des sondes alternatives pour les glycanes ou les acides nucléiques, ou des systèmes microfluidiques pour tester les réponses de l’écoulement. Le même inoculum peut alimenter des analyses transcriptomiques ou protéomiques, liant directement le phénotype du biofilm à la régulation (par exemple, signalisation c-di-GMP, réponse à la famine). Ce cadre comprend également le dépistage des mutants, des tests de perturbation environnementale et l’évaluation de composés anti-biofilms ou anti-virulences.

Ce flux de travail intégré transforme les observations isolées en une compréhension multidimensionnelle cohérente des biofilms de Leptospira. En combinant le débit (CV), la dynamique (time-lapse), la chimie et la profondeur (CLSM) et l’ultrastructure (SEM), l’approche capture avec fidélité la nature mobile, poreuse et polarisée des communautés de Leptospira. En étendant^{les études antérieures} 17,35,36, il démontre que l’expérimentation coordonnée et modulaire révèle des phénomènes invisibles aux études monométhodes — comme l’augmentation de la biomasse malgré une viabilité en baisse, ou la cinétique divergente entre espèces. En fin de compte, cette approche soutient des analyses comparatives, reproductibles et fonctionnellement pertinentes entre espèces, mutants et conditions, fournissant une base pour la microbiologie mécaniste, la résilience écologique et la conception de stratégies anti-biofilm.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 & micro ; m membrane hydrophile stérile en polycarbonate	it4ip	1000M25/861N101/13
Habilet de revêtement en verre stérile de 12 mm	SPL	330164
16 % de paraformel (PFA) & nbsp ;	Thermo Scientific	28908
Aiguille 21G	BD Médecine	304432
Microplaque à 24 puits	NUNC	143982
Plat à fond en verre de 35 mm	Ibidi	81218-200
Antenne Hi-Q4 à fond en verre de 35 mm	Ibidi	81156
Microplaques à 96 puits	NEST	701001
Moyen de montage antifade   ;	Biorad	29410
Revêtement au carbone	Leica Microsystem	Em ACE600
Traceur CFDA/SE	Biolégende	423801
Adhésif carbone conducteur	Science de la microscopie électronique	77816
Violet cristal (CV)	Sigma	C3886
Microscope en champ sombre	Leica Microsystem	11888846	Leica DM4000 B équipée d’un condenseur fiel sombre (catétamètre n° et 11505142)
Éthanol	VWR Chemicals	83813.36
FM4-64	Invitrogen	T3166
Acide acétique glaciaire	Supelco	1.00063
Solution de glutaraldéhyde	Sigma-Aldrich	G5882
Hexaméthyldisilazane	Acros Organics	120581000
Incubateur	Memmert	IN30
Microscope confocal inversé	Leica Microsystem	Leica DMI6000 TCS SP8 X	Confocal microscope SP8
Microscope inversé équipé d’optiques à contraste de phase	Nikon	CELL-S2	BioStation IM-Q
Leptospira Base Moyenne EMJH  ;	Becton Dickinson	BD  ; 279410	Médium EMJH pour Leptospira
Tétraoxyde d’osmium (OsO4)  ;	Sigma	BCCG9181
Propidium iodure   ;	Biotium	40017
Microscope électronique à balayage	JEOL	JSM-IT300
Tampon cacodylate de sodium   ;	Thermo-Sciences Chimiques	15453149
Spectrophotomètre Varioskan Lux	Thermo Scientific	VLBL00GD0
Solution physiologique stérile tamponnée phosphate	Biosolve	0016232301BS
Seringue (1 mL)	Chirana	CH03002L
Coloration SYTO9 fluorescente verte sur acide nucléique   ;	Invitrogen	S34854