Article de méthode

Imagerie super-résolution de cellules entières via DNA-PAINT sur un disque tournant confocal avec réaffectation optique des photons

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DOI :

10.3791/69531

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6 janvier 2026

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1London Centre for Nanotechnology, University College London, 2Department of Chemistry, University College London

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la procédure pour réaliser la microscopie de localisation profonde à cellule entière à molécule unique (SMLM) à l’aide d’un microscope confocal à disque tournant avec réassignation optique de photons, permettant ainsi l’imagerie DNA-PAINT sans besoin d’optiques personnalisées ou d’illuminations complexes.

Résumé

La microscopie de localisation à molécule unique (SMLM) permet l’imagerie à l’échelle nanométrique des structures cellulaires, mais est généralement limitée à l’imagerie près du couvercle en raison des limitations de la fluorescence totale par réflexion interne (TIRF) et de l’illumination à haute inclinaison et feuille optique (HILO). Ici, un protocole qui utilise un microscope confocal à disque rotatif équipé de réassignation optique de photons (SDC-OPR) pour effectuer la SMLM dans des cellules entières est présenté. Cette méthode permet l’imagerie à molécule unique de haute précision sur tout le volume cellulaire en utilisant l’accumulation de points d’ADN pour l’imagerie en topographie nanoscale (DNA-PAINT) sans avoir besoin d’optiques personnalisées ou de schémas d’illumination complexes. Le protocole fournit un guide étape à pas pour configurer un microscope à disque tournant commercialement disponible (par exemple, CSU-W1 SoRA) pour l’imagerie SMLM, incluant des paramètres d’acquisition optimisés pour l’imagerie profonde. Les étapes de préparation de l’échantillon sont définies pour marquer les cibles intracellulaires avec des sondes conjuguées à l’ADN afin de réaliser l’imagerie ADN-PAINT, y compris des stratégies d’imagerie multicolore de plusieurs cibles. L’acquisition d’images est suivie d’une localisation et d’une reconstruction par une seule molécule à l’aide de logiciels standards. Des considérations cruciales pour minimiser le fond, optimiser la résolution latérale et garantir la qualité de l’imagerie sur toute la profondeur cellulaire sont également abordées. Ce protocole accessible permet aux chercheurs de réaliser des SMLM profondes et complètes à l’aide d’équipements confocaux standards, élargissant ainsi la gamme des questions biologiques abordables par imagerie à molécule unique au-delà des régions proches de la membrane.

Introduction

La microscopie de localisation à molécule unique (SMLM)1 est une famille de techniques de super-résolution qui atteignent une résolution à l’échelle nanométrique en séparant temporellement l’émission de fluorophores individuels et en les localisant avec une grande précision. Un SMLM réussi nécessite un rapport signal sur bruit (SNR) élevé pour détecter les événements de molécule unique, ce qui a traditionnellement limité son utilisation à des installations optiques offrant une excitation intense et localisée. Les configurations les plus courantes sont la microscopie à fluorescence interne totale (TIRF)2 et l’illumination à feuilles laminées hautement inclinées (HILO) 3. Le TIRF réduit la fluorescence de fond en créant un champ évanescent qui excite sélectivement les fluorophores à quelques nanomètres du couvercle, supprimant ainsi l’illumination hors focus. Cependant, cette restriction rend le TIRF inadapté à l’imagerie de structures biologiques plus profondes, telles que les organites s’étendant dans le domaine extracellulaire. La microscopie HILO offre des profondeurs de pénétration plus élevées, permettant d’imager plusieurs centaines de nanomètres au-dessus du substrat en verre. Cela se fait au prix d’un champ de vision (FOV)4 réduit et d’un éclairage inégal avec des plans de plus en plus élevés, limitant son applicabilité à des structures cellulaires plus grandes. Plus récemment, les techniques de microscopie à feuilles lumineuses (LSM) telles que la feuille lumineuse enréseau 5,6,7 et la microscopie d’illumination à un seul plan objectif (soSPIM)8 ont étendu la SMLM à l’imagerie volumétrique et tissulaire. En façonnant le faisceau d’excitation en fines feuilles lumineuses structurées, le LSM obtient une coupe optique avec un fond et une phototoxicité réduits. SoSPIM capture des plans focaux orthogonaux à l’axe de détection en une seule exposition, permettant une imagerie volumétrique rapide avec une résolution quasi isotrope. L’application soSPIM a démontré la SMLM 3D dans des cellules entières et de petits organites (>20 μm de profondeur) avec une résolution isotrope allant jusqu’à 40 nm, et un fond de flou minimal9. Malgré leurs forces, ces méthodes nécessitent généralement des échantillons transparents, des optiques spécialisées et un alignement complexe, et restent sensibles aux aberrations optiques et à la diffusion dans les échantillons plus épais.

La microscopie confocale propose une alternative en rejetant la lumière floue grâce à l’utilisation d’un sténopé situé devant le détecteur, combiné à des miroirs à balayagede faisceau 10. Cette capacité de coupe optique permet l’imagerie volumétrique profonde avec un SNR élevé. En particulier, la microscopie confocale à disque tournant (SDC) combine la rapidité et la détection en grand champ de l’imagerie conventionnelle avec la capacité de coupe des systèmes de balayage ponctuel. Cela est réalisé dans la SDC conventionnelle grâce à l’intégration d’un disque rotatif orné de trous parallèles, souvent combiné à un réseau de microlentilles aligné. Les microlentilles recueillent une part importante de la fluorescence émise et la focalisent à travers les trous d’épingle, ce qui réduit le signal de fond. Cette configuration permet un coupement optique rapide sans besoin d’optiques spécialisées ni de préparation supplémentaire du montage de l’échantillon, ce qui en fait un choix robuste facilement implémentable et optimisé pour l’acquisition d’images SMLMvolumimétriques profondes 11.

Dans cette étude, l’unité de scanner confocal à disque rotatif CSU-W1 équipée de la réassignation optique des photons (SDC-OPR) est utilisée. Contrairement au SDC standard, SDC-OPR introduit un second réseau de microlentilles qui projette les photons émis sur un motif de trou d’épinglecomplémentaire 12, afin de réduire la diffusion et de récupérer des photons qui seraient autrement rejetés. Cette réaffectation des photons affine efficacement la fonction d’étalement ponctuelle (PSF), améliorant la résolution latérale au-delà de celle de la SDC conventionnelle tout en rejetant la lumièrefloue 13. Plus précisément, le réseau de microlentilles SDC-OPR redirige les photons hors axe vers leurs points d’origine les plus proches, augmentant ainsi la luminosité de fluorescence détectée par rapport à la SDC standard. De plus, les avantages de résolution de SDC-OPR peuvent être amplifiés via la déconvolution d’image. Les algorithmes itératifs de déconvolution affinent informatiquement la PSF, réduisent le fond et améliorent le rapport signal/fond sans nécessiter de modifier la configuration optique. Cette approche combinée offre un avantage significatif en termes de précision de localisation par rapport à la SDC standard pour les expériences de localisation à moléculeunique 14.

Ici, un protocole robuste et reproductible pour la microscopie de localisation d’une seule molécule utilisant un microscope confocal à disque rotatif équipé de réassignation optique de photons (SDC-OPR) est présenté. Cette approche combine la précision à l’échelle nanométrique de DNA-PAINT avec la vitesse, le champ de vision et la pénétration en profondeur de l’imagerie à disque tournant. DNA-PAINT, une adaptation de l’accumulation ponctuelle pour l’imagerie de la topographie à l’échelle nanométrique (PAINT)15, repose sur l’hybridation transitoire de brins « imageurs » marqués fluorescentement avec des brins complémentaires « d’amarrage » ancrés à des cibles moléculaires. Ces événements de liaison réversibles génèrent des signaux de fluorescence stochastiques qui peuvent être localisés avec précision, permettant une reconstruction à haute résolution de l’ultrastructure cellulaire. DNA-PAINT permet l’utilisation de fluorophores hautement photostables, assure une cinétique de liaison ajustable pour un contrôle précis des conditions d’imagerie, et atténue le photoblanchiment grâce au renouvellement continu des brins d’imageursfluorescents 16.

Pour garantir la reproductibilité et la spécificité, l’approche repose sur des conjugués ADN-anticorps personnalisés qui relient les brins d’amarrage aux anticorps secondaires. Des étapes détaillées de préparation de l’échantillon, y compris la conjugaison anticorps-ADN, sont présentées pour soutenir des résultats expérimentaux robustes. Le protocole est validé sur des structures cellulaires bien caractérisées telles que les complexes poreux nucléaires (CPN)17 et les microtubules dans des échantillons fixes, fournissant un point de référence pour estimer la précision de la reconstruction. Les variations de résolution, quantifiées via la précision de localisation en tant que proxy, sont également évaluées en fonction du champ de vision et de la profondeur d’imagerie.

De plus, l’efficacité de ce flux de travail pour l’imagerie multiplexée est démontrée grâce à Exchange-PAINT18, une stratégie permettant la visualisation séquentielle de plusieurs cibles avec le même colorant et une seule source laser basée sur DNA-PAINT. Le flux de travail Exchange-PAINT est appliqué à l’imagerie multicolore en super-résolution des mitochondries, microtubules et NPC au sein d’un même échantillon.

Ensemble, ce protocole fournit des directives complètes et des notes clés sur l’adaptabilité sur la conjugaison anticorps-ADN, la préparation de l’échantillon, les conditions d’imagerie et l’analyse des données, permettant aux chercheurs de réaliser des images reproductibles ADN-PAINT sur SDC-OPR. En étendant l’imagerie haute résolution au-delà des limites de profondeur et de champ de vision des approches basées sur le TIRF, cette méthode élargit l’applicabilité de la SMLM à un large éventail de contextes biologiques.

Protocole

Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation des tampons

  1. Préparation du tampon du cytosquelette (CB) :
    1. Préparez 10 mM de MES (pH 6,1) avec 150 mM de NaCl, 5 mM d’EGTA, 5 mM de D-glucose et 5 mMde MgCl 2 dans 1x solution tampon de phosphate filtrée (PBS).
    2. Conserver à 4 °C et filtrer avant utilisation.
  2. Préparation du stock d’acide protocatechuic 40x (PCA) :
    1. Dissoudre 154 mg de PCA dans 10 mL d’eau distillée et filtrée.
    2. Ajustez le pH à 9,0 avec le NaOH.
    3. Alibétique et conserver à -20°C pendant un maximum de 6 mois.
      REMARQUE : Si une aliquote apparaît brune, jetez-la, car cela indique une oxydation.
  3. Préparation du stock de protocatéchuate-3,4-dioxygénase (PCD) 100x :
    1. Préparez une solution à 50 % de glycérol avec 50 mM de KCl, 1 mM d’EDTA et 100 mM de tampon Tris.
    2. Dissouds 2,2 mg de PCD dans 3,4 mL de solution de glycérol.
    3. Alibétique et conservée à -20 °C pendant un maximum de 6 mois.
  4. Préparation du stock 100x Trolox :
    1. Dissoudre 50 mg de Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchromane-2-carboxylique) dans 215 μL de méthanol jusqu’à ce que la solution devienne verte dans une hotte chimique en utilisant un équipement de protection individuelle (EPI) approprié.
    2. Ajoutez 1,6 mL d’eau distillée et filtrée. Laissez la solution devenir blanche et commencer à se solidifier.
    3. Ajoutez 175 μL de 1M NaOH 1M. Laissez la solution recommencer à devenir liquide.
    4. En volumes de 10 μL, continuez à ajouter 1 M NaOH jusqu’à ce que la solution soit totalement clarifiée (environ 40 μL).
    5. Alibétique et conservée à -20 °C pendant un maximum de 6 mois. La solution finale paraît jaunâtre.
      REMARQUE : La solution finale 100x a un pH de 11, mais une dilution à 1x donne un pH de 7-8.
  5. Tampon C+
    1. Préparez 1 mM d’EDTA, 500 mM de NaCl et une solution Tween-20 à 0,02 % dans 1x PBS.
    2. Ajustez le pH à 7,4 avec HCl et/ou NaOH selon les besoins.
    3. Supplément optionnel de Trolox : Ajoutez les volumes requis de stocks de PCA (40x), PCD (100x) et Trolox (100x) pour obtenir des dilutions 1x, laissez la solution s’équilibrer pendant 1 h à température ambiante (23 °C) avant utilisation.
      REMARQUE : Préparez du neuf chaque semaine. Si vous utilisez du Trolox, utilisez-le dans les 4 heures suivant le mélange.
  6. Tampons immunocolorants (paraformoldéhyde PFA, glycine et triton) :
    1. Pour une préparation à 4 % de PFA à partir d’une ampoule de 10 mL à 16 % de PFA :
      1. Dans une hotte chimique, ouvrez soigneusement l’ampoule.
      2. Décantez 10 mL de 16 % de PFA dans un tube centrifuge conique de 50 mL.
      3. Effectuez une dilution 1:4 dans un PBS 1x pour obtenir 4 % de PFA, en ajoutant soigneusement ~30 mL de PBS filtré 1x au PFA décanté à 16 %, afin que le volume final soit de ~40 mL.
      4. Alyquote dans des tubes microcentrifuge de 1 mL et conservés à -20 °C jusqu’à ce que nécessaire.
    2. Pour 60 mM de glycine en préparation PBS :
      1. Mettez 225 mg de glycine dans un tube centrifuge conique de 50 mL.
      2. Ajoutez 50 mL de PBS 1x filtré.
      3. Vortex jusqu’à ce que ce soit complètement mélangé et filtre.
      4. Conserver à 4 °C jusqu’à ce que cela soit nécessaire.
    3. Pour une préparation à 0,1 % du Triton X-100 :
      1. Préparez d’abord un stock de travail de 10 % de Triton X-100 en diluant 1 mL de 100 % de Triton X-100 en 9 mL de PBS 1x filtré (volume final = 10 mL), en pipette et en mélangeant lentement pour éviter la surbulle. Conserver à 4 °C jusqu’à ce que cela soit nécessaire.
      2. À partir du stock de travail à 10 %, ajoutez 0,1 mL de Triton X-100 à 10 % à 9,9 mL de PBS filtré 1x pour le stock final à 0,1 %, puis mélangez à nouveau lentement. Conserver à 4 °C jusqu’à ce que cela soit nécessaire.

2. Conjugaison anticorps-ADN

  1. Concentrez l’anticorps à l’aide d’une unité de filtration centrifuge ultrafiltrante de 100 kDa :
    1. Laver l’unité de filtration centrifuge ultrafiltrante de 100 kDa avec 100 μL de PBS filtré 1x pendant 30 minutes à 14 000 x g, 4 °C.
    2. Ajoutez 100 μL d’anticorps avec 200 μL de PBS filtré 1x à l’unité de filtration centrifuge d’ultrafiltration de 100 kDa précédemment lavée, faites tourner pendant 30 minutes à 14 000 x g, 4° C. Assurez-vous que la concentration d’anticorps dépasse 1,5 mg/mL après concentration avec le filtre centrifuge d’ultrafiltration. Avec cette méthode, le filtre centrifuge à ultrafiltration concentre généralement l’anticorps de ~3 fois.
    3. Inversez l’unité de filtration centrifuge ultrafiltrante de 100 kDa dans un tube propre, faites tourner pendant 6 minutes à 1000 x g, 4 °C. C’est l’anticorps concentré dans le PBS.
    4. Mesurez le volume d’anticorps concentré (1 ou 2 μL) pour calculer la nouvelle concentration et effectuez un spectre d’absorption UV-Vis avec un spectrophotomètre UV-Vis microvolume. Réglez l’arrière-plan sur 1x PBS et enregistrez les spectres.
  2. Réduire le brin d’amarrage d’ADN thiolé :
    1. Dissoudre 7,7 mg de DTT pré-pesé dans 100 μL d’eau filtrée, puis transférer dans un tube frais.
    2. Ajouter 100 μL de 3 mM EDTA dans 1x PBS au tube original de DTT, vortex, et transférer dans le même tube à l’étape 2.2.1, ce qui donne 200 μL de 250 mM DTT en 1,5 mM EDTA en 1x PBS.
    3. Dissoudre le brin d’amarrage d’ADN thiolé dans un PBS filtré 1x pour une concentration finale de 1 mM. Enregistrez un spectre UV-Vis de la solution du brin d’amarrage d’ADN (dilué à 10 μM dans 1x PBS) et sauvegardez-le à l’aide du spectrophotomètre UV-Vis microvolume.
    4. Mélangez 13 μL d’ADN thiolé (1 mM) avec 30 μL de DTT (250 mM), secouez pendant 2 h à température ambiante (23 °C).
      REMARQUE : Stockez les brins d’amarrage d’ADN inutilisés restants dans des aliquotes de 13 μL à -20 °C pour de futures réactions.
  3. Conjugaison des anticorps avec le réticulateur :
    1. Dissoudre le méliémide-PEG2-ester de succinimidyle en réticulation dans le DMSO à 10 mg/mL (23,5 mM). Conservez 10 μL d’aliquotes à -20 °C jusqu’à ce que cela soit nécessaire.
    2. Mélangez l’anticorps concentré de l’étape 2.1 avec 20x molaires d’excès du réticulateur. Incubez pendant 90 minutes, en secouant, à 4 °C.
  4. Filtrer le filtrage anticorps et réticulation avec une colonne de désalage de spin de 7,0 KDa contenant de la résine d’exclusion de taille (limite de 7 kDa de poids moléculaire) :
    1. Retirez la fermeture inférieure de la colonne de désalage de rotation de 7,0 kDa et desserrez le capuchon. Placez-le dans un tube de microcentrifuge à faible liaison protéique. Centrifugeuse pendant 1 minute à 1500 x g, 4 °C.
      REMARQUE : Marque l’inclinaison de la résine après le premier tour. Pour tous les usages ultérieurs de la colonne, placez l’inclinaison directement vers l’extérieur sur la centrifugeuse. Appliquez des échantillons et des lavis au centre et évitez le contact avec le lit de résine.
    2. Ajoutez 300 μL de PBS filtré 1x au filtre de colonne de désalage à spin de 7,0 kDa, desserrez le bouchon, centrifugez pendant 1 minute à 1500 x g, 4 °C. Répétez deux fois de plus.
      REMARQUE : Laissez la colonne de désalage de spin à 7,0 KDa avec 300 μL de 1x PBS jusqu’à ce que la réaction anticorps-réticulateur soit prête ; Ne laissez pas la colonne sécher.
    3. Retirez les derniers 300 μL de lavage PBS en centrifugant à nouveau pendant 1 minute à 1500 x g, 4 °C.
    4. Appliquez la solution d’anticorps réticulants au centre du lit de résine, goutte dans les gouttes. Placez la colonne de désalage à spin de 7,0 kDa dans un tube propre de microcentrifuge, centrifugez pendant 2 minutes à 1500 x g, 4 °C. Le produit réticulant anticorps se trouve désormais dans le tube de la microcentrifuge ; Conservez à 4 °C ou sur glace.
  5. Purifiez le mélange ADN-DTT avec des colonnes de spin désalinisantes avec Sephadex G-25 (résine d’exclusion de taille pour la purification de l’ADN) :
    1. Manipulez les colonnes de spin de désalage (purification de l’ADN) afin que la résine soit répartie uniformément. Retirez la fermeture inférieure et desserrez le bouchon, puis placez-la dans un tube propre de microcentrifuge.
    2. Désalez les colonnes de spin à la centrifugeuse (purification de l’ADN) à 735 x g pendant 1 minute pour retirer le tampon de stockage.
    3. Placez les colonnes de spin désalinisantes (purification de l’ADN) dans un nouveau tube de microcentrifuge et ajoutez lentement le mélange ADN/DTT au centre de la résine. Centrifugez à 735 x g pendant 2 minutes. L’ADN purifié et réduit sera désormais dans le tube de la microcentrifuge.
  6. Combinez l’ADN et les produits réticulants anticorps :
    1. Ajouter l’ADN réduit au produit réticulant anticorps à un excès de 10 molaires d’ADN :anticorps. Mélangez l’ADN purifié avec le produit réticulant anticorps immédiatement après la purification. Cela empêche l’ADN de se relacer.
    2. Incubez toute la nuit, en secouant, à 4 °C.
      REMARQUE : Mélangez l’ADN et l’anticorps en fin d’après-midi et purifiez-les immédiatement le lendemain matin. Une incubation prolongée de l’ADN et des anticorps peut entraîner des rapports ADN :anticorps élevés.
  7. Retirez l’ADN excédentaire avec une unité de filtration centrifuge ultrafiltrante de 100 kDa le lendemain matin :
    1. Lavez l’unité de filtration centrifuge ultrafiltrante de 100 kDa avec 300 μL de PBS filtré 1x pendant 30 minutes à 14 000 x g, 4 °C.
    2. Ajoutez le mélange ADN-anticorps avec 300 μL de PBS filtré 1x à l’unité filtrante centrifuge ultrafiltrante de 100 kDa et faites tourner pendant 30 minutes à 14 000 x g, 4 °C.
    3. Inversez l’unité de filtration centrifuge ultrafiltrante dans un tube propre, faites tourner pendant 6 minutes à 1000 x g, 4 °C. C’est le produit concentré dans PBS.
    4. Diluez le produit à 100 μL dans un PBS filtré 1x.
    5. Enregistrez un spectre UV-Vis du produit (1 ou 2 μL) à l’aide du spectrophotomètre UV-Vis microvolume, avec un fond de 1x PBS, et enregistrez les spectres.
    6. Mesurez la concentration finale et le rapport ADN :anticorps à partir des spectres. Observez un décalage du pic d’absorption de l’anticorps de 280 nm à 260 nm, dû à l’absorption supplémentaire de l’ADN. Utilisez l’étape 2.8 pour déterminer la concentration et le rapport ADN :anticorps.
    7. Conservez le produit dans les conditions de stockage initiales de l’anticorps utilisé. Si vous congelez, évitez les cycles de congélation-dégel.
  8. Calculer le rapport ADN :anticorps à partir des spectres UV-Vis :
    1. À partir des spectres de l’ADN pur (10 μM en 1x PBS), mesurez les valeurs d’absorbance à 260 nm (Équation 1) et 280 nm (Équation 2). Divisez-les par la concentration d’ADN (10 μM) pour déterminer les coefficients d’absorption molaire de l’ADN (Équation 3 et Équation 4).
    2. Répétez pour que l’anticorps trouve Équation 5 et Équation 6, en se rappelant de diviser par la concentration d’anticorps utilisé pour les spectres.
    3. D’après les spectres produits, l’absorption à 260 nm et 280 nm dépend à la fois de l’absorbance de l’ADN et de l’anticorps :
      Équation 7
      Équation 8
      Où cDNA et cAb sont respectivement les concentrations d’ADN et d’anticorps dans le produit final. Résolvez ces équations simultanément pour trouver la concentration molaire de l’ADN et des anticorps dans le produit. Calculez le rapport ADN :anticorps à l’aide de ces concentrations.
      REMARQUE : La concentration de l’anticorps pour les premiers spectres peut être calculée en mesurant le volume d’anticorps restant après filtration avec une filtration centrifuge d’ultrafiltration de 100 kDa et en comparant cela au volume initial (avec concentration connue) d’anticorps utilisé.

3. Culture cellulaire

  1. Cellules HeLa Kyoto mEGFP-Nup107.
    1. Préparez un stock de milieu de culture cellulaire, le Médium Eagle Modifié (DMEM) de Dulbecco, complété avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline/Streptomycine (P/S), puis conservez-le à 4 °C. Préchauffez le média 30 minutes avant l’utilisation dans un bain-marie à 37 °C. Selon les conditions de travail, il est recommandé d’aliquoter et de filtrer la quantité nécessaire pour éviter toute contamination.
    2. Les cellules de graines à 2 x 105 cellules/mL dans 7 mL de milieu DMEM préchauffé et complété dans des flasques T25. Placez les flasques cellulaires dans un incubateur adapté à 37 °C et 5 % deCO2 .
    3. Assurez-vous de passer toutes les 48 à 72 heures pour éviter la surpopulation.
      1. Prenez la fiole T25 contenant la culture confluente et aspirez le milieu de la fiole.
      2. Pipett 1 mL de trypsine EDTA (TE), assurant une couverture complète en inclinant doucement la fiole. Incubez à 37 °C pendant 7 minutes pour permettre le détachement cellulaire du flasque.
      3. Ajoutez 2 mL de média DMEM complété et triturez.
      4. Transférez la suspension de la cellule dans un tube centrifuge conique de 15 mL avec 7 mL supplémentaires de milieux DMEM renforcés.
      5. Centrifugez à 400 x g pendant 5 minutes. Vérifiez soigneusement la formation de granules au fond du tube sans le déranger.
      6. Aspirez le milieu et resuspendez la granule cellulaire dans un milieu DMEM complété.
      7. Semez 2 x 10cellules de 5 mL dans une nouvelle fiole T25 contenant 7 mL de milieu préchauffé. Incubez à 37 °C et 5 % de CO2.
        REMARQUE : Si vous n’êtes pas sûr de la densité cellulaire, on peut utiliser un hémocytomètre pour déterminer le nombre de cellules. Il est recommandé de commencer par une resuspension de 1 mL de granulés avant le dépouillement.
  2. Cellules U2OS CRISPR mEGFP-Nup96
    1. Préparez un média 5A de McCoy’s à 10 % FBS et 1 % P/S, conformément à l’étape 3.1.1.
    2. Cellules de graines à 2 x 105 cellules/mL dans 7 mL de milieu McCoy’s 5A complété dans des flasques T25. Incubez à 37 °C et 5 % de CO2.
    3. Passage toutes les 48 heures pour maintenir la croissance de la culture en dessous de 80 % de confluence :
      1. Aspirez le milieu à partir d’une fiole et lavez doucement la culture adhérente avec 2 mL de PBS filtré pré-chauffé (37 °C).
      2. Aspirez le PBS et ajoutez 2 mL d’Accutase, en inclinant lentement la fiole pour assurer une couverture complète, puis éclovez à 37 °C pendant 7 minutes.
      3. Ajoutez 2 mL de support McCoy’s 5A complété et triturez.
      4. Ajoutez 7 mL de média à la suspension de la cellule et transférez-la dans un tube centrifuge conique de 15 mL ou 50 mL pour centrifugation. Centrifugez à 400 x g pendant 5 minutes et vérifiez la formation de granulés au fond du tube.
      5. Résuspendez le comprimé cellulaire dans un média 5A complété par McCoy.
      6. Semez à 2 x 105 cellules/mL dans un nouveau flasque T25 avec 7 mL de milieux préchauffés. Incubez à 37 °C et 5 % de CO2.
        REMARQUE : Réchauffez toutes les solutions ajoutées aux cellules à 37 °C dans un bain d’eau ou de perles. Pour l’Accutase, ne réchauffez que 2 mL d’aliquotes pendant au maximum 5 minutes pour éviter la dégradation.

4. Immunocoloration de Nup96, mitochondries et microtubules

  1. Préparation des cellules U2OS mEGFP-Nup96
    1. Suivant les étapes décrites à l’étape 3.2, aspirez le milieu du flasque de T25 et lavez doucement les cellules adhérées avec 2 mL de PBS filtré 1x.
    2. Aspirez le PBS et ajoutez 2 mL d’accutase, inclinez lentement la fiole vers le haut et vers le bas, puis incubez à 37 °C pendant 7 minutes pour favoriser le décollement cellulaire.
    3. Ajoutez 2 mL de support McCoy’s 5A complété et triturez.
    4. Suspension à cellule supérieure avec 7 mL de support McCoy’s 5A supplémenté et transféré dans un tube centrifuge conique de 15 mL ou 50 mL avant de centrifuger à 400 x g pendant 5 minutes. Encore une fois, vérifiez la formation des granulés au fond du tube.
    5. Résuspendez le comprimé cellulaire dans un média 5A complété par McCoy.
    6. Les cellules de semence à 1 x 105 cellules/mL dans des microlames à 8 puits et incubent dans l’incubateur cellulaire (37 °C, 5 % CO2) toute la nuit.
      REMARQUE : Utilisez les cellules de graines 24 heures avant les procédures de fixation et d’immunocoloration, afin de permettre l’adhésion.
  2. Immunocoloration des cellules U2OS mEGFP-Nup96 pour l’imagerie Nup96
    1. Après incubation nocturne, remplacer le média McCoy’s 5A dans les microlames à 8 puits par du PBS filtré 1x. En succession rapide, aspirez le PBS et ajoutez la solution de fixation préchauffée (37 °C) à 4 % de PFA dans une hotte chimique.
    2. Laissez les cellules fixer pendant 30 minutes à température ambiante (23 °C), de préférence dans la hotte chimique, avant que le PFA ne soit lavé et que les déchets soient jetés. Toutes les étapes peuvent désormais être effectuées à température ambiante, sauf indication contraire.
    3. Retirez la solution de fixation à 4 % de PFA et lavez la lame 3x 3 minutes avec 1x PBS.
      ATTENTION : Utilisez du PFA dans une hotte chimique tout en portant des EPI appropriés.
    4. Après fixation, perméabilisez la membrane cellulaire en ajoutant 0,1 % de Triton X-100 dans une solution PBS 1x. Laissez reposer 5 minutes, puis lavez 3 x 3 minutes avec 60 mM de glycine dans 1x PBS, pour atténuer l’autofluorescence des PFA résiduels.
      REMARQUE : La solution de perméabilisation Triton est extrêmement sensible au temps et pourrait modifier l’intégrité de la structure cellulaire si elle est laissée trop longtemps en place.
    5. Ajoutez 5 % de BSA dans 1x PBS pendant 1 heure dans le noir, pour bloquer les cellules avant l’immunocoloration.
    6. Préparez 20 nM du nanocorps anti-GFP conjugué à l’ADN en solution bloqueante (5 % de BSA dans 1x PBS) pour éviter le blocage de liaison inspécifique. Incubez la lame avec le mélange de nanocorps pendant 1 h à température ambiante (23 °C), puis lavez les brins d’ADN non liés pendant 3 x 3 minutes avec un PBS filtré 1x.
      REMARQUE : Point de pause : Après fixation, blocage et ajout d’anticorps, les échantillons peuvent être conservés à 4 °C pendant la nuit. Ce point de pause est principalement attribué au temps nécessaire à la préparation de l’échantillon, plutôt qu’à cause d’une nécessité stricte du protocole. L’imagerie peut se poursuivre immédiatement après ces étapes si elle le souhaite.
  3. Immunocoloration des cellules U2OS mEGFP-Nup96 pour l’imagerie des mitochondries et des microtubules
    1. Après une incubation nocturne, remplacer simultanément le milieu DMEM dans les microlames à 8 puits par 200 μL de glutaraldéhyde à 0,3 % et 0,25 % de Triton X-100 dans le tampon du cytosquelette (CB) et laisser pendant 2 minutes pour la préfixation.
    2. Remplacer la solution de préfixation par un tampon du cytosquelette (CB) complété à 2 % de glutaraldéhyde. Laissez reposer 10 minutes pour fixer les cellules, puis lavez la lame 3 x 3 min avec 60 mM de glycine dans PBS, comme à l’étape 4.2.4.
      ATTENTION : Utilisez du glutaraldéhyde dans une hotte chimique tout en portant des équipements de protection individuels appropriés.
    3. Ajoutez de l’ADN de spermatozoïdes de saumon tondu à 3 % de BSA dans 1x PBS pendant 1 heure dans l’obscurité, pour bloquer les cellules avant l’immunocoloration.
    4. Ajoutez 5 μg/mL d’antitubuline conjuguée à l’ADN (conjuguée comme décrit ci-dessus), pour l’imagerie des microtubules, et/ou 1:200 d’anticorps TOM20 pour l’imagerie mitochondriale, dans 2 % de BSA pendant 2 heures à température ambiante (23 °C). Laver 3 x 3 minutes avec 1 PBS.
    5. Ajoutez 25 nM d’IgG anti-Rabbit conjugué à l’ADN sdAb et incubez pendant 1 heure à température ambiante (23 °C). Laver 3 x 3 minutes avec 1 PBS.
      REMARQUE : Point de pause : Après fixation, blocage et ajout d’anticorps, les échantillons peuvent être conservés à 4 °C pendant la nuit. Ce point de pause est principalement attribué au temps nécessaire à la préparation de l’échantillon, plutôt qu’à cause d’une nécessité stricte du protocole. L’imagerie peut se poursuivre immédiatement après ces étapes si elle le souhaite.
  4. Préparation des cellules HeLa Kyoto mEGFP-Nup107
    1. Aspirez le milieu de la fiole T25 des cellules HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 et lavez doucement la fiole avec 2 mL de PBS filtré 1x.
    2. Aspirez le PBS et ajoutez 2 mL de trypsine EDTA (TE) puis penchez lentement la fiole vers le haut et vers le bas, puis éclovez à 37 °C pendant 7 minutes.
    3. Ajoutez 2 mL de média DMEM complété et triturez.
    4. Ajoutez la solution à cellules dans un tube centrifuge conique de 15 mL avec 7 mL supplémentaires de média DMEM complété, puis centrifugez à 400 x g pendant 5 minutes. Vérifiez la formation de granulés au fond du tube.
    5. Resuspendez la granulation cellulaire dans un milieu DMEM complété.
    6. Cellules de graine à 1 x 105 cellules/mL dans des microlames à 8 puits.
      REMARQUE : Séminez les cellules 24 heures avant l’imagerie.
  5. Immunocoloration de HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 pour les microtubules
    1. Après une incubation nocturne, remplacer simultanément le milieu DMEM dans les microlames à 8 puits par 200 μL de glutaraldéhyde à 0,3 % et 0,25 % de Triton X-100 dans le tampon du cytosquelette (CB) et laisser pendant 2 minutes pour la préfixation.
    2. Remplacer la solution de préfixation par du glutaraldéhyde à 2 % dans CB et laisser reposer 10 minutes pour fixer les cellules. Laver 3 x 3 minutes avec 60 mM de glycine dans 1x PBS.
      ATTENTION : Utilisez du glutaraldéhyde dans une hotte chimique tout en portant des équipements de protection appropriés.
    3. Ajoutez 5 % de BSA dans 1x PBS pendant 1 heure dans le noir, pour bloquer les cellules avant l’immunocoloration.
    4. Ajoutez 5 μg/mL d’antitubuline conjuguée à l’ADN (conjuguée comme décrit ci-dessus), pour l’imagerie microtubulaire à 5 % de BSA dans 1x PBS pendant 2 heures à température ambiante (23 °C). Laver 3 x 3 minutes avec 1 PBS.
      REMARQUE : Point de pause : Après fixation, blocage et ajout d’anticorps, les échantillons peuvent être conservés à 4 °C pendant la nuit. Ce point de pause est principalement attribué au temps nécessaire à la préparation de l’échantillon, plutôt qu’à cause d’une nécessité stricte du protocole. L’imagerie peut se poursuivre immédiatement après ces étapes si elle le souhaite.
    5. REMARQUE : Lors du travail avec des anticorps ou des lignées cellulaires alternatives, ajustez les facteurs de dilution pour l’anticorps ou le nanocorps couplé à l’ADN selon les recommandations du fabricant.
  6. Préparation à l’imagerie
    REMARQUE : Cette étape est commune à tous les protocoles d’immunocoloration.
    1. Ajoutez des nanoparticules d’or de 90 nm diluées 1:2 dans de l’eau déionisée directement dans chaque puits, en utilisant le volume complet du puits. Incubez pendant 5 minutes pour permettre une correction future de dérive lors de l’imagerie. Laver les puits 3 fois avec 1 PBS.
    2. Pour l’imagerie Nup96, ajoutez le brin d’imageur désiré à 1 nM dans un tampon C+ complété par 1x Trolox, 1x PCA et 1x PCD.
    3. Pour l’Exchange-PAINT des mitochondries et/ou microtubules, ajoutez le premier brin d’imageur désiré à 1 nM uniquement en Tampon C+. Après la première séance d’imagerie, lavez l’échantillon soigneusement mais soigneusement après la première séance d’imagerie pour retirer toutes les brins résiduels sans déplacer l’échantillon. En général, avec 5 lavages et 30 secondes d’attente, c’est suffisant. Ajoutez ensuite le second brin d’imagerie à 1 nM en tampon C+ uniquement pour la deuxième série d’imagerie.

5. Installation et paramètres d’imagerie : microscopie de localisation à molécule unique

REMARQUE : Les images montrées dans ce protocole ont été acquises à l’installation de microscopie super-résolution LMCB à University College London, Royaume-Uni, à l’aide d’un microscope confocal à disque tournant commercialement disponible, équipé d’une caméra sCMOS, et exploité via le logiciel NIS-Elements.

  1. Utilisez un système confocal à disque rotatif avec excitation multifocale et une caméra sCMOS.
  2. Démarrez le système 30 minutes avant l’imagerie : allumez le microscope, la caméra et les lasers, puis démarrez l’ordinateur. Attendez que le logiciel NIS-Elements se charge complètement.
  3. Sélectionnez le mode d’imagerie approprié dans les éléments NIS : disque pivotant confocal standard ou super-résolution SDC-OPR SoRA, avant de définir les paramètres d’acquisition.
  4. Choisissez l’objectif d’immersion en huile Apo NA 1.49 de 60× pour l’imagerie SDC ou SDC-OPR afin de maximiser la détection des événements à molécule unique et améliorer le post-traitement.
  5. Sélectionnez le grossissement approprié (1×, 2,8× ou 4×) en fonction de l’objectif, des réglages de l’appareil photo et de l’échantillon à étudier. Ajustez le binning de l’appareil photo en conséquence : 1× binning pour un grossissement de 1×, 2× binning pour 2,8×, et 4× binning pour 4×. Pour cette configuration, cela correspond à des tailles de pixels effectives de 108 nm pour 1× (sans binning) ou 4× (binning 4×), et 78 nm pour 2,8× (binning 2×). Le binning est nécessaire pour obtenir des tailles de pixels adaptées au SMLM, correspondant approximativement à l’écart-type PSF (typiquement 100-150 nm)19,20.
    REMARQUE : Des grossissements plus élevés (2,8× ou 4×) augmentent la densité de puissance du laser, améliorant ainsi l’uniformité de l’éclairage. Cela réduit le champ de vision, donc le binning doit être ajusté proportionnellement (c’est-à-dire 2× binning pour un grossissement de 2,8× ; 4× binning pour un grossissement de 4×) pour maintenir la taille des pixels.
  6. Réglez le temps d’exposition pour l’acquisition de DNA-PAINT et synchronisez-le avec la vitesse de rotation du disque tournant (réglable depuis le pad CSU-W1). Assurez-vous que la vitesse de rotation est un multiple du temps d’exposition, ou appuyez sur le bouton Sync pour correspondre automatiquement au régime optimal le plus proche. Vérifiez l’écran pour détecter des artefacts de rayures, car cela indique des réglages non synchronisés. Pour les expériences présentées ici, un temps d’exposition de 300 ms a été utilisé.
    REMARQUE : La vitesse de rotation des disques SoRa améliorés par microlentille SDC et de rotation de l’unité SDC impacte le profil d’excitation du faisceau, affectant la distribution moyenne de la densité de puissance sur la zone éclairée. Pour cette raison, des temps d’exposition plus élevés peuvent être nécessaires que pour les configurations TIRF.
  7. Configurez la longueur d’onde du laser, la puissance et la roue de filtres (les éléments NIS suggéreront un filtre approprié). La longueur d’onde du laser sera déterminée par le spectre du colorant de l’imageur.
    REMARQUE : Dans ce travail, Cy3B a été utilisé, qui est excité de manière optimale avec un laser de 561 nm. Cy3B offre le meilleur rapport signal/fond pour DNA-PAINT, ce qui en fait le choix privilégié pour cette application.
  8. Ajustez la puissance du laser via le pad laser (0 % à 100 %). Pour l’imagerie ADN-PAINT, réglez le laser à puissance maximale (100 %). Pour ce système, cela correspond à 1,75 mW (≈ 65 W/cm 2) mesuré après l’objectif pour le grossissement de 4×, 3 mW (≈ 50 W/cm 2) pour 2×, et 5 mW (≈ 15 W/cm 2) pour 1×.
    1. Pour enregistrer la puissance après l’objectif, utilisez un mesureur laser calibré et placez le capteur sur l’étage du microscope aussi près que possible de l’endroit où doit se trouver le plan de l’échantillon. Veillez à éviter le contact avec l’objectif objectif. Enregistrez l’alimentation pour chaque configuration utilisée.
  9. Appliquez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif d’huile Apo NA 1,49 propre à 60×.
  10. Fixez l’échantillon préparé (des étapes 4.2-4.5) sur l’étage à l’aide d’un adaptateur d’étage. Cela est important pour minimiser la dérive lors de l’acquisition de l’image et pour empêcher les mouvements lors des échanges de tampons, en particulier dans les expériences multicolores.
  11. Passez au mode champ clair dans la méthode d’imagerie sélectionnée et concentrez-vous sur le plan de verre en utilisant les nanoparticules comme référence. Activez le Perfect Focus System (PFS). Le PFS ou un système similaire pour maintenir la mise au point pendant tout le temps d’acquisition est crucial car la dérive dans la direction axiale ne peut pas être corrigée par post-traitement.
    REMARQUE : Le Nikon PFS maintient l’échantillon nettement net en surveillant et ajustant continuellement la distance entre un plan de référence fixe et le plan focal de l’échantillon à l’aide d’un objectif décalé et d’un détecteur à ligne CCD. En fonctionnant indépendamment de l’acquisition d’image, le système corrige la dérive de mise au point en temps réel (~millisecondes).
  12. Avec PFS activé, sélectionnez le plan d’imagerie d’intérêt. Pour les cellules U2OS mEGFP-Nup96 ou les cellules HeLa Kyoto mEGFP-Nup107, utilisez le signal 488 GFP des NPC marqués GFP pour identifier la cellule la plus plate et déterminer le plan focal optimal. Utilisez une faible puissance laser (~10 % de la puissance maximale du laser) pendant cette étape pour éviter le photoblanchiment.
  13. Définissez le nom et le chemin de sauvegarde de l’expérience. Cochez la case Temps pour définir l’intervalle, la durée et le nombre de boucles. Pour l’acquisition continue, on règle l’intervalle à Aucun délai et on n’entre que le nombre de boucles, qui correspond au nombre total d’images.
    REMARQUE : Assurez-vous que la case PFS en bas est sélectionnée, puis appuyez sur Exécuter. Le logiciel fournira automatiquement une durée estimée de l’expérience et enregistrera les données à la fin de l’expérience. Pour arrêter l’expérience avant sa fin, appuyez sur Terminer pour sauvegarder la progression actuelle, ou sur Abandonner pour terminer l’expérience sans sauvegarder.
  14. Pour la première protéine, acquérir 17 000 à 20 000 images avec un temps d’intégration de 300 ms.
    REMARQUE : La concentration du brin de l’imageur doit être optimisée à cette étape afin de garantir que les signaux monomoléculaires ne se chevauchent pas tout en fournissant suffisamment de localisations pour la reconstruction. Ce processus est similaire à une acquisition SMLM typique, où la concentration de l’imageur est ajustée pour obtenir un nombre suffisant d’événements pour la reconstruction tout en minimisant les chevauchements. La concentration optimale dépend de la structure à imager. Par exemple, les structures fortement marquées comme les microtubules nécessitent généralement des concentrations d’imageur plus faibles (inférieures à 1 nM).
  15. Retirez doucement le tampon d’imagerie pour la protéine suivante à l’aide d’une pipette, en veillant à ne pas déranger l’échantillon. Lors de la surveillance de l’échantillon avec la caméra du microscope, ajoutez soigneusement 200 μL de tampon C+ sans l’imageur pour laver le premier colorant.
  16. Répétez cette étape jusqu’à ce qu’aucun signal de fluorescence de la première solution d’imageur ADN ne soit détectable (généralement 5 lavages).
  17. Ajoutez une seconde solution d’imagerie et vérifiez que les événements à une seule molécule sont détectés à nouveau.
  18. Acquérir 17 000 à 20 000 images avec un temps d’intégration de 300 ms pour la seconde protéine.
  19. Répétez les étapes 5.14-5.18 pour chaque protéine supplémentaire à imager.
  20. Pour l’imagerie 3D, acquérir des piles z avec un espacement de 0,5 à 1 μm sur toute la hauteur de la cellule. Cela a été réalisé avec un protocoleJOB spécifique 21 conçu pour le logiciel d’acquisition (éléments NIS) qui enregistre une vidéo d’un nombre prédéfini d’images à des positions z spécifiques, maintenant la PSF pendant toute la durée d’acquisition.
    REMARQUE : Le logiciel, accompagné d’instructions utilisateur détaillées, est fourni dans le cadre du protocoleJOB 21. Une description complète du POSTE est également incluse. Le logiciel, nommé « MultiZ_DNAPaint.bin », peut être téléchargé depuis l’onglet Matériaux de la publication. Pour exécuter le JOB, téléchargez ce fichier et importez-le dans l’explorateur JOBS de NIS-Elements, en suivant les instructions étape par étape fournies.

6. Traitement et analyse d’images

REMARQUE : Les images ont d’abord été traitées par déconvolution à l’aide d’un logiciel compatible, suivies d’une analyse de localisation à une molécule utilisant le logiciel Picasso développé par le laboratoireJungmann 16.

  1. Ouvrez les piles d’images ND2 dans le logiciel NIS-Elements AR.
  2. Pour les images 2D, sélectionnez Déconvolution 2D. Pour les images 3D, répétez cette procédure pour chaque z-stack individuelle.
  3. Choisissez la déconvolution aveugle, un trou effectif de 0,01, et réglez le niveau de bruit sur Bruit. Ensuite, on entre le taux d’excitation et d’émission du laser, ici 560 nm et 571 nm, respectivement. D’autres paramètres sont automatiquement obtenus à partir des métadonnées ND2 pour fournir une estimation approximative de la fonction d’étalement de points (PSF) de l’image source.
  4. Spécifiez le nombre d’itérations (ici, 12), sélectionnez Créer un nouveau document, puis appuyez sur Déconstituer. Sauvegardez le fichier résultant après traitement.
    REMARQUE : L’algorithme améliore itérativement la qualité de l’image en effectuant des opérations de convolution qui affinent la PSF jusqu’à ce que la convergence ou le nombre d’itérations spécifié soit atteint. Une inspection visuelle de l’image déconvoluée est recommandée. Un ajustement du nombre d’itérations est nécessaire en fonction des contraintes de calcul et de la qualité de l’image.
  5. Chargez la pile d’images décomplexées dans le module Picasso Localize.
  6. Dans la barre de menu, sélectionnez Analyser → Paramètres et entrez les paramètres spécifiques à chaque appareil selon les spécifications du fabricant. Pour la caméra sCMOS utilisée dans cette étude (Hamamatsu ORCA-Fusion BT) : gain EM : 1, Base : 100, Sensibilité : 0,23 (facteur de conversion, électrons/comptes), Efficacité quantique : 0,95 (selon la longueur d’onde d’excitation utilisée).
    REMARQUE : L’efficacité quantique n’est plus utilisée depuis la version 0.6.0 de Picasso et est conservée uniquement pour la rétrocompatibilité.
  7. Fixe la longueur côté boîte à 7. La longueur de la boîte est déterminée à l’aide de la formule [6 × σPSF + 1], où σPSF est l’écart-type du PSF. Cette optimisation améliore la précision de localisation, améliorant la résolution de l’image reconstruite.
  8. Sélectionnez la taille de pixel appropriée pour la configuration d’image, conformément à l’étape de section 5.5.
  9. Ensuite, choisissez un gradient net minimum approprié (par exemple, ~1000, selon l’échantillon) et activez l’aperçu pour visualiser les localisations détectées. Inspectez les résultats et ajustez le seuil de gradient au besoin pour minimiser les détections de fond et garantir une localisation précise.
  10. Dans la barre de menu, sélectionnez Analyser → Localiser (Identifier & ajuster) pour commencer l’identification des points et l’ajustement de toutes les images du film. Après la compétition, ce processus sauvegarde automatiquement un fichier .hdf5 et .yaml.
    REMARQUE : Le fichier .hdf5 stocke la position de localisation de chaque ajustement gaussienne ainsi que d’autres paramètres. .yaml enregistre des informations sur la vidéo et la procédure d’analyse et peut être inspecté à l’aide d’un éditeur de texte.
  11. Chargez le fichier .hdf5 dans le module Picasso Render pour visualiser la carte de localisation reconstruite et effectuer la correction de dérive.
  12. Dans Rendu Picasso, sélectionnez Posttraitement → Dédériver par RCC. Saisissez une valeur de segmentation, à partir de 1000. Une fois terminé, le graphique de dérive calculé xy apparaîtra. Répétez le processus séquentiellement avec des valeurs de segmentation plus faibles (par exemple, 500, puis 250), observant des améliorations progressives de la dérive temporelle.
    REMARQUE : La correction de dérive peut également être réalisée en utilisant des nanoparticules comme marqueurs fiduciaux ; cependant, lors de l’imagerie de plans surélevés, le signal des nanoparticules peut ne pas être visible. Dans ces cas, seule une correction de dérive redondante par corrélation croisée (RCC) est appliquée.
  13. Assurez-vous d’enregistrer le fichier corrigé par dérive, en sélectionnant Fichier → Enregistrer les localisations avant de fermer la fenêtre de rendu Picasso.
  14. Chargez le fichier corrigé par dérive de l’étape 6.13 dans le module Picasso Filter pour des étapes supplémentaires de post-traitement, en imposant des seuils sur les métriques de qualité de la localisation d’une seule molécule, tels que : (i) Précision de localisation (lpx, lpy) ; (ii) largeurs PSF (sx, sy) ; (iii) Comptage de photons ; et (iv) tout critère supplémentaire visant à éliminer le bruit, les valeurs aberrantes ou les taches mal résolues.
    REMARQUE : lpx et lpy (précision de localisation en x et y) estiment l’incertitude dans la position localisée le long des axes x et y et sont calculés sur la base de la borne inférieure de Cramér-Rao (CRLB).
  15. Pour filtrer une propriété, sélectionnez la colonne correspondante dans l’en-tête du tableau, puis choisissez Tracer → Histogramme dans le menu.
    REMARQUE : Sélectionner deux colonnes permet de tracer un histogramme 2D.
  16. Pour filtrer par une plage de propriétés spécifique, cliquez et glissez à travers la région désirée dans un histogramme 1D ou 2D. La région sélectionnée apparaîtra ombrée en vert, et tout événement de localisation dont les valeurs sont en dehors de cette plage sera instantanément exclu de la liste de localisation.
  17. Filtrez les données par photons, sx, sy, lpx et lpy, en ne conservant que la plage centrale de la distribution de chaque paramètre afin d’assurer la conservation des localisations les plus fiables.
    REMARQUE : La partie centrale de la distribution de largeur PSF se situe généralement entre 0,4 et 1,2 × de pixel. Excluez les distributions secondaires souvent causées par des signaux qui se chevauchent ou des taches mal résolues.
  18. Sauvegardez les données filtrées en sélectionnant Fichier → Enregistrer dans le menu.
  19. Répétez le processus de l’étape 6.1 à 6.18 pour toutes les vidéos prises pour chaque solution d’imageur.
  20. Ouvrez le fichier filtré dans le module Picasso Render. L’intensité dans cette image super-résolue représente le nombre de localisations. Le contraste peut être modifié en sélectionnant Affichage → Paramètres d’affichage et en modifiant la valeur de la densité maximale.
  21. Pour enregistrer l’image super-résolution d’un seul canal, sélectionnez « Précision de localisation individuelle » dans la section Flou. Une barre de balance peut également être ajoutée à partir de la section barre d’échelle.
  22. Pour sauvegarder l’image super-résolution de tous les canaux, ouvrez tous les fichiers .hdf5 traités. La couleur de chaque chaîne peut être modifiée en sélectionnant Afficher → Fichiers dans le menu.
  23. Alignez tous les canaux en sélectionnant les canaux post-traitement → Alignez.
  24. Sélectionnez Fichier → Exporter l’image complète pour enregistrer une image ou un fichier .png → Exporter la vue courante pour un zoom spécifique de l’image.
    REMARQUE : Utilisez des pratiques cohérentes de nommage et de documentation des fichiers pour la reproductibilité. Le logiciel Picasso ajoute automatiquement un suffixe à chaque fichier sauvegardé. Les métriques Cramer Rao Lower Bound et l’analyse basée sur les voisins plus proches (NeNA)22 peuvent être extraites en sélectionnant Afficher → Afficher les informations dans le menu. Le NeNA quantifie la distribution spatiale des fluorophores localisés en évaluant la distance euclidienne entre les localisations voisines. Alors que le CRLB fournit une borne inférieure théorique pour la précision de localisation basée sur les statistiques de photons et le bruit de fond, le NeNA propose une estimation expérimentale de la précision de localisation dérivée directement du jeu de données lui-même. Pour cette raison, NeNA est largement utilisé dans la SMLM comme mesure complémentaire à la CRLB, car il capture non seulement les limites théoriques mais aussi des influences pratiques telles que la correction de dérive, les erreurs d’ajustement et la variabilité expérimentale. La métrique NeNA est extraite du module de rendu Picasso. Le CRLB de l’ajustement à une seule molécule est utilisé pour déterminer les valeurs de précision de localisation informées (σSMLM). La valeur rapportée est la moyenne entre σx et σy, pour toutes les localisations, qui sont la valeur de mode de la distribution de la précision de localisation en x et y, respectivement.

Résultats

Pour démontrer les capacités d’imagerie super-résolution du système SDC-OPR (Figure 1A), sa résolution dans le plan a été évaluée en réalisant des expériences d’imagerie ADN-PAINT (Figure 1B) sur des complexes poreux nucléaires (CPN), qui constituent une structure de référencebiologique 17. La figure 1C montre une image représentative SDC-OPR avec DNA-PAINT de la nucléoporine 96 (Nup96), marquée avec une protéine fluorescente verte monomérique améliorée (mEGFP) et marquée avec des nanocorps anti-GFP conjugués à l’ADN, dans les cellules U2OS. Les panneaux zoomés révèlent la sous-structure NUP, et la Figure 1D montre des protéines Nup96 appariées (indiquées par des flèches) cohérentes avec la symétrie 8 fois attendue des pores nucléaires. À la Figure 1E, la distance euclidienne entre les paires Nup96 a été mesurée en les alignant et en traçant l’histogramme de la section transversale de l’image sommée (n = 16 paires). L’analyse a révélé une séparation pic-pic de (13 ± 2) nm (Figure 1E), en accord avec les résultats des modèles EM ainsi que sur l’imagerieHILO et TIR 23. Chaque ajustement de pic affichait un écart-type de 4 nm, confirmant la haute précision de localisation (σSMLM = 3,3 nm, NeNA = 4,4 nm) obtenue avec DNA-PAINT sur SDC-OPR. Notamment, cette précision a été maintenue sur l’ensemble du champ de vision de 53 × 53 μm², ce qui est exceptionnel pour les systèmes à base de confocalité.

Pour démontrer la capacité à l’imagerie multicolore, Nup96, les mitochondries et les microtubules dans les cellules U2OS ont été marqués par ADN pour acquisition à l’aide de l’Exchange-PAINT18. Cette technique utilise des brins d’imageurs d’ADN orthogonaux conjugués à un seul fluorophore, permettant d’exciter toutes les cibles avec la même source laser (Figure 2A). Plutôt que d’acquérir des signaux simultanément, il les sépare à travers des projectiles d’imagerie séquentiels, facilitant une intégration simple dans tout système commercial SDC-OPR. La figure 2B montre Nup96 en bleu marqué avec un nanocorps anti-GFP, les mitochondries en rouge avec un anticorps anti-TOM20 secondaire, et les microtubules en vert avec un anticorps primaire anti-α-tubuline. Notamment, la précision exceptionnelle de localisation sur une seule molécule obtenue pour l’imagerie Nup96 monocolore a été préservée sur toutes les cibles de l’expérience multi-cibles, donnant des valeurs de précision de localisation de 3,9 nm pour le NPC, 4,0 nm pour la α-tubuline et 3,3 nm pour les mitochondries (Figures 2B panneaux 1, 2 et 3).

Pour l’imagerie à grand champ de vision, les microtubules dans les cellules HeLa étaient imagés à l’aide de divers grossissements disponibles sur le système SDC-OPR, combinés à différents réglages de binning de la caméra pour maintenir des tailles de pixels entre 78 nm et 108 nm (Figure 3). La figure 3A montre le cytosquelette microtubulaire de 10 cellules HeLa, avec des couleurs représentant la précision de localisation. À un grossissement de 1×, la précision moyenne de localisation est nettement inférieure à celle des grossissements plus élevés (Figure 3B-D), avec une plus grande variabilité observée. Cela est dû à la réduction de la densité de puissance laser sur le champ de vision plus large, où le profil d’illumination gaussien devient apparent, ce qui entraîne une diminution de la précision vers les bords du champ de vision. Néanmoins, atteindre une précision de localisation moyenne de 9,5 nm sur l’étendu champ de vision de 211 × 211 μm² est impressionnant pour les systèmes à base de champs confocaux et permet une investigation à haute résolution de l’hétérogénéité biologique.

Enfin, la possibilité d’imager des cellules entières est démontrée en acquérant des images ADN-PAINT du réseau de microtubules dans des cellules HeLa fixes d’un volume confocal d’environ ~500 nm d’épaisseur et d’un pas z de 1 μm en utilisant le plus grand grossissement du système (champ de vision de 4×, 53 × 53 μm²). La figure 4A présente les images de reconstruction à une seule molécule pour chaque plan z, ainsi que la précision de localisation correspondante et les valeurs de NeNA. De plus, une visualisation 3D en couleur du réseau de microtubules dans la cellule HeLa est fournie dans la Figure 4C. À mesure que la profondeur augmente, le nombre de photons détectés diminue en raison de la diffusion et des aberrations optiques, ce qui réduit la précision de localisation tant pour les précisions de localisation dérivées de la limite inférieure de Cramér-Rao (CRLB) (Figure 4A, à droite) que pour celles calculées à l’aide de la métrique NeNA. Néanmoins, le haut niveau de collecte de photons possible par le système SDC-OPR permet σSMLM ≤ 10 nm pour une profondeur d’imagerie allant jusqu’à 9 μm avec des distributions étroites. En effet, les structures microtubulaires filamenteuses à double paroi étaient clairement résolues à différentes profondeurs : près de l’interface couverlinge-cellule, en positions axiales intermédiaires, et en haut de la cellule, avec une distance pic à pic entre 30 nm et 40 nm (Figure 4C), cohérente avec les valeursrapportées 24. Ces résultats mettent en lumière la capacité du SDC-OPR à fournir des images haute résolution sur de grands champs de vision et sur toute la hauteur des cellules.

Figure 1
Figure 1 : Microscopie de localisation en plan à molécule unique de différents échantillons cellulaires et imagerie multicolore à super-résolution. (A) Schéma du système confocal du disque rotatif avec réassignation optique de photons (SDC-OPR), comprenant un réseau de microlentilles conçu pour maximiser la collecte de photons. (B) Schéma de l’ADN-PAINT : Les brins d’ADN marqués par fluorescence, appelés brins imageurs, s’hybrident transitoirement avec des séquences d’ADN complémentaires (brins d’amarrage) qui sont ancrés à l’anticorps/nanocorps ciblant la protéine d’intérêt. Ces événements de liaison de courte durée génèrent des signaux de fluorescence qui apparaissent sous forme de clignotements stochastiques. (C) Image représentative DNA-PAINT sur le système SDC-OPR en utilisant un grossissement 4× du NPC des cellules U2OS. La capacité haute résolution est démontrée dans l’insert, où les PNJ individuels sont clairement résolus. (D) ADN-PAINT amélioré par SDC-OPR permet de visualiser des NPC uniques, où des flèches blanches mettent en évidence les paires caractéristiques de protéines Nup96 dans l’architecture du pore. (E) Distribution des mesures de distance entre les dimères Nup96 (n=16 paires) au sein d’unités de symétrie NPC uniques. Cette figure a été modifiée à partir de Zaza et al.14. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine. 

Figure 2
Figure 2 : Exchange-PAINT pour l’imagerie multicolore à l’aide d’un microscope SDC-OPR. (A) Schéma de l’Exchange-PAINT de trois cibles imagées séquentiellement. Trois cibles protéiques ont été marquées avec des anticorps fonctionnalisés par l’ADN, des fragments Fab ou des nanocorps. Les brins de l’imageur Cy3B ont été imagés séquentiellement par type de brin avec des étapes de lavage entre les projectiles d’imagerie. (B) Imagerie Exchange-PAINT à trois couleurs des cellules U2OS utilisant la microscopie SDC-OPR avec grossissement 4×, montrant les microtubules (rouge ; marqués avec de l’anti-α-tubuline conjuguée à l’ADN), les mitochondries (vertes ; ADN-nanocorps ciblant TOM20), et NPC (bleu ; Nup96 marqué mEGFP avec des nano-nanocorps d’ADN anti-GFP). Barre-échelle : 5 μm. La région zoomée met l’accent sur la résolution améliorée obtenue sur le système SDC-OPR, en se concentrant sur (1) mitochondries, (2) microtubules et (3) NUP. Barres d’échelle = 1 μm. Cette figure a été modifiée à partir de Zaza et al.14. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3
Figure 3 : Imagerie ADN-PAINT dans de grands champs de vision sur un microscope SDC-OPR. Images ADN-PAINT de microtubules (marquage anti-α-tubuline) acquises à plusieurs grossissements : (A) 1× grossissement et 1 binning (FOV de 211 × 211 μm²), (B) 2,8× et 2 binning (FOV de 76 × 76 μm²), (C) 4× grossissement et 4 binning (FOV de 53 × 53 μm²). La couleur représente la précision de localisation de 0 à 16 nm dans le cas d’un grossissement 1x et de 0 à 4 nm dans les autres. (D) Précision de localisation mesurée à différentes distances (en μm) du centre du champ de vision pour des grossissements de 1× (rouge), 2,8× (jaune) et 4× (vert). Cette figure a été modifiée à partir de Zaza et al.14. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4
Figure 4 : Imagerie ADN de cellule entière - PAINT. (A) À gauche. Imagerie volumétrique des microtubules dans les cellules HeLa via DNA-PAINT acquise à l’aide de SDC-OPR à un grossissement de 4×, montrant des sections axiales de z = 0 à 9 μm (pas de 1 μm). Chaque plan affiche la position z, la précision de localisation et la métrique NeNA. Barres d’échelle : 5 μm (xy). Exact. Précision de localisation versus profondeur de pénétration pour tous les plans. (B) Rendu 3D du réseau de microtubules sur la même cellule HeLa que dans (A). La couleur représente la profondeur de pénétration de 0 à 9 μm. (C) Images zoomées de petites régions mises en évidence à chaque profondeur de pénétration indiquées par (A). Cette figure a été modifiée à partir de Zaza et al.14. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Discussion

La microscopie à fluorescence à super-résolution a brisé la barrière de diffraction, améliorant considérablement la résolution spatiale. Pourtant, son adoption généralisée dans la recherche biologique fait face à des défis persistants. Notamment, les compromis entre champ de vision, résolution et profondeur de pénétration rendent difficile l’optimisation simultanée des trois facteurs. Ces défis ont été relevés en utilisant les capacités combinées de la SMLM et de la microscopie confocale à disque tournant, améliorées par la réaffectation optique des photons (SDC-OPR). En intégrant des réseaux de microlentilles dans une configuration SDC standard, comme le permettait le système commercial SDC-OPR, la collecte de photons a été augmentée tandis que la taille effective du trou d’épingle a été réduite, entraînant une amélioration significative de la résolution. Comparé au SDC standard, le système SDC-OPR a démontré une nette amélioration de la puissance de résolution, distinguant avec succès des caractéristiques séparées par 10 nm14 dans le plan focal, alors que le SDC standard ne pouvait résoudre que des distances supérieures à 20nm 11. Cette capacité de résolution accrue souligne l’avantage de la réaffectation des photons pour obtenir des séparations à l’échelle moléculaire. Plus précisément, une précision de localisation latérale inférieure à 2 nm a été obtenue au niveau du plan focal (z = 0 μm), la précision latérale restant inférieure à 10 nm à des profondeurs allant jusqu’à 9 μm, combinée à un champ de vision très adaptable de 53 × 53 μm² ou 76 × 76 μm². Même avec un champ de vision large de 211 × 211 μm², le système offrait une impressionnante précision moyenne de localisation en plan de 9,5 nm. Ces résultats mettent en lumière la capacité du système à obtenir des images haute résolution dans des cellules entières.

Concernant les réactions de couplage pour les différents anticorps utilisés, le protocole doit être suivi avec soin afin d’assurer un rapport anticorps/ADN optimal. Dépasser ce rapport peut réduire la précision de localisation et affecter négativement les mesures quantitatives, comme celles réalisées dansqPAINT 25. Il est donc crucial de vérifier le rapport à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis microvolume, garantissant ainsi un rapport final de 1:1 entre l’ADN et l’anticorps.

Une étape cruciale pour obtenir des images de haute qualité et super-résolution des microtubules est une fixation correcte. Les méthodes de fixation conventionnelles reposant uniquement sur de fortes concentrations de PFA perturbent souvent les structures microtubulaires. Au contraire, l’utilisation seule ou en combinaison avec le PFA améliore significativement la préservationstructurelle 26,27.

Pour une imagerie optimale, un objectif à haute ouverture numérique (NA) est essentiel pour maximiser la collecte de photons par événement à une seule molécule. Dans le système commercial SDC-OPR, la puissance du laser est intentionnellement inférieure à celle des microscopes TIRF conventionnels utilisés pour le SMLM afin de minimiser le photoblanchiment des échantillons. Bien que DNA-PAINT élimine les problèmes de photoblanchiment et puisse théoriquement utiliser une puissance laser plus élevée, les systèmes commerciaux actuels imposent des limitations, nécessitant des temps d’exposition plus longs que pour l’éclairage TIRF. De plus, comme l’éclairage dans SDC-OPR est confocal, les molécules ne sont pas excitées en continu pendant l’exposition. En conséquence, des temps d’exposition plus longs sont nécessaires par rapport à l’éclairage continu du TIRF ; Dans cette étude, un temps d’exposition de 300 ms a été utilisé. Cependant, selon les exigences de résolution d’une expérience donnée, des temps d’intégration plus courts (par exemple, 150-200 ms) peuvent être utilisés avec une perte minimale derésolution de 28.

Optimiser la concentration du brin de l’imageur est une étape cruciale pour garantir que les signaux à molécule unique restent bien séparés tout en générant suffisamment de localisations pour une reconstruction précise. Cet ajustement est analogue aux acquisitions SMLM standard, où l’équilibre entre la densité d’événements et le chevauchement du signal est soigneusement contrôlé. La concentration optimale de l’imageur doit être ajustée pour chaque cible différente. Par exemple, pour les microtubules, une concentration initiale du brin de l’imageur inférieure à 1 nM est recommandée, avec des ajustements effectués selon les besoins.

Maintenir une focalisation stable lors d’acquisitions prolongées est crucial, car la dérive axiale (z) ne peut pas être corrigée après traitement. La dérive latérale (xy) peut être compensée via RCC ou marqueurs fiduciaux. Dans cette configuration, le système de mise au point parfaite (PFS) du microscope assure la stabilité de la mise au point pendant des heures d’imagerie.

En résumé, l’intégration de SMLM avec SDC-OPR offre une plateforme puissante pour l’imagerie haute résolution en profondeur dans des cellules entières, surmontant les compromis traditionnels entre résolution, profondeur et champ de vision. Cependant, pour pleinement exploiter les capacités du système, une attention méticuleuse aux conditions expérimentales est essentielle, de la conjugaison et de la fixation des anticorps aux paramètres d’acquisition et au traitement des données. Chaque étape, de la préparation de l’échantillon à la correction de dérive, joue un rôle crucial pour obtenir des données fiables et de haute précision. Avec une optimisation soigneuse des protocoles, cette approche offre une solution robuste et polyvalente pour l’imagerie quantitative à l’échelle nanométrique dans des échantillons biologiques complexes. Ce protocole devrait aider la communauté à adopter la microscopie de localisation à molécule unique et à obtenir des images super-résolues à partir de plans d’échantillonnage difficiles d’accès avec l’éclairage conventionnel TIRF ou HILO. Les deux objectifs sont réalisés à l’aide de microscopes disponibles dans le commerce, généralement présents dans les installations de microscopie du monde entier.

En termes d’autres applications et d’applications futures, la méthode est applicable à des échantillons de cellules entières ainsi qu’à des échantillons de tissus plus complexes à des profondeurs d’imagerie plus élevées, comme démontré dans des étudesprécédentes 14. Contrairement aux approches nécessitant une coupe physique, cette technique permet l’imagerie volumétrique des tissus intacts, préservant l’architecture native et minimisant les artefacts introduits par la coupe physique. L’utilisation de sondes d’affinité plus petites, telles que les nanocorps, améliore encore la pénétration tissulaire par rapport aux anticorps de pleine longueur, permettant un marquage plus uniforme sur des échantillons épais. Cette approche ouvre la porte à l’étude de l’organisation cellulaire et des distributions moléculaires in situ avec une plus grande fidélité. Au-delà de ces applications, la stratégie se prête également à un criblage à haut débit des nanostructures et des assemblages biomoléculaires, permettant des investigations systématiques de l’hétérogénéité et de la fonction structurales. De plus, les développements récents dans DNA-PAINT ont permis de produire des sondes d’imagerie auto-trempantes, basées soit sur des interactions de trempant decolorant soit sur des interactions colorant-colorant 29,30,31, qui réduisent efficacement les signaux de fond, augmentent l’intensité de fluorescence et améliorent la résolution spatiale, permettant des taux d’acquisition plus rapides. L’intégration de ces sondes fluorogéniques dans le cadre SDC-OPR a le potentiel d’augmenter encore la vitesse et la résolution d’imagerie. La combinaison de ces avancées avec les forces du système SDC-OPR pourrait élargir son applicabilité à des spécimens biologiques plus complexes, établissant ainsi la plateforme comme un outil flexible pour la cartographie détaillée des structures cellulaires et moléculaires dans une grande variété de tissus.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à déclarer.

Remerciements

Cette recherche a été financée par l’Human Frontier Science Program Organization (HFSP) via une bourse postdoctorale interdisciplinaire auprès de CZ (LT0025/2023-C) et par le Engineering and Physical Sciences Research Council pour soutenir le M.T. (EP/R513143/1 et EP/W524335/1) et l’O.P.L.D (EP/R513143/1 et EP/T517793/1). S.S reconnaît également la Royal Society grâce à une bourse Dorothy Hodgkin (DHF\R1\191019 et DHF\R\251006). Ce travail a également été soutenu par des subventions de la Chan Zuckerberg Initiative (2023-321188) et du BBSCR (BB/Y513064/1) à S.S.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
(± ;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchromane-2-carboxylique acideMerck  ;238813-5GTrolox
acide 3,4-dihydroxybenzoïque   ;Merck  ;37580-25G-FPCA
60 et fois ; Objectif Apo NA 1.49Nikon
7.0 KDA colonne de dessalage de spin contenant la résine d’exclusion de taille   ;Fisher Scientific Ltd89882Colonnes de désalage Zeba Spin pour l’étape 2.4
Accutase - Milieu de décollement des cellules enzymatiquesCellule promoC-41310
Alpaga sdAb (1H1) anti-GFP couplé à de l’ADN personnalisé (sdAB-5'-TCCTCCTCCTCCT-3')Photonique massiveProduit personnaliséNanocorps anti-GFP pour Drosophila
Alpaga sdAb (1H1) anti-GFP couplé à l’ADNPhotonique massiveMASSIVE-TAG-Q-FAST anti-GFP - F3Nanocorps anti-GFP pour la NUP
Anti-alpha tubuline (YL1/2)Thermo Fisher ScientificMA1-80017
IgG anti-lapinPhotonique massiveMassive-sdAB-FAST 2-Plex, secondaire sdAB F2
Anti-TCR&ZETA ; (6B10.2)BioLegend644102
Albumine sérique bovineMerck  ;A4503-10GBSA
Tube centrifuge conique 15 mLFisher Scientific Ltd17705004
Tube centrifuge conique 50 mLVWR International734-0448
CSU-W1 SoRaNikonMicroscope SDC-OPR
Dessalage des colonnes de spin avec Sephadex G-25 (résine d’exclusion de taille pour la purification de l’ADN) & nbsp ;Fisher Scientific Ltd11743309Marque : Cytiva. Colonnes G-25 pour l’étape 2.5
D-glucoseMerck  ;G8270-1KG
Médias DMEMThermo Fisher Scientific11965092
DMSO, anhydreThermo Fisher ScientificD12345
DTT  ; (Dithiothréitol)Thermo Fisher Scientific15976082
EDTAThermo Fisher Scientific15575020
EGTAMarck324626
Sérum fœtal bovinThermo Fisher ScientificA5256701
GlutaraldéhydeServa2311402
GlycérolMerck  ;G5516-500ML  ;
GlycineMP Biomédicals219482580
Maleimide-PEG2-succinimidyl  ;Merck  ;746223-50MG
Médias 5A de McCoyFisher Scientific Ltd16600082
MES (acide 2-(N-morpholino)éthanasolifique)MerckM3671-50G
MéthanolFisher Scientific Ltd32213-25L
MgCl2Fisher Scientific Ltd10418464
Tubes microcentrifuges 0,5 mLFisher Scientific Ltd11508232
Tubes à microcentrifuge 1,5 mLEppendorf10509691  ;
Spectrophotomètre UV-Vis microvolumeThermo Fisher ScientificND-UN-WNanodrop
NaCl2Sigma-AldrichS6546-1L  ;
Nanoparticules 90 nm - OrCytodiagnosticG-90-100
Caméra CMOS Orca Fusion-BTHamamatsu
Pénicilline-StreptomycineThermo Fisher Scientific15070063P/S
Solution saline tamponnée phosphate (solution 1x)Fisher Scientific Ltd11530546PBS
Pierce 16 % de formaldéhyde (va-et-à-vers), sans méthanolFisher Scientific Ltd11586711PFA
Chlorure de potassium   ;Merck  ;  ; P9541-500G
Protocatéchuate 3,4-Dioxygénase   ;Merck  ;P8279-25UN  ;PCD
Sodium  ; HydroxydeFisher Scientific Ltd12963614
Anticorps TOM20AbcamAb186735
Tampon de trisVWR InternationalA4577.1000
Triton  ; X-100  ;   ;VWR International1086031000
Préadolescent-20Merck  ;P9416-50ML
Unité de filtration centrifuge ultrafiltrante, MWCO 100 kDaMerck  ;UFC510024Fabricant : Amicon Ultra
&mu ;-Slide 8 puits haut Fond en verreIbidiIB-80807
&mu ;-Slide VI 0.5 Fond en verreIbidiIB-80607

Références

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