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Article de méthode

Génération et caractérisation médiatisées par CRISPR/Cas9 d’une souche Ent2*/CyO de Drosophila melanogaster

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DOI :

10.3791/69546

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7 août 2026

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1College of Traditional Chinese Medicine, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 2Innovative Team for Medicinal Plant Resources and Breeding, Institute of Special Agricultural Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences

Dans cet article

Résumé

Le transporteur nucléoside équilibré 2 (ENT2) est une protéine transmembranaire conservée impliquée dans le transport des nucléosides et le métabolisme cellulaire. Dans cette étude, un flux de travail d’édition génomique basé sur CRISPR/Cas9 a été mis en place pour générer un allèle ciblé par Ent2 chez Drosophila melanogaster. Une lignée hétérozygote stable Ent2*/CyO a été construite et maintenue à l’aide d’une stratégie de chromosomie équilibreur. Ce travail décrit la conception, la génération et la validation moléculaire de la lignée mutante, ainsi que sa caractérisation phénotypique sous différentes conditions de température. Le flux de travail établi et la souche mutante offrent un cadre pratique pour étudier les gènes à phénotypes létaux homozygotes et pour étudier la variation phénotypique associée à la température chez Drosophila.

Résumé

Dans cette étude, une approche d’édition du génome basée sur CRISPR/Cas9 a été utilisée pour introduire des mutations dans le gène du transporteur nucléoside équilibré 2 (Ent2) chez Drosophila melanogaster. Des ARN-guides ciblant la région codante d’Ent2 ont été conçus et co-injectés avec l’ARNm Cas9 dans des embryons w 1118. Les allèles mutants ont été identifiés par séquençage de Sanger et maintenus comme une lignée hétérozygote stable Ent2*/CyO à l’aide d’un chromosome équilibreur. Par la suite, nous avons évalué le poids corporel, la capacité à grimper, le taux de survie et les activités de la superoxyde dismutase (SOD) et de la catalase (CAT) chez les mouches à fruits à 22 °C et 25 °C, respectivement. Les résultats indiquent qu’à 22 °C et 25 °C, la longueur corporelle et le poids des mouches à fruits Ent2*/CyO ont été significativement réduits par rapport à la w1118, et leur développement a été retardé. À 22 °C, la durée de vie globale des mouches Ent2*/CyO était légèrement plus longue que celle du W1118, tandis qu’à 25 °C, aucune différence significative n’a été observée. Concernant la capacité locomotrice, la performance de montée des mouches hétérozygotes était significativement inférieure à celle du W1118 à ces deux températures, les mâles étant plus gravement affectés. De plus, les activités enzymatiques antioxydantes de la CAT et de la SOD chez les mouches Ent2*/CyO ont été significativement réduites, indiquant une altération claire de la capacité antioxydante. Ces résultats décrivent le profil phénotypique d’une lignée mutante Ent2 générée par CRISPR et démontrent la faisabilité de combiner l’édition génomique avec des stratégies de chromosomes équilibreurs chez Drosophila. Cette étude fournit un cadre méthodologique et une ressource génétique pour les futures recherches sur les gènes associés au métabolisme et aux réponses environnementales.

Introduction

Drosophila melanogaster reste l’un des organismes modèles les plus utilisés en génétique et biologiedu développement. Elle se caractérise par un cycle de vie court, une reproduction rapide, des outils de manipulation génétique bien établis et un génome entièrementannoté 2,3. Cette espèce est largement appliquée dans des études sur la fonction génique, la régulation métabolique et l’adaptabilité environnementale 4,5. Les nucléosides et leurs dérivés tels que l’ATP sont essentiels à la génération d’énergie cellulaire, à la synthèse des acides nucléiques et à la transduction du signal chez Drosophila, reflétant une régulation métabolique conservée à travers lesmétazoaires 6. Les voies de signalisation purinergiques chez Drosophila, qui dépendent des mécanismes de transport extracellulaire de l’adénosine et des nucléosides, mettent en lumière le rôle fonctionnel du mouvement des nucléosides à travers les membranes dans la coordination des réponses d’énergie et de transductiondu signal 7. Parmi ces processus, le transport des nucléosides à travers la membrane cytoplasmique est principalement médié par la famille des transporteurs nucléosides équilibrés (ENT), DmENT2 présentant une activité de transport fonctionnel chez Drosophila8.

La famille ENT comprend plusieurs sous-types, parmi lesquels ENT2 est un transporteur nucléosidetransmembranaire 9 largement étudié. Il facilite le transport transmembranaire indépendant de l’énergie de divers nucléosides de purine etpyrimidine 10,11. Chez les mammifères, ENT2 est un transporteur bidirectionnel omniprésent qui facilite l’absorption cellulaire des nucléosides et nucléobases de purine et pyrimidine. Cette activité de transport contribue au sauvetage des nucléotides et aide à maintenir l’homéostasie métaboliquecellulaire 12. ENT2 assure également l’intermédiaire du transport de divers médicaments dérivés des nucléosidiques, étendant sa pertinence fonctionnelle au-delà du mouvement des nucléosidiques endogènes, mettant en lumière son importance physiologique et clinique pluslarge 13. De plus, ENT2 a été impliquée dans des troublesneurologiques 14, le métabolismetumoral 15, le dysfonctionnement vasculaire16 et le métabolisme énergétique cellulaire chezl’humain 17. Cependant, les études portant sur les rôles au niveau de l’organisme Ent2 chez Drosophila restent limitées.

Les rôles de l’ENT2 dans la croissance et le développement, le métabolisme énergétique, la performance locomotrice et la capacité antioxydante dans des conditions de température variables n’ont pas été pleinementexplorés 18. La température influence fortement le métabolisme basal et la durée de vie chez Drosophila, les températures d’élevage plus élevées augmentant généralement l’activité métabolique et réduisant lalongévité 19. Ces changements dépendants de la température dans l’expression génique peuvent influencer les voies physiologiques et ainsi modifier les effets phénotypiques de mutations génétiquesspécifiques 20.

La protéine 9 associée à répétitions palindromiques courtes régulièrement interespacées régulièrement interespacées (CRISPR/Cas9) a été largement utilisée chez Drosophila pour diverses opérations de modification génomique telles que l’élimination, la délétion, le remplacement et l’introduction de balises spécifiques au site, démontrant son efficacité et sa fiabilité 21,22,23. Les derniers progrès indiquent que les éditeurs de bases dérivés de CRISPR peuvent également être utilisés pour des modifications de base spécifiques au site plus fines chez Drosophila, fournissant un nouvel outil pour les mutations ponctuelles et un contrôle phénotypiqueprécis 24. Les méthodes traditionnelles de mutagenèse, y compris la mutagenèse chimique et par radiation ainsi que les criblages médiés par transposons, peuvent générer des mutationsgénétiques 25. Ces approches sont souvent limitées par une faible efficacité et un fort aléatoire dans les événements de mutation. En conséquence, les chercheurs doivent dépister un grand nombre d’individus afin d’isoler des allèles spécifiquesd’intérêt 26. CRISPR/Cas9 permet un clivage dirigé par l’ARN-guide programmé (gRNA) à des séquences d’ADN spécifiées. Les ruptures de double brin résultantes sont réparées par une jonction non homologue ou une réparation dirigée par l’homologie, générant des mutations définies et héréditaires et réduisant significativement les mutations de fond pouvant perturber l’analyse phénotypique27,28. Les allèles mutants générés via CRISPR/Cas9 peuvent être maintenus dans un état hétérozygote par liaison avec des chromosomes équilibreurs, tels que Curly O (CyO)29. Cette stratégie a démontré qu’elle empêche efficacement la perte des allèles létaux sous forme homozygote dans la génétique de Drosophila. En conséquence, il soutient une évaluation phénotypique systématique et à long terme, incluant des études fonctionnelles sous des températures ou conditions environnementales variables29,30. La conception simple et la grande efficacité de CRISPR/Cas9 ont considérablement raccourci le cycle de construction de la souche et amélioré la stabilité du fond génétique. Cela est particulièrement important pour étudier les facteurs environnementaux à long terme tels que la réponse à la température et l’homéostasie développementale.

Sur cette base, le gène Ent2 chez Drosophila melanogaster a été éliminé à l’aide du système CRISPR/Cas9, et une souche mutante hétérozygote Ent2*/CyO de manière stable a été établie. Le cycle de développement, le poids corporel, la capacité locomotrice et les activités des enzymes antioxydantes SOD et CAT ont été évalués de manière systématique. En comparant les phénotypes multidimensionnels de w1118 et de mouches mutantes sous des conditions de température variables, cette étude vise à présenter une stratégie reproductible pour générer et maintenir des lignées mutantes dérivées de CRISPR et à fournir une caractérisation descriptive des phénotypes résultants. Ce travail offre un cadre méthodologique et une ressource génétique utile pour de futures études sur les gènes impliqués dans le métabolisme et les réponses environnementales.

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Protocole

1. Conception des cibles CRISPR/Cas9 pour le gène Ent2

  1. Sélectionnez les sites CRISPR candidats dans les exons 2 et 5 d’Ent2 (ID FlyBase : FBgn0263916) en utilisant CHOPCHOP (v3)31 et le CCTop (v1.0)32.
  2. Le génome de référence a été défini comme Drosophila melanogaster Release 6 (dm6) (Acquisition d’assemblage RefSeq : GCF_000001215.4). Ensuite, des sites candidats à gRNA ont été identifiés. Enfin, les sites identifiés ont été filtrés pour obtenir les gRNA optimaux.
  3. Filtrez les cibles par score de spécificité MIT ≥ 80 (CHOPCHOP), score CFD ≤ 0,1 (CCTop), contenu GC 40 % à 60 %, et distance PAM minimale.
  4. Classez les cibles avec un score pondéré (efficacité 50 %, spécificité 30 %, optimisation GC 20 %) et choisissez deux gRNA.
  5. Ajoutez un « G » à l’extrémité 5′ de chaque gRNA pour satisfaire à l’exigence de promoteur T7. Utilisez les oligonucléotides avant-agrégés spécifiques à l’ARNg suivants pour générer le modèle de transcription sgRNA de longueur complète par PCR :
    Ent2-sg1-F : TAATACGACTCACTAT
    AGGTGACGTTAAATCCATCGTTTTTTAGAGCTAGAAATAGC
    Ent2-sg2-F : TAATACGACTCAC
    TATATTGCCGTTGGAATCATGGGGTTTAGAGCTAGAAATAGC
  6. La séquence restante de l’échafaudage d’ARNsg est fournie par l’oligonucléotide inverse universel lors de la PCR.

2. Préparation de modèles de transcription d’ARNsgs

  1. Préparation de modèles de transcription d’ARNsgs
    1. Assembler un mélange de réaction PCR de 60 μL en utilisant la méthode de recuit à double oligonucléotide33 selon les instructions du fabricant. Combinez l’oligonucléotide direct spécifique à l’ARNg (Ent2-sg1-F ou Ent2-sg2-F) avec un oligonucléotide inverse universel codant pour l’échafaudage sgRNA afin d’obtenir le gabarit dsDNA complet pour la transcription in vitro.
    2. Programme le thermocycleur : 95 °C 3 min ; 35 cycles de 95 °C 30 s, 55 °C 30 s, 72 °C 20 s ; puis 72 °C pendant 10 minutes ; Maintenez à 12 °C.
  2. Purifier le modèle de transcription
    1. Ajouter 100 μL d’acétate d’ammonium (voir Tableau des matériaux) à un produit PCR de 60 μL ; mélanger. Ajouter 400 μL d’éthanol anhydre ; inversez pour mélanger et incubez à -20 °C pendant 20 minutes.
    2. Centrifugeuse à 4 °C, 20 000 x g pendant 15 minutes ; Jetez le surnageant.
    3. Faites sécher le pellet à l’air avec le tube ouvert pendant 10 minutes. Resuspendez le pellet dans 10 μL de ddH₂O sans nucléase.
  3. Transcription in vitro de gRNA
    1. Mettez en place une réaction de transcription in vitro de T7 de 10 μL en suivant les instructions du kit (voir tableau des matériaux).
    2. Incubez à 37 °C pendant 35 minutes. Ajoutez 0,5 μL de DNase I (fournie dans le kit de transcription) et éclovez à 37 °C pendant 15 minutes.
  4. Purifier le gRNA
    1. Diluez le mélange de transcription à 60 μL avec du ddH₂O sans nucléase. Ajoutez 60 μL de phénol/chloroforme saturé en eau (voir Tableau des matériaux) ; Vortex brièvement et centrifugeuse à 4 °C, 16 000 x g pendant 5 minutes.
    2. Transférer 45 μL de la phase aqueuse dans un nouveau tube sans RNase de 1,5 mL. Ajouter 5 μL d’acétate de sodium ; mélange.
    3. Ajouter 125 μL d’éthanol anhydre prérefroidi ; mélanger et incuber à -20 °C pendant 20 à 30 minutes. Centrifugeuse à 4 °C, 20 000 x g pendant 15 minutes ; Jetez le surnageant.
    4. Lavez le pellet avec 200 μL d’éthanol à 70 % (sans RNase) ; centrifugeuse à 4 °C, 20 000 x g pendant 5 minutes ; Retirez le surnageant.
    5. Séchez le pellet à 37 °C jusqu’à ce que l’éthanol s’évapore complètement. Resuspendre en 20 μL ddH₂O ; aliquote et conserver à -80 °C.
    6. Mesurez la concentration d’ARNg à l’aide d’un spectrophotomètre NanoDrop et ajustez la concentration à 250 ng/μL pour l’injection. Assurez-vous de la pureté du gRNA avec un ratio A260/A280 d’environ 2,0.
      REMARQUE : Nous insistons sur le fait que les gants doivent être portés tout au long du processus pour la protection de la RNase. Tous les consommables, y compris les tubes centrifugeuses et embouts de pipette pré-refroidis sans RNase, doivent être utilisés de manière constante pendant la procédure. Les déchets réactifs organiques générés pendant l’opération doivent être collectés séparément dans des conteneurs désignés selon leur type et régulièrement transportés vers un centre certifié d’élimination des déchets dangereux pour une manipulation appropriée.

3. Préparation de l’ARNm Cas9

  1. Préparation du modèle de transcription
    REMARQUE : Utilisez des pointes et des tubes sans RNase lors des étapes liées à l’ARN.
    1. Dégeler le plasmide d’expression Cas9 MLM3613 (voir Tableau des matériaux) sur la glace. Dans un tube sans RNase, combinez 20 μg d’ADN plasmidique, 7,5 μL de tampon de restriction 10x, 1 μL de PmeI (10 000 U/mL) et de ddH₂O sans nucléase à 75 μL.
    2. Incubez à 37 °C pendant 30 minutes. Vérifiez la linéarisation complète en chargeant 5 μL sur un gel d’agarose à 1 % à 120 V pendant 30 minutes.
  2. Purification des modèles de transcription
    1. Ajoutez 23 μL de dodécylsulfate de sodium à 2 % (SDS, voir Tableau des matériaux pour plus de détails) et 0,5 μL de protéinase K (voir Tableau des matériaux pour les détails) à 70 μL de la digestion ; Incubez à 50 °C pendant 30 minutes.
    2. Ajouter 45 μL de chloroforme et 45 μL de phénol trisaturé ; Vortex brièvement ; centrifugeuse 13 800 x g, 5 min.
    3. Transférer une phase aqueuse de 90 μL dans un nouveau tube. Ajouter 10 μL d’acétate de sodium (fourni par le kit) et 200 μL d’éthanol anhydre pré-refroidi ; Mix ; incuber −20 °C, 30 min.
    4. Centrifugeuse 20 000 x g, 4 °C, 15 min ; Jetez le surnageant. Lavez la pellete deux fois avec 100 μL d’éthanol à 70 % ; centrifugeuse 20 000 x g, 2 min chacun ; Séchage à l’air.
    5. L’ADN dissous dans 20 μL de ddH₂O sans nucléase ; Confirmez >500 ng/μL.
  3. Transcription in vitro avec co-caping
    1. Configurez la réaction à l’aide d’un kit de transcription in vitro T7 avec un capuchon (voir Tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant.
    2. Incubez à 37 °C pendant 2 heures pour générer un ARNm Cas9 plafonné.
    3. Après la réaction de transcription, ajoutez 1 μL de DNase (fourni dans le kit, concentration 2 U/μL), mélangez soigneusement, puis incubez à 37°C pendant 15 minutes pour dégrader le modèle d’ADN.
  4. Ajoutez une queue poly(A)
    1. Amenez l’ARN à 14 μL de ddH₂O.
    2. Ajouter 2 μL de tampon poly(A) poly(A) poly(A) d’E . coli, 2 μL d’ATP (10 mM), 1 μL inhibiteur de RNase et 1 μL de poly(A) poly(A) polymémérase.
    3. Incubez à 37 °C pendant 45 minutes.
  5. Purifier l’ARNm
    1. Appliquez la réaction à un kit d’ARN total à colonne de spin (voir Tableau des matériaux). Chargez l’échantillon sur une membrane de silice de 2 mL ; centrifugeuse 8 000 x g, 15 s ; rejeter le flux direct.
    2. Ajoutez 500 μL de tampon RPE à la colonne RNeasy, centrifugez à 8000 x g pendant 15 s, puis jetez le liquide résiduel. Répétez cette étape une fois, puis centrifugez pendant 2 minutes et jetez le liquide résiduel.
    3. Placez la colonne RNeasy dans un nouveau tube centrifugeuse de 1,5 mL. Ajoutez 30 μL de ddH₂O sans RNase, centrifugez à 8000 x g pendant 1 minute pour éluer l’ARN. Ajustez la concentration d’ARNm à 500 ng/μL pour l’injection. Stockez l’ARN élué à -80 °C.

4. Microinjection d’embryons de Drosophila

  1. Préparation des échantillons d’injection
    1. Mélangez 15 μg d’ARNm Cas9 avec 7,5 μg d’ARNg double brin à un rapport de volume de 2:1.
    2. Ajustez à 30 μL avec de l’eau sans RNase traitée à DEPC ; Reste sur la glace.
  2. Élevage de Drosophila
    1. Transférez la souche injectée de Drosophila w1118 dans de grands tubes alimentaires pour amplification. Des mouches W1118 ont été utilisées comme témoins de référence pour représenter l’état physiologique de base sans effets associés à l’équilibreur.
    2. Maintenez les mouches dans une chambre climatique artificielle réglée à 25 °C avec une humidité de 60 % à 70 % et un cycle clair-obscur de 12:12 pendant 14 jours.
    3. À 17h00 le lendemain de la période d’élevage de 14 jours (jour 15), on collecte les mouches adultes pour synchroniser la ponte chronométrée des embryons. Ce délai précis de collecte garantit que les embryons utilisés pour l’injection sont à un stade de développement constant. Contrôler l’heure de la journée est important pour minimiser les effets du rythme circadien sur le développement embryonnaire et le comportement reproductif, assurant ainsi la reproductibilité expérimentale et réduisant la variabilité physiologique entre les lots.
  3. Microinjection de Drosophila
    1. Recueillez les mouches adultes pour les injecter dans des cages à mouches, avec environ 400 adultes par cage. Collecter les embryons sur des plaques d’agar recouvertes de levure ; Recueillez les embryons dans les 60 minutes suivant la ponte et rincez-les sur les manteaux de recouverture. Aucune déchorionation n’a été réalisée avant l’injection.
    2. Alignez les embryons sur des couvertures avec leurs pôles postérieurs orientés vers l’extérieur, disposés de manière ordonnée de haut en bas. Assurez-vous que l’aiguille d’injection pénètre le pôle postérieur à une profondeur appropriée (environ un cinquième de la longueur de l’embryon) pour une livraison cytoplasmique cohérente. Un total de 300 embryons ont été utilisés dans cette étude.
    3. Sous un stéréomicroscope, concentrez la pointe de l’aiguille et l’embryon dans le même plan.
    4. À l’aide de l’instrument d’injection, percez le pôle postérieur et injectez 0,001 μL du mélange dans chaque embryon.
    5. Transférer les embryons injectés dans des fioles alimentaires ; incuber à 25 °C, ~70 % d’humidité relative (RH) pour obtenir la génération P₀ (les adultes injectés qui survivent pour produire leur descendance).

5. Construction de souches d’expression stables chez Drosophila

  1. Croisez P₀ en croix avec des mouches Bc/CyO .
    1. Microinjectez un mélange d’ARNg ciblant le gène d’intérêt et la protéine Cas9 dans 300 embryons de la souche w1118 Drosophila . Après l’injection, obtenir un total de 30 adultes P0 viables et fertiles. Croisez chaque adulte P0 (mosaïque) individuellement avec des mouches de la souche w1118 , obtenant 16 croisements par paire unique (8 fioles avec des mâles P0 croisés avec des femelles vierges et 8 fioles avec des femelles P0 croisées avec des mâles). Maintenir tous les croisements à 25 °C sous des conditions de culture constante.
    2. Après l’apparition des larves F1, retirez les mouches parentales P0. Extraire l’ADN génomique de la progéniture F1 et le soumettre à une analyse PCR pour déterminer les génotypes adultes F1 (Ent2/+).
    3. Générez une progéniture F2 par croisements simples entre des mouches Bc/CyO . Sélectionnez des adultes F2 individuels et génotypés-les pour identifier les mouches avec le génotype Ent2/CyO .
    4. Intercross F3 s’élève (Ent2/CyO) pour évaluer la présence de mutants homozygotes. Si aucune mouche homozygote n’est récupérée, on croise des mouches Ent2/CyO pour une génération supplémentaire afin de déterminer davantage si le génotype homozygote est létal.
  2. Extraction d’ADN génomique par Drosophila
    1. Recueillez une ou deux mouches adultes dans un tube EP de 1,5 mL et ajoutez 110 μL de tampon d’extraction d’ADN végétal.
    2. Homogénéisez soigneusement les échantillons avec un broyeur de tissus pendant au moins 3 minutes.
    3. Incubez les homogénéats dans un bain métallique à 65 °C pendant au moins 30 minutes.
    4. Ajoutez 100 μL de chloroforme, inversez doucement le mélange pour mélanger, puis faites passer 10 secondes en vortex. Centrifugez les échantillons à 14 000 tr/min pendant 10 minutes à température ambiante.
    5. Transférez soigneusement environ 65 μL (ou plus) du surnageant dans un nouveau tube, ajoutez deux volumes d’éthanol absolu pré-refroidi (pré-incubé à 4 °C pendant au moins 10 minutes), inversez doucement pour mélanger, puis incubez à -20 °C pendant au moins 15 minutes.
    6. Centrifugez à 14 000 tr/min pendant 10 minutes à 4 °C et jetez soigneusement le surnageant.
    7. Faites sécher la pastille d’ADN à température ambiante ou dans un incubateur jusqu’à ce qu’elle soit complètement sèche, puis resuspendez-la dans un volume approprié de tampon de PB. Pour les échantillons femelles (f), ajoutez 50 μL de tampon PB, tandis que pour les échantillons mâles (m), ajoutez 15 μL.
  3. Amplification PCR et séquençage Sanger
    1. Effectuez une amplification PCR à l’aide d’amorces spécifiques destinées à contourner les régions amont et aval du site cible de l’ARNg.
    2. Purifiez les produits PCR et soumettez-les au séquençage Sanger. Analysez les chromatogrammes de séquençage à l’aide du logicielSnapGene 34 et alignez-les avec la séquence de référence de type sauvage pour une analyse comparative.
    3. Examinez les graphiques de pics près du site cible de l’ARNg pour repérer des pics qui se chevauchent indiquant des mutations d’indel. Effectuer le séparation des pics pour résoudre les signaux contradictoires et confirmer le type de mutation, y compris les insertions ou suppressions au site cible.
    4. Croisement rétrocroisé avec des mâles Bc/CyO pendant 4 générations pour établir Ent2/CyO.
      Note : Il a été observé que Ent2*/Ent2* et CyO/CyO sont mortels aux premiers stades du développement ; par conséquent, les hétérozygotes Ent2*/CyO sont maintenus.
  4. Après avoir établi les hétérozygotes Ent2*/CyO , prélever des échantillons du même lot d’hétérozygotes Ent2*/CyO au stéréomicroscope.
  5. Sélectionnez au hasard 20 mouches adultes et pesez-les à l’aide d’une balance de précision avec une résolution de 0,001 g. Photographiez les échantillons pour documenter les caractéristiques phénotypiques.

6. Caractérisation phénotypique descriptive

  1. Les 120 derniers mâles et 120 femelles (testés trois flacons pour chaque groupe, chaque fiole contenant 20 mouches) de chaque Ent2*/CyO et w1118 à 22 °C et 25 °C.
  2. Notez le nombre de décès chaque semaine et tracez les courbes de survie.
  3. Mettre en place 30 couples de reproduction aléatoires par groupe ; Permettre une accouplement de 24 heures ;
  4. Transférer les adultes dans des tubes frais ; descendants arrière.
  5. À 7 jours après l’éclosion, évaluer le succès de l’escalade (≥8 cm dans les 30 s) avec six répétitions par groupe.
  6. Toutes les observations ont été enregistrées comme des caractéristiques descriptives de la lignée mutante et n’ont pas été utilisées pour déduire la fonction génique.

7. Mesurer les activités des enzymes antioxydantes

  1. Collecter 300 mâles et 300 femelles adultes (testés trois flacons pour chaque groupe, chaque flacon contenant 100 mouches) Ent2*/CyO et w1118 mouches témoins à 5 jours après l’éclosion afin d’assurer la maturité physiologique et l’âge comparable.
  2. Transférer les mouches dans des tubes vides sans nourriture et mourir de faim pendant 2 heures pour standardiser l’état métabolique avant les tests biochimiques.
  3. Ajoutez une perle/tube en acier ; Homogénéisez à 60 Hz, 2 min.
  4. Centrifugeuse 4 °C, 161 x g, 10 min ; Récupérez le surnageant.
  5. Mesurez la dismutase totale de superoxyde (SOD, voir le tableau des matériaux pour les détails) et la catalase (CAT, voir le tableau des matériaux pour les détails) selon les instructions du kit.

8. Statistiques et analyse des données

  1. Exprimez toutes les données sous forme de moyenne ± d’erreur standard de la moyenne (figure-protocol-1± SEM).
  2. Utilisez l’ANOVA unidirectionnelle pour comparer les données d’activité enzymatique ; Appliquer une ANOVA à trois voies (facteurs : génotype, température, sexe) pour évaluer le poids du corps, la capacité d’escalade et la longueur du corps. Effectuer le test HSD de Tukey à posteriori lorsque celaest approprié 35.
  3. Définissez la signification comme P < 0,05 pour tous les tests statistiques.
  4. Analysez les données de durée de vie à l’aide de courbes de survie et effectuez le test log-rank (Mantel-Cox), qui évalue l’existence de différences significatives dans les trajectoires de survie entre les cohortesexpérimentales 36.
  5. Effectuez toutes les analyses et tracés dans le logiciel GraphPad Prism 9.5.0 en suivant les directiveslogicielles 37.
  6. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées uniquement pour la comparaison descriptive et non pour établir des relations causales.

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Résultats

Conception et analyse de vérification d’efficacité des sites ciblant le gène Ent2
Les sites cibles candidats pour le gène Ent2 ont été conçus à l’aide des plateformes CHOPCHOP et CCTop (Figure 1). Deux gRNA ciblant les régions de l’exon 2 et de l’exon 5 ont été sélectionnés en fonction de critères de spécificité et d’efficacité. Pour vérifier la réussite de l’édition du génome, l’ADN génomique d’individus sélectionnés au hasard de la lignée Ent2*/

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Discussion

L’ENT est une protéine conservée évolutivement qui influence de multiples processusbiologiques 38. Lorsqu’elle est exprimée dans les ovocytes de Xenopus laevis, Ent2 présente une activité de transport desnucléosides 8. Des études ont démontré que le mutant homozygote d’Ent2 est mortel au stade larvaire tardif, ou au début dustade nymphal 10. Dans la présente étude, un flux de travail d’édit...

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Déclarations de divulgation

Tous les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Soutenir cette recherche par le Programme de Développement des Sciences et Technologies de la province du Jilin (Projet n° 20230505044ZP).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acétate d'ammoniumSigma A1542
Kit de dosage de la catalase (méthode à lumière visible) (méthode au molybdate d'ammonium)Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA007-1-1
Dodécyl sulfateSigmaL3771
Dispositif d'injectionEppendorf FemtoJet 4i
Plasmide linéarisé : MLM3613Addgene42251
MicroscopeOLYMPUS CKX3-SLP
Kit mMESSAGE mMACHINE T7Thermo FisherAM1344
Kit de transcription mMESSAGE mMACHINE T7Thermo FisherAM1344
Enzame de restriction PmeINEB R0560S
Poly(A) polyméraseNEBM0276S
Protéase KThermo FisherEO0491
Kit RNeasy MiniQIAGEN74104
Système de production de RNA à grande échelle T7 RiboMAX ExpressPromega P1320
Kit T7 RiboMAXPromega P1320
Kit de dosage de la superoxyde dismutase totale (méthode à l'hydroxylamine)Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA001-1
w1118 Drosophila Fangjing Biology
Phénol/chloroforme saturé en eauSigmaP2069

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