Génération et caractérisation médiatisées par CRISPR/Cas9 d’une souche Ent2*/CyO de Drosophila melanogaster

Résumé

Le transporteur nucléoside équilibré 2 (ENT2) est une protéine transmembranaire conservée impliquée dans le transport des nucléosides et le métabolisme cellulaire. Dans cette étude, un flux de travail d’édition génomique basé sur CRISPR/Cas9 a été mis en place pour générer un allèle ciblé par Ent2 chez Drosophila melanogaster. Une lignée hétérozygote stable Ent2*/CyO a été construite et maintenue à l’aide d’une stratégie de chromosomie équilibreur. Ce travail décrit la conception, la génération et la validation moléculaire de la lignée mutante, ainsi que sa caractérisation phénotypique sous différentes conditions de température. Le flux de travail établi et la souche mutante offrent un cadre pratique pour étudier les gènes à phénotypes létaux homozygotes et pour étudier la variation phénotypique associée à la température chez Drosophila.

Résumé

Dans cette étude, une approche d’édition du génome basée sur CRISPR/Cas9 a été utilisée pour introduire des mutations dans le gène du transporteur nucléoside équilibré 2 (Ent2) chez Drosophila melanogaster. Des ARN-guides ciblant la région codante d’Ent2 ont été conçus et co-injectés avec l’ARNm Cas9 dans des embryons ^{w 1118}. Les allèles mutants ont été identifiés par séquençage de Sanger et maintenus comme une lignée hétérozygote stable Ent2*/CyO à l’aide d’un chromosome équilibreur. Par la suite, nous avons évalué le poids corporel, la capacité à grimper, le taux de survie et les activités de la superoxyde dismutase (SOD) et de la catalase (CAT) chez les mouches à fruits à 22 °C et 25 °C, respectivement. Les résultats indiquent qu’à 22 °C et 25 °C, la longueur corporelle et le poids des mouches à fruits Ent2*/CyO ont été significativement réduits par rapport à la w¹¹¹⁸, et leur développement a été retardé. À 22 °C, la durée de vie globale des mouches Ent2*/CyO était légèrement plus longue que celle du W¹¹¹⁸, tandis qu’à 25 °C, aucune différence significative n’a été observée. Concernant la capacité locomotrice, la performance de montée des mouches hétérozygotes était significativement inférieure à celle du W¹¹¹⁸ à ces deux températures, les mâles étant plus gravement affectés. De plus, les activités enzymatiques antioxydantes de la CAT et de la SOD chez les mouches Ent2*/CyO ont été significativement réduites, indiquant une altération claire de la capacité antioxydante. Ces résultats décrivent le profil phénotypique d’une lignée mutante Ent2 générée par CRISPR et démontrent la faisabilité de combiner l’édition génomique avec des stratégies de chromosomes équilibreurs chez Drosophila. Cette étude fournit un cadre méthodologique et une ressource génétique pour les futures recherches sur les gènes associés au métabolisme et aux réponses environnementales.

Introduction

Drosophila melanogaster reste l’un des organismes modèles les plus utilisés en génétique et biologie^{du développement.} Elle se caractérise par un cycle de vie court, une reproduction rapide, des outils de manipulation génétique bien établis et un génome entièrement^{annoté 2,3}. Cette espèce est largement appliquée dans des études sur la fonction génique, la régulation métabolique et l’adaptabilité environnementale ^4,5. Les nucléosides et leurs dérivés tels que l’ATP sont essentiels à la génération d’énergie cellulaire, à la synthèse des acides nucléiques et à la transduction du signal chez Drosophila, reflétant une régulation métabolique conservée à travers les^{métazoaires 6}. Les voies de signalisation purinergiques chez Drosophila, qui dépendent des mécanismes de transport extracellulaire de l’adénosine et des nucléosides, mettent en lumière le rôle fonctionnel du mouvement des nucléosides à travers les membranes dans la coordination des réponses d’énergie et de transduction^{du signal 7}. Parmi ces processus, le transport des nucléosides à travers la membrane cytoplasmique est principalement médié par la famille des transporteurs nucléosides équilibrés (ENT), DmENT2 présentant une activité de transport fonctionnel chez Drosophila⁸.

La famille ENT comprend plusieurs sous-types, parmi lesquels ENT2 est un transporteur nucléoside^{transmembranaire 9} largement étudié. Il facilite le transport transmembranaire indépendant de l’énergie de divers nucléosides de purine et^{pyrimidine 10,11}. Chez les mammifères, ENT2 est un transporteur bidirectionnel omniprésent qui facilite l’absorption cellulaire des nucléosides et nucléobases de purine et pyrimidine. Cette activité de transport contribue au sauvetage des nucléotides et aide à maintenir l’homéostasie métabolique^{cellulaire 12}. ENT2 assure également l’intermédiaire du transport de divers médicaments dérivés des nucléosidiques, étendant sa pertinence fonctionnelle au-delà du mouvement des nucléosidiques endogènes, mettant en lumière son importance physiologique et clinique plus^{large 13}. De plus, ENT2 a été impliquée dans des troubles^{neurologiques 14}, le métabolisme^{tumoral 15}, le dysfonctionnement vasculaire¹⁶ et le métabolisme énergétique cellulaire chez^{l’humain 17}. Cependant, les études portant sur les rôles au niveau de l’organisme Ent2 chez Drosophila restent limitées.

Les rôles de l’ENT2 dans la croissance et le développement, le métabolisme énergétique, la performance locomotrice et la capacité antioxydante dans des conditions de température variables n’ont pas été pleinement^{explorés 18}. La température influence fortement le métabolisme basal et la durée de vie chez Drosophila, les températures d’élevage plus élevées augmentant généralement l’activité métabolique et réduisant la^{longévité 19}. Ces changements dépendants de la température dans l’expression génique peuvent influencer les voies physiologiques et ainsi modifier les effets phénotypiques de mutations génétiques^{spécifiques 20}.

La protéine 9 associée à répétitions palindromiques courtes régulièrement interespacées régulièrement interespacées (CRISPR/Cas9) a été largement utilisée chez Drosophila pour diverses opérations de modification génomique telles que l’élimination, la délétion, le remplacement et l’introduction de balises spécifiques au site, démontrant son efficacité et sa fiabilité 21,22,23. Les derniers progrès indiquent que les éditeurs de bases dérivés de CRISPR peuvent également être utilisés pour des modifications de base spécifiques au site plus fines chez Drosophila, fournissant un nouvel outil pour les mutations ponctuelles et un contrôle phénotypique^{précis 24}. Les méthodes traditionnelles de mutagenèse, y compris la mutagenèse chimique et par radiation ainsi que les criblages médiés par transposons, peuvent générer des mutations^{génétiques 25}. Ces approches sont souvent limitées par une faible efficacité et un fort aléatoire dans les événements de mutation. En conséquence, les chercheurs doivent dépister un grand nombre d’individus afin d’isoler des allèles spécifiques^{d’intérêt 26}. CRISPR/Cas9 permet un clivage dirigé par l’ARN-guide programmé (gRNA) à des séquences d’ADN spécifiées. Les ruptures de double brin résultantes sont réparées par une jonction non homologue ou une réparation dirigée par l’homologie, générant des mutations définies et héréditaires et réduisant significativement les mutations de fond pouvant perturber l’analyse phénotypique^27,28. Les allèles mutants générés via CRISPR/Cas9 peuvent être maintenus dans un état hétérozygote par liaison avec des chromosomes équilibreurs, tels que Curly O (CyO)²⁹. Cette stratégie a démontré qu’elle empêche efficacement la perte des allèles létaux sous forme homozygote dans la génétique de Drosophila. En conséquence, il soutient une évaluation phénotypique systématique et à long terme, incluant des études fonctionnelles sous des températures ou conditions environnementales variables^29,30. La conception simple et la grande efficacité de CRISPR/Cas9 ont considérablement raccourci le cycle de construction de la souche et amélioré la stabilité du fond génétique. Cela est particulièrement important pour étudier les facteurs environnementaux à long terme tels que la réponse à la température et l’homéostasie développementale.

Sur cette base, le gène Ent2 chez Drosophila melanogaster a été éliminé à l’aide du système CRISPR/Cas9, et une souche mutante hétérozygote Ent2*/CyO de manière stable a été établie. Le cycle de développement, le poids corporel, la capacité locomotrice et les activités des enzymes antioxydantes SOD et CAT ont été évalués de manière systématique. En comparant les phénotypes multidimensionnels de w¹¹¹⁸ et de mouches mutantes sous des conditions de température variables, cette étude vise à présenter une stratégie reproductible pour générer et maintenir des lignées mutantes dérivées de CRISPR et à fournir une caractérisation descriptive des phénotypes résultants. Ce travail offre un cadre méthodologique et une ressource génétique utile pour de futures études sur les gènes impliqués dans le métabolisme et les réponses environnementales.

Protocole

1. Conception des cibles CRISPR/Cas9 pour le gène Ent2

1. Sélectionnez les sites CRISPR candidats dans les exons 2 et 5 d’Ent2 (ID FlyBase : FBgn0263916) en utilisant CHOPCHOP (v3)³¹ et le CCTop (v1.0)³².
2. Le génome de référence a été défini comme Drosophila melanogaster Release 6 (dm6) (Acquisition d’assemblage RefSeq : GCF_000001215.4). Ensuite, des sites candidats à gRNA ont été identifiés. Enfin, les sites identifiés ont été filtrés pour obtenir les gRNA optimaux.
3. Filtrez les cibles par score de spécificité MIT ≥ 80 (CHOPCHOP), score CFD ≤ 0,1 (CCTop), contenu GC 40 % à 60 %, et distance PAM minimale.
4. Classez les cibles avec un score pondéré (efficacité 50 %, spécificité 30 %, optimisation GC 20 %) et choisissez deux gRNA.
5. Ajoutez un « G » à l’extrémité 5′ de chaque gRNA pour satisfaire à l’exigence de promoteur T7. Utilisez les oligonucléotides avant-agrégés spécifiques à l’ARNg suivants pour générer le modèle de transcription sgRNA de longueur complète par PCR :
   Ent2-sg1-F : TAATACGACTCACTAT
   AGGTGACGTTAAATCCATCGTTTTTTAGAGCTAGAAATAGC
   Ent2-sg2-F : TAATACGACTCAC
   TATATTGCCGTTGGAATCATGGGGTTTAGAGCTAGAAATAGC
6. La séquence restante de l’échafaudage d’ARNsg est fournie par l’oligonucléotide inverse universel lors de la PCR.

2. Préparation de modèles de transcription d’ARNsgs

1. Préparation de modèles de transcription d’ARNsgs
   1. Assembler un mélange de réaction PCR de 60 μL en utilisant la méthode de recuit à double oligonucléotide³³ selon les instructions du fabricant. Combinez l’oligonucléotide direct spécifique à l’ARNg (Ent2-sg1-F ou Ent2-sg2-F) avec un oligonucléotide inverse universel codant pour l’échafaudage sgRNA afin d’obtenir le gabarit dsDNA complet pour la transcription in vitro.
   2. Programme le thermocycleur : 95 °C 3 min ; 35 cycles de 95 °C 30 s, 55 °C 30 s, 72 °C 20 s ; puis 72 °C pendant 10 minutes ; Maintenez à 12 °C.
2. Purifier le modèle de transcription
   1. Ajouter 100 μL d’acétate d’ammonium (voir Tableau des matériaux) à un produit PCR de 60 μL ; mélanger. Ajouter 400 μL d’éthanol anhydre ; inversez pour mélanger et incubez à -20 °C pendant 20 minutes.
   2. Centrifugeuse à 4 °C, 20 000 x g pendant 15 minutes ; Jetez le surnageant.
   3. Faites sécher le pellet à l’air avec le tube ouvert pendant 10 minutes. Resuspendez le pellet dans 10 μL de ddH₂O sans nucléase.
3. Transcription in vitro de gRNA
   1. Mettez en place une réaction de transcription in vitro de T7 de 10 μL en suivant les instructions du kit (voir tableau des matériaux).
   2. Incubez à 37 °C pendant 35 minutes. Ajoutez 0,5 μL de DNase I (fournie dans le kit de transcription) et éclovez à 37 °C pendant 15 minutes.
4. Purifier le gRNA
   1. Diluez le mélange de transcription à 60 μL avec du ddH₂O sans nucléase. Ajoutez 60 μL de phénol/chloroforme saturé en eau (voir Tableau des matériaux) ; Vortex brièvement et centrifugeuse à 4 °C, 16 000 x g pendant 5 minutes.
   2. Transférer 45 μL de la phase aqueuse dans un nouveau tube sans RNase de 1,5 mL. Ajouter 5 μL d’acétate de sodium ; mélange.
   3. Ajouter 125 μL d’éthanol anhydre prérefroidi ; mélanger et incuber à -20 °C pendant 20 à 30 minutes. Centrifugeuse à 4 °C, 20 000 x g pendant 15 minutes ; Jetez le surnageant.
   4. Lavez le pellet avec 200 μL d’éthanol à 70 % (sans RNase) ; centrifugeuse à 4 °C, 20 000 x g pendant 5 minutes ; Retirez le surnageant.
   5. Séchez le pellet à 37 °C jusqu’à ce que l’éthanol s’évapore complètement. Resuspendre en 20 μL ddH₂O ; aliquote et conserver à -80 °C.
   6. Mesurez la concentration d’ARNg à l’aide d’un spectrophotomètre NanoDrop et ajustez la concentration à 250 ng/μL pour l’injection. Assurez-vous de la pureté du gRNA avec un ratio A260/A280 d’environ 2,0.
      REMARQUE : Nous insistons sur le fait que les gants doivent être portés tout au long du processus pour la protection de la RNase. Tous les consommables, y compris les tubes centrifugeuses et embouts de pipette pré-refroidis sans RNase, doivent être utilisés de manière constante pendant la procédure. Les déchets réactifs organiques générés pendant l’opération doivent être collectés séparément dans des conteneurs désignés selon leur type et régulièrement transportés vers un centre certifié d’élimination des déchets dangereux pour une manipulation appropriée.

3. Préparation de l’ARNm Cas9

1. Préparation du modèle de transcription
   REMARQUE : Utilisez des pointes et des tubes sans RNase lors des étapes liées à l’ARN.
   1. Dégeler le plasmide d’expression Cas9 MLM3613 (voir Tableau des matériaux) sur la glace. Dans un tube sans RNase, combinez 20 μg d’ADN plasmidique, 7,5 μL de tampon de restriction 10x, 1 μL de PmeI (10 000 U/mL) et de ddH₂O sans nucléase à 75 μL.
   2. Incubez à 37 °C pendant 30 minutes. Vérifiez la linéarisation complète en chargeant 5 μL sur un gel d’agarose à 1 % à 120 V pendant 30 minutes.
2. Purification des modèles de transcription
   1. Ajoutez 23 μL de dodécylsulfate de sodium à 2 % (SDS, voir Tableau des matériaux pour plus de détails) et 0,5 μL de protéinase K (voir Tableau des matériaux pour les détails) à 70 μL de la digestion ; Incubez à 50 °C pendant 30 minutes.
   2. Ajouter 45 μL de chloroforme et 45 μL de phénol trisaturé ; Vortex brièvement ; centrifugeuse 13 800 x g, 5 min.
   3. Transférer une phase aqueuse de 90 μL dans un nouveau tube. Ajouter 10 μL d’acétate de sodium (fourni par le kit) et 200 μL d’éthanol anhydre pré-refroidi ; Mix ; incuber −20 °C, 30 min.
   4. Centrifugeuse 20 000 x g, 4 °C, 15 min ; Jetez le surnageant. Lavez la pellete deux fois avec 100 μL d’éthanol à 70 % ; centrifugeuse 20 000 x g, 2 min chacun ; Séchage à l’air.
   5. L’ADN dissous dans 20 μL de ddH₂O sans nucléase ; Confirmez >500 ng/μL.
3. Transcription in vitro avec co-caping
   1. Configurez la réaction à l’aide d’un kit de transcription in vitro T7 avec un capuchon (voir Tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant.
   2. Incubez à 37 °C pendant 2 heures pour générer un ARNm Cas9 plafonné.
   3. Après la réaction de transcription, ajoutez 1 μL de DNase (fourni dans le kit, concentration 2 U/μL), mélangez soigneusement, puis incubez à 37°C pendant 15 minutes pour dégrader le modèle d’ADN.
4. Ajoutez une queue poly(A)
   1. Amenez l’ARN à 14 μL de ddH₂O.
   2. Ajouter 2 μL de tampon poly(A) poly(A) poly(A) d’E . coli, 2 μL d’ATP (10 mM), 1 μL inhibiteur de RNase et 1 μL de poly(A) poly(A) polymémérase.
   3. Incubez à 37 °C pendant 45 minutes.
5. Purifier l’ARNm
   1. Appliquez la réaction à un kit d’ARN total à colonne de spin (voir Tableau des matériaux). Chargez l’échantillon sur une membrane de silice de 2 mL ; centrifugeuse 8 000 x g, 15 s ; rejeter le flux direct.
   2. Ajoutez 500 μL de tampon RPE à la colonne RNeasy, centrifugez à 8000 x g pendant 15 s, puis jetez le liquide résiduel. Répétez cette étape une fois, puis centrifugez pendant 2 minutes et jetez le liquide résiduel.
   3. Placez la colonne RNeasy dans un nouveau tube centrifugeuse de 1,5 mL. Ajoutez 30 μL de ddH₂O sans RNase, centrifugez à 8000 x g pendant 1 minute pour éluer l’ARN. Ajustez la concentration d’ARNm à 500 ng/μL pour l’injection. Stockez l’ARN élué à -80 °C.

4. Microinjection d’embryons de Drosophila

1. Préparation des échantillons d’injection
   1. Mélangez 15 μg d’ARNm Cas9 avec 7,5 μg d’ARNg double brin à un rapport de volume de 2:1.
   2. Ajustez à 30 μL avec de l’eau sans RNase traitée à DEPC ; Reste sur la glace.
2. Élevage de Drosophila
   1. Transférez la souche injectée de Drosophila w¹¹¹⁸ dans de grands tubes alimentaires pour amplification. Des mouches W¹¹¹⁸ ont été utilisées comme témoins de référence pour représenter l’état physiologique de base sans effets associés à l’équilibreur.
   2. Maintenez les mouches dans une chambre climatique artificielle réglée à 25 °C avec une humidité de 60 % à 70 % et un cycle clair-obscur de 12:12 pendant 14 jours.
   3. À 17h00 le lendemain de la période d’élevage de 14 jours (jour 15), on collecte les mouches adultes pour synchroniser la ponte chronométrée des embryons. Ce délai précis de collecte garantit que les embryons utilisés pour l’injection sont à un stade de développement constant. Contrôler l’heure de la journée est important pour minimiser les effets du rythme circadien sur le développement embryonnaire et le comportement reproductif, assurant ainsi la reproductibilité expérimentale et réduisant la variabilité physiologique entre les lots.
3. Microinjection de Drosophila
   1. Recueillez les mouches adultes pour les injecter dans des cages à mouches, avec environ 400 adultes par cage. Collecter les embryons sur des plaques d’agar recouvertes de levure ; Recueillez les embryons dans les 60 minutes suivant la ponte et rincez-les sur les manteaux de recouverture. Aucune déchorionation n’a été réalisée avant l’injection.
   2. Alignez les embryons sur des couvertures avec leurs pôles postérieurs orientés vers l’extérieur, disposés de manière ordonnée de haut en bas. Assurez-vous que l’aiguille d’injection pénètre le pôle postérieur à une profondeur appropriée (environ un cinquième de la longueur de l’embryon) pour une livraison cytoplasmique cohérente. Un total de 300 embryons ont été utilisés dans cette étude.
   3. Sous un stéréomicroscope, concentrez la pointe de l’aiguille et l’embryon dans le même plan.
   4. À l’aide de l’instrument d’injection, percez le pôle postérieur et injectez 0,001 μL du mélange dans chaque embryon.
   5. Transférer les embryons injectés dans des fioles alimentaires ; incuber à 25 °C, ~70 % d’humidité relative (RH) pour obtenir la génération P₀ (les adultes injectés qui survivent pour produire leur descendance).

5. Construction de souches d’expression stables chez Drosophila

1. Croisez P₀ en croix avec des mouches Bc/CyO .
   1. Microinjectez un mélange d’ARNg ciblant le gène d’intérêt et la protéine Cas9 dans 300 embryons de la souche w1118 Drosophila . Après l’injection, obtenir un total de 30 adultes P0 viables et fertiles. Croisez chaque adulte P0 (mosaïque) individuellement avec des mouches de la souche w1118 , obtenant 16 croisements par paire unique (8 fioles avec des mâles P0 croisés avec des femelles vierges et 8 fioles avec des femelles P0 croisées avec des mâles). Maintenir tous les croisements à 25 °C sous des conditions de culture constante.
   2. Après l’apparition des larves F1, retirez les mouches parentales P0. Extraire l’ADN génomique de la progéniture F1 et le soumettre à une analyse PCR pour déterminer les génotypes adultes F1 (Ent2/+).
   3. Générez une progéniture F2 par croisements simples entre des mouches Bc/CyO . Sélectionnez des adultes F2 individuels et génotypés-les pour identifier les mouches avec le génotype Ent2/CyO .
   4. Intercross F3 s’élève (Ent2/CyO) pour évaluer la présence de mutants homozygotes. Si aucune mouche homozygote n’est récupérée, on croise des mouches Ent2/CyO pour une génération supplémentaire afin de déterminer davantage si le génotype homozygote est létal.
2. Extraction d’ADN génomique par Drosophila
   1. Recueillez une ou deux mouches adultes dans un tube EP de 1,5 mL et ajoutez 110 μL de tampon d’extraction d’ADN végétal.
   2. Homogénéisez soigneusement les échantillons avec un broyeur de tissus pendant au moins 3 minutes.
   3. Incubez les homogénéats dans un bain métallique à 65 °C pendant au moins 30 minutes.
   4. Ajoutez 100 μL de chloroforme, inversez doucement le mélange pour mélanger, puis faites passer 10 secondes en vortex. Centrifugez les échantillons à 14 000 tr/min pendant 10 minutes à température ambiante.
   5. Transférez soigneusement environ 65 μL (ou plus) du surnageant dans un nouveau tube, ajoutez deux volumes d’éthanol absolu pré-refroidi (pré-incubé à 4 °C pendant au moins 10 minutes), inversez doucement pour mélanger, puis incubez à -20 °C pendant au moins 15 minutes.
   6. Centrifugez à 14 000 tr/min pendant 10 minutes à 4 °C et jetez soigneusement le surnageant.
   7. Faites sécher la pastille d’ADN à température ambiante ou dans un incubateur jusqu’à ce qu’elle soit complètement sèche, puis resuspendez-la dans un volume approprié de tampon de PB. Pour les échantillons femelles (f), ajoutez 50 μL de tampon PB, tandis que pour les échantillons mâles (m), ajoutez 15 μL.
3. Amplification PCR et séquençage Sanger
   1. Effectuez une amplification PCR à l’aide d’amorces spécifiques destinées à contourner les régions amont et aval du site cible de l’ARNg.
   2. Purifiez les produits PCR et soumettez-les au séquençage Sanger. Analysez les chromatogrammes de séquençage à l’aide du logiciel^{SnapGene 34} et alignez-les avec la séquence de référence de type sauvage pour une analyse comparative.
   3. Examinez les graphiques de pics près du site cible de l’ARNg pour repérer des pics qui se chevauchent indiquant des mutations d’indel. Effectuer le séparation des pics pour résoudre les signaux contradictoires et confirmer le type de mutation, y compris les insertions ou suppressions au site cible.
   4. Croisement rétrocroisé avec des mâles Bc/CyO pendant 4 générations pour établir Ent2/CyO.
      Note : Il a été observé que Ent2*/Ent2* et CyO/CyO sont mortels aux premiers stades du développement ; par conséquent, les hétérozygotes Ent2*/CyO sont maintenus.
4. Après avoir établi les hétérozygotes Ent2*/CyO , prélever des échantillons du même lot d’hétérozygotes Ent2*/CyO au stéréomicroscope.
5. Sélectionnez au hasard 20 mouches adultes et pesez-les à l’aide d’une balance de précision avec une résolution de 0,001 g. Photographiez les échantillons pour documenter les caractéristiques phénotypiques.

6. Caractérisation phénotypique descriptive

1. Les 120 derniers mâles et 120 femelles (testés trois flacons pour chaque groupe, chaque fiole contenant 20 mouches) de chaque Ent2*/CyO et w¹¹¹⁸ à 22 °C et 25 °C.
2. Notez le nombre de décès chaque semaine et tracez les courbes de survie.
3. Mettre en place 30 couples de reproduction aléatoires par groupe ; Permettre une accouplement de 24 heures ;
4. Transférer les adultes dans des tubes frais ; descendants arrière.
5. À 7 jours après l’éclosion, évaluer le succès de l’escalade (≥8 cm dans les 30 s) avec six répétitions par groupe.
6. Toutes les observations ont été enregistrées comme des caractéristiques descriptives de la lignée mutante et n’ont pas été utilisées pour déduire la fonction génique.

7. Mesurer les activités des enzymes antioxydantes

1. Collecter 300 mâles et 300 femelles adultes (testés trois flacons pour chaque groupe, chaque flacon contenant 100 mouches) Ent2*/CyO et w¹¹¹⁸ mouches témoins à 5 jours après l’éclosion afin d’assurer la maturité physiologique et l’âge comparable.
2. Transférer les mouches dans des tubes vides sans nourriture et mourir de faim pendant 2 heures pour standardiser l’état métabolique avant les tests biochimiques.
3. Ajoutez une perle/tube en acier ; Homogénéisez à 60 Hz, 2 min.
4. Centrifugeuse 4 °C, 161 x g, 10 min ; Récupérez le surnageant.
5. Mesurez la dismutase totale de superoxyde (SOD, voir le tableau des matériaux pour les détails) et la catalase (CAT, voir le tableau des matériaux pour les détails) selon les instructions du kit.

8. Statistiques et analyse des données

1. Exprimez toutes les données sous forme de moyenne ± d’erreur standard de la moyenne (± SEM).
2. Utilisez l’ANOVA unidirectionnelle pour comparer les données d’activité enzymatique ; Appliquer une ANOVA à trois voies (facteurs : génotype, température, sexe) pour évaluer le poids du corps, la capacité d’escalade et la longueur du corps. Effectuer le test HSD de Tukey à posteriori lorsque cela^{est approprié 35}.
3. Définissez la signification comme P < 0,05 pour tous les tests statistiques.
4. Analysez les données de durée de vie à l’aide de courbes de survie et effectuez le test log-rank (Mantel-Cox), qui évalue l’existence de différences significatives dans les trajectoires de survie entre les cohortes^{expérimentales 36}.
5. Effectuez toutes les analyses et tracés dans le logiciel GraphPad Prism 9.5.0 en suivant les directives^{logicielles 37}.
6. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées uniquement pour la comparaison descriptive et non pour établir des relations causales.

Résultats

Conception et analyse de vérification d’efficacité des sites ciblant le gène Ent2
Les sites cibles candidats pour le gène Ent2 ont été conçus à l’aide des plateformes CHOPCHOP et CCTop (Figure 1). Deux gRNA ciblant les régions de l’exon 2 et de l’exon 5 ont été sélectionnés en fonction de critères de spécificité et d’efficacité. Pour vérifier la réussite de l’édition du génome, l’ADN génomique d’individus sélectionnés au hasard de la lignée Ent2*/CyO établie a été amplifié et soumis au séquençage de Sanger. Les chromatogrammes de séquençage ont montré des pics chevauchés à partir du site cible, compatibles avec des mutations d’insertion/délétion (indel). Une analyse de séquence plus poussée a révélé des mutations de décalage de cadre menant à des codons d’arrêt prématurés (Figure 2). Ces résultats confirment que le système CRISPR/Cas9 a introduit avec succès des mutations au locus Ent2 ciblé et démontrent la faisabilité du flux de travail d’édition du génome.

Figure 1. Le schéma du site d’élimination du gène Ent2 et l’emplacement de l’amorce de détection dans le génome. Ce schéma illustre la structure génomique du locus Ent2, en mettant en évidence les codons CDS (vert), de démarrage et d’arrêt (rouge), le motif PAM de gRNA (gris), la séquence cible de gRNA (bleu) et la séquence d’amorce d’amplification de gRNA (jaune). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2. Le graphique maximal du séquençage des résultats de la descendance de Drosophila d’Ent2*/CyO auto-consanguine en lignée stable. Chromatogramme de séquençage confirmant le génotype de la descendance obtenue par auto-croisement de la lignée stable Ent2*/CyO hétérozygote. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Observations morphologiques descriptives de la raie Ent2/CyO
Nous avons observé les différences de forme corporelle entre les deux génotypes de mouches à fruits selon les sexes dans des conditions de 22 °C et 25 °C à l’aide d’un stéréomicroscopie (Figure 3). Dans les deux conditions de température, les mouches des fruits mâles et femelles présentaient une forme corporelle typique en forme de « long fuseau ». Les abdomens des femelles étaient larges et en forme de fuseau, avec des extrémités des ailes légèrement dépassant la pointe abdominale. La jonction thorax–abdomen chez les mâles était clairement définie, et la pigmentation foncée à l’extrémité de l’abdomen — une caractéristique distinctive chez les mâles — était visible. Les ailes des mouches w¹¹¹⁸ des deux sexes étaient transparentes avec des veines clairement définies, et aucune courbure du bord des ailes ni rupture de veine n’a été observée. En revanche, les hétérozygotes Ent2*/CyO présentaient une courbure notable de la base de l’aile et une courbure des bords de l’aile. À 22 °C, quel que soit le sexe, la longueur corporelle des mouches à fruits était significativement supérieure à celle du même génotype, soit 25 °C. De plus, la longueur corporelle des femelles était significativement supérieure à celle des mâles à la même température. De plus, à 22 °C et 25 °C, la taille corporelle des hétérozygotes Ent2*/CyO était plus petite que celle des mouches w¹¹¹⁸ correspondantes. Pour étudier la base morphologique, nous avons simultanément mesuré la longueur du corps des mouches (Figure 3E, Tableau 1). Une ANOVA à trois voies a révélé des effets principaux significatifs du génotype (F(1,16)=230,1, P<0,0001), de la température (F(1,16)=19,50, P=0,0004) et du sexe (F(1,16)=166,9, P<0,0001). Une interaction génotype x sexe significative (F(1,16)=14,96, P=0,0014) et une interaction à trois (génotype x température x sexe significative) ont également été observées.

Figure 3. La morphologie témoin des adultes w¹¹¹⁸ et Ent2*/CyO . Images représentatives montrant les caractéristiques de posture de la Drosophila féminine (A, C) et masculine (B, D) à 22 °C et 25 °C, ainsi qu’une comparaison quantitative de la longueur du corps (E). ** P < 0,01. Barre d’échelle : 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Analyse de survie sous différentes conditions de température
Nous avons analysé statistiquement les courbes de survie des hétérozygotes Ent2*/CyO et de^{W 1118} mouches à 22 °C et 25 °C (Figure 4). Les résultats ont montré que la courbe de survie des femelles hétérozygotes Ent2*/CyO était la plus élevée, avec deux individus encore vivants à la 14e semaine. Toutes ^{les 1118} femmes sont décédées avant la 14e semaine. Tous les mâles hétérozygotes Ent2*/CyO sont morts à la 12e semaine, tandis que tous les^{hommes à 1118} sont morts à la 11e semaine. Ces résultats indiquent qu’à 22 °C, l’espérance de vie globale des femelles est plus longue que celle des mâles, et au sein du même sexe, la capacité de survie des hétérozygotes Ent2*/CyO est légèrement plus forte que celle du type w¹¹¹⁸.

Sous des conditions de 25 °C, la période de survie globale a été considérablement raccourcie. Les courbes de survie de w¹¹¹⁸ femelles et des mâles hétérozygotes Ent2*/CyO sont tombées à zéro à la 10e semaine. Les courbes de survie des femelles hétérozygotes Ent2*/CyO et de ^{W 1118} mâles ont diminué à 1 à 2 individus à la 8e semaine et ont atteint zéro à la 9e semaine. La différence entre le mutant et W¹¹¹⁸ n’était pas statistiquement significative (P > 0,05). Ces observations décrivent les caractéristiques de survie de la lignée mutante dans différentes conditions environnementales.

Figure 4. Courbes de survie de Drosophila sous différentes conditions de température. Analyse de survie comparant la durée de vie des mouches Ent2*/CyO et W¹¹¹⁸ à 22 °C et 25 °C. n=3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Évaluation de l’activité locomotrice
Les capacités d’escalade des mouches à fruits w¹¹¹⁸ et Ent2*/CyO ont été comparées sous deux conditions de température : 22 °C et 25 °C (Figure 5, Tableau 2). Les résultats montrent qu’à 22 °C (Figure 5A), 98,15 % des ¹¹¹⁸ femmes ont réussi à grimper de plus de 8 cm en 30 s, tandis que cette proportion est tombée à 89,74 % chez les femelles hétérozygotes Ent2*/CyO (P < 0,05). Tous les¹¹¹⁸ mâles ont pu grimper plus de 8 cm, tandis que le taux de réussite chez les mâles hétérozygotes Ent2*/CyO était de 98,14 % (P < 0,05). À 25 °C (Figure 5B), toutes ^{les 1118} femelles (100 %) ont grimpé de plus de 8 cm en 30 s, mais cette proportion a diminué à 91,31 % chez les femelles hétérozygotes Ent2*/CyO (P < 0,05). Parmi ^{les hommes W 1118}, 77,28 % ont réussi à grimper de plus de 8 cm (P < 0,01), tandis que seulement 63,57 % des hommes hétérozygotes Ent2*/CyO ont atteint cette mesure (P < 0,01). Pour évaluer davantage les performances locomotrices, la proportion de mouches grimpant au-delà de 15 cm a été analysée (Figure 5C). Une ANOVA à trois voies a révélé des effets principaux très significatifs du sexe (F(1,16) = 201,7, P < 0,0001) et de la température d’élevage (F(1,16) = 72,60, P < 0,0001) sur la performance en escalade. Cependant, l’effet principal du génotype n’était pas significatif (F(1,16) = 0,59, P = 0,4545). Ces résultats indiquent que la performance locomotrice varie selon les conditions expérimentales et peut différer entre groupes selon le contexte.

Figure 5. Comparaison de la capacité d’escalade de Drosophila à différentes températures. Quantification des performances en escalade à 22 °C (A) et 25 °C (B) ainsi que statistiques pour les individus avec une distance d’escalade > 15 cm (C). ** P < 0,01. n=3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Mesure du poids corporel
Le poids corporel a été mesuré chez W ¹¹¹⁸ et Ent2*/CyO hétérozygotes à 22 °C et 25 °C (Figure 6). Nos résultats montrent que, comparé à ^{w 1118} mouches, le poids des hétérozygotes Ent2*/CyO a été significativement réduit à la fois à 22 °C et 25 °C (P < 0,05 ou P < 0,01). Nous avons observé que le poids des mouches mâles w¹¹¹⁸ était significativement inférieur à celui des mouches femelles w¹¹¹⁸ (P < 0,01). De même, le poids des hétérozygotes Ent2*/CyO masculins était significativement inférieur à celui des hétérozygotes Ent2*/CyO féminines (P < 0,01). Nous avons réalisé une ANOVA à trois voies pour évaluer les effets indépendants et interactifs du génotype, de la température d’élevage et du sexe sur le poids corporel chez Drosophila. L’analyse a montré des effets principaux significatifs du génotype (F(1,16) = 32,38, P < 0,0001), de la température (F(1,16) = 23,31, P = 0,0002) et du sexe (F(1,16) = 25,52, P = 0,0001) (Figure 6 ; Tableau 3). De plus, il y avait une interaction bidirectionnelle significative entre la température et le sexe (F(1,16) = 24,76, P = 0,0001), indiquant que l’effet de la température sur le poids corporel différait selon le sexe. Cependant, aucune interaction significative n’a été trouvée entre le génotype et la température (F(1,16) = 0,40, P = 0,538), le génotype et le sexe (F(1,16) = 1,31, P = 0,269), ni l’interaction à trois (génotype x température x sexe : F(1,16) = 0,48, P = 0,497), suggérant que la réponse des mutants Ent2*/CyO à la température et au sexe était similaire à celle du type sauvage.

Compte tenu de la température significative × interaction sexuelle, nous avons réalisé une analyse des effets simples pour clarifier son schéma spécifique. Les résultats ont montré que, chez les femelles, les individus élevés à 22 °C avaient un poids corporel significativement plus élevé que ceux élevés à 25 °C (P = 0,00¹²) ; cependant, chez les hommes, il n’y avait pas de différence significative de poids corporel entre les deux températures (P > 0,9999). Cela indique que la baisse de la température de 25 à 22 °C augmentait spécifiquement le poids corporel des mouches femelles, sans effet significatif sur les mâles.

Bien qu’il n’y ait pas eu d’interactions significatives entre le génotype et d’autres facteurs, l’effet principal fort du génotype indiquait que les mutants Ent2*/CyO avaient généralement un poids corporel inférieur dans toutes les conditions comparé au type sauvage. Des comparaisons post-hoc ont également révélé qu’à 22 °C, les femelles de type sauvage (f¹¹¹⁸:22 °C Femelles) avaient un poids corporel significativement plus élevé que tous les groupes mutants (P < 0,0001), et à la même température, les deux génotypes présentaient un dimorphisme sexuel significatif (femelles > mâles, P < 0,01). À 25 °C, la différence de poids corporel entre le type sauvage et les mutants montrait une tendance similaire mais n’atteignait pas de signification statistique. Ces résultats décrivent les caractéristiques de poids corporel de la lignée mutante dans différentes conditions environnementales et biologiques.

Figure 6. Comparaison du poids corporel chez Drosophila à différentes températures. Mesures de poids corporel à 22 °C et 25 °C. ^ns P > 0,05, * P < 0,05, ** P < 0,01. n=3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Activité enzymatique antioxydante
Les activités enzymatiques antioxydantes de w¹¹¹⁸ et Ent2*/CyO hétérozygote Drosophila ont été comparées à 25 °C (Figure 7). Nos résultats ont montré que, comparés à w¹¹¹⁸ mouches, les hétérozygotes Ent2*/CyO mâles et femelles présentaient des activités significativement réduites de la catalase (CAT) et de la dismutase superoxyde (SOD) (P < 0,01). Nous avons également constaté que les activités de CAT et SOD chez W¹¹¹⁸ mâles étaient significativement plus élevées que chez W¹¹¹⁸ femelles (P < 0,05 ou P < 0,01). De même, les activités enzymatiques antioxydantes chez les hommes hétérozygotes Ent2*/CyO étaient significativement plus élevées que chez les femmes hétérozygotes Ent2*/CyO (P < 0,01).

Figure 7. La comparaison de la capacité antioxydante de Drosophila à la température d’alimentation optimale. Des essais d’activité enzymatique montrant l’activité CAT (A) et SOD (B) chez les mouches Ent2/CyO comparées à W¹¹¹⁸ en mouches. * P < 0,05, ** P < 0,01. n=3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

	SS	DF	MS	F (DFn, DFd)	Valeur p
Génotype	0.8026	1	0.8026	F (1, 16) = 230,1	P<0,0001
Température	0.06803	1	0.06803	F (1, 16) = 19,50	P=0,0004
Genre	0.5822	1	0.5822	F (1, 16) = 166,9	P<0,0001
Température du génotype x	0.005798	1	0.005798	F (1, 16) = 1,662	P=0,2156
Génotype x Genre	0.05218	1	0.05218	F (1, 16) = 14,96	P=0,0014
Température x Sexe	0.01323	1	0.01323	F (1, 16) = 3,793	P=0,0692
Génotype x Température x Sexe	0.02173	1	0.02173	F (1, 16) = 6,231	P=0,0239
Résiduel	0.05581	16	0.003488

Tableau 1 : Analyse de la variance des mesures de longueur corporelle chez Drosophila.

Tableau ANOVA	SS	DF	MS	F (DFn, DFd)	Valeur p
Genre	0.1483	1	0.1483	F (1, 16) = 201,7	P<0,0001
Génotype	0.0004319	1	0.0004319	F (1, 16) = 0,5877	P=0,4545
Température	0.05336	1	0.05336	F (1, 16) = 72,60	P<0,0001
Génotype x Genre	0.01418	1	0.01418	F (1, 16) = 19,30	P=0,0005
Sexe x Température	0.007134	1	0.007134	F (1, 16) = 9,708	P=0,0067
Température du génotype x	0.0135	1	0.0135	F (1, 16) = 18,37	P=0,0006
Sexe x Génotype x Température	0.005903	1	0.005903	F (1, 16) = 8,032	P=0,0120
Résiduel	0.01176	16	0.0007349

Tableau 2 : Analyse de la variance de la capacité d’escalade (> 15 cm) chez Drosophila.

	SS	DF	MS	F (DFn, DFd)	Valeur p
Génotype	4.363E-07	1	4.363E-07	F (1, 16) = 32,38	P<0,0001
Température	3.141E-07	1	3.141E-07	F (1, 16) = 23,31	P=0,0002
Genre	3.439E-07	1	3.439E-07	F (1, 16) = 25,52	P=0,0001
Température du génotype x	5.333E-09	1	5.333E-09	F (1, 16) = 0,3958	P=0,5381
Génotype x Genre	1.765E-08	1	1.765E-08	F (1, 16) = 1,310	P=0,2692
Température x Sexe	3.336E-07	1	3.336E-07	F (1, 16) = 24,76	P=0,0001
Génotype x Température x Sexe	6.513E-09	1	6.513E-09	F (1, 16) = 0,4834	P=0,4968
Résiduel	2.156E-07	16	1.347E-08

Tableau 3 : Analyse de la variance des mesures de poids corporel chez Drosophila.

Discussion

L’ENT est une protéine conservée évolutivement qui influence de multiples processus^{biologiques 38}. Lorsqu’elle est exprimée dans les ovocytes de Xenopus laevis, Ent2 présente une activité de transport des^{nucléosides 8}. Des études ont démontré que le mutant homozygote d’Ent2 est mortel au stade larvaire tardif, ou au début du^{stade nymphal 10}. Dans la présente étude, un flux de travail d’édition du génome basé sur CRISPR/Cas9 a été mis en place pour générer des allèles ciblant Ent2 chez Drosophila melanogaster. La létalité observée des mutants homozygotes lors de l’établissement de la souche est cohérente avec ces rapports antérieurs, ce qui soutient la validité de la stratégie d’édition du génome. Dans ce cadre, la lignée hétérozygote Ent2*/CyO générée dans cette étude fournit un modèle pour documenter les caractéristiques phénotypiques associées à la perte partielle d’Ent2. Dans les conditions expérimentales testées, des différences de taille corporelle, de poids, d’activité locomotrice et de niveaux d’enzymes antioxydantes ont été observées entre les mouches Ent2*/CyO et w¹¹¹⁸ . Ces observations décrivent le profil phénotypique de la lignée mutant établie.

En termes de développement et de taille corporelle, les individus hétérozygotes Ent2*/CyO étaient significativement plus petits que les mouches^{w 1118} , à 22 °C et 25 °C. Cette différence peut être attribuée à une efficacité réduite du transport des nucléosides résultant de l’absence du gène Ent2, ce qui, à son tour, affecte la stabilité du métabolisme énergétique et la régulation de l’ecdysone. De plus, les effets négatifs sont devenus plus marqués à 25 °C. Des recherches ont indiqué que la durée de vie animale est influencée par le taux métabolique, un concept connu sous le nom de théorie du taux^{métabolique 19}. Les résultats de cette étude suggèrent que le taux métabolique élevé des mouches à haute température pourrait être étroitement lié aux carences nutritionnelles et aux retards de développement résultant d’un métabolisme nucléoside altéré. Cependant, étant donné l’utilisation d’un seul allèle dérivé de CRISPR, ces résultats doivent être interprétés comme des observations descriptives plutôt que comme des preuves directes de la fonction du gène.

Une variation dépendante de la température était également visible sur plusieurs relevés phénotypiques. Le mutant présente une prolongation de vie modeste à 22 °C, en particulier chez les femelles, un résultat cohérent avec les études^{précédentes 39,40}. En revanche, à 25 °C, la différence d’espérance de vie diminue, voire disparaît. En tant qu’organismes poikilothermiques, les mouches des fruits présentent un taux métabolique plus élevé et, par conséquent, une espérance de vie plus courte à des températures^{élevées 41,42}, ce qui correspond aux résultats de cette étude. Dans ce contexte, les schémas observés peuvent refléter des réponses physiologiques générales à la température.

La performance locomotrice et les activités enzymatiques antioxydantes variaient également selon les génotypes, les sexes et les conditions de température. Des performances de montée réduites et des activités SOD et CAT plus faibles ont été observées chez les mouches Ent2/CyO dans certaines conditions. Des études antérieures ont lié les transporteurs de nucléosides au métabolisme du NAD⁺, à la fonction mitochondriale et à la régulation du stress^oxydatif 17,43,44,45,46,47. Bien que ces rapports fournissent un contexte biologique possible, les données actuelles se limitent à la caractérisation phénotypique et n’établissent pas de liens mécanistiques entre Ent2 et ces voies.

Nos résultats montrent également que, dans les mêmes conditions, les mouches des fruits mâles présentent généralement une activité enzymatique antioxydante plus élevée que les femelles^39,48. Cela signifie que des facteurs liés au genre peuvent réguler la réponse antioxydante via différentes voies de signalisation. Les facteurs de transcription liés aux réponses antioxydantes, tels que Nrf2/CncC et leurs gènes cibles en aval, montrent des différences d’expression entre les différents sexes, affectant ainsi la capacité antioxydante^{globale 49}. Cette observation est cohérente avec les rapports de différences entre les sexes dans la résistance au stress oxydatif et les défenses antioxydantes chez Drosophila, où les femelles maintiennent généralement des niveaux plus faibles de ROS et des activités enzymatiques antioxydantes de base plus élevées par rapport aux hommes, ce qui peut contribuer aux différences de résistance au stress et de longévité entre les^{sexes 50}. Ces observations soulignent également l’importance de prendre en compte des variables biologiques telles que le sexe lors de la caractérisation des phénotypes mutants.

D’un point de vue méthodologique, cette étude présente un flux de travail reproductible pour générer et valider les mutations médiées par CRISPR/Cas9 chez Drosophila. Une conception précise et une sélection des gRNA sont essentielles, car des gRNA efficaces déterminent l’efficacité du clivage ciblé par Cas9 et minimisent les modifications^{involontaires 21,51}. La microinjection à haute précision de composants Cas9 et gRNA dans les embryons est également cruciale, car des injections inefficaces peuvent entraîner de faibles taux d’édition ou du^{mosaïcisme 52}. Une confirmation complète des génotypes par séquençage garantit la présence des modifications prévues et exclut les modifications hors cible ou incomplètes, renforçant ainsi l’intégrité du modèle⁵³. Notamment, l’utilisation du chromosome équilibreur CyO était essentielle pour maintenir l’allèle mutant Ent2 en raison de la létalité des mutants homozygotes. Cette approche est largement utilisée en génétique de Drosophila pour préserver les mutations délétères et permettre des analyses en aval. La présente étude démontre l’application pratique de cette stratégie dans un cadre d’édition CRISPR/Cas9.

Plusieurs limites doivent être reconnues. Premièrement, des analyses phénotypiques ont été réalisées à l’aide d’une seule lignée mutante dérivée de CRISPR. Il est bien reconnu que l’édition CRISPR/Cas9 peut générer des allèles hétérogènes, et l’analyse de plusieurs lignées indépendantes est généralement recommandée pour renforcer les conclusions génétiques. Par conséquent, les résultats rapportés ici doivent être interprétés comme une caractérisation préliminaire d’un allèle mutant. De futures études intégrant des allèles Ent2 générés de manière indépendante supplémentaires seront nécessaires pour améliorer la robustesse des conclusions. Deuxièmement, la lignée mutante était maintenue à l’aide du chromosome équilibreur CyO, tandis que le groupe témoin (w¹¹¹⁸) ne porte pas de chromosome équilibreur. Comme les chromosomes équilibreurs eux-mêmes peuvent influencer les traits développementaux et physiologiques, l’absence d’un contrôle équilibré représente une source potentielle de confusion. Cette limitation doit être prise en compte lors de l’interprétation des différences phénotypiques entre les génotypes. Troisièmement, les conditions environnementales telles que l’humidité, le cycle lumineux et l’alimentation étaient maintenues dans des environnements standards de laboratoire mais n’étaient pas systématiquement modifiées. Comme ces facteurs peuvent influencer le métabolisme et les réponses au stress, de futures études intégrant des gradients environnementaux contrôlés permettraient une évaluation plus complète des interactions phénotype-environnement.

En résumé, cette étude établit un flux de travail basé sur CRISPR/Cas9 pour générer et maintenir les allèles mutants Ent2 chez Drosophila melanogaster et fournit une caractérisation descriptive de la lignée hétérozygote résultante dans différentes conditions environnementales. Les résultats soulignent l’applicabilité de cette approche à l’étude de gènes à phénotypes létaux et soulignent l’importance des considérations du plan expérimental, notamment le fond génétique, les chromosomes équilibreurs et les variables environnementales.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acétate d'ammonium	Sigma	A1542
Kit de dosage de la catalase (méthode à lumière visible) (méthode au molybdate d'ammonium)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A007-1-1
Dodécyl sulfate	Sigma	L3771
Dispositif d'injection	Eppendorf FemtoJet	4i
Plasmide linéarisé : MLM3613	Addgene	42251
Microscope	OLYMPUS	CKX3-SLP
Kit mMESSAGE mMACHINE T7	Thermo Fisher	AM1344
Kit de transcription mMESSAGE mMACHINE T7	Thermo Fisher	AM1344
Enzame de restriction PmeI	NEB	R0560S
Poly(A) polymérase	NEB	M0276S
Protéase K	Thermo Fisher	EO0491
Kit RNeasy Mini	QIAGEN	74104
Système de production de RNA à grande échelle T7 RiboMAX Express	Promega	P1320
Kit T7 RiboMAX	Promega	P1320
Kit de dosage de la superoxyde dismutase totale (méthode à l'hydroxylamine)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A001-1
w1118 Drosophila	Fangjing Biology
Phénol/chloroforme saturé en eau	Sigma	P2069