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Article de méthode

Établissement d’organoïdes tumoraux, de fibroblastes associés au carcinome et de fibroblastes équivalents provenant du même patient atteint de cancer de l’œsophage

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DOI :

10.3791/69548

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3 avril 2026

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1Department of Esophageal and Gastroenterological Surgery, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 2Department of Molecular Pathogenesis, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 3Department of Pathology and Oncology, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 4Faculty of Health Sciences, Graduate School of Medicine, Juntendo University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode permettant d’isoler simultanément les organoïdes cancéreux, les fibroblastes associés au carcinome (CAF) et les fibroblastes (CF) non associés à la tumeur chez le même patient atteint d’un carcinome épidermoïde œsophagien (ESCC). L’utilisation de ces documents correspondant aux patients pourrait éviter les problèmes liés à la variabilité entre patients et offrir une plateforme expérimentale appropriée pour la recherche sur les CCES.

Résumé

Dans le carcinome épidermoïde œsophagien (ECCC), l’acquisition de la résistance au traitement et la récidive tumorale restent des défis cliniques majeurs. Les fibroblastes associés au carcinome (CAF), composants clés du microenvironnement tumoral, sont connus pour influencer la progression de l’ECC et la réponse thérapeutique. Cependant, de nombreux aspects du rôle des CF dans la malignité tumorale restent inconnus, vraisemblablement en raison de la variabilité inter-patients chez les patients ESCC. Diverses lignées cellulaires humaines d’ESCC disponibles pour la recherche sont considérées comme imitant partiellement la nature du carcinome humain. Ils sont également propagés in vitro pendant des années et des décennies dans une boîte de Petri, ce qui entraîne une adaptation aux conditions de culture. De plus, les lignées cellulaires humaines d’ESCC présentent diverses altérations génétiques et épigénétiques distinctes parmi les patients originaux, entraînant une variabilité entre patients. Néanmoins, des lignées cellulaires cancéreuses cultivées à long terme ont été utilisées dans la plupart des études antérieures pour expérimenter des CAF mal adaptés aux patients. La variabilité inter-patients au sein de chaque lignée cellulaire cancéreuse et entre cellules cancéreuses et CAFs pourrait donc entraîner une réduction de la reproductibilité et de la fiabilité des résultats. Pour éliminer la variabilité inter-patients, trois types cellulaires distincts ont été isolés sur le même patient : organoïdes cancéreux et CAF provenant d’une région ESCC disséquée chirurgicalement, et des fibroblastes (CF) équivalents d’une région non tumorale adjacente comme témoins spécifiques aux patients pour les CAF. Un protocole détaillé est présenté permettant l’isolement simultané des organoïdes cancéreux, des CAF et des CF. Les organoïdes cancéreux ont bien grandi dans des conditions tridimensionnelles. Les CAF et les FQ ont été colorés positivement pour la vimentine, l’un des marqueurs fibroblastiques, soutenant l’enrichissement de ces cellules dans les lignées fibroblastiques. Le protocole décrit nous permet d’établir des organoïdes ESCC et des fibroblastes compatibles avec les patients, fournissant une plateforme expérimentale précieuse qui exclut la variabilité inter-patients dans l’étude des interactions tumeur-stromal.

Introduction

Le cancer de l’œsophage est associé à des taux d’incidence et de mortalité élevés dans lemonde 1. Il est globalement classé en deux principaux sous-types histologiques : le carcinome épidermoïde œsophagien (ECCC) et l’adénocarcinome œsophagien (CAE)2. L’ESCC est plus répandue que l’EAC, avec une incidence particulièrement plus élevée en Asie de l’Est eten Afrique 3. Les stratégies de traitement de l’ECC sont relativement bienétablies 4,5. Pour les lésions à un stade précoce confinées à la couche muqueuse, la résection endoscopique est indiquée comme une option curative et peu invasive. Chez les patients atteints d’une maladie localement avancée mais résécable, la combinaison de chimioradiothérapie néoadjuvante suivie d’œsophagectomie a démontré une efficacité clinique. Pour les cas non résécables ou métastatiques, la chimiothérapie systémique reste la base du traitement. Néanmoins, la résistance thérapeutique et la récidive de la maladie continuent de poser d’importants défis cliniques.

Les tumeurs ne sont pas composées uniquement de cellules cancéreuses, mais aussi d’un microenvironnement tumoral complexe comprenant divers types de cellules stromales. Parmi eux, les fibroblastes associés au carcinome (CAF), composants cellulaires majeurs du microenvironnement tumoral, jouent un rôle crucial dans la progression tumorale et la réactivitéthérapeutique 6,7,8,9. Dans l’ESCC, l’implication des CAF dans la malignité tumorale et la résistance au traitement a également été de plus en plusrapportée 10, 11,12. Cependant, les mécanismes moléculaires précis des CAF sous-jacents à la malignité de l’ESCC restent largement incertains.

Dans la plupart des études antérieures, les effets des CAF sur les cellules cancéreuses ont été évalués à l’aide de diverses lignées cellulaires d’ESCC propagées dans des plaques de Petri pendant de nombreuses années, voire des décennies. De telles lignées cellulaires s’adapteraient aux conditions de culture et ressembleraient peu aux tumeursd’origine 13. De plus, les lignées cellulaires d’ESCC sont dérivées de différents patients et présentent diverses altérations génétiques et épigénétiques, manifestement distinctes dans les cellules ESCC respectives, servant de variabilités inter-patients. Les résultats expérimentaux d’une lignée cellulaire cancéreuse peuvent souvent être incohérents avec ceux d’une autre lignée cellulaire cancéreuse. Par conséquent, les expériences utilisant différentes lignées cellulaires ESCC et les CAF incompatibles avec le patient peuvent poser des difficultés à traiter précisément les interactions de ces cellules de manière reproductible et fiable.

Pour remédier à ces limitations, un protocole a été développé pour isoler simultanément les organoïdes tumoraux compatibles avec le patient, les CAF et les fibroblastes (FQ) non tumoraux à partir du même échantillon chirurgical d’ESCC. Les organoïdes dérivés du patient récapitulent généralement les caractéristiques architecturales et phénotypiques clés des tumeurs primaires tout en préservant l’hétérogénéité moléculaire. Les organoïdes établis formaient des sphéroïdes dans des conditions de culture tridimensionnelle (3D) et montraient une capacité proliférative stable. Les CAF et les FQ ont été confirmées comme enrichies pour des populations de cellules fibroblastiques positives à la vimentine, un marqueur de fibroblaste.

Ce protocole fournit des étapes détaillées et reproductibles pour le traitement tissulaire, la dissociation enzymatique, l’ensemencement d’organoïdes, l’isolement de CAF/CF, le passage et la cryopréservation. Pour aider les chercheurs à évaluer l’applicabilité avant la mise en œuvre, des informations pratiques ont été incluses : les organoïdes se forment généralement en 3 à 5 jours, atteignent la préparation au passage en 7 à 10 jours, et peuvent être développés de manière stable pendant plus de dix passages. Les CAF et les CF peuvent être adoptés pendant au moins huit générations. Les organoïdes et les fibroblastes peuvent être cryopréservés en environ 20 jours. Les taux de réussite des établissements atteignent environ 70 % pour les organoïdes et 80 % pour les CAF et les CF. De plus, un test de milieu conditionné validé utilisant un milieu conditionné par CAF ou FQ est inclus, offrant une approche robuste pour évaluer les effets paracrins des cellules stromales sur le comportement organoïde tumoral. Collectivement, cette plateforme organoïde-stromale jumelée offre un modèle expérimentalement accessible et biologiquement pertinent pour étudier les interactions tumeur-stromales ESCC et soutenir le développement de stratégies thérapeutiques de précision.

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Protocole

Toutes les procédures impliquant des tissus humains doivent être réalisées sous les approbations institutionnelles appropriées de biosécurité et dans un cabinet de sécurité biologique certifié. Le patient a fourni un consentement éclairé écrit, et le projet a été approuvé par le Comité d’éthique de la recherche de la Faculté de médecine de l’Université Juntendo. Un aperçu de la procédure des protocoles 2 à 6 est présenté à la Figure 1. La composition et les concentrations de chaque composant dans le milieu organoïde ESCC (Eso_v1) ont été déterminées sur la base de Kijima et al.14 et d’autres études15, 16, 17, avec seulement des modifications mineures. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Réactifs et préparation tissulaire

  1. Préparez les réactifs et le matériel.
    1. Stérilisez tous les instruments, y compris ciseaux, pinces et pipettes, avant de commencer la procédure.
    2. Préparez 10 mL de solution physiologique tamponnée phosphate (PBS) dans un tube de 15 mL.
    3. Préparez des tubes de 15 mL à faible attachement et identifiez-les selon l’origine de l’échantillon (par exemple, tube de lavage tumoral (A), tube de digestion tumorale (B), tube de lavage non tumoral (C), tube de digestion non tumoral (D)).
    4. Enduit les pipettes en agissant en aspirant et en distribuant le sérum bovin fœtal (FBS) 2 à 3 fois pour réduire l’adhérence cellulaire pendant le traitement.
      REMARQUE : Le revêtement FBS empêche les fragments de tissu d’adhérer aux surfaces plastiques lors de la dissociation mécanique.
  2. Préparer des solutions enzymatiques
    1. Préparez la solution enzymatique I pour la digestion tumorale en mélangeant 2,7 mL de milieu d’Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10 % de FBS et 1x pénicilline–streptomycine (PS) (ci-après DMEM/10 % FBS), 0,3 mL de collagénase à 10 mg/mL, 0,15 mL de dispase à 10 000 PU/mL, et 0,03 mL d’amphotéricine B à 2,5 μg/mL. Température à 37 °C.
    2. Préparez la solution enzymatique II pour la digestion non tumorale en mélangeant 2,7 mL de DMEM/10 % de FBS, 0,3 mL de collagénase à 1 mg/mL et 0,03 mL d’amphotéricine B. À température maximale à 37 °C.
      REMARQUE : La collagénase et la dispase facilitent la dissociation des tissus tumoraux.
  3. Préparer un milieu de culture organoïde
    1. Préparez un milieu organoïde ESCC (milieu Eso_v1) contenant 60 % de milieu organoïde basal, 40 % de milieu conditionnéL-WRN 18 (voir étape 1.4), 50 ng/mL d’EGF (facteur de croissance), 1 mM de N-acétyl-L-cystéine (antioxydant), 5 mM de nicotinamide (vitamine hydrosoluble), 500 nM A83-01 (inhibiteur TGF-βR (empêchant la croissance des fibroblastes)), 1x B-27 (complément de culture sans sérum), 1x N-2 (supplément de culture sans sérum) et 10 μM Y-27632 (inhibiteur de ROCK).
    2. Équilibrez le milieu à 37 °C avant utilisation.
      REMARQUE : Le milieu conditionné par L-WRN (surnageant provenant des cellules L-WRN) fournit les signaux WNT, R-spondin et Noggin essentiels à l’initiation organoïde. Y27632 est contenu dans le milieu tout au long de la période de culture.
  4. Préparez un milieu conditionné L-WRN
    1. Décongelez un flacon de cellules L-WRN et ensemenzez-les sur un plat de 100 mm avec 10 mL de DMEM/FBS à 10 % et cultivez pendant 1 à 2 jours.
    2. Remplacer le milieu par 10 mL de DMEM/10 % de FBS contenant G418 (500 μg/mL finaux) et de l’hygromycine B (500 μg/mL finaux), puis cultiver jusqu’à atteindre 80 % de confluence.
    3. Faites passer les cellules sur deux antennes de 100 mm avec 10 mL de DMEM/10 % de FBS (avec G418 et Hygromycine B) et cultivez jusqu’à ce que les cellules atteignent une confluence de 100 %.
    4. Faire passer les cellules sur cinq antennes de 150 mm contenant 20 mL de DMEM/10 % de FBS (sans antibiotiques) par vase et cultiver jusqu’à une confluence à 100 %.
    5. Aspirez et jetez le milieu de chaque plat de 150 mm.
    6. Ajoutez 25 mL par plat de milieu de collecte (milieu basal organoïde complété avec 5 % de FBS).
    7. Incubez pendant 24 heures.
    8. Collectez le médium des cinq plats (25 mL × 5 = 125 mL) dans une bouteille en verre stérile.
    9. Répétez les étapes 1.4.6–1.4.8 pour un total de 8 collections (volume ciblé regroupé : ~1 000 mL).
    10. Filtrez stérilement le CM en pool à l’aide d’un filtre à bout de bouteille.
    11. Aliquote 40 mL dans 25 tubes stériles de 50 mL.
    12. Stockez les aliquotes à −80 °C.
  5. Préparez un milieu de culture de fibroblastes
    1. Préparez le fibroblaste moyen-1.
    2. Équilibrez le milieu à 37 °C avant utilisation.
  6. Préparez des plats pour la manipulation des mouchoirs
    1. Versez plusieurs gouttes (trois à cinq) de FBS avec une pointe P1000 sur deux plats de 100 mm pour créer un revêtement (Plate T pour le tissu tumoral, Plat N pour le tissu non tumoral).
      REMARQUE : Le revêtement FBS favorise un hachage mécanique plus lisse et empêche l’adhérence de petits fragments de tissu à la surface de la plaque.
  7. Manipulation des tissus et identification des échantillons
    1. Confirmez que les échantillons tumoraux et non tumoraux sont transportés sur la glace.
    2. Placez les mouchoirs sur un plat de 60 mm contenant une petite quantité de DMEM/10 % de FBS et conservez sur la glace jusqu’à utilisation. Commencez le traitement dans les 16 heures suivant la résection chirurgicale pour maintenir la viabilité.
    3. Identifier le tissu tumoral par sa texture ferme et sa morphologie irrégulière de la surface, qui diffèrent de celles du tissu non tumoral.

2. Traitement des tissus, lavage et digestion enzymatique

REMARQUE : Cette étape consiste à digérer les sections de tissu haché et non tumorales avec différentes solutions enzymatiques.

  1. Réduisez la tumeur et les tissus non tumoraux
    1. Transférez chaque échantillon de tissu (environ 5 mm × 5 mm) sur sa plaque recouverte de FBS respective (Plat T pour le tissu tumoral et Plat N pour le tissu non tumoral).
    2. Réduisez chaque tissu en fragments de ~0,5 mm à l’aide d’un scalpel stérile.
      REMARQUE : Les fragments plus petits augmentent l’accessibilité enzymatique et améliorent l’efficacité digestive.
  2. Lavez le mouchoir haché.
    1. Enrobez une pipette de 10 mL de FBS pour éviter l’adhérence des tissus.
    2. Ajoutez 5 mL de PBS sur chaque plat à l’aide de la pipette enduite de FBS et resuspendez doucement le papier haché.
    3. Transférez la suspension dans le tube de lavage tumoral correspondant (tube A) ou le tube de lavage non tumoral (tube C).
    4. Répétez les étapes 2.2.2 et 2.2.3 (volume total : 10 mL).
    5. Laissez les tubes reposer 2 minutes à température ambiante ; retirer le surnageant en laissant environ 0,5 à 1 mL de PBS et de tissu au fond.
    6. Ajoutez 10 mL de PBS frais avec une nouvelle pipette ; après avoir enrobé la pipette de FBS, pipettez la suspension avec force tout en évitant la formation de bulles.
      REMARQUE : La pipetage forcée aide à la dissociation mécanique et à l’élimination du sang et du mucus. Éviter les bulles empêche la lyse cellulaire induite par le cisaillement. Toutes les étapes de lavage visent à éliminer les débris.
    7. Laissez les tubes reposer 2 minutes à température ambiante ; retirer le surnageant en laissant environ 0,5 à 1 mL de PBS et de tissu au fond.
    8. Répétez la procédure de lavage (étapes 2.2.6 et 2.2.7) deux fois pour un total de trois lavages.
  3. Transférez les tissus dans des tubes digestifs.
    1. Ajoutez 10 mL de PBS frais avec une nouvelle pipette ; après avoir enrobé la pipette de FBS, transférez le tissu tumoral dans le tube de digestion tumorale (tube B) et le tissu non tumoral dans le tube de digestion non tumoral (tube D).
    2. Laissez les tubes reposer 2 minutes à température ambiante, retirez le surnageant en laissant environ 0,5 mL de PBS et de tissu au fond.
  4. Effectuer une digestion enzymatique.
    1. Digestion des tissus tumoraux
      1. Ajoutez tout le volume de solution enzymatique I (collagénase + dispase) dans le tube digestif tumoral (tube B).
      2. Incubez à 37 °C pendant 2 heures avec une rotation douce.
    2. Digestion des tissus non tumoraux
    3. Ajoutez tout le volume de la solution enzymatique II (collagénase uniquement) dans le tube digestif non tumoral (tube D).
      1. Incubez à 37 °C pendant 4 heures avec une rotation douce.
    4. Continuez à l’étape 3 (traitement des échantillons tumoraux) ou à l’étape 6 (ensemencement des fibroblastes équivalents), selon l’origine de l’échantillon.
      REMARQUE : Les types d’enzymes utilisées pour digérer les tissus tumoraux et non tumoraux, ainsi que les temps de traitement, ont été déterminés sur la base d’optimisations expérimentales antérieures. Les tissus tumoraux contiennent souvent une matrice extracellulaire dense ; La dispase combinée à la collagénase améliore la capacité digestive.

3. Traitement des échantillons tumoraux pour l’isolation organoïde et CAF

REMARQUE : Cette étape vise à isoler les cellules tumorales épithéliales pour la formation d’organoïdes et les fibroblastes stromales (CAF) à partir des mêmes échantillons tumoraux digérés.

  1. Filtrer et collecter les cellules d’origine tumorale.
    1. Placez une tamoire de cellules de 100 μm sur un tube conique de 50 mL.
    2. Humidifiez le passoire en passant 3 mL de DMEM/10 % FBS.
      REMARQUE : Le pré-mouillage réduit la perte cellulaire en empêchant l’adhésion aux fibres sèches du maillé.
    3. Transférez tout le contenu du tube de digestion tumorale (tube B) sur la passoire à l’aide d’une pointe P1000 recouverte de FBS pour retirer les fragments de tissu non digérés.
    4. Ajoutez 6 mL supplémentaires de DMEM/10 % de FBS pour rincer les grappes résiduelles à travers la passoire.
    5. Retirez la tamoire et ramenez le filtrat au tube B (un nouveau tube de 15 mL à faible attachement peut également être utilisé).
  2. Lavez et concentrez le filtrat.
    1. Centrifugez le tube à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
    2. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette jetable.
    3. Ajoutez 10 mL de DMEM/10 % de FBS, mélangez doucement par inversion, puis centrifugez à nouveau à 300 × g pendant 5 minutes.
    4. Aspirez soigneusement le surnageant tout en conservant la pellete.
    5. Réduisez le volume restant à 40 μL à l’aide d’une pipette P200.
  3. Allouer des cellules pour organoïdes et cultures CAF.
    1. Allouez 30 μL pour l’ensemencement des organoïdes.
    2. Allouez 10 μL pour le semis CAF.
      REMARQUE : Ce rapport fournit empiriquement des populations épithéliales et fibroblastiques suffisantes pour une expansion parallèle.

4. Ensemencement organoïde (culture 3D)

REMARQUE : Cette étape est réalisée pour établir des organoïdes de l’ESCC à partir d’une suspension cellulaire d’origine tumorale.

  1. Préparez les dômes de matrice membranaire du socle.
    1. Préchauffez une plaque standard à 24 puits à 37 °C.
      REMARQUE : Le préchauffage de la plaque accélère la solidification des dômes de la matrice membranaire du basoir.
    2. Mélangez 30 μL de suspension d’origine tumorale avec 90 μL de matrice membranaire basale glacée (rapport 1:3).
    3. Appliquez 30 μL par dôme sur quatre puits.
    4. Laissez les dômes se solidifier pendant 15 minutes dans un incubateur CO₂.
  2. Ajouter un milieu de culture organoïde
    1. Préparez un milieu organoïde avec des compléments prémélangés (FGF10, SB202190, et des antibiotiques, tels que 1× Amphotéricine B et 100 μg/mL de Primocine, si utilisés).
      REMARQUE : Eh bien 1 : Eso_v1 ; Puits 2 : Eso_v1 + 10 μM SB202190 ; Puits 3 : Eso_v1 + 100 ng/mL FGF10 ; Puits 4 : Eso_v1 + 10 μM SB202190 + 100 ng/mL FGF10 (concentrations finales).
    2. Ajoutez doucement 1 mL de médium à chaque puits le long du mur.
    3. Incuber dans des conditions standard de culture CO₂.
    4. Changez le milieu tous les 3 à 5 jours.
      REMARQUE : Le prémélange des suppléments évite la nécessité de pipeter de petits volumes directement sur des dômes fragiles de la matrice membranaire du socale. Les antibiotiques ne sont ajoutés que durant les 6 premiers jours suivant la pose de l’organoïde. Les conditions de culture (FGF10 +/-, SB202190 +/-) sont déterminées en fonction du taux de croissance et de la morphologie (de préférence sphérique).
  3. Surveillez la formation des organoïdes.
    1. Observez les dômes quotidiennement à l’aide d’un microscope inversé.
      REMARQUE : Morphologie attendue : jours 3 à 5 → sphéroïdes visibles ; Jour 7 à 10 → sphéroïdes denses prêts à être éliminés.
    2. Faites passer les organoïdes lorsqu’ils atteignent une taille d’environ 100 à 200 μm ou présentez un entassement en dôme de 90 % ou plus.

5. Classement CAF

REMARQUE : Cette étape est réalisée pour établir des CAF à partir d’une suspension cellulaire d’origine tumorale.

  1. S’ensemence des CAF sur un plat enrobé de collagène.
    1. Préparez un plat de 60 mm enrobé de collagène contenant 1,5 mL de médium fibroblastique-1.
    2. Ajouter 10 μL du filtrat tumoral alloué à l’ensemencement du CAF.
    3. Ajoutez des antibiotiques comme 1× amphotéricine B et 100 μg/mL de primocine.
    4. Incuber dans des conditions standard de culture CO₂.
    5. Changez le milieu tous les 3 à 5 jours.
      REMARQUE : Empiriquement, le milieu des fibroblastes-1 est souvent plus adapté que d’autres milieux pour l’établissement initial et la croissance des CAF et des FQ. Les antibiotiques ne sont ajoutés que durant les 6 premiers jours.
  2. Surveiller la croissance de la CAF
    1. Surveillez l’apparition d’une morphologie de fuseau de type fibroblaste à partir des jours 3 à 5.
    2. Fibroblastes de passage à une confluence de 90 % à 100 %.
      REMARQUE : En cas de contamination par les cellules épithéliales, les fibroblastes peuvent être isolés sélectivement en ajustant la durée de trypsinisation, car les fibroblastes se détachent plus rapidement que les cellules épithéliales lors du passage.

6. Classement CF

REMARQUE : Cette étape est réalisée pour obtenir des FQ compatibles avec les patients à partir de tissu adjacent non tumoral.

  1. Lavez et préparez la digestion non tumorale.
    1. Centrifugez le tube de digestion non tumoral (tube D) à 300 × g pendant 5 minutes.
    2. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette jetable.
    3. Ajoutez 10 mL de DMEM/10 % de FBS, mélangez doucement par inversion, puis centrifugez à nouveau à 300 × g pendant 5 minutes.
    4. Aspirez soigneusement le surnageant tout en conservant la pellete.
    5. Répétez les étapes 6.1.3 et 6.1.4 une fois de plus.
  2. Ensemencer des CF sur une plaque enrobée de collagène
    1. Transférez toute la suspension sur un plat de 60 mm recouvert de collagène contenant 1,5 mL de médium fibroblastique-1.
    2. Ajoutez des antibiotiques comme 1× amphotéricine B et 100 μg/mL de primocine.
    3. Incuber dans des conditions standard de culture CO₂.
    4. Changez le milieu tous les 3 à 5 jours.
      REMARQUE : Les antibiotiques ne sont ajoutés que pendant les 6 premiers jours.
  3. Surveillez la croissance de la mucoviscienne.
    1. Observez la morphologie du fuseau de type fibroblaste à partir de 3 à 5 jours.
    2. Fibroblastes de passage à une confluence de 90 % à 100 %.

7. Passage organoïde et cryoconservation

  1. Passage organoïde.
    REMARQUE : Le but de cette étape est d’élargir les organoïdes une fois qu’ils atteignent une densité appropriée.
    1. Aspirez l’ancien milieu et lavez chaque puits avec 1 mL de PBS.
    2. Ajoutez 0,5 mL de trypsine pré-chauffée pour organoïde dans chaque puits.
    3. Pipette vigoureusement avec une pointe P1000, en utilisant le bord de la pointe pour perturber le dôme de la matrice membranaire du sous-sol.
      REMARQUE : Le cisaillement mécanique aide à décomposer la matrice membranaire basale dense, améliorant l’accès enzymatique.
    4. Incubez pendant 10 à 15 minutes dans un incubateur CO₂ jusqu’à ce que tous les amas de gel se dissolvent. Dissociez les organoïdes en 20 à 50 amas cellulaires.
      REMARQUE : Évitez la dissociation totale unicellulaire, car elle réduit la viabilité.
    5. Collectez la suspension dans un tube de 15 mL à faible attache.
    6. Rincez le puits quatre fois avec 0,5 mL de DMEM/10 % de FBS et transférez tous les rinçages dans le même tube à faible fixation.
    7. Centrifugez le tube à 300 × g pendant 5 minutes.
    8. Retirez le surnageant et resuspendez le pellet dans un minimum de DMEM/10 % de FBS ; régler le volume de suspension à 80 μL.
    9. Mélangez 80 μL de suspension organoïde avec 240 μL de matrice membranaire basale glacée (ratio 1:3).
    10. Placez le mélange sur une plaque préchauffée à 6 puits (37 °C), avec 4 à 6 dômes par puits.
    11. Laissez les dômes solidifier pendant 15 minutes, puis ajoutez 3 mL de Eso_v1 milieu (la composition optimale lors de la culture initiale à l’étape 4.2) par puits.
    12. Changez le milieu tous les 3 à 5 jours.
      REMARQUE : Les organoïdes sont passés lorsqu’ils atteignent un diamètre d’environ 100 à 200 μm ou lorsque le recouvrement dépasse 90 %. Le comptage cellulaire n’est pas effectué. Pour les sous-cultures courantes, les organoïdes sont divisés dans un ratio de 1:4 à 1:10. Une reformation rapide des sphéroïdes est attendue dans un délai de 48 à 72 heures.
  2. Cryoconservation organoïde
    1. Lavez chaque puits avec 3 mL de PBS.
    2. Ajoutez 1,5 mL de trypsine pour organoïde dans chaque puits, pipetez vigoureusement, puis incubez pendant 10 minutes.
    3. Rassemblez toute la suspension dans un tube de 15 mL à faible attachement et rincez le puits quatre fois.
    4. Centrifugez le tube à 300 × g pendant 5 minutes et retirez le surnageant.
    5. Resuspendez la boule dans 2 mL de 90 % FBS/10 % DMSO.
    6. Aliquote 0,5 mL dans chaque cryovial.
    7. Placez les fioles dans un récipient congelant et conservez à −80 °C toute la nuit.
    8. Transférez les fioles dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme.
      REMARQUE : Les organoïdes sont regroupés lorsqu’ils atteignent un diamètre d’environ 100 à 200 μm ou lorsque le surpeuplement des dômes dépasse 90 %.
  3. Récupération d’organoïdes gelés
    1. Décongelez rapidement le cryovial dans un bain-marie à 37 °C.
    2. Transférez le contenu dans 5 mL de DMEM/10 % de FBS dans un tube de 15 mL.
    3. Centrifugez le tube à 300 × g pendant 5 minutes.
    4. Retirez le surnageant et remettez le pellet en suspension dans 40 à 60 μL de DMEM/10 % de FBS.
    5. Mélangez la suspension avec une matrice membranaire de socle glacée à un ratio 1:3.
    6. Placez le mélange sur une plaque préchauffée à 6 puits (37 °C) sous forme de 4 à 6 dômes par puits.
    7. Laissez les dômes solidifier pendant 15 minutes, puis ajoutez 3 mL de Eso_v1 milieu (la composition optimale lors de la culture initiale à l’étape 4.2) par puits.

8. Passage des fibroblastes et cryoconservation

  1. CAF et CF en passe
    REMARQUE : Le but de cette étape est d’élargir les fibroblastes une fois qu’ils atteignent une densité appropriée.
    1. Lavez la vaisselle avec 2 mL de PBS.
    2. Ajoutez 0,4 mL de trypsine à 0,25 %.
    3. Incuber pendant 5 minutes dans un incubateur CO₂, en surveillant le décollement au microscope.
    4. Neutraliser la trypsine avec du DMEM/FBS à 10 % et transférer toute la suspension cellulaire sur une antenne de 100 mm contenant 10 mL de milieu.
      REMARQUE : Les fibroblastes sont transmis lorsqu’ils atteignent une confluence de 90 % à 100 %. Pour les sous-cultures courantes, elles sont divisées dans un ratio de 1:3. Empiriquement, la prolifération des fibroblastes ralentit ou cesse lorsque la densité cellulaire est faible.
  2. Cryoconservation par fibroblastes
    1. Lavez les cellules avec 5 mL de PBS.
    2. Ajoutez 1 mL de trypsine à 0,25 %, puis incubez pendant 5 minutes dans un incubateur CO₂.
    3. Neutralisez la trypsine avec du DMEM/FBS à 10 % et transférez toute la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL.
    4. Centrifugez à 300 × g pendant 5 minutes.
    5. Resuspendez la pellete cellulaire dans 2 mL de 90 % FBS/10 % DMSO.
    6. Aliquote 0,5 mL dans chaque cryovial.
    7. Placez les flacons dans un récipient congelant et conservez à −80 °C toute la nuit.
    8. Transférez les fioles dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme.

9. Dosage de médium conditionné

REMARQUE : Le but de cette étape est d’évaluer les effets paracrines des fibroblastes sur les organoïdes tumoraux ESCC utilisant un milieu conditionné (MC). Ce test fournit un modèle d’interaction stromal-tumeur reproductible lorsque la co-culture directe n’est pas encore optimisée.

  1. Préparation d’un milieu conditionné CAF/CF
    1. Cultivez le même nombre de CAF ou CF dans 3 mL de DMEM/10 % de FBS sur des antennes de 60 mm jusqu’à une confluence de 80 % à 90 %.
    2. Lavez les cellules une fois avec 2 mL de PBS.
    3. Ajoutez 3 mL de DMEM/2 % de FBS.
    4. Incubez pendant 48 heures dans un incubateur CO₂.
    5. Collectez le surnageant dans un tube de 15 mL.
    6. Centrifugez à 2000 × g pendant 5 minutes pour enlever les débris cellulaires.
    7. Collectez 2,5 mL du surnageant dans un nouveau tube de 15 mL.
    8. Aliquote le milieu conditionné en portions de 100 à 500 μL et stocke à -80 °C.
  2. Préparation du milieu organoïde
    1. Préparez le milieu organoïde de l’ESCC comme décrit à l’étape 1.3.
    2. Mélangez le milieu organoïde et le milieu conditionné à un ratio 1:1 (50 % v/v).
  3. Culture d’organoïdes cancéreux utilisant le milieu de test organoïde.
    1. Après le passage organoïde décrit à l’étape 7, semez les organoïdes dans un seul dôme de matrice membranaire de 20 μL par puits sur une plaque préchauffée de 48 puits (37 °C).
    2. Après la solidification du dôme, ajoutez 0,3 mL de médium organoïde à chaque puits.
    3. Remplacez le milieu organoïde tous les 3 à 7 jours.
    4. Évaluer la morphologie et la taille des organoïdes cancéreux.
      REMARQUE : Tous les matériaux d’origine humaine sont considérés comme potentiellement infectieux. Un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants, des masques et des lunettes de protection, est toujours porté. La collagénase, la dispase et le diméthyle sulfoxyde (DMSO) peuvent provoquer des irritations de la peau, des yeux et des voies respiratoires ; par conséquent, le contact direct et l’inhalation sont évités. Toutes les procédures enzymatiques impliquant des tissus humains sont réalisées conformément aux directives institutionnelles de biosécurité. Les déchets liquides contenant des tissus humains sont collectés dans des contenants scellés pour biohazard et autoclavés avant leur élimination. Les déchets chimiques, y compris les solutions DMSO et enzymatiques, sont éliminés conformément aux directives institutionnelles concernant les déchets dangereux. Tous les instruments réutilisables sont rincés à 70 % d’éthanol et autoclavés avant réutilisation.

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Résultats

Des échantillons de tissu ont été prélevés dans la région tumorale et une région adjacente non tumorale située à 3 cm de la tumeur, excisés chirurgicalement chez un patient atteint d’ESCC qui n’avait pas reçu de chimiothérapie néoadjuvante. Les organoïdes cancéreux et les CAFs ont été isolés de la région tumorale, tandis que les FQ ont été isolés de la région non tumorale. Les tissus chirurgicaux ont été hachés en morceaux d’environ 0,5 mm (Figure 2A), puis ...

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Discussion

Les rapports précédents utilisaient des organoïdes atteints de cancer et des CAF appariés par les patients pour étudier le rôle des CAF dans la prolifération et la résistance aux médicaments chez les cancers humains du côlon, du sein, du pancréas, ainsi que de la tête et du couchez les patients 20,21,22,23,24. Ces études ont d...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le prix Juntendo University Young Investigator Award (2024 et 2025) accordé à P. Z. et par des subventions pour la recherche scientifique du ministère de l’Éducation, de la Culture, du Sport, des Sciences et de la Technologie du Japon (23K07362, 21K08693). Nous tenons à remercier tous les membres des départements de pathologie et d’oncologie, ainsi que de chirurgie œsophagienne et gastroentérologique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Antenne de 100 mmTPP93100
100x Pénicilline-Streptomycine (PS)Nacalai26253-84
Tube de 15 mlFastGeneFG2001
Plaque de culture cellulaire à 24 puitsTPP92024
Plaque de culture cellulaire à 48 puitsTPP92448
Tube de 50 mlFastGeneFG2004
Antenne de 60 mmTPP93060
Plaque de culture cellulaire à 6 puitsTPP92006
A83-01Les îles Caïmans9001799
DMEM avancé/F12  ;Gibco12634010Milieu basal organoïde = DMEM avancé/F12 + GlutaMAX + 1x PS
Alexa488 anti-souris IgGInvitrogenA11029
Amphotéricine BThermoFisher15290018
Anticorps anti-Vimentine (V9)Santa CruzSC-6260Dilution 1/500 pour usage
B-27ThermoFisher17504044
Filtre à bout de bouteilleSartorius180F15
Filtre cellulaire, 100 & micro ; m poreBD Falcon352360
Collagénase, type ISIGMAC0130
Dishe enrobé de collagène de 60 mmIWAKI4010-010
Diméthyl Sulfoxyde (DMSO)Wako043-07216
Dispase IGODO SHUSEI386-02271
Eagle Medium Modifié (DMEM) de DulbeccoNacalai08459-64
ECLIPSE Ti2Nicon
Sérum fœtal bovin (FBS)SERANAS-FBS-CO-015
Milieu de croissance des fibroblastes 2PromoCellC-23020Milieu fibroblastique-1 = Milieu de croissance fibroblastique 2
G418InvivogenANT-GN-1
GlutaMAX  ;Gibco35050061
HFDM-1KSK87-160Milieu fibroblastique-2 = HFDM-1 + 1 % FBS + 1 x PS
Hoechst33342  ;Nacalai04929-82
HygromycineInvivogenANT-HG-1
Système IncuCyteEssen BioScience
Cellules L-WRNATCCCRL-3276
MatrigelCorning354234Matrice membranaire du socle = Matrigel
N2ThermoFisher17502048
N-acétyl-L-cystéineWako017-05131
NicotinamideTCIN0078
Solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS)Nacalai14249-24
PrimocinInvivogenant-pm-05
EGF humain recombinantPEPROTECHAF-100-15
FGF-10 humain recombinantPEPROTECHPEP-100-26
SB202190SelleckS1077
Scalpel, n° 11Feather8-3086-02
STEMFULLBakélite de sumitomoMS-90150Tube à faible attachement de 15 mL = STEMFULL
TrypLE ExpressGibco12605028Trypsine pour organoïde = TrypLE Express
TrypsineNacalai35556-44
Y-27632SelleckS1049

Références

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