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Article de méthode

Pathologie striatale induite par les lentiviraux comme modèle préclinique des ataxies spinocérébelleuses polyglutamine

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DOI :

10.3791/69550

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13 mars 2026

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1ABC-RI, Algarve Biomedical Center Research Institute, 2Faculdade de Medicina e Ciências Biomédicas, Universidade do Algarve, 3ABC Collaborative Laboratory: Integrated Ageing and Rejuvenation Solutions (ABC CoLAB - Ageing Better)

Dans cet article

Résumé

Les ataxies spinocérébelleuses à la polyglutamine sont causées par des expansions CAG produisant des protéines sujettes à l’agrégation. Ce protocole décrit la production de vecteurs, la délivrance stéréotaxique et l’analyse des inclusions et de la perte de marqueurs neuronaux, fournissant une plateforme contrôlée pour étudier les mécanismes et évaluer les thérapies ciblées pour les maladies neurodégénératives.

Résumé

Les ataxies spinocérébelleuses polyglutamine sont un groupe de six maladies neurodégénératives causées par une mutation du tractus trinucléotidique CAG dans la région codante de chaque gène causal. Cette mutation entraîne un étirement anormalement étendu de la polyglutamine dans la protéine, la rendant sujette à l’agrégation et entraînant la formation d’inclusions intraneuronales, caractéristiques de ces maladies. Les mécanismes moléculaires sous-jacents à la pathogenèse de ces maladies sont complexes et pas entièrement compris. Jusqu’à présent, ces maladies restent incurables. Comprendre les mécanismes moléculaires dans les régions cérébrales vulnérables est essentiel au développement thérapeutique. Des plateformes expérimentales flexibles et spécifiques à chaque région sont nécessaires pour tester rapidement les mécanismes et interventions sans le temps ni le coût de générer plusieurs lignées transgéniques, sans toutefois traiter la vulnérabilité sélective. Ces dernières années, nous et d’autres avons développé plusieurs modèles basés sur des lentiviraux pour étudier l’impact de l’expansion de l’expression protéique dans des régions spécifiques du cerveau. Ces modèles présentent des caractéristiques neuropathologiques et comportementales qui imitent certaines pathologies, soulignant leur importance pour comprendre la pathogenèse et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans cet article, nous décrivons le développement d’un modèle striatal en utilisant SCA2 comme exemple. Nous mettons en avant le développement et la production de vecteurs lentiviraux, ainsi que l’injection stéréotaxique des vecteurs exprimant la forme étendue de l’ataxine-2 (la protéine responsable de la maladie). Enfin, nous caractérisons deux principales caractéristiques neuropathologiques : la formation des inclusions et la perte des marqueurs neuronaux. En fournissant une plateforme contrôlée qui reproduit ces caractéristiques pathologiques clés, ce modèle constitue un outil précieux pour disséquer les mécanismes spécifiques à la région de la neurodégénérescence et évaluer les interventions thérapeutiques ciblées.

Introduction

Les ataxies spinocérébelleuses polyglutamine (polyQ SCA) sont un groupe de six troubles neurodégénératifs autosomiques dominants causés par des expansions répétées des trinucléotidiques CAG dans divers gènes causaux, entraînant des tractus toxiques de polyglutamine (polyQ) au sein des protéinescodées 1. Parmi eux, les SCA polyQ les plus fréquents sont la maladie de Machado-Joseph et la maladie de Machado-Joseph et la maladie de Machado-Joseph les plus fréquentes. Ces troubles affectent principalement les cellules neuronales dans des régions cérébrales spécifiques, y compris le cervelet et le tronc cérébral, ainsi que le striatum et d’autres zones. Par conséquent, ils provoquent une incoordination motrice progressive, des troubles de la marche, une neurodégénérescence sévère et une mortprématurée 3.

De nombreux modèles animaux ont été développés pour étudier les SCA polyQ et tester des approches thérapeutiques. Des souris transgéniques, des lignées knock-in et des modèles murins à expression conditionnelle ont été utilisés pour élucider la base moléculaire de la progression de la maladie et les voies cellulairesimpliquées 4,5. Cependant, la création d’un nouveau modèle animal de maladie est longue et coûteuse, et elle n’est souvent pas adaptée à l’étude de l’implication régionale du cerveau dans la pathogenèsede la maladie 6.

Les modèles murins basés sur les lentiviraux (LV) offrent une alternative complémentaire aux modèles conventionnels, avec un coût réduit et la possibilité d’étudier des régions spécifiques ducerveau 7,8. Les vecteurs lentiviraux permettent la délivrance de transgènes volumineux (jusqu’à 8 kb), ce qui permet une induction rapide de pathologies dans des régions cérébrales définies sans modification de la lignée germinale, et ils peuvent être utilisés chez des animaux de différents âges. L’injection directe de vecteurs lentiviraux dans la région cérébrale cible peut permettre une expression régionale spécifique de gènes pathogènes ou thérapeutiques avec une immunogénicité réduite par rapport à d’autres vecteursviraux 4. De plus, l’accouchement postnatal évite la compensation développementale pour étudier les mécanismes de la maladie dans des conditions qui ressemblent davantage à l’apparitionhumaine. Les niveaux d’expression peuvent être ajustés en ajustant la dose virale, en produisant des phénotypes de gravité contrôlée et en facilitant la modélisation de la progression progressive de la maladie. De plus, cette méthode permet une expression spécifique au type cellulaire selon le promoteurchoisi 4,7.

Plusieurs études ont démontré la praticité et l’utilité des modèles murins basés sur la chirurgie basse pour la modélisation des SCApolyQ 10, 11, 12, 13. Nous et d’autres avons développé des modèles basés sur le VE pour SCA111, SCA212, SCA311,12 et SCA714, constituant des plateformes pour l’expression rapide et spécifique à la région ou le silence des gènes de la maladie tout en reproduisant des aspects clés de la neuropathologie.

En résumé, l’approche lentivirale décrite ici offre un outil polyvalent et efficace pour modéliser la pathogenèse des SCA polyQ. En surmontant certains des principaux inconvénients des modèles animaux actuels, cette méthode accélère les études de preuve de concept et offre un meilleur contrôle sur l’apparition, la localisation et la gravité de la maladie – des caractéristiques qui la rendent très adaptée au dépistage thérapeutique et à l’étude des mécanismes moléculaires. Ici, nous décrivons une méthode reproductible pour générer et caractériser un modèle lentiviral striatal de l’ataxie spinocérébelleuse polyglutamine, permettant une analyse détaillée des premiers événements pathogènes et l’évaluation des traitements candidats.

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Protocole

Toutes les expériences animales ont été menées conformément aux directives Recherche animale : Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE) et au Guide des National Institutes of Health for the Care and Use of Laboratory Animals. La présente étude a été approuvée par la Direção-Geral da Alimentação e Veterinária (DGAV). Des souris C57BL/6J ont été utilisées dans cette étude et hébergées en groupe dans des cages standard sous un cycle de 12 heures de lumière et d’obscurité de 12 heures, avec nourriture et eau fournies à libitum.

REMARQUE : Les matériaux utilisés dans ce protocole sont décrits plus en détail dans le Tableau des Matériaux.

1. Emballage des vecteurs lentiviraux

REMARQUE : Toutes les procédures impliquant des vecteurs lentiviraux doivent être réalisées dans un laboratoire BSL-2 conformément aux directives de sécurité de l’institution. Nous avons utilisé le système de transfection à 4 plasmides en raison de sa biosécurité supérieure comparée à d’autres systèmes producteurs de lentiviraux (voir Figure 1 pour les détails sur le plasmide de transfert).

  1. Décongelez les cellules HEK 293T dans un bain-marie et ssemez-les dans une fiole T75 à l’aide du Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco, complété avec 2 mM de L-glutamine, 10 % de FBS et 1 % de Pen-Streptococe. Ce milieu DMEM complet était utilisé à toutes les étapes du protocole. Utilisez les cellules au passage numéro ≤10 pour garantir des titres viraux élevés et des résultats constants.
    REMARQUE : Vérifiez toujours la contamination par mycoplasma avant de procéder.
  2. Lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 % à 90 %, développez-les en 2 flasques de T175 en divisant la culture initiale 1:2. Semez 20 gamelles de culture de 100 mm avec 3,8 x 106 cellules par gamelle (volume final 10 mL) et incubez-les pendant 24 heures à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂. Compter les cellules par exclusion bleue de trypane à l’aide d’un hémocytomètre Neubauer.
    REMARQUE : Envisagez d’exclure le Pen-streptocoque du milieu afin de réduire le stress cellulaire et, par conséquent, maximiser la transfection cellulaire.
  3. Le lendemain, préparez le mélange de transfection comme décrit dans le Tableau 1. Vortex et tourner brièvement vers le bas pour homogénéiser. Incubez le mélange à température ambiante pendant 10 à 20 minutes pour permettre à l’ADN : complexes PEI de se former.
  4. Après l’ADN : les complexes PEI ont été laissés se former pendant 15 minutes à température ambiante, ajustez le mélange à 5 mL avec un DMEM complet.
    Retirez 5 mL de substrat de chaque plat de culture (moitié du volume total) et remplacez-les par 5 mL de mélange de transfection. Cela maintient le volume final de culture à 10 mL pendant la transfection.
  5. Transfecter les cellules avec les trois plasmides d’emballage et le plasmide de transfert comme décrit dans le tableau 1.
    REMARQUE : Tous les plasmides utilisés pour la production lentivirale doivent être préparés à l’aide de kits de purification sans endotoxines. De plus, l’intégrité du plasmide doit être vérifiée par analyse enzymatique de restriction afin de confirmer la justesse des régions LTR et de la cassette transgène avant la transfection.
  6. Ajoutez 5 mL de mélange à transfection goutte à goutte sur chaque assiette et faites éclore pendant 6 heures. Aspirez tout le substrat et remplacez-le par 10 mL de substrat frais. Incubez pendant 48 heures.
    REMARQUE : Pour augmenter le titre viral, collectez le milieu à 48 heures, ajoutez 10 mL de médium frais sur chaque plaque, puis recollectez après 24 heures. Le milieu précédemment collecté peut être stocké à 4 °C pendant jusqu’à 24 heures. Cela permettra une concentration deux fois supérieure au volume et augmentera le titre viral.
  7. Filtrez tout le milieu conditionné contenant des vecteurs lentiviraux à l’aide d’une unité de filtration de 0,22 μm.

2. Purification et titration des vecteurs lentiviraux

  1. Transférer le surnageant filtré dans des ultracentrifugeuses coniques appropriées et centrifuger à 65 000 x g pendant 1 h 30 min à 4 °C, en utilisant, par exemple, un rotor à seau pivotant.
  2. Écartez soigneusement le surnageant et resuspendez chaque pellet dans 400 μL de 1 % de BSA dilué dans 1x PBS, évitant la formation de bulles. Incubez sur glace pendant au moins 1 heure.
  3. Après une heure d’incubation, mélangez délicatement chaque tube pour s’assurer que les granulés sont entièrement en suspension et homogènes, puis regroupez tous les pellets resuspendus dans un seul tube.
  4. Remplissez le tube avec 1 % de BSA/PBS jusqu’à ce qu’il soit au moins deux tiers rempli pour éviter l’effondrement lors de la centrifugation.
  5. Centrifugez à nouveau à 65 000 x g pendant 1 h 30 min à 4 °C pour pelleter les vecteurs lentiviraux. Jetez soigneusement le surnageant et séchez le bord du tube avec du papier stérile.
  6. Résuspendez la pellete contenant les vecteurs lentiviraux à 45 μL de 1 % de BSA/PBS, en évitant les bulles. Scellez le tube avec un film transparent et évacuez à 4 °C pendant 24 heures.
  7. Le lendemain, préparez des aliquotes de 10 μL des vecteurs lentiviraux. Gardez une aliquote de 10 μL pour la titration : 5 μL pour le kit ELISA p24 et 2 μL pour le kit qPCR. Titrez les vecteurs lentiviraux à l’aide d’ELISA et de qPCR selon les instructions du fabricant.
    REMARQUE : Le choix de la méthode de titrage dépend des besoins expérimentaux, par exemple une évaluation rapide ou une quantification précise des unités infectieuses. ELISA basé sur p24 quantifie la protéine de la capside et mesure donc le total des particules physiques ; Il est rapide, moins coûteux que d’autres méthodes et très reproductible. Cependant, il ne distingue pas les particules infectieuses des non infectieuses, ce qui peut entraîner une surestimation du titre fonctionnel. La titrage basée sur la qPCR mesure le nombre de génomes viraux (vg) emballés en particules, fournissant une estimation plus précise des virions contenant le génome et permettant une comparaison directe entre les préparations de vecteurs. Cependant, il ne peut toujours pas évaluer l’infectiosité effective des particules virales. Enfin, les tests basés sur l’infectivité, tels que la cytométrie en flux pour les vecteurs fluorescents ou la formation de colonies résistantes aux antibiotiques, mesurent directement les unités de transduction fonctionnelle (TU/ml) et sont les plus pertinentes biologiquement, bien qu’elles soient plus laborieuses, dépendantes du type cellulaire, longues et pluscoûteuses 15,16.

3. Chirurgie stéréotaxique pour la délivrance lentivirale bilatérale dans le striatum de la souris

  1. Préparation animale
    1. Peser l’animal et calculer la dose d’anesthésie requise. Administrez l’anesthésie intrapéritonéale à une dose de 10 μL/g de poids corporel à l’aide d’une solution prête à l’emploi. Cette solution est préparée en combinant 7,5 mL de NaCl à 0,9 %, 500 μL de médétomidine (1,0 mg/mL), 1,0 mL de midazolam (5,0 mg/mL) et 1,0 mL de fentanyl (0,05 mg/mL), pour un volume final de 10 mL. Prévoyez environ 10 minutes pour une induction complète de l’anesthésie.
    2. Confirmez la profondeur de l’anesthésie (par exemple, le réflexe de pincement de l’orteil). Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux et rassez le cuir chevelu.
    3. Placez l’animal dans le cadre stéréotaxique sur un coussin chauffant. Positionnez la tête à l’aide des barres d’oreilles et de la barre de morsure.
      REMARQUE : Le nombre d’animaux à injecter et la chronologie dépendent de l’expérience et doivent être déterminés par une analyse statistique a priori basée sur les hypothèses spécifiques et les tailles d’effet attendues. Par exemple, dans notre étudeprécédente 12, les cerveaux injectés ont été analysés 4, 8 et 12 semaines après l’injection afin d’évaluer la progression des changements neuropathologiques.
  2. Préparation de la seringue et charge virale
    1. Utilisez l’aiguille Hamilton standard pour le chargement et une aiguille à pointe émoussée de 26G pour l’injection. Chargez 2 μL de solution vectorielle lentivirale dans la seringue. Assurez-vous que la dose virale par site d’injection soit de 400 ng d’antigène p24/mL, ou 5 x 109 UI/mL 10,12,17.
    2. Montez la seringue dans la pompe à microinjection automatisée (par exemple, Stoelting). Préparez la seringue en mode infusion jusqu’à ce qu’une goutte de liquide apparaisse à l’extrémité de l’aiguille. Assurez-vous que le biseau est orienté vers l’avant.
    3. Réglez les paramètres de la pompe - vitesse : 0,25 μL/min, volume par hémisphère : 2 μL, type de seringue : adapté à l’usage.
      REMARQUE : Le volume à injecter dépend de l’espèce de rongeur et de la zone cérébrale cible à transduire. Des injections de 1 μL conduisent à une expression focale, tandis que des volumes totaux plus importants (jusqu’à 10 μL) nécessitent des débits d’injection très lents et présentent un risque plus élevé de perturbation tissulaire ou de reflux.
  3. Ciblage striatal et injection
    1. Désinfectez le cuir chevelu avec 70 % d’éthanol. Réaliser une incision médiane (~1–1,5 cm) à l’aide d’une lame de scalpel stérile, de l’espace des oreilles jusqu’aux yeux.
    2. Exposez et nettoyez le crâne, en retirant le périoste avec des coton-tigeons. Localiser Bregma et enregistrer le point zéro stéréotaxique (manuellement ou numériquement).
    3. Déterminer les coordonnées d’injection par rapport à Bregma (pour une souris de 8 à 12 semaines d’environ 18 à 20 g) : Antéro-postérieur (AP) +0,6 mm ; Médiolatérale (ML) ±1,8 mm ; Dorso-ventral (DV) : –3,3 mm.
    4. Entraînez-vous prudemment aux coordonnées AP/ML indiquées. Procédez lentement pour éviter de pénétrer le cerveau. Sinon, arrêtez une fois que l’os est suffisamment aminci – cela s’explique par la visualisation des vaisseaux sanguins dans la dure-mère à travers le crâne. Perforez soigneusement la dure-mère avec une petite aiguille.
    5. Vérifiez que le trou est bien placé en abaissant l’aiguille d’injection. Testez l’obstruction de l’aiguille en injectant une partie de la solution jusqu’à ce qu’une goutte soit clairement visible.
    6. Baissez lentement l’aiguille d’injection jusqu’à la coordonnée DV. Injecter 2 μL de solution virale par hémisphère à 0,25 μL/min. Après l’injection, attendez 5 minutes avant de rétracter lentement l’aiguille pour éviter le reflux.
    7. Injecter le lentivirus codant pour la protéine de type sauvage (ATXN2WT ou ATXN3WT) dans un hémisphère et le lentivirus codant pour la protéine mutante/étendue (ATXN2MUT ou ATXN3MUT) dans le côté controlatéral (randomisé ou prédéfini)12,13.
      REMARQUE : En utilisant l’atlascérébral de la souris 18, pratiquement toutes les régions cérébrales peuvent être ciblées stéréotaxialement au-delà du striatum, y compris le cortex, l’hippocampe, la substance noire et le cervelet. Parce que le cervelet est le site principal de pathologie dans les SCA, il représente une cible particulièrement pertinente pour la délivrance de vecteurs. Pour le développement de ce modèle murin SCA3 cérébelleux, nous avons utilisé des coordonnées 1,6 mm rostral à lambda, 0 mm de la ligne médiane, et 1 mm ventral à la surface du crâne, avec la barre buccale réglée à −3,3, assurant une ciblisation précise du cortexcérébelleux 12,15.
  4. Surveillance pendant l’opération
    1. Surveillez les mouvements des moustaches et les réflexes. Si un mouvement est observé, administrez une dose d’anesthésie supplémentaire (un tiers du volume initial).
  5. Fermeture de la plaie et récupération
    1. Fermez l’incision avec 3 à 5 points de suture nylon 5-0 interrompus. Administrez un mélange de médicaments antagonistes par voie sous-cutanée à une dose de 10 μL/g de poids corporel afin d’inverser les effets des anesthésiques initiaux. Cette solution est préparée en combinant 1,5 mL de NaCl à 0,9 %, 500 μL d’atipamézole (5,0 mg/mL), 5,0 mL de flumazénil (0,1 mg/mL) et 3,0 mL de naloxone (0,4 mg/mL), pour un volume final de 10 mL.
    2. Placez l’animal dans une cage de récupération propre au-dessus d’un coussin chauffant et surveillez-le toute la nuit.
      REMARQUE : La salle d’injection devrait idéalement être équipée d’une armoire de sécurité biologique pour la manipulation des vecteurs. Les chercheurs doivent porter un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, y compris une blouse de laboratoire, des gants et une protection oculaire. Tous les déchets (par exemple, aiguilles, seringues et matériaux contaminés) doivent être éliminés dans des contenants à biohazard conformément aux réglementations institutionnelles et nationales.

4. Collecte, préparation et traitement des tissus

  1. Préparation
    1. Préparez tous les instruments de dissection et les solutions nécessaires pour l’euthanasie et la collecte de tissus chez la souris (par exemple, anesthésie, paraformoldéhyde à 4 % [PFA] dans le PBS).
    2. Préparez 4 % de PFA à l’avance, conservez-le congelé, puis décongelez au maximum 24 heures avant utilisation. Assurez-vous que la solution est bien refroidie avant la perfusion.
      ATTENTION : Le PFA est toxique. Manipulez uniquement à l’intérieur d’une hotte avec un équipement de protection individuelle (EPI) approprié et une formation appropriée.
    3. Administrez une dose létale de pentobarbital (100–200 mg/kg, intrapéritonéale) pour anesthésier l’animal. Confirmer l’anesthésie profonde en l’absence du réflexe de pincation des orteils ; Si le réflexe persiste, administrez une dose supplémentaire.
  2. Perfusion transcardique
    1. Positionnez et sécurisez l’animal dans l’appareil de dissection. À l’aide de pinces, soulevez la peau abdominale et effectuez une incision verticale ascendante avec des ciseaux (Figure 2A, flèche rose).
    2. Soulevez le fascia superficiel et faites une incision supérieure jusqu’à ce que le foie soit visible, évitant ainsi les blessures des organes abdominaux.
    3. Coupez le diaphragme horizontalement, puis étendez l’incision vers l’aisselle (Figure 2A, flèche blanche). Réfléchissez et maintenez la paroi thoracique.
    4. Insérez une aiguille de perfusion à l’apex du ventricule gauche, en veillant à ce qu’elle ne perce pas la paroi ventriculaire. Faites une petite incision dans l’oreillette droite avec des ciseaux fins (Figure 2B).
    5. Commencez la perfusion transcardique avec 50 mL de paraformoldéhyde (PFA) glacé à 4 % à un débit de 1 à 2 mL/min.
      REMARQUE : Souvent, la solution froide provoque des recourbes de la queue et des contractions musculaires, ce qui est un signe d’une bonne perfusion.
  3. Dissection cérébrale
    1. Préparez un tube contenant suffisamment de PFA à 4 % pour submerger complètement le cerveau. Décapitez la souris avec de gros ciseaux. Jetez le corps dans un sac biohazard scellé pour l’incinération.
    2. Réfléchissez le cuir chevelu pour exposer le crâne. Identifiez le foramen magnum et commencez à retirer le crâne en coupant latéralement avec de fines ciseaux, parallèlement au cerveau (Figure 2C).
    3. Répétez du côté controlatéral, puis découpez le crâne entre les yeux au-dessus des bulbes olfactifs.
    4. Soulevez le crâne du cervelet vers les bulbes olfactifs pour exposer le cerveau. À l’aide d’une spatule, retirez soigneusement le cerveau de l’antérieur vers l’avant et immergez-le dans un PFA à 4 % pendant un maximum de 24 heures à 4 °C.
    5. Remplacer la solution d’immersion par 20 % à 30 % de saccharose dans le PBS et incuber à 4 °C jusqu’à la fin de l’infiltration. Le cerveau flotte d’abord puis coule une fois complètement infiltré, généralement dans les 24 heures. S’il reste à flot, prolongez l’incubation jusqu’à ce qu’il se stabilise au fond du tube.
      REMARQUE : Cette étape de cryoprotection minimise les artefacts de congélation en réduisant la teneur en eau des tissus.
      Séchez doucement le cerveau et le tube, puis conservez à -80 °C jusqu’à une utilisation supplémentaire.
  4. Cryosection et collecte de tissus flottants
    1. Avant la coupe, réglez le cryostat à -20 °C et à l’épaisseur souhaitée.
      REMARQUE : Pour le striatum, les coupes coronales d’une épaisseur de 20 à 25 μm offrent un compromis idéal entre préservation structurelle et pénétration des anticorps, produisant des sections suffisamment robustes pour la manipulation tout en maintenant une haute qualité de coloration et une haute résolution spatiale. Les conditions de cryosection doivent également être spécifiées pour d’autres régions cérébrales, car l’épaisseur optimale peut varier selon la cytoarchitecture. Pour le cervelet, des sections sagittales de 25 à 35 μm sont généralement recommandées, car cette épaisseur préserve l’organisation en couches du cortex cérébelleux.
    2. Transportez le cerveau sur de la glace sèche et laissez-le s’équilibrer à l’intérieur du cryostat pendant 5 à 10 minutes. Cette étape est importante pour prévenir les dommages tissulaires.
    3. Retirez les bulbes olfactifs avec un scalpel ; Ils doivent être doux et faciles à couper. Appliquez une goutte de T.O.C. frais de la taille d’un pois sur le disque de l’échantillon et placez le cervelet en contact (Figure 1D). Positionnez le cerveau pour la césarisation coronale. Une fois congelé, ajoutez un T.O.C. supplémentaire pour implanter tout le cerveau.
      NOTE : L’O.C.T. est transparent à température ambiante et devient blanc opaque une fois complètement congelé ; Si elle reste brillante, laissez plus de temps de congélation dans le cryostat.
    4. Montez le disque de spécimen dans le support et taillez jusqu’à ce que le striatum (deux cercles blancs dans chaque hémisphère) soit visible. Si les hémisphères ont reçu des traitements différents, percer un hémisphère avec une aiguille pour maintenir l’orientation. Note ceci pour une analyse ultérieure.
    5. Passez en mode sectionnement et collectez des sections flottantes dans une plaque à 48 puits à l’aide d’un pinceau fin ou d’une pipette Pasteur en verre poli au feu.
      REMARQUE : La méthode de flottement libre améliore la pénétration des anticorps, réduit le fond de corps, permet un stockage à long terme et assure des sections espacées uniformément pour une couverture striatale complète.
    6. Remplir les puits avec du PBS contenant 0,05 % d’azide de sodium.
      ATTENTION : L’azide de sodium est toxique – manipulez avec des EPI et éliminez les déchets de manière appropriée.
    7. Placez la première section dans le puits A1, la seconde dans A2, et continuez dans l’ordre. Lorsque la plaque est pleine, il faut soit continuer dans une nouvelle plaque, soit revenir au puits A1 et continuer jusqu’à ce que tout le striatum soit sectionné (~3 plaques complètes à 48 puits). Scellez les plaques avec un film transparent et conservez à 4 °C jusqu’à utilisation.
      REMARQUE : Pour l’analyse du striatum entier, choisir une colonne de la plaque donne des sections espacées uniformément représentatives de toute la région.

5. Immunohistochimie avec coloration DAB

  1. Lavez les sections 3 fois dans du PBS pour éliminer l’azide de sodium résiduel. Incubez dans une solution de phénylhydrazine (0,2 - 0,3 mg/mL dans PBS) pendant 30 minutes à 37 °C.
    ATTENTION : La phénylhydrazine est cancérigène – effectuez cette étape dans une hotte à fumée et éliminez les déchets comme dangereux.
  2. Laver 3 fois dans PBS pendant 5 min, 10 min, 10 minutes de façon séquentielle. Bloquez le tissu pendant 1 heure au TR dans un PBS contenant 10 % de sérum de chèvre normal (NGS) et 0,1 % de Triton X-100.
  3. Incubez toute la nuit à 4 °C avec un anticorps primaire dans la dilution recommandée (par exemple, anti-ataxine-2 de souris, 1:1000 en solution bloqueante) sous une agitation douce. Laver 3 fois dans PBS pendant 5 min, 10 min, 10 minutes de façon séquentielle.
  4. Incuber avec un anticorps secondaire biotinylé (1:200 en solution bloqueante) pendant 2 heures à la RT sous agitation légère. Laver 3 fois dans PBS pendant 5 min, 10 min, 10 minutes de façon séquentielle.
  5. Incuber dans un complexe ABC pendant 30 à 40 minutes à la RT. Laver 3 fois dans le PBS pendant 5 min, 10 min, 10 min et 10 min séquentiellement.
  6. Préparer la solution DAB fraîche : pour 2,5 mL d’eau ultrapure, ajouter 1 goutte de tampon et de vortex ; ajouter 2 gouttes de DAB et de vortex ; Ajoute 1 goutte de H₂O₂ et recommence le vortex.
    ATTENTION : Le DAB est cancérigène – manipulez dans une hotte à fumée et jetez correctement les déchets.
  7. Développer des coupes en solution DAB individuellement jusqu’à atteindre l’intensité de coloration souhaitée (généralement 1 à 10 minutes). Arrêtez immédiatement la réaction en transférant vers PBS.
    REMARQUE : La réactivité au DAB diminue avec le temps ; Travailler efficacement. Si plusieurs sections sont présentes dans le puits à la fois, assurez-vous qu’elles ne sont pas en contact, car cela influencera le processus de coloration.
  8. Laver 3 fois dans PBS pendant 5 min, 10 min, 10 minutes de façon séquentielle. Montez les sections sur des lames recouvertes de gélatine et laissez-les sécher complètement. Ne pas étiqueter les lames avec un crayon graphite, car cela pourrait interférer avec l’imagerie.
  9. Déshydrater, clair et couper comme suit : immerger dans de l’eau distillée pendant 30 secondes, déshydrater par série d’éthanol : 75 %, 96 %, 100 % (3 min chacun). Clair dans un substitut de xylène pendant 5 minutes et séchage à l’air libre. Appliquez la gaine de couverture avec un support de montage à durcissement rapide et laissez-la durcir à l’intérieur de la hotte pendant au moins 24 heures avant d’imager ou de stocker.

6. Quantification du volume appauvri par DARPP-32 dans le striatum de la souris à l’aide de FIJI (ImageJ)

  1. Acquisition d’images
    1. Capturez des images des coupes cérébrales coronales couvrant tout le striatum (environ Bregma +1,0 à –0,5 mm). Maintenez un éclairage, un grossissement (par exemple, 10x) et une résolution constants. Sauvegardez les images au format TIFF avec des noms de fichiers séquentiels (par exemple, Striatum_Bregma_+0.5.tif).
  2. Préparation d’images aux FIJI
    1. Ouvrez chaque image dans FIJI. Calibrez la taille des pixels : allez dans Analyser > définir l’échelle. Utilisez une échelle connue à partir d’un micromètre ou des métadonnées de l’image (par exemple, 1 pixel = 1 μm).
    2. Convertir les images en 8 bits : Image > Type > 8 bits. Ajustez la luminosité/contraste si nécessaire pour une visualisation optimale de la zone épuisée (évitez le seuil à cette étape).
  3. ROI sélection des zones appauvries
    1. Utilisez l’outil Polygone, Au Vol Libre ou Pinceau pour délimiter la région appauvrie en DARPP-32 (généralement plus légère ou sans coloration dans le striatum). Va dans Analyser > Mesure pour enregistrer la surface enμm 2.
    2. Sauvegardez le ROI en allant dans ROI Manager > Ajouter > Plus > Sauvegarder ou utiliser la fonction Multi-mesures pour l’analyse par lots.
    3. Répétez pour toutes les sections cérébrales concernées.
  4. Calcul du volume épuisé
    1. Multipliez la surface épuisée dans chaque section par la distance entre les sections (typiquement 120 à 240 μm, selon l’épaisseur et l’espacement des sections).
      Volume par section (mm3) = Surface appauvrie (mm2) × Intervalle de section (mm)
    2. Sommez le volume sur toutes les sections :
      Volume total épuisé (mm3) = Σ (surface × intervalle)
    3. Optionnel : Superposition pour la visualisation. Utilisez l’Image > Overlay > From ROI pour visualiser les régions appauvries à travers les sections. Exportez une image résumée ou une animation pour les figurines.
  5. Vérifiez toujours l’alignement avec l’atlas cérébral de la souris pour une cartographie rostro-caudal précise. Analysez chaque hémisphère séparément pour distinguer les effets unilatéraux (par exemple, WT vs injection mutante).

7. Quantification des agrégats protéiques dans le striatum de la souris

  1. Quantification manuelle à l’aide de FIJI
    1. Chargez et calibrez l’image. Ouvrez l’image en FIJI. Calibrez la taille des pixels (sautez cette étape si vous utilisez des images avec des métadonnées).
    2. Va dans Analyser > définir l’échelle, saisi la distance connue (par exemple, 1 pixel = 0,5 μm). En FIJI, allez dans Plugins > Analyser > compteur de cellules > compteur de cellules. Cliquez sur Initialiser, puis sélectionnez l’image.
    3. Choisissez un type de marqueur (par exemple, Type 1) pour les granulats. Cliquez manuellement sur chaque agrégat visible pour l’étiqueter. Données d’enregistrement : FIJI affichera le comptage dans le panneau Compteur de cellules. Comptez les enregistrements pour chaque image/section. Exportez les comptes manuellement ou utilisez une macro pour compiler les résultats.
  2. Quantification semi-automatisée utilisant IHCAggreCount
    1. Téléchargez et traitez les images. Ouvrez IHCAggreCount et cliquez sur Télécharger l’image (Figure supplémentaire 1).
      REMARQUE : L’application IHCAggreCount a été développée par notre laboratoire comme un outil scientifique autonome conçu pour rationaliser et standardiser la quantification des agrégats cellulaires à partir d’images microscopiques. Le logiciel a été entièrement construit en Python avec une architecture modulaire qui sépare la gestion des images, le traitement, la correction de sélection, le calcul des mesures, et autres. IHCAggreCount est entièrement compatible avec Windows 10 et Windows 11, ainsi qu’avec macOS 13 Ventura et macOS 14 Sonoma, et a été testé avec succès sur les deux plateformes. Comparé aux méthodes manuelles conventionnelles d’inspection d’image, le logiciel offre des avantages analytiques significatifs : il réduit la subjectivité de l’utilisateur, élimine les étapes manuelles répétitives, accélère le traitement des images, assure des mesures reproductibles, permet une extraction cohérente par région d’intérêt et permet un traitement en lots de plusieurs environnements. Dans l’ensemble, l’application offre un flux de travail plus rapide, objectif et plus robuste pour la détection et la quantification des globules que l’approche manuelle traditionnelle. La demande est disponible auprès des auteurs sur demande raisonnable.
    2. L’image apparaîtra dans l’affichage de l’image originale. Naviguez jusqu’à l’onglet Traitement. Appliquez HiLo pour améliorer les agrégats/contraste de fond (voir Figure 2 supplémentaire). Appliquez un seuil de luminosité pour filtrer les agrégats de l’arrière-plan (Figure supplémentaire 3). Utilisez le filtre de taille minimale pour éliminer les petites particules (bruit) (Figure supplémentaire 4). Éventuellement, appliquer le seuil de rondeur pour exclure les formes non agrégées (Figure supplémentaire 5).
    3. Pour la détection d’agrégats IHC, allez dans l’onglet Général et cliquez sur Calculer les agrégats totaux et Calculer la surface d’agrégats. Tous les agrégats détectés sont mis en évidence et listés dans le tableau matriciel (ID, superficie, taille moyenne ; Figure supplémentaire 6).
  3. Corrections manuelles (optionnelles)
    1. Allez à l’onglet correction, utilisez Smart Add pour détecter automatiquement les agrégats dans certaines régions (Figure supplémentaire 8). Utilisez l’ajout manuel pour étiqueter manuellement les agrégats. Utilisez la suppression intelligente pour supprimer les labels indésirables. (Les granulats surlignés sont affichés pour inspection visuelle ; Figure supplémentaire 7).
  4. Résultats à l’exportation
    1. Cliquez sur Exporter CSV pour exporter les données de l’image actuelles. Cliquez sur Exporter tout pour exporter par lots des données provenant de plusieurs images analysées. Analysez toujours les images sous les mêmes réglages de luminosité/contraste et d’autres paramètres (par exemple, seuil) entre les groupes expérimentaux dans IHCAggreCount.

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Résultats

Cette étude a permis d’identifier avec succès l’expression de l’ataxine-2 et du DARPP-32 en utilisant le protocole actuel. Après injection stéréotaxique de vecteurs lentiviraux dans le striatum de souris C57BL/6J, une expression robuste d’ataxine-2 de type sauvage et mutante a été détectée après 12 semaines. Nous avons déjàmontré à 12 que ces constructions sont spécifiques aux neurones, ce qui transduit en moyenne 20 000 neurones parmm3. Dans n...

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Discussion

Cet article décrit la génération d’un modèle murin lentiviral striatal pour une SCA polyQ. Il décrit également la production de vecteurs lentiviraux à haut titre codant pour la forme sauvage et étendue de la protéine causale, ainsi que l’injection bilatérale des VE dans le striatum de la souris par chirurgie stéréotaxique. De plus, il décrit la procédure de collecte du cerveau, le traitement histologique et la quantification par image des signes de la maladie. Ensemble, ces méth...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Le laboratoire de Clévio Nóbrega est financé par le projet Cure CSB, par l’Association Viljem Julijan pour les Enfants atteints de Maladies Rares (Slovénie), et par l’Institut de Recherche du Centre Biomédical de l’Algarve (ABC-Ri). Certains des auteurs de cet article disposent d’une bourse de doctorat financée par la Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), avec les références suivantes : Tiago Moreira-Gomes (2022.11008.BD), Inês T Afonso (2022.10161.BD) et Rafael G Costa (2022). 11973.BD).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,9% NaClFournisseur local—Utilisé pour la préparation des mélanges d'anesthésie et d'antagonistes
Plats de culture tissulaire de 100 mmSPL Life Sciences11090
Kit ABC (complexe Avidine-Biotine)VECTASTAIN Elite
Atipamézole (5,0 mg/mL)Fournisseur local—Antagoniste de la médetomidine
Centrifugeuse de table--
Cabine de biosécurité, Classe II (conforme BSL-2)--
Anticorps secondaire biotinylé--
Albumine sérique bovine (BSA)NZYTechMB47002
Sections cérébrales (par exemple, sections coronales de 30–40 µm) immunomarquées pour DARPP-32--
Plugin Cell Counter (FIJI)Intégré / ImageJ—Outil pour le comptage manuel des agrégats
Incubateur CO2 (37 °C, 5% CO2, humidifié)--
Station de travail informatiqueFournisseur local—Utilisé pour le traitement d'images et l'exécution des logiciels
Tubes de centrifugation ultra pour coniquesBeckman Coulter358126
Tampons de cotonFournisseur local—Utilisé pour le retrait du périoste
Cryostat avec support de disque spécimen--
DAB (Diaminobenzidine)--
Lecteur de coordonnées stéréotaxiques numériqueStoelting/WPI51725Affichage numérique pour la mesure des coordonnées
Milieu amélioré de Dulbecco pour oiseaux de type poule (DMEM, glucose élevé)Gibco/Thermo Fisher11-965-092
Éthanol 70, 96 et 100%--
Éthanol, 70%Fournisseur local—Pour la désinfection du cuir chevelu
Fentanyl (0,05 mg/mL)Fournisseur local—Composant anesthésique
Sérum bovin fœtal (FBS), inactivé par la chaleurGibco/Thermo Fisher10500064
FIJI (distribution ImageJ)NIH / ImageJhttps://fiji.sc/Logiciel open-source pour la quantification manuelle des agrégats
Pinces fines (pour la pince du doigt)Fournisseur local—Pour la surveillance de la profondeur de l'anesthésie
Flumazénil (0,1 mg/mL)Fournisseur local—Antagoniste du midazolam
Pinces et scalpelFournisseur local—Pour le retrait du périoste et l'exposition du crâne
Seringues microlitre/étanches au gaz Hamilton Séries 700/1700Hamilton / Fisher Sci.7653-01/10550203Pour le chargement de solution virale
Aiguilles Hamilton à petit moyeu amovibles (26G)Hamilton / Fisher Sci.7804-03/ 10698205Pour l'administration virale
Coussinet chauffant (pour les rongeurs)Kent Scientific / SOMNIpar exemple 04-777-177Pour maintenir la température corporelle
Cellules HEK 293T (≤ passage 10, sans mycoplasme)ATCC ou équivalentCRL-3216
Peroxyde d'hydrogène--
Logiciel IHCAggreCountFourni sur demandeN/ALogiciel interne propriétaire pour la détection et la quantification semi-automatisées des agrégats
Microscope inversé (pour la confluence cellulaire)--
Mélangeur vortex de laboratoire--
Vecteurs lentiviraux (WT et mutants)En interne / Installation centraleN/ASolution virale pour injection
L-glutamine (200 mM)Gibco/Thermo Fisher25030081
Microscope optique avec caméra (champ clair)--
Médetomidine (1,0 mg/mL)Fournisseur local—Composant anesthésique
Micro-perceuse (compatible stéréotaxique)Stoelting / Fournisseur local—Pour la craniotomie
Pompe de microinjection (par exemple, Stoelting)Stoelting/WPI53210Pompe d'infusion automatisée pour les injections virales
Micropipettes (P1000, P200, P10) et embouts--
Images de microscopie (sections IHC)Générées en interneN/AImages d'immunohistochimie à analyser
Lamelles de microtome (à profil bas, jetables)--
Midazolam (5,0 mg/mL)Fournisseur local—Composant anesthésique
Médium de montage--
Naloxone (0,4 mg/mL)Fournisseur local—Antagoniste du fentanyl
Porte-aiguille et aiguilles de dissection fines--
Sérum de chèvre normal (NGS)--
Composé O.C.T.Tissue-Tek
Pommade ophtalmique (Bepanthen Eye and Nose Ointment, 5% Dexpanthenol)Bayer11568-0053Prévient le dessèchement de la cornée pendant la chirurgie
Mélangeur orbital--
Kit ELISA p24ZeptoMetrix0801111
Parafilm--
Paraformaldéhyde (PFA)--
PBS--
PBS sans Ca2+/Mg2+, pH 7,0Gibco/Thermo Fisher10-010-031
pCMV-dR8.2AddgenePlasmid #12263
Penicilline-Streptomycine (100×)Gibco/Thermo Fisher15140122
Pentobar

Références

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