Analyse de profilage de thrombus : une plateforme basée sur la microfluidique pour caractériser de manière exhaustive la thrombogenèse biomécanique

Summary

Ce travail décrit un test microfluidique qui utilise la contrainte de cisaillement pour déclencher la formation de thrombus dans le sang et caractérise le thrombus par plusieurs dimensions de lecture. Ce test peut mesurer la tendance prothrombotique des échantillons sanguins, et est donc utile pour le diagnostic des maladies, la découverte de médicaments, ainsi que pour les études mécanistes fondamentales liées à la thrombose.

Abstract

La thrombose est une pathologie qui décrit l’accumulation anormale de plaquettes et de facteurs de coagulation dans un vaisseau sanguin. Bien que de nombreux travaux se concentrent sur l’activation des plaquettes par les agonistes solubles comme mécanisme sous-jacent de la thrombose, il a souvent été négligé que le flux sanguin facilite également la formation de thrombus. En particulier, dans les artères, la thrombose est généralement associée à une sténose artérielle, qui augmente la contrainte de cisaillement dans le flux sanguin et facilite le processus de thrombogenèse, un phénomène appelé thrombogenèse biomécanique. Pendant longtemps, aucun biotest n’était disponible pour fournir des informations globales et détaillées sur le processus de thrombogenèse biomécanique. Pour y remédier, un test de profilage du thrombus a été développé en combinant la microfluidique avec l’imagerie à fluorescence multicolore, permettant une caractérisation complète de la thrombogenèse biomécanique avec sept lectures couvrant la taille et la composition du thrombus ainsi que le niveau d’activation des plaquettes. Ce test de profilage des thrombes peut être utilisé pour évaluer la tendance prothrombotique chez l’humain et l’efficacité des agents antithrombotiques, et il est également utile pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la thrombose artérielle.

Introduction

La thrombose est une cause principale de maladies cardiovasculaires, responsable de millions de décès dans le monde chaque^année. Actuellement, aucun biotest n’est disponible dans les contextes cliniques standards pour évaluer les risques de thrombose. Parmi les tests de fonction hématologique en laboratoire et au point de soins, les tests de coagulation conventionnels et l’agrégométrie se sont révélés peu fiables pour prédire la thrombose ou les événements cardiovasculaires indésirables^{majeurs 2,3,4}. Les tests de throm....

Protocol

Ce protocole suit les directives et a été approuvé par le Comité d’éthique de la recherche humaine de la branche médicale de l’Université du Texas. Le matériel expérimental comprend un dispositif microfluidique, des composants de perfusion (connecteurs, tubes, seringue et pompe à seringue), et un microscope inversé avec des composants optiques permettant l’imagerie en champ clair et à fluorescence multicolore. Un phare multi-LED et un cube filtre à passes multiples sont utilisés au microscope pour diviser 4 canaux fluorescents avec un minimum de débordement mutuel : excitation : 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, et émission : 435/30, 51....

Results

Le test de profilage du thrombus perfusionne le sang à travers un canal sténotique pour permettre la formation du thrombus par cisaillement, et réalise une imagerie de fluorescence multicolore en temps réel pour collecter des informations multidimensionnelles sur le thrombus formé. En réalisant des expériences utilisant à la fois les capteurs Set 1 et Set 2, il est possible de caractériser le thrombus sous des aspects tels que la taille, l’enrichissement des protéines réticulantes (facte.......

Discussion

En combinant le test de sténose microfluidique avec l’imagerie à fluorescence multicolore, le test de profilage du thrombus offre une approche pratique et puissante pour étudier la thrombogenèse biomécanique et la mécanobiologie des plaquettes. Par contre, le test est utile dans un large éventail d’applications. Par exemple, elle peut être utilisée pour dépister des agents antithrombotiques qui inhibent spécifiquement l’agrégation biomécanique des plaquettes, où la cible moléculaire et l.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seringues de 10 mL	Henke Sass Loup	5100-X00V0	Prélèvement de sang
Tubes Falcon de 15 mL	Genesee Scientific	28-101	Stockage des échantillons de sang
Seringue en verre étanche au gaz de 1 mL	Hamilton	81331	Assemblage matériel
2.2.9	MERU VasImmune		Coloration par thrombus
Aiguilles sondes 20 X1/2	McMaster-Carr	M919	Création de dispositifs PDMS
Seringues de 20 mL	Henke Sass Loup	5200-X00V0	Prélèvement de sang
70 % d’éthanol	Sigma-Aldrich	EX0281-1	Désinfection des seringues étanches et nettoyage des lames en verre
AK4-Alexa Fluor 647	BioLegend	304918	Coloration par thrombus
Alexa Fluor 405 NHS Ester	Invitrogen	A30000	Marquage du fibrinogène
Kit d’affichage des anticorps Alexa Fluor 555	Invitrogen	A88065	Étiquetage MBC 370.2 et 2.2.9
Annexin V-Pacific Blue	Invitrogen	501121505	Coloration par thrombus
Vaporisateur de nettoyage	Office Depot	911245	Création de dispositifs PDMS
Ensemble de couteaux de loisir créatif avec boîte en bois	Excel Blades	44282	Création de dispositifs PDMS
Eau déionisée   ;	ThermoFisher Scientific & nbsp ;	751-628	Lavage des seringues étanches au gaz
Dessiccateur	Bel Art	F420270000	Dégazage des PDMS
Spatule de laboratoire multifonction jetable	LevGo	17211	Mélanger la base élastomère en silicone et l’agent de durcissement   ;
Colonne de filage pour l’élimination des colorants et de la biotine	Zeba	A44296S	Marquage du fibrinogène
Fibrinogène	Recherche innovante	IHUFBG25MG	Coloration par thrombus
Pompe à seringue Fusion 200-X	Chemyx Inc.	0720X	Assemblage matériel
Héparine & nbsp ;	Sigma-Aldrich	H3149	Anticoagulation par échantillon sanguin
Générateur à haute fréquence	Electro-technic product Inc.	BD-20	Création de dispositifs PDMS
Monomère VWF humain	Sino Biological Inc.	10973-H08C	Revêtement microfuidique de dispositif
Logiciel Image J v1.53	Fidji, Institut national de la santé		Analyse des données
Microscope inversé	Leica	DM IL A DIRIGÉ ; cube filtre : Leica DFT51010 ; phare : LED5	Assemblage matériel
Kimwipes	Kimberly-Clark Professionnelle	34120	Nettoyage des lames en verre
Capsules de verrouillage Luer	International Medical Industries, Inc.	57100B	Prélèvement de sang
MBC 370.2	Kerafast	EBW104	Coloration par thrombus
Lunettes de couverture microscope	Paul Marienfeld GmbH & ; Comté KG	ES0107222	Création de dispositifs PDMS
Racloir à Mini-Lame de Rasoir	Stanley	28-100	Création de dispositifs PDMS
Spectrophotomètre UV-Vis NanoDrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000	Concentration de protéines et mesure du rapport F/P
Four	Instruments de laboratoire	3512	Création de dispositifs PDMS
PAC-1-Alexa Fluor 647	BioLegend	362806	Coloration par thrombus
Tasse en plastique	ThermoFisher Scientific & nbsp ;	S04589	Mélanger la base élastomère en silicone et l’agent de durcissement   ;
SU-8 photorésine maître & nbsp ; Moisissure	Installation de salle blanche de nanofabrication Nano3 de l’UC San Diego		Création de dispositifs PDMS
Kit Sylgard 184 en élastomère en silicone	Krayden Dow	DC4019862	PDMS
SZ22-FITC  ;	Beckman Coulter	IM 1756U	Coloration par thrombus
Tubulure	Cole - Palmer Instrument Co.	06422-01	Assemblage matériel