Article de méthode

Analyse des traceurs isotopiques stables de la vitamine A utilisant LC-MS/MS

684 vues

⸱

DOI :

10.3791/69558

⸱

30 décembre 2025

 ,  ,  , 
1Human Nutrition and Exercise Research Centre, Newcastle University, 2Newcastle University Centre for Cancer, 3Fera Science Ltd

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour quantifier simultanément les rétinoïdes marqués isotopiquement et natifs dans le plasma humain, en utilisant LC-MS/MS, avec des limites de détection de 6 fmol sur colonne. La méthode intègre une procédure d’extraction d’échantillons simple et un temps d’exécution analytique court, permettant un débit élevé d’échantillons.

Résumé

La méthode de dilution isotopique du rétinol (RID) estime les réserves totales de vitamine A (TBS) chez l’humain grâce à une dilution isotopique stable avec le réservoir de vitamine A du corps. Pour cela, il est essentiel de déterminer avec précision et efficacité le rapport isotopique plasmatique entre le rétinol marqué et le rétinol non marqué par spectrométrie de masse. Pour éviter des procédures d’extraction et/ou de purification longues et longues, telles que la HPLC préparative et la dérivétaisation, le LC-MS/MS est utilisé pour effectuer des analyses rapides, sensibles et simultanées des rétinoïdes marqués et non marqués. La méthode utilise deux niveaux de détection : (i) une séparation initiale masse/charge (m/z) des ions parents (précurseurs), suivie de (ii) la détection des ions fils (produits) fragmentés. Cela entraîne une forte sensibilité, avec des limites de détection du rétinol aussi basses que 6 fmol en colonne. Malgré les avantages de la spectrométrie de masse en tandem, une séparation chromatographique liquide est nécessaire pour séparer le rétinol des esters rétinyles, car les groupes fonctionnels terminaux sont perdus lors de l’ionisation, ce qui entraîne des motifs de fragmentation des ions parents (m/z de 269) et filles similaires. L’article décrit l’isolation du rétinol endogène et marqué (13C ou 2H) du plasma par extraction au solvant, suivie de la quantification par LC-MS/MS sous ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) en mode ion positif.

Introduction

La vitamine A est un nutriment liposoluble essentiel à la santéhumaine 1. La carence en vitamine A augmente la susceptibilité à la morbidité infectieuse sévère et à la mortalité et est estimée à une prévalence mondiale de 29 %, avec des niveaux plus élevés en Afrique subsaharienne (48 %) et en Asie du Sud (44 %). La supplémentation en vitamine A est une stratégie efficace pour réduire la mortalité infantile excessive, en particulier dans les zones à haut risque comme l’Afriquesubsaharienne 3. Cependant, l’introduction d’une supplémentation semestrielle en vitamine A combinée à une enrichissement à grande échelle en vitamine A des aliments de base et la distribution de poudre de micronutriments, souvent gérées par différentes entités publiques et privées, a le potentiel d’exposer les individus à un apport excessif en vitamineA 4,5,6,7,8,9,10 . Ainsi, les biomarqueurs de la vitamine A devraient idéalement pouvoir couvrir tout le spectre de la vitamine A, de la carence à la toxicité. La méthode de dilution isotopique du rétinol (RID) est actuellement la méthode indirecte la plus précise pour évaluer les réserves totales de vitamine A par le corps chezl’humain 11,12,13 et a été validée par rapport aux concentrations hépatiques de vitamine A, considérée comme le meilleur marqueur biochimique du statut de vitamineA 14,15. La méthode repose sur le principe qu’une dose orale de tracante de vitamine A stable marquée par un isotope se mélange à la vitamine A non marquée (la trace) dans des pools corporels échangeables. La mesure de l’activité spécifique du rétinol plasmaque (c’est-à-dire le rapport entre le traceur de rétinol marqué et le rétinol total dans le plasma (traceur/trace dans le plasma)) à un moment précis après le dosage permet d’estimer le statut de la vitamine A à l’aide d’une équationRID 11,12,13.

Pour déterminer des concentrations précises et précises de traceurs et traces de rétinol dans le plasma, diverses méthodes ont été appliquées pour quantifier la vitamine A stable marquée par isotopes, notamment la chromatographie gazeuse par spectrométrie de masse (GC-MS), la spectrométrie de masse à rapport isotopique (IRMS) et la chromatographie liquide en tandem spectrométrie de masse (LC-MS/MS)16,17,18,19,20,21,22.23, 24, 25, 26. Il est important de noter que LC-MS/MS combine haute sensibilité, spécificité et simplicité opérationnelle avec la capacité de mesurer directement à la fois le rétinol natif et marqué dans des matrices complexes. Ainsi, pour éviter la préparation longue de l’échantillon, comme la chromatographie liquide haute performance (HPLC) préparative pour IRMS ou la dérivatisation pour le GC-MS, l’analyse LC-MS/MS est un choix idéal car cette méthode implique une procédure d’extraction simple, des limites de détection très basses pour les isotopes stables, et des temps d’exécution courts 7,18,19. Ici, nous présentons une méthode LC-MS/MS mise à jour avec un temps d’exécution plus court, des flux de travail simples combinés à une sensibilité et une sélectivité élevées, comme méthode très adaptée à l’analyse à haut débit d’échantillons issus d’interventions humaines à grande échelle et d’études observationnelles, où la détermination des réserves totales de vitamine A est requise.

Protocole

L’étude a été approuvée par le Conseil d’éthique de la recherche de l’Université des Philippines, Manille (ID IRB : UPMREB 2016-282-01), le Comité d’Éthique Institutionnelle de l’UC Davis (ID IRB : 903681-2), et enregistrée au ClinicalTrials.gov (ID : NCT03030339). L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique des Services de Santé du Ghana (GHS-ERC 012/07/20), et l’essai a été enregistré à https://clinicaltrials.gov sous le nom de NCT04632771.

1. Élaboration de normes internes

  1. Solution standard interne : Préparez la solution interne à une concentration de 1 mg/mL d’acétate de rétinyle dans de l’éthanol contenant 0,1 % d’hydroxytoluène butylé (BHT) ; v/v. Divisez les solutions d’origine en aliquotes et stockez-les à -80 °C pendant jusqu’à 3 mois.
    REMARQUE : Pour l’étalon interne, il est possible d’utiliser soit de l’acétate de rétinyle non marqué, soit de l’acétate de rétinyle marqué. Si un standard de rétinyl-acétate non marqué est utilisé, il est essentiel d’obtenir une résolution de base des pics d’acétate de rétinyl et de rétinol (voir Figure 1).
  2. Solution de travail standard interne : Préparez une solution de travail standard interne en diluant la norme d’origine (1 mg/mL) à 1 μg/mL. D’abord, diluez 60 μL de l’étalon d’origine avec 300 μL d’éthanol, puis diluez 60 μL de cette solution dans 10 000 μL d’éthanol. Pour chaque échantillon, 20 μL de la solution standard interne de travail sont ajoutés, contenant 20 ng d’acétate de rétinyl.
    REMARQUE : Les solutions de travail standard internes peuvent être stockées à -20 °C pendant jusqu’à 1 semaine.

2. Préparation des étalons d’étalonnage

  1. Norme de calibration : Préparer les solutions standard de calibration à une concentration de 1 mg/mL de rétinol dans de l’éthanol contenant 0,1 % de BHT (p/v) pour la trace et le traceur. Aliquot stocke solutions et conserver à -80 °C pendant jusqu’à 3 mois. N’utilisez chaque aliquote qu’une seule fois pour éviter les cycles de gel-dégel.
  2. Solution de travail standard d’étalonnage : Retirer 100 μL de la solution standard de la crosse d’étalonnage et diluer avec 10 000 μL d’éthanol dans une fiole volumique. Déterminez la concentration de la solution d’étalonnage diluée à 325 nm dans un spectrophotomètre à l’aide d’une cuvette en quartz (voir Tableau 1 pour les détails).
  3. Prenez une aliquote de l’étalon d’étalonnage dilué et ajustez la concentration à 8 μM pour la trace et à 2 μM pour le traceur en utilisant 50 % d’éthanol et 50 % d’acétonitrile/dH 2O (70:30 (v/v).
  4. Préparez des étalons de calibration en double à sept concentrations différentes en utilisant 50 % d’éthanol et 50 % d’acétonitrile/dH 2O (70:30 (v/v). Si 200 μL de plasma sont extraits, les étalons de calibration des traces doivent aller de 6 μM à 0,03 μM, et les étalons des traceurs doivent aller de 0,5 μM à 0,004 μM.
    REMARQUE : Pour une quantification précise, le rétinol et les esters de rétinyle marqués isotopiquement dans le plasma sont quantifiés à l’aide de courbes de calibration en 7 pointsdupliquées 27. Le point le plus élevé sur la courbe d’étalonnage (double de la concentration attendue la plus élevée de la trace et du traceur dans le plasma) prend en compte le facteur de concentration de l’extrait reconstitué à partir du volume plasma d’origine.

3. Extraction des rétinoïdes du plasma

  1. Retirez des échantillons de plasma du congélateur à -80 °C et décongelez à température ambiante (environ 30 min).
  2. Une fois dégivrée, faites tourner chaque échantillon en vortex et faites tourner quelques secondes pour vous assurer qu’il ne reste aucun plasma dans le couvercle. Ensuite, placez les échantillons sur la glace.
  3. Allumez une centrifugeuse réfrigérée et laissez-la refroidir à 4 °C. Marquez des tubes en verre de 15 mL avec des bouchons à vis (identifiant du sujet et point temporel) et pipetez 200 μL d’eau déionisée (dH 2O) dans chaque tube d’échantillon.
  4. À partir de la solution de travail standard interne, on pipete 20 μL du mélange standard interne dans le tube en verre.
  5. À l’aide d’une pipette, injectez 200 μL de plasma dans le tube correspondant contenant l’étalon interne et ledH2O.
  6. Pipeter 400 μL d’éthanol dans chaque tube d’échantillon et faire tourner le tube pour mélanger l’éthanol au plasma. Ne faites pas de vortex pour éviter que des résidus de protéines ne collent à la paroi vitrée.
  7. Pour la première extraction d’hexane, ajoutez 2 mL d’hexane à chaque tube et fermez fermement les couvercles des tubes.
  8. Placez les tubes dans un vibrateur orbital et secouez à 15 000 tr/min pendant 30 minutes. Transférez les tubes dans une centrifugeuse réfrigérée et faites tourner à 1 800 x g pendant 10 minutes à 4 °C.
  9. À l’aide de pipettes Pasteur en verre, transférez le surnageant dans un jeu propre de tubes à essai en verre marqués. Faites attention à ne pas transférer de protéines, précipités ou d’eau.
  10. Produire une seconde extraction d’hexane en ajoutant 2 mL supplémentaires d’hexane au résidu restant, fermer fermement les couvercles des tubes, placer les tubes dans le shaker orbital et secouer à 15 000 tr/min pendant 15 minutes.
  11. Transférez les tubes dans une centrifugeuse réfrigérée et faites tourner à 1 800 x g pendant 10 minutes à 4 °C. À l’aide de pipettes Pasteur en verre, transférez le surnageant dans le tube à essai en verre contenant le surnageant de la première extraction d’hexane (étape 3.9) pour chaque échantillon, respectivement.
  12. Évaporez le solvant combiné d’extraction d’hexane (premier et deuxième surnageant d’extraction pour chaque échantillon) sous un doux jet de N2 dans une hotte à fumée assombrie pendant environ 30 minutes. Réglez le bloc chauffant à 35 °C.
  13. Résuspendez le résidu séché dans 50 μL d’éthanol, formez brièvement un vortex, puis ajoutez 50 μL de phase mobile (70:30 acétonitrile/dH 2O (v/v)) et à nouveau le vortex.
    REMARQUE : La resuspension du résidu séché doit être effectuée à l’aide de 100 μL d’éthanol uniquement si l’objectif est de quantifier les esters de rétinyle.
  14. Transférez dans des tubes microcentrifuge marqués de 0,5 mL. Centrifugez à 16 900 x g pendant 5 minutes.
  15. Transférer 80 μL du résidu reconstitué dans des fioles HPLC ambrées avec des inserts de 300 μL. Bouchez immédiatement le flacon pour éviter la perte de solvant due à l’évaporation.
  16. Transférez les fioles en verre dans une cryobox, identifiez-les avec le nom de l’étude, la date d’extraction et les identifiants de l’échantillon, puis conservez-les dans un congélateur à -80 °C jusqu’à l’analyse.
    REMARQUE : L’analyse des échantillons stockés doit être terminée dans un délai de 3 à 5 jours. Un volume plasmatique de 200 μL est normalement suffisant pour détecter le traceur de vitamine A marqué jusqu’à 90 jours après la dose. Cependant, le volume du plasma peut être ajusté à 400 μL si les rapports plasma/eau/éthanol sont maintenus à 1:1:2 en volume.

4. Préparation d’échantillons de contrôle standard interne

  1. Préparez la solution éthanol/phase mobile en pipettant 120 μL d’éthanol dans un tube microcentrifuge et en ajoutant 200 μL d’acétonitrile/dH 2O (v/v) et en vortexant.
  2. Dans trois tubes séparés de 0,6 mL, une pipette de 20 μL de la solution de travail standard interne.
  3. Ajoutez 80 μL d’éthanol/solution de phase mobile préparée et le vortex. Transférez les trois échantillons de contrôle standard interne dans des fioles HPLC ambrées avec des inserts de 300 μL et bouchez immédiatement les fioles pour éviter la perte de solvant due à l’évaporation.

5. Normes des maisons de plasma

  1. Pour préparer les échantillons standards locaux, obtenir un volume de plasma suffisant pour permettre l’analyse d’au moins trois échantillons par analyse analytique. Le volume total requis du plasma est déterminé par le nombre d’échantillons à analyser.
  2. Les aliquotes contiennent le plasma standard en petits cryoviaux aux volumes nécessaires pour chaque analyse et stockent à -80 °C.
    REMARQUE : Il est crucial que la norme maison contienne le traceur de rétinol marqué par un isotope utilisé dans les échantillons inconnus. Un matériau suffisant peut être obtenu en regroupant des échantillons de volontaires dans une seule aliquote.
  3. Extraire au moins trois échantillons de plasma standard pour chaque analyse au même volume que des échantillons de plasma inconnus, comme fait à l’étape 3.
  4. Placez les standards de la maison de plasma sur tout le rack d’échantillons avec au moins 10 échantillons de plasma inconnus entre eux. Utilisez des standards de maison de plasma pour calculer les variations intra- et inter-jours.

6. Échantillons standards externes

  1. Obtenir des échantillons certifiés externes standards et les stocker à -80 °C. Une norme externe certifiée largement utilisée est la norme NIST Standard Reference Material SRM 968.
  2. Extraire au moins quatre échantillons externes de plasma standard par analyse au même volume que des échantillons de plasma inconnus à l’aide de l’étape 3. Utilisez des échantillons standards externes pour vérifier l’exactitude des résultats obtenus.

7. Optimisation manuelle des composés

  1. Assurez-vous que la sonde du nébuliseur chauffé APCI est installée dans le boîtier source MS. Préparez la solution d’infusion pour chaque traceur isotopique stable à environ 1 μg/mL.
    REMARQUE : La solution doit être similaire à la phase mobile et contenir un peu d’acide pour la protonation. Un bon solvant à utiliser serait 1:1 acétonitrile/dH 2Oavec 0,1 % d’acide formique (v/v).
  2. Remplissez une seringue Luer-lock Hamilton de 1 mL avec la solution d’infusion, puis connectez la seringue à la source avec un tube PEEK via l’union de mise à la terre. Réglez le débit d’infusion à 10 μL/s.
  3. Sélectionnez Accordage manuel et assurez-vous que l’instrument est en mode accordage et calibration. Démarrez la pompe à seringue et sélectionnez le type Q1 Scan en mode positif.
  4. Fixez une plage de masse inférieure de 50 Da, et une plage de masse supérieure d’environ 100 Da au-dessus de la masse moléculaire du composé ciblé.
  5. Réglez les cycles à 500, vitesse de balayage à 200 Da/s. Cliquez sur Start et observez le signal dans la fenêtre des spectres de masse.
  6. Attendez que le signal se stabilise, puis vérifiez que les pics m/z attendus apparaissent. Considérons les pics [M+H]+ et [M+2H]2+ puisque le MS est en mode positif.
  7. La hauteur maximale visée devrait être autour de 1e6. Le courant d’ions total (TIC) devrait être de 1e7-1e9. Continuez à infuser jusqu’à ce que le signal soit stable, puis cliquez sur Stop. Il doit y avoir un pic distinct avec une forte intensité formé à partir du composé dans la solution d’infusion. Le courant total des ions (TIC) est affiché, ce qui montre le signal total pour tous les ions combinés.
    REMARQUE : la masse attendue de 12C Retinol est de 269 Da, donc une plage de 50 à 300 Da est appropriée pour indiquer les ions [M+H]+ et [M+2H]2+ .

8. Balayage des ions produit (MS2) / vérification des spectres CE

  1. Réglez la masse de départ à une masse inférieure, par exemple 50 Da, et la masse de Stop juste au-dessus de la masse Q1 (par exemple, 269,1 pour le rétinol 12C). Réglez les cycles à 5 et changez l’énergie de collision (CE) à 10. Vérifiez la masse Q1 comme ion précurseur. S’il n’y a pas de fragments plus petits apparaissants, augmentez CE à 20.
  2. À mesure que l’EC augmente, davantage d’ions produits se forment. Continuez à augmenter l’EC jusqu’à ce que l’ion précurseur à droite du spectre disparaisse complètement. Augmentez encore davantage la CE pour voir une fragmentation secondaire potentielle.

9. Scan MRM

  1. Lors du scan MS2, sélectionnez les trois ions produits les plus abondants ou les plus appropriés à utiliser pour une optimisation ultérieure.
  2. Pour chaque ion produit, saisissez la masse Q1 (précurseur) et les masses Q3 (produit) trouvées. Réglez le temps d’attente à 200 ms. Nommez chaque fragment en conséquence (par exemple, 12C_Frag_93).
  3. Sélectionnez l’énergie de collision et identifiez la valeur CE optimale en utilisant la fonction rampe. Remplissez la colonne CE avec la valeur CE optimisée pour chaque fragment.
  4. Optimiser le potentiel de dégroupement (DP) optimisé après optimisation de la CE pour minimiser les interférences isobares. Optimisez le potentiel de sortie de la cellule de collision (CXP) pour une transition à la fois.

10. Optimisation source/gaz

  1. Ces paramètres ne peuvent pas être automatiquement optimisés. Si vous devez améliorer l’intensité du signal, effectuez un processus d’optimisation manuelle. Changez un paramètre à la fois et comparez si le signal a augmenté, est resté le même ou a diminué.

11. Conditions de chromatographie liquide

  1. Pour la chromatographie, utilisez un gradient de phase binaire mobile de 0,1 % (v/v) d’acide formique dansdH 2O (A) et de 0,1 % (v/v) acide formique dans l’acétonitrile (B).
  2. Selon le système LC appliqué, il faut utiliser soit une colonne ABZ PLUS de 100 mm x 2,1 mm (3 μm) équipée d’une cartouche C18 de 4 mm x 2 mm (pour HPLC), soit un bouclier Premier BEH de 100 mm x 2,1 mm (1,7 μm) équipé d’une colonne FIT RP18 (pour la chromatographie ultra-haute pression (UPLC)) pour l’analyse du rétinol. Maintenir les colonnes à une température de 40 °C ou 50 °C, respectivement.
  3. Injectez 10 μL de l’extrait de plasma sur la colonne. Éluter les analytes à un débit de 0,4 mL/min. Pour les systèmes HPLC, le gradient linéaire est : 60 % B à 95 % B en 6,0 min ; 100 % B de 6,1 min à 13,0 min ; 100 % B à 60 % B de 13,1 à 14,0 min ; et 60 % B de 14,0 à 17,0 min. Pour les systèmes UPLC, le gradient linéaire dépend de la question de recherche. Si seul le rétinol est déterminé, le gradient est : 40 % B à 60 % B en 1,0 min ; 60 % B à 95 % B de 1,0 min à 6,0 min ; 100 % B de 6,5 min à 7,5 min ; 100 % B à 40 % B de 7,5 à 7,6 min ; et 40 % de B de 7,6 à 8,5 min. Si l’objectif est également d’analyser les esters de rétinyle en même temps que le rétinol, le gradient linéaire est : 60 % B à 95 % B en 3,0 min ; 100 % B de 3,5 min à 6,5 min ; 100 % B à 60 % B de 6,5 à 7,0 min ; et 60 % B de 7,0 à 8,5 min.

12. Conditions de la SEP/EM

  1. Effectuer une analyse MS/MS sous ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) en mode ion positif. L’APCI est choisi plutôt que l’ionisation par électropulvérisation car il offre une intensité de signal plus élevée, une plage linéaire plus large et un bruit de fondplus faible (26).
  2. Pour les transitions de masse respectives pour [12C]rétinol, [13C10]rétinol et [2H6]rétinol ainsi que leurs esters/acétates respectifs avec des paramètres sélectionnés de surveillance de réaction (SRM) pour le API4000 et le spectromètre de masse QTRAP 5500, consultez les Tables 2, Tableau 3 et Figure 2.
    REMARQUE : La surveillance d’ions sélectionnés pour le rétinol, les esters de rétinyle et l’acétate de rétinyle correspondait au même fragment d’ion m/z 269 pour la quantification APCI, car cet ion correspond à la perte d’eau, d’acides gras ou d’acide acétique provenant des molécules protonées. Puisque le LC-MS/MS est capable de séparer les pics de rétinol de ses esters, une injection unique permet de déterminer l’enrichissement isotopique dans les fractions de rétinol et d’esters de rétinyle dans un seul échantillon.

13. Quantification du rétinol

  1. Quantifier les concentrations de rétinol de [12C], derétinol et de [13C10] de rétinol selon leurs standards d’étalonnage respectifs.
  2. Déterminer les pertes d’extraction en utilisant la récupération des concentrations standard internes pour chaque échantillon par rapport aux échantillons témoins standards internes.
  3. Effectuer la confirmation des concentrations plasmatiques de rétinol en utilisant le matériau de référence standard (SRM) 968 du National Institute of Standards and Technology (NIST).

Résultats

Pour illustrer l’efficacité de la méthode analytique pour analyser le rétinol stable marqué par des isotopes à travers différents systèmes chromatographiques, nous présentons les résultats de deux études différentes.

Pour l’utilisation du API4000 avec HPLC initial, des échantillons plasmatiques de 111 enfants philippins âgés de 12 à 18 mois, ayant reçu une dose orale de 400 μg (1,17μmol) [13 C10] acétate de rétinyl au jour 0, suivie d’une prise de 6 mL de sang 4 jours après la dose, ont étéanalysés 7,28. Les concentrations moyennes plasmatiques totales de rétinol étaient de 1,1 μmol/L, et la moyenne [13C10] de rétinol était de 0,007 μmol/L. Puisque le niveau de bruit de fond dans la transition m/z 279 à 100 avait une hauteur moyenne de crête de ~50 cps (Figure 1), le niveau de détection (LOD) et de quantification (LOQ) pour [13C10] rétinol étaient fixés à 150 cps et 500 cps, correspondant respectivement à 6 fmol et 19 fmol sur colonne. Puisque une bonne résolution de base a été obtenue entre le rétinol [12C] et l’étalon interne appliqué d’acétate de rétinyl, il n’était pas nécessaire d’utiliser un acétate de rétinyle marqué par un isotope stable.

Une séparation chromatographique plus rapide peut être obtenue en utilisant l’UPLC en combinaison avec le QTRAP 5500, avec des temps d’exécution inférieurs à 10 minutes. Selon la question de recherche, deux méthodes de séparation différentes peuvent être appliquées ; (i) si l’objectif est de déterminer le rétinol marqué natif et isotopique appliqué avec un standard interne non marqué d’acétate de rétinyl, les temps de rétention entre le rétinol (4,37 min) et l’acétate de rétinyl (5,33 min) assurent une bonne séparation de base (Figure 3) ; (ii) si l’objectif est de séparer le rétinol natif et marqué par les isotopes, ainsi que les esters de rétinyle natif et marqués, une bonne séparation peut être obtenue en 8,5 minutes (Figure 4). Cependant, en raison des temps de rétention étroits entre le rétinol (2,10 min) et l’acétate de rétinyle (2,43 min), il est conseillé d’utiliser plutôt de l’acétate de rétinyle marqué isotopiquement ([2H4] acétate de rétinyle). Dans cet exemple, des échantillons séromiques ont été analysés sur 80 femmes ghanéennes en âge de procréer qui ont reçu une dose équivalente de rétinol de 2 mg d’acétate de rétinyle [2H6], suivie d’une prise de sang 21 jours après la dose. Les concentrations moyennes de rétinol total sérique étaient de 1,89 μmol/L, avec une moyenne [2H6] de rétinol à 0,027 μmol/L et une moyenne [13C10] de 0,025 μmol/L.

La méthode présentée a atteint un faible niveau de détection (LOD = 6 fmol ; LOQ = 19 fmol sur colonne), démontrant une sensibilité et une spécificité élevées pour détecter le rétinol stable marqué par des isotopes avec une séparation de base claire entre le rétinol natif et les standards internes. De plus, la méthode fonctionnait efficacement avec les configurations HPLC et UPLC, malgré les différences de temps de rétention. L’utilisation d’étalons internes marqués isotopiquement ([2H4] acétate de rétinyle) a permis une quantification précise dans des conditions UPLC plus rapides, si des esters de rétinyl doivent être déterminés. La validation par rapport aux normes de référence certifiées par le NIST a confirmé l’exactitude, tandis que les coefficients de variation intra-journaliers et inter-jours (2,3 % et 4,4 %, respectivement) ont démontré une excellente précision et reproductibilité. L’analyse réussie d’échantillons de plasma/sérum provenant de deux populations distinctes (enfants philippins et femmes ghanéennes) avec des protocoles de dosage différents montre robustesse et utilité pratique dans diverses études nutritionnelles.

figure-results-1
Figure 1 : Chromatogramme LC-MS/MS utilisant le spectromètre de masse API4000. Le chromatogramme du rétinol sérique a été obtenu 4 jours après l’ingestion orale de 0,4 mg d’acétate de rétinyle [13C10]. La surveillance de réaction sélectionnée (SRM) de m/z 269 à 93 montre la séparation du rétinol [12C] (RT = 5,06 min) et de l’acétate de rétinyle [12C] (RT = 5,83 min) comme norme interne (IS). Le signal du rétinol [13C10] entre m/z 279 et 100 dépasse suffisamment à la fois la limite de détection (LOD) et la limite de quantification (LOQ). Conditions chromatographiques : (A) gradient de phase binaire mobile de 0,1 % (v/v) acide formique dans dH2O et (B) 0,1 % (v/v) acide formique dans l’acétonitrule ; débit de 0,4 mL/min avec un gradient linéaire de : 60 % B à 95 % B en 6,0 min ; 100 % B de 6,1 min à 13,0 min ; 100 % B à 60 % B de 13,1 à 14,0 min ; et 60 % B de 14,0 à 17,0 min ; Colonne ABZ PLUS de 100 mm x 2,1 mm (3 μm), équipée d’une cartouche C18 de 4 mm x 2 mm maintenue à 40 °C. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

figure-results-2
Figure 2 : Spectres de masse ioniques produit APCI-MS/MS. Spectres de masse des ions produits APCI-MS/MS par injection en flux de (A) m/z 269 [12C] rétinol, (B) m/z 273 [2H4] rétinol, (C) m/z 275 [2H6] rétinol, et (D) m/z 279 [13C10] rétinol en mode ion positif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

figure-results-3
Figure 3 : Chromatogramme LC-MS/MS utilisant le spectromètre de masse QTRAP 5500. Chromatogramme LC-MS/MS d’un extrait typique d’un plasma standard à la maison échantillonnée 21 jours après une ingestion orale de 1,0 mg d’acétate de rétinyle [2H6] et 90 jours après une ingestion orale de 1,0 mg d’acétate de rétinyle [13C10]. La surveillance de la réaction sélectionnée (SRM) de m/z 269→93 montre le pic de rétinol [12C] (RT = 4,37 min) et l’acétate de rétinyl (RT = 5,33 min) comme standard interne (IS) ; le rétinol [2H6] (RT = 4,36 min) à m/z 275→96 ; et le pic du rétinol [13C10] (RT = 4,38) à m/z 279→100. Conditions chromatographiques : (A) gradient de phase binaire mobile de 0,1 % (v/v) acide formique endH 2O et (B) 0,1 % (v/v) acide formique dans l’acétonitrule ; débit de 0,4 ml/min avec un gradient linéaire de : 40 % B à 60 % B en 1,0 min ; 60 % B à 95 % B de 1,0 min à 6,0 min ; 100 % B de 6,5 min à 7,5 min ; 100 % B à 40 % B de 7,5 à 7,6 min ; et 40 % B de 7,6 à 8,5 min ; Colonne FIT AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FIT de 100 mm x 2,1 mm (2,1 mm) ; maintenue à 50°C. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Chromatogramme LC-MS/MS du rétinol et des esters de rétinyle à l’aide du spectromètre de masse QTRAP 5500. Chromatogramme LC-MS/MS d’un extrait typique d’un plasma standard de maison échantillonné 6 h après une ingestion orale de 1,0 mg d’acétate de rétinyle et 90 mg après une ingestion orale de 1,0 mg d’acétate de rétinyle [13C10]. La surveillance de la réaction sélectionnée (SRM) de m/z 269→93 montre le pic de [12C]rétinol (RT = 2,10 min) ; le [2H4]acétate de rétinyle à m/z 273→94 (RT = 2,43 min) comme norme interne (IS) ; la séparation du [2H6]rétinol (RT = 2,09 min) et du palmitate de rétinyle [2H 6]atteint un pic à m/z 275→96 ; et le pic de rétinol [13C10] (RT = 2,10) à m/z 279→100. Conditions chromatographiques : (A) gradient de phase binaire mobile de 0,1 % (v/v) acide formique endH 2O et (B) 0,1 % (v/v) acide formique dans l’acétonitrule ; débit de 0,4 ml/min avec un gradient linéaire de : 60 % B à 95 % B en 3,0 min ; 100 % B de 3,5 min à 6,5 min ; 100 % B à 60 % B de 6,5 à 7,0 min ; et 60 % B de 7,0 à 8,5 min ; Colonne FIT AcquityTM Premier BEH RP18 VanGuard FIT de 100 mm x 2,1 mm (2,1 mm) ; maintenue à 50 °C. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Paramètres
Absorptivité molaire (ɛ) du rétinol dans l’éthanol :52 770 M-1 cm-1
Facteur de dilution :100 (100 μL d’étalonnage d’origine en 10 mL d’éthanol)
Absorbance moyenne mesurée :0.575
Calcul
Concentration (mol) de [12C]rétinol dans l’éthanol :Concentration (mol) = Absorption / ɛ x Longueur de la cuvette
= 0,575 / 52770 M-1 cm-1 x 1 cm = 1,09 x 10-5 M
Correction pour dilution :1,09 x 10-5 M x 100 = 1,09 x 10-3 M ou 1,09 mM

Tableau 1 : Détermination de la concentration standard d’étalonnage du stock de rétinol.

AnalyteTransitions MRM (m/z)Potentiel de dégroupement (V)Potentiel d’entrée (V)Énergie de collision (eV)Potentiel de sortie de collision (V)
[12C]-rétinol/esters269→935110276
[2H 4]acétate de rétinyle273→945110276
[2H 6] rétinol/esters275→965110276
[13C10] - rétinol/esters279→1004110276

Tableau 2 : Paramètres sélectionnés de surveillance de la réaction (SRM). Paramètres pour [12C] rétinol, [13C10] rétinol, et [2H6] rétinol ainsi que leurs esters respectifs utilisant le API4000

AnalyteTransitions MRM (m/z)Potentiel de dégroupement (V)Potentiel d’entrée (V)Énergie de collision (eV)Potentiel de sortie de collision (V)
[12C]-rétinol/esters269→939410338
[2H 4]acétate de rétinyle273→9454102011
[2H 6] rétinol/esters275→966910253
[13C10] - rétinol/esters279→10010210359

Tableau 3 : Paramètres sélectionnés de surveillance de réaction (SRM). Paramètres pour [12C] rétinol, [13C10] rétinol, et [2H6] rétinol ainsi que leurs esters respectifs utilisant QTRAP 5500

Discussion

La méthode LC-MS/MS présentée offre une sensibilité extrêmement élevée, avec des limites de détection aussi basses que 6 fmol/L, permettant ainsi aux chercheurs d’utiliser aussi peu que 100 à 200 μL de plasma19. Cette méthode de SEP en tandem ciblée est particulièrement puissante pour confirmer l’identité des isotopologues rétinoïdes lorsque des ions quantificateurs et produits qualifiés sontutilisés 18. Cependant, puisque les rétinoïdes marqués par des isotopes sont présents à des concentrations nettement plus faibles que les rétinoïdes physiologiques non marqués, les échantillons plasmatiques contenant du rétinol marqué et des esters de rétinyle peuvent nécessiter une étape de concentration supplémentaire. Cette nécessité dépend de facteurs tels que le moment de l’analyse de sang post-dose, la concentration de traceur oral et la sensibilité du système LC-MS/MS. Historiquement, des doses plus élevées d’applications étaient utilisées pour compenser la sensibilité plus faible des spectromètres de masse antérieurs, mais les avancées récentes ont facilité l’utilisation de doses plusfaibles 13. Dans les exemples présentés, une dose orale plus élevée augmente le niveau de rétinol stable marqué par isotope même à des moments ultérieurs, c’est-à-dire à 21 jours contre 4 jours.

Puisque les groupes fonctionnels terminaux des esters de rétinyle sont perdus lors de l’ionisation, le même parent m/z de 269 et des schémas de fragmentation d’ions filles similaires sont observés pour les esters de rétinol et de rétinyl. Par conséquent, la séparation chromatographique est cruciale pour déterminer leurs concentrationsséparées 18. De plus, en raison de la forte abondance naturelle des isotopes stables de 13C dans les isotopologues endogènes du rétinol, il est recommandé d’incorporer plus de trois atomes de 13C dans le traceur de rétinol afin d’éviter de corriger l’enrichissement naturel de base en 13C du rétinol dans le plasmahumain 29.

Les échantillons de plasma nécessitent un traitement préalable à l’analyse isotopique en deux étapes. D’abord, les échantillons plasmatiques doivent être déprotéinisés, suivis de l’extraction du rétinol et des esters de rétinyle à l’aide d’un solvant non polaire, ce qui crée un systèmebiphasique 18,19,20. Bien qu’une séparation de phase claire soit obtenue avec le protocole ci-dessus, il est crucial que l’interphase dans le système biphasique ne soit pas perturbée ou collectée, car cela augmentera le temps de séchage et réduira la précision de l’analyse. Alternativement, notre groupe a également exploré l’application d’une procédure d’extraction monophasée pour les rétinoïdes20. Pour cela, des échantillons de plasma de 200 μL sont pipettés dans un tube micro-centrifuge plastique de 2 mL, et les rétinoïdes sont extraits à l’aide d’une combinaison d’éthanol et d’acétate d’éthyle. L’application de ce protocole d’extraction permet d’analyser le rétinol et de plus de rétinoïdes polaires, tels que les isomères d’acide rétinoïque, avec un récupération équivalente à celle de l’extraction biphasique, et est également comparable à la méthode d’extraction en une étape de l’acétonitrile de Kane et Napoli30.

Étant donné que les rétinoïdes sont sensibles à l’oxydation et à l’isomérisation lorsqu’ils sont exposés à la lumière UV et à la chaleur, il est crucial de réaliser l’analyse aussi rapidement que possible, et des précautions générales doivent être prises lors de la collecte, de la manipulation et du stockage du plasma30. Les méthodes traditionnelles pour analyser les rétinoïdes marqués par des isotopes stables utilisent l’isolation et/ou des dérivations chronophages. L’analyse GC-MS nécessite d’isoler la fraction de rétinol du sérum humain à l’aide de chromatographie liquide haute performance (HPLC), suivie de la dérivatisation durétinol 22. Bien que la dérivatisation ne soit pas nécessaire pour le GC-C-IRMS, une séparation préalable du rétinol à l’aide de deux étapes distinctes de purification HPLC estrecommandée 17,25,31, et la détermination d’un enrichissement naturel de base en 13C du rétinol dans le plasma humain dans la population échantillonnée est égalementrequise 17,32. En revanche, la méthode LC-MS/MS présentée présente plusieurs avantages. Il évite des procédures d’extraction et/ou de purification longues et chronophages, permettant une analyse rapide, sensible et simultanée des esters de rétinyle et du rétinollibre 16,18,26,32. De plus, la méthode est efficace car elle offre une grande précision avec une faible variabilité et s’adapte à différents systèmes LC-MS/MS.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à déclarer.

Remerciements

Le soutien à ce travail a été assuré par la Fondation Bill & Melinda Gates (Projet numéro : OPP1115464) et l’Agence internationale de l’énergie atomique (AIEA) à Vienne (Projet Numéro E4.30.30).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Solvants
Grade HPLC à l’éthanol absoluFisher10428671
Acétonitre de qualité HPLCFisher10660131
Hexane 95 % N-Hexane pour HPLC certifié HPLCFisherH/0406/17
Grade HPLC en isopropanolVWR20880.32
Grade HPLC en isopropanolVWR20880.32
Méthanol 99 % 2,5 LThermo Scientific11367996
Standards/isotopes
All-trans-rétinolBioXtra95144
Acétate de rétinyleSigmaPHR1236
Rétinol marqué par isotope stable :ReseaChem/Buchem BV
Acétate de rétinyle marqué par un isotope stable :ReseaChem/Buchem BVN/AUne gamme d’isotopes stables peut être utilisée pour la méthode DRI. Une liste des différents isotopes disponibles dans le commerce est présentée dans le tableau 1.& nbsp ;
Vitamine A et Vitamine A  ; (19,19,19,20,20,20-D6)
Vitamine A et Vitamine A  ; (8,9,10,11,12,13,14,15,19,20-13C10)
Acétate de vitamine A (10,19,19,19-D4)
Acétate de vitamine A (19,19,20,20,20,20-D6)
Acétate de vitamine A (8,9,10,11,12,13,14,15,19,20-13C10)
Équipement
Distributeur de solvant réglable de 5 mlSigma-AldrichZ627607-1EA
ABI 4000 LC-MS/MS.AB Sciex
Balances analytiques & nbsp ;Fisher13592970
Pistons capillaires (pointes de pipette) CP100 10x96 TIPACKGilsonFD148314
Pistons capillaires CP250ST 6x96GilsonF148714
Meuble à fumée
Microman E M100E Pipette (déplacement positif)GilsonFD10004
Pipette Microman E M250E (déplacement positif)GilsonFD10005
Pipetman P100, 10-100ul, éjecteur métalliqueGilsonF114057M
Pipetman P1000, 100-1000ul, éjecteur métalliqueGilsonF114059M
Pipetman P20, 2-20ul, éjecteur métalliqueGilsonF144056M
QTRAP 5500 LC-MS/MSAB Sciex
Centrifugeuse réfrigérée 5810 REppendorf
Bain marie sonoreVWRUSC100T
SpectrophotomètreThermo Fisher ScientificA51119600C
Concentrateur d’échantillons Techne et bloc thermique.VWR
Vibrax VXR Shaker de baseIKA0002819002
Mélangeur vortex ; MS3 IKA de baseFisherMPR-555-050L
Accessoire de tube à essai VX2 - werke type VX2IKA0000568900
Consommables
Tubes microcentrifugeuses de 1,5 mlFisherFB74323
100 mm x 2,1 mm (1,7 & mu ; m) Colonne AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FITEaux186009498
100 mm x 2,1 mm (3 & micro ; m) Colonne Supelcosil ABZ PLUSSupelco57917
Pointes de pipette 1000ulStarlabS1122-1830
Flasques volumétriques de 100 mlFisher11323644Flacon volumétrique certifié Pyrex Borosilicate Class A
Pointes de pipette 200ulStarlabS1120-8810
Cartouche SecurityGuard C18 4 mm x 2 mmPhenomenexAJ0-4286
Fioles volumétriques de 50 mlFisher11313644Flacon volumétrique certifié Pyrex Borosilicate Class A
Fioles en verre ambré de 9 mm avec insertsFisher11583680
Bouchons filetés de fioles de 9 mmFisher13206419
Cryobox en cartonStarlabA9623-8181
Hellma Cuvette UV quartzSLSCEL1600
Gaz azoté (de la plus haute pureté et sans oxygène)BOC
Pasteur PipetteFisher11546963
Tubes Pyrex Culture 100x16mmCorningCLS9944916
Bouchons à vis PTFE 16mmCorningCLS999815
Capsules en PTFE ambré en verre de 2 mlFisher11573542
Bouchon à vis fiole 9mm silicone blanc / PTFE rougeThermo  ;13206419

Références

  1. Tanumihardjo, S. A., et al. Biomarkers of Nutrition for Development (BOND)-Vitamin A Review. J Nutr. 146 (9), 1816-1848 (2016).
  2. Stevens, G. A., et al. Trends and mortality effects of vitamin A deficiency in children in 138 low-income and middle-income countries between 1991 and 2013: a pooled analysis of population-based surveys. Lancet Global Health. 3 (9), E528-E536 (2015).
  3. Baye, K., et al. Estimates of child mortality reductions attributed to vitamin A supplementation in sub-Saharan Africa: scale up, scale back, or refocus. Am J Clin Nutr. 116 (2), 426-434 (2022).
  4. Bielderman, I., Vossenaar, M., Melse-Boonstra, A., Solomons, N. W. The potential double-burden of vitamin A malnutrition: under- and overconsumption of fortified table sugar in the Guatemalan highlands. Eur J Clin Nutr. 70 (8), 947-953 (2016).
  5. Brown, K. H., Engle-Stone, R., Kagin, J., Rettig, E., Vosti, S. A. Use of Optimization Modeling for Selecting National Micronutrient Intervention Strategies: An Example Based on Potential Programs for Control of Vitamin A Deficiency in Cameroon. Food Nutr Bull. 36 (3 Suppl), S141-S148 (2015).
  6. Bruins, M. J., et al. Maximizing the benefits and minimizing the risks of intervention programs to address micronutrient malnutrition: symposium report. Matern Child Nutr. 12 (4), 940-948 (2016).
  7. Engle-Stone, R., et al. Filipino Children with High Usual Vitamin A Intakes and Exposure to Multiple Sources of Vitamin A Have Elevated Total Body Stores of Vitamin A But Do Not Show Clear Evidence of Vitamin A Toxicity. Curr Dev Nutr. 6 (8), nzac115(2022).
  8. Engle-Stone, R., et al. Weighing the risks of high intakes of selected micronutrients compared with the risks of deficiencies. Ann New York Acad Sci. 1446 (1), 81-101 (2019).
  9. Raiten, D. J., et al. Perspective: Integration to Implementation (I-to-I) and the Micronutrient Forum-Addressing the Safety and Effectiveness of Vitamin A Supplementation. Adv Nutr. 11 (2), 185-199 (2020).
  10. van Stuijvenberg, M. E., et al. South African preschool children habitually consuming sheep liver and exposed to vitamin A supplementation and fortification have hypervitaminotic A liver stores: a cohort study. Am J Clinical Nutr. 110 (1), 91-101 (2019).
  11. Gannon, B. M., Tanumihardjo, S. A. Comparisons among Equations Used for Retinol Isotope Dilution in the Assessment of Total Body Stores and Total Liver Reserves. J Nutr. 145 (5), 847-854 (2015).
  12. Green, M. H., Green, J. B., Ford, J. L. Better Predictions of Vitamin A Total Body Stores by the Retinol Isotope Dilution Method Are Possible with Deeper Understanding of the Mathematics and by Applying Compartmental Modeling. J Nutr. 150 (5), 989-993 (2020).
  13. Lietz, G., et al. Current Capabilities and Limitations of Stable Isotope Techniques and Applied Mathematical Equations in Determining Whole-Body Vitamin A Status. Food Nutr Bull. 37, S87-S103 (2016).
  14. Furr, H. C., et al. Vitamin A concentrations in liver determined by isotope dilution assay with tetradeuterated vitamin A and by biopsy in generally healthy adult humans. Am J Clin Nutr. 49 (4), 713-716 (1989).
  15. Haskell, M. J., et al. Assessment of vitamin A status by the deuterated-retinol-dilution technique and comparison with hepatic vitamin A concentration in Bangladeshi surgical patients. Am J Clin Nutr. 66 (1), 67-74 (1997).
  16. Fleshman, M. K., Riedl, K. M., Novotny, J. A., Schwartz, S. J., Harrison, E. H. An LC/MS method for d8-β-carotene and d4-retinyl esters: β-carotene absorption and its conversion to vitamin A in humans. J Lipid Res. 53 (4), 820-827 (2012).
  17. Gannon, B., et al. Biofortified orange maize is as efficacious as a vitamin A supplement in Zambian children even in the presence of high liver reserves of vitamin A: a community-based, randomized placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr. 100 (6), 1541-1550 (2014).
  18. Oxley, A., et al. An LC/MS/MS method for stable isotope dilution studies of beta-carotene bioavailability, bioconversion, and vitamin A status in humans. J Lipid Res. 55 (2), 319-328 (2014).
  19. Oxley, A., et al. Determination of Vitamin A Total Body Stores in Children from Dried Serum Spots: Application in a Low- and Middle-Income Country Community Setting. J Nutr. 151 (5), 1341-1346 (2021).
  20. Oxley, A., Lietz, G. Use of stable isotopes to study bioconversion and bioefficacy of provitamin A carotenoids. Meth Enzymol. 670, 399-422 (2022).
  21. Parker, R. S., et al. Study of beta-carotene metabolism in humans using 13C-beta-carotene and high precision isotope ratio mass spectrometry. Ann N Y Acad Sci. 691, 86-95 (1993).
  22. Tang, G. W., Qin, J., Dolnikowski, G. Deuterium enrichment of retinol in humans determined by gas chromatography electron capture negative chemical ionization mass spectrometry. J Nutr Biochem. 9 (7), 408-414 (1998).
  23. Tang, G. W., Qin, J., Dolnikowski, G. G., Russell, R. M. Short-term (intestinal) and long-term (postintestinal) conversion of beta-carotene to retinol in adults as assessed by a stable-isotope reference method. Am J Clin Nutr. 78 (2), 259-266 (2003).
  24. Tang, G. W., Qin, J., Hao, L. Y., Yin, S. A., Russell, R. M. Use of a short-term isotope-dilution method for determining the vitamin A status of children. Am J Clin Nutr. 76 (2), 413-418 (2002).
  25. Tanumihardjo, S. A. Vitamin A status assessment in rats with C-13(4)-retinyl acetate and gas chromatography/combustion/isotope ratio mass spectrometry. J Nutr. 130 (11), 2844-2849 (2000).
  26. van Breemen, R. B., et al. Development of a method for quantitation of retinol and retinyl palmitate in human serum using high-performance liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization-mass spectrometry. J Chromatogr A. 794 (1-2), 245-251 (1998).
  27. Fu, Y., Li, W., Flarakos, J. Recommendations and best practices for calibration curves in quantitative LC-MS bioanalysis. Bioanalysis. 11 (15), 1375-1377 (2019).
  28. Ford, J. L., et al. Use of Model-Based Compartmental Analysis and a Super-Child Design to Study Whole-Body Retinol Kinetics and Vitamin A Total Body Stores in Children from 3 Lower-Income Countries. J Nutr. 150 (2), 411-418 (2020).
  29. van Lieshout, M., West, C. E., van Breemen, R. B. Isotopic tracer techniques for studying the bioavailability and bioefficacy of dietary carotenoids, particularly beta-carotene, in humans: a review. Am J Clinical Nutr. 77 (1), 12-28 (2003).
  30. Kane, M. A., Napoli, J. L. Quantification of endogenous retinoids. Methods Mol Biol. 652, 1-54 (2010).
  31. Preston, T. Existing and emerging technologies for measuring stable isotope labelled retinol in biological samples: isotope dilution analysis of body retinol stores. Int J Vitam Nutr Res. 84, 30-39 (2014).
  32. Valentine, A. R., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Vitamin A isotope dilution predicts liver stores in line with long-term vitamin A intake above the current Recommended Dietary Allowance for young adult women. Am J Clin Nutr. 98 (5), 1192-1199 (2013).

Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Traceurs de vitamine Adilution isotopique du r tinolspectrom trie de masse en tandemanalyse du r tinol plasmatiquequantification du r tinolextraction par solvantionisation pression atmosph riques paration des esters de r tinyle
Vidéo bientôt disponible
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.