Article de méthode

Transplantation intramusculaire de cellules endocrines pancréatiques dérivées des cellules souches pluripotentes humaines chez la souris

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DOI :

10.3791/69562

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10 avril 2026

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1Instituto de Investigaciones Biomédicas Sols-Morreale, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Universidad Autónoma de Madrid, 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas CIBERDEM, Instituto de Salud Carlos III

Dans cet article

Résumé

Nous proposons un protocole mini-invasif pour la transplantation intramusculaire d’îlots de cellules souches pancréatiques dérivées de cellules souches humaines dans des souris immunodéficientes pour une implantation in vivo et une analyse en aval.

Résumé

Les cellules endocrines du pancréas dérivées des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) constituent une source prometteuse pour la thérapie des cellules du diabète et la modélisation des maladies. Bien que plusieurs protocoles de différenciation aient été établis, l’implantation in vivo est couramment nécessaire pour étudier la maturation et le fonctionnement dans un contexte physiologique. La plupart des approches de transplantation reposent sur des sites tels que la capsule rénale ou l’espace sous-cutané, ce qui peut présenter des limitations techniques ou physiologiques. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour la transplantation intramusculaire d’îlots pancréatiques SC dérivés de hPSC sur des souris immunodéficientes. Ce site permet un accès chirurgical simple, une réduction de l’invasion et une récupération fiable des greffons pour une analyse ultérieure. La procédure permet l’implantation intramusculaire d’îlots dérivés des cellules souches et soutient leur récupération pour une évaluation en aval de la sécrétion d’insuline après un défi oral de glucose. Le protocole comprend des étapes pour la préparation et la compactation en grappes, la chirurgie de transplantation, la sécrétion d’insuline stimulée par glucose in vivo (GSIS) et la récupération de greffons pour l’analyse histologique, fournissant un cadre reproductible pour la transplantation intramusculaire dans des modèles murins précliniques.

Introduction

Le diabète est un trouble métabolique hétérogène dont la prévalence a doublé au cours des trois dernières décennies et devrait toucher 1,3 milliard de personnes d’ici 2050. Bien que des facteurs environnementaux, tels que l’alimentation et le mode de vie, jouent un rôle important dans l’apparition du diabète de type 2 (DT2), la prédisposition génétique contribue également de manière significative à sapathogenèse 2. Les cellules β pancréatiques sont responsables de la synthèse et de la sécrétion de l’insuline et jouent un rôle central dans la physiopathologie dudiabète 3. Pour comprendre comment le risque génétique contribue au dysfonctionnement des cellules β, les cellules β dérivées des cellules souches humaines, organisées en grappes endocriniennes tridimensionnelles (ci-après appelées îlots SC), fournissent un système modèle hautement informatifet pertinent 4,5. Les protocoles récents guident efficacement la différenciation des cellules souches humaines en cellules β productrices d’insuline en récapitulant des étapes clés du développement pancréatique à l’aide d’inhibiteurs spécifiques et de facteursde croissance 6,7.

Ces systèmes répliquent de manière fiable les étapes du développement de manière évolutive et reproductible, surmontant les limites des îlots dérivés par les donateurs, qui ne supportent pas la modélisation développementale et sont soumis à des contraintes d’approvisionnement. Les modèles muriens ont fourni des informations précieuses sur le développement pancréatique, mais ils ne parviennent souvent pas à reproduire pleinement les manifestations phénotypiques observées chez des patientshumains 5. Par conséquent, l’utilisation d’un système basé sur les cellules souches permet de caractériser les variants génétiques impliqués dans le développement pancréatique humain et β dysfonctioncellulaire 8.

Malgré ces avancées, les îlots SC générés in vitro restent transcriptomiquement et fonctionnellement immatures comparés aux cellules adultes β natives. Ils présentent une sécrétion d’insuline stimulée par le glucose sous-optimale et manquent d’expression de marqueurs β cellules matures tels que MAFA et G6PC2 9,10. Pour combler cet écart, une maturation in vivo par transplantation chez des souris immunodéficientes est souvent utilisée ; Cela améliore généralement à la fois la dynamique de la sécrétion d’insuline et les profils d’expressiongénique 6.

Le métabolisme du glucose est strictement régulé et nécessite l’intégration de signaux systémiques. Les îlots SC transplantés sont capables d’intégrer des signaux provenant de plusieurs organes, offrant un environnement physiologiquement plus pertinent, crucial pour évaluer les conséquences fonctionnelles de la variation génétique chez les cellules β humaines11.

La transplantation d’îlots SC chez des souris a été réalisée à différents sites anatomiques. Le site conventionnel est la capsule rénale, efficace pour favoriser la maturation des cellules β et inverser le diabète chez les rongeurs traités par la streptozotocine (STZ) 12, mais il implique une chirurgie invasive complexe, ce qui limite sa mise en œuvre dans leslaboratoires 13. De plus, cette méthode n’est pas applicable en milieu clinique pour traiter les patients atteints de diabète de type 1 en raison des limitations de taille et devascularisation 14. Des sites alternatifs de transplantation, tels que les tissus intramusculaires, sous-cutanés et adipeux, ont été rapportés, offrant des voies moins invasives et plus cliniquement applicables. Bien que la transplantation intramusculaire puisse poser des difficultés pour atteindre une maturation optimale des cellules β et une sécrétion d’insuline par rapport à la capsulerénale 12, elle peut néanmoins assurer une sécrétion efficace d’insuline et le maintien de l’homéostasie du glucose, tout en offrant une approche chirurgicale plus simple et plusaccessible 15,16.

Ainsi, dans ce protocole, nous présentons une approche de transplantation intramusculaire qui aborde plusieurs limites d’autres protocoles de transplantation. Cette méthode est peu invasive et offre une stratégie in vivo fiable pour la maturation des îlots SC et l’étude des variantes génétiques liées à la dysfonction des cellules β.

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Protocole

Toutes les expériences impliquant des cellules souches pluripotentes (hPSC) et des animaux de laboratoire ont été approuvées par des comités d’éthique institutionnels, régionaux et nationaux. Les lignes hPSC utilisées ici ont été initialement dérivées et distribuées conformément aux approbations éthiques appropriées et aux procédures de consentement éclairé dans les institutions sources. La figure 1 montre le flux de travail global, du maintien des hPSC à la différenciation dirigée de la lignée pancréatique et à la maturation vers des îlots SC adaptés à la transplantation.

1. Différenciation des hPSC en progéniteurs pancréatiques

REMARQUE : Ce protocole s’appuie sur deux étapes préparatoires essentielles : 1) le maintien et l’expansion des hPSC, et 2) leur différenciation dirigée vers la lignée endocrinienne du pancréas. Les deux étapes ont été décrites endétail 7,17. Les hPSC sont maintenus dans des plaques revêtues de milieux B8 conformément aux recommandations de Lyria-Leyte et al.17. Récolter les hPSC pour les différencier lors de la croissance exponentielle avant qu’ils ne deviennent confluents. À la densité de semis recommandée, ils devraient atteindre une confluence de 90-100 % le lendemain, prêts à commencer la différenciation. La différenciation vers la lignée endocrinienne du pancréas est réalisée selon la procédure décrite par Barsby et al.7. Les détails complets des médias sont disponibles dans le Tableau 1.

  1. Recouvrir fraîchement les plaques de différenciation d’une matrice extracellulaire dérivée de la membrane basale.
  2. Semez 0,16-0,19 million de cellules/cm2 au jour 0 (1,7 million de cellules dans un puits à partir d’une plaque à 6 puits). Utilisez 1,5 à 2 fois le volume de B8 + CEPT pour éviter la déplétion des nutriments (3-4 mL par puits dans une plaque à 6 puits).
    REMARQUE : Lors du passage de hPSC ou d’expériences de différenciation de semencement, nous complétons préférentiellement les milieux B8 avec CEPT, un cocktail de chroman 1, d’emricasan, de polyamines et de trans-ISRIB, plutôt que l’inhibiteur ROCK conventionnel Y-27632, en raison de sa capacité avérée à améliorer la survie deshPSC 18. Néanmoins, Y27632 reste une alternative valable à ce protocole.
  3. Effectuez les changements de média en utilisant les médias différenciés S1 à S4 selon le calendrier suivant : S1 (jours 1-4), S2 (jours 4-7), S3 (jours 7-9) et S4 (jours 9-11).
    REMARQUE : Voir le Tableau 1 pour les compositions multimédias complètes ; des détails procéduraux supplémentaires sont décrits par Barsby et al.7.

2. Génération de clusters 3D et différenciation vers les cellules productrices d’insuline

REMARQUE : Au jour 11, les cellules différenciées devraient avoir évolué en progéniteurs pancréatiques. Pour favoriser davantage la différenciation endocrinienne à ce stade, les cellules passent d’une culture planaire à une culture 3D.

  1. Ajoutez 0,5 mL de solution anti-adhérence à 5 % (p/v) (voir le tableau 1 pour les détails) pour recouvrir le fond d’une plaque de micropuits à 24 puits contenant des micropuits pyramidaux inversés (diamètre de 400 μm). Centrifugez à 1 300 g pendant 10 minutes à température ambiante (RT).
    REMARQUE : La solution anti-adhérence crée une surface antiadhérente qui empêche les cellules d’adhérer au plastique et favorise une agrégation uniforme.
  2. Examinez les micropuits au microscope pour détecter des bulles d’air et ré-centrifugez si nécessaire pour éliminer tout air piégé (Figure 2A). Aspirez la solution anti-adhérence et lavez deux fois avec 0,5 mL de PBS/puits. Laissez les puits couverts de PBS jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être utilisés.
  3. Lavez les cellules avec 1 mL de PBS-0,5 mM EDTA, aspirez le PBS-EDTA, et recouvrez les puits de trypsine (1 mL pour un puits d’une plaque à 6 puits). Incubez à 37 ºC pendant 8 à 12 minutes (jusqu’à ce que le tapotement provoque un décollement visible).
  4. Ne retirez pas la trypsine ; diluez plutôt avec 2x volumes de DMEM-F12 ou PBS, puis resuspendez doucement par pipetage. Placez la suspension dans un tube conique et passez immédiatement à l’étape suivante.
    REMARQUE : Il vaut mieux incuber plus longtemps en trypsine que de pratiquer une trituration mécanique rude.
  5. Centrifugez la suspension à 200 g pendant 3 minutes en RT. Aspirez soigneusement le surnageant et resuspendez doucement le pellet dans un milieu S4 préchauffé (1,25 mL pour chaque puits d’un micropuits à 24 puits).
  6. Aspirez le PBS provenant de micro-puits de antenne. Ajoutez doucement 1,25 mL des cellules en suspension à chaque puits de la plaque du micropuits.
    REMARQUE : Chaque puits de la plaque de 24 micropuits contient 1 200 micropuits. La densité d’ensemencement nécessaire pour obtenir des grappes de taille appropriée est de 1 500 cellules par micropuits, correspondant à 1,8 million de cellules par puits. Alternativement, des micropuits à 6 puits peuvent être utilisés, ajustant les volumes et le nombre de cellules (environ 8,85 millions de cellules dans 5 mL de milieu de stade 4).
  7. Centrifugez la plaque à 100 g pendant 3 minutes à RT pour répartir les cellules uniformément dans les micropuits. Transférez soigneusement les plaques de micropuits dans un incubateur humidifié.
  8. Effectuer des modifications de média en utilisant les supports de différenciation S5 (D14-D18), S6 (D18-D25) et S7 (D25-D46).
    REMARQUE : Les détails complets de la composition sont fournis dans le Tableau 1, avec des détails procéduraux supplémentaires décrits par Barsby et al.7.
    Le cocktail CEPT peut être utilisé à cette étape à la place de l’inhibiteur ROCK Y-27632, en raison de sa capacité avérée à améliorer la survie cellulaire lors de la formation del’organoïde 18. L’agrégation réussie est indiquée par la formation d’amas sphériques compacts en 24 à 48 heures (voir Figure 2B).

3. Transplantation d’îlots SC dans le muscle tendu de souris immunodéficientes

REMARQUE : Les îlots SC ont été transplantés à différents stades de différenciation (du stade 4 au stade 7). Alors que la transplantation d’îlots SC S7 différenciés représente la stratégie optimale pour évaluer la réactivité auglucose 6, la transplantation de progéniteurs à un stade plus précoce (S4-S5) ou d’îlots SC immatures (S6) peut aider à révéler des différences de différenciation ou de maturation masquées in vitro par l’utilisation de conditions de culture définies. Cependant, la greffe de progéniteurs moins différenciés comporte un risque accru de formation de tératomes, principalement en raison de populations cellulaires résiduelles non différenciées.

  1. Compactage des amas
    1. Transférer la quantité appropriée de grappes dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL (voir note).
      REMARQUE : La dose cellulaire dépend de l’objectif expérimental. Pour l’histologie, 0,5 à 1 million de cellules par souris suffisent pour une récupération fiable des greffes, tandis que les tests fonctionnels ou la réversion du diabète chez les souris traitées par STZ nécessitent généralement des doses plus élevées, jusqu’à 2 à 5 millions de cellules. Avant la compactation, les îlots SC doivent présenter une morphologie sphérique uniforme avec un diamètre cible de ~150-250 μm (plage acceptable : 100-300 μm). Cette plage de taille correspond approximativement à ~10³-4 × 10³ cellules par groupe, les agrégats surdimensionnés (>300-400 μm) doivent être évités, car ils sont plus susceptibles à la nécrose centrale. La taille et l’uniformité des grappes sont vérifiées avant compactage par imagerie en champ clair ou stéréoscopique des puits représentatifs, suivies d’une mesure du diamètre à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image standard.
    2. Connectez la seringue à l’ensemble aiguille-tube et remplissez-le avec un medium S7.
    3. Aspirez les grappes directement dans le tube à partir du tube de la microcentrifuge. Pliez le tube en deux et insérez la section pliée dans une pointe de pipette de 200 μL. Insérez l’ensemble pointe-tubulaire-aiguille dans un tube conique de 15 mL et fixez les extrémités au bord du tube à l’aide de ruban adhésif.
    4. Centrifugez le tube à 100 g pendant 2 minutes à 4 °C pour compacter les grappes. Placez immédiatement le tube sur la glace.
  2. Transplantation de grappes dans des souris
    REMARQUE : Toutes les interventions chirurgicales doivent être réalisées avec un équipement de protection individuelle approprié et conformément aux réglementations institutionnelles sur la biosécurité et le bien-être animal. Les agents anesthésiques et les objets tranchants doivent être manipulés et éliminés selon les procédures de sécurité approuvées.
    1. Induire l’anesthésie chez les souris NOD-scid-gamma à l’aide d’isoflurane à 3-5 %.
    2. Rasez le côté postérieur de la jambe droite sous le genou et désinfectez avec 70 % d’éthanol.
    3. Détachez le tube de la pointe de la pipette et connectez-le à la seringue. Coupez le tube près des grappes compactées et fixez-le à l’extrémité émoussée de l’aiguille. Poussez le sérum jusqu’à ce que la première grappe atteigne la pointe de l’aiguille.
    4. Placez la souris à plat ventre, penché vers la droite, et étendez la jambe droite. Insérez l’aiguille à 4-5 mm de profondeur dans le compartiment médial de la cuisse droite, dans la région entre les muscles adducteur et gracilis.
    5. Injectez les grappes tout en rétractant l’aiguille de ~3 mm. Faites pivoter la seringue et retirez l’aiguille.
    6. Surveillez la souris jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie de l’anesthésie.
      REMARQUE : Pour la caractérisation fonctionnelle (c’est-à-dire GSIS in vivo , section 4), des îlots SC d’un seul génotype par souris doivent être utilisés ; Une seule greffe suffit. Cependant, pour la caractérisation histologique ou transcriptomique de la maturation après l’implantation, les deux jambes peuvent être utilisées (par exemple, une jambe portant des clusters SC dérivés de hPSC contenant un variant génétique associé à la maladie, et l’autre jambe avec le variant corrigé). Une délivrance intramusculaire correcte ne peut pas être confirmée directement in vivo immédiatement après l’injection. L’implantation réussie est au contraire vérifiée rétrospectivement par l’identification macroscopique du greffon au moment de la ponction (Figure 3) et par analyse histologique (Figure 4).

4. Sécrétion d’insuline stimulée par le glucose in vivo (GSIS)

REMARQUE : Le GSIS in vivo, via un défi oral au glucose, évalue la sécrétion fonctionnelle d’insuline en réponse à un stimulus physiologique. Toutes les procédures doivent suivre les directives institutionnelles de soins et d’utilisation des animaux. Les réponses fonctionnelles des cellules β transplantées s’améliorent avec la maturation in vivo : le peptide C humain peut être détecté dès 2 semaines après la greffe, tandis qu’une sécrétion robuste de glucose réactive est généralement obtenue après 4 semaines. Ces délais peuvent varier selon le stade de développement des îlots SC au moment de la transplantation

  1. Souris rapides pendant 4 à 6 heures avant l’administration du glucose, assurant ainsi l’accès à l’eau.
  2. Préparez une solution de D-(+)-glucose à 20 % (en pa/v) dans de l’eau. Stérilisez en passant par un filtre de 0,22 μm et réchauffez à température ambiante avant utilisation.
  3. Peser chaque souris et calculer la dose de glucose requise à 3 g/kg de poids corporel.
  4. Chargez le volume approprié de solution de glucose dans une aiguille de gavage courbe de 20 G fixée à une seringue de 1 mL.
  5. Maîtrisez doucement la souris et effectuez un gavage oral, en assurant une insertion fluide de l’aiguille pour éviter l’aspiration trachéale.
  6. Prélever des échantillons sanguins par ponction sous-mandibulaire ou veineuse caudale au départ (0 min) et 15 et 30 minutes après le gavage, à l’aide de tubes capillaires et de microcentrifuge de 1,5 mL. Laissez le sang coaguler à température ambiante pendant environ 15 minutes, puis stockez les tubes sur de la glace.
  7. Centrifugez les échantillons à 1 000 g pendant 15 minutes à 4 °C et transférez le sérum dans de nouveaux tubes. Conserver à −80 °C jusqu’à analyse par ELISA.
    REMARQUE : Les points temporels peuvent être ajustés selon le modèle expérimental. Il est essentiel d’utiliser un test capable de distinguer l’insuline humaine de la souris ou le peptide C afin d’évaluer la sécrétion d’insuline dérivée du greffon dans les modèles xénotransplantés.

5. Récupération de grappes greffées

  1. Euthanasiez la souris en suivant les directives institutionnelles d’éthique animale.
  2. Pour minimiser la contamination tissulaire par la fourrure, vaporisez de l’éthanol à 70 % (v/v) sur le corps.
  3. Retirez la peau pour exposer les muscles des membres inférieurs et localisez les grappes greffées à l’aide d’une loupe. Exciser le tissu contenant des greffes à l’aide de ciseaux et de pinces.
  4. Rincez le tissu une fois avec du PBS et transférez-le à 4 % (p/v) de paraformodéhyde (PFA) sur glace. Fixez le tissu en PFA à 4 % à 4 °C pendant 4 heures avec des secousses douces.
  5. Lavez l’échantillon dans un PBS pendant 1 heure en secouant doucement. Transférez le tissu à 30 % (p/v) de saccharose sur PBS et incubez toute la nuit à 4 °C.
    REMARQUE : Les tissus biologiques, les échantillons de sang et les déchets chimiques (y compris les fixateurs et résidus anesthésiques) doivent être éliminés conformément aux directives institutionnelles de biosécurité et de gestion des déchets chimiques.

6. Coloration des explants

  1. Intégration OCT
    1. Incorporez le tissu dans un moule rempli de composé à température de coupe optimale (OCT).
    2. Placez la moisissure dans un bain de glace sèche en isopropanol pour congeler rapidement l’échantillon. Conserver à -80 °C jusqu’à la cryosection.
    3. À l’aide d’un cryostat, coupez des sections de 5 à 7 μm et stockez les lames à -80 °C.
  2. Immunocoloration
    1. Équilibrez les lames à RT pendant 15 minutes à l’intérieur d’un récipient pour éviter la condensation.
    2. Rincez les lames avec du PBS pendant 3 x 5 minutes.
    3. Incuber chaque section avec 100 μL de solution de blocage/perméabilisation pendant 30 minutes à la RT (0,1 % de tensioactif non ionique dans le PBS, avec 5 % de sérum de l’espèce où l’anticorps secondaire a été élevé).
    4. Incubez chaque section avec 50 μL d’anticorps primaire dilué dans une solution de blocage/perméabilisation pendant la nuit à 4 °C.
    5. Rincez les lames avec du PBS pendant 3 x 5 minutes.
    6. Incubez chaque section avec 50 μL d’anticorps secondaire dilué dans une solution de blocage/perméabilisation 1 h à la RT.
    7. Rincez les lames avec du PBS pendant 3 x 5 minutes.
    8. Montez les glissières avec 15 μL de solution de montage avec DAPI et appliquez un couverdissage. Conservez à 4 °C dans le noir jusqu’à l’imagerie.

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Résultats

Les résultats présentés correspondent à une transplantation intramusculaire d’îlots SC de stade 7 chez des souris immunodéficientes et à une analyse réalisée 6 semaines après la transplantation. Un nombre limité d’animaux porteurs de greffes représentatives a été analysé pour illustrer la faisabilité de la procédure. Dans cette étude, un résultat réussi est défini comme la récupération macroscopique du greffon intramusculaire suivie d’une confirmation his...

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Discussion

Dans ce protocole, nous décrivons la transplantation intramusculaire d’îlots SC comme une approche simple, reproductible et minimalement invasive pour la maturation in vivo , avec un potentiel d’évaluation fonctionnelle. Bien que la greffe sous la capsule rénale soit largement considérée comme la « référence » pour l’engressement d’îlots ou d’îlots SC chez les rongeurs, elle nécessite une expertise technique accrue et une intervention chirurgicale plus longue. En revanche, le si...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Nous remercions le Dr Danwei Huangfu (Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, États-Unis) pour avoir généreusement fourni les lignes de hPSC utilisées dans cette étude. Ce travail a été soutenu par les subventions PID2021-122284NA-I00 et CNS2023-145179 du Ministère espagnol de la Science, de l’Innovation et des Universités MICIU/AEI/10.13039/501100011033 et Next GenerationEU/PRTR (A.B.), ainsi que par le CIBER-Consortium for Biomedical Research in Network, CB07/08/0029 et PID2023-150719OB-I00 (M.V.), Instituto de Salud Carlos III (ISCIII). Le Centre de recherche biomédicale sur le diabète et les troubles métaboliques associés (CIBERDEM) est une initiative de l’ISCIII et partiellement soutenue par le Fonds européen de développement régional (FEDER).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium saltSigma Aldrich49752
Activin AQkineQk001
AggreWell 400 24-well (microwell plate)Stemcell34415
BetacellulinGenScriptZ03102
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Fatty Acid FreeGoldbioA-421
CHIR 99021LC labsC-6556 
Chroman-1Medchem ExpressHY-15392CEPT cocktail
CMRL-1066Pan BiotechP04-84600
D-(+)-GlucoseSigma AldrichG7021
Dibenzazepine (DBZ)SyncomCustom productGamma-secretase inhibitor
Dulbecco's Modified Eagle Medium and Ham’s F12 media (DMEM/F12)Corning15383541
EGFQkineQk011
EmricasanMedchem ExpressHY-10396CEPT cocktail
EthanolamineSigma AldrichE9508
FGF2-G3GenScriptCustom product
FGF7GenScriptZ03047
HeparinSigma AldrichH3149
InsulinGibco30284510
L-Alanyl-L-GlutamineLinusX0551-100
L-Ascorbic AcidSanta Cruzsc-202686
LDN-193189 Sigma AldrichSML0559
Lipid ConcentrateGibco11548846
Matrigel (basement membrane-derived extracellular matrix)Falcon354230
MCDB 131Corning15-100-CV
N-acetylcysteineThermo Scientific10521221
NaHCO3Fisher Scientific10553325
NicotinamideSigma AldrichN0636
NRG-1QkineQk045
Pluronic F-127 (anti-adherence solution)Sigma Aldrich82184Used at 5% (w/v)
Polyamine Supplement (1000×)Sigma AldrichP8483CEPT cocktail
RepSoxMedChemExpressHY-13012Alk5 Inhibitor
Retinoic AcidSigma AldrichR2625
SANT-1SelleckchemS7092
Sobetirome (GC1)Sigma AldrichSML1900-5MGCell-permeable T3 analog
Sodium PyruvateCorning25-000-CI
Sodium SeleniteSigma AldrichS5261
T3 (3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)Sigma AldrichT6397
TGF-β1 QkineQk010
TPBTocris5343
Trace Elements ACorning15333641
Trace Elements BCorning15343641
Trans-ISRIBMedchem ExpressHY-12495CEPT cocktail
TransferrinInVitria777TRF029
Triton X-100 (nonionic surfactant)Thermo Scientific11488696
TrypLEGibco11538856
Y-27632LC LaboratoriesY-5301ROCK inhibitor
ZM-447439 MedChemExpressHY-10128
ZnSO4Sigma AldrichZ0251
Antibodies
Rat anti-Human C-peptide (insulin)DSHBGN-ID4-sUsed at 150 ng/mL
Mouse anti-glucagonProteintech67286-1-Ig1:2000
Rabbit anti-somatostatinMilliporeAB54941:500
Goat anti-rat AF488InvitrogenA-110061:500
Donkey anti-mouse AF488InvitrogenA-212021:500
Donkey anti-rabbit AF488InvitrogenA-212061:500

Références

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