Le profilage ARN-seq des ganglions lymphatiques drainants et métastatiques dans le cancer du sein HER2-positif identifie le POSTN comme marqueur pronostique

Résumé

Nous révélons un programme centré sur la matrice extracellulaire et PI3K-AKT sous-jacent à la diffusion des ganglions lymphatiques dans le cancer du sein HER2 positif et identifions POSTN comme un marqueur de mauvais pronostic, soutenant la stratification du risque et les stratégies thérapeutiques orientées par les voies.

Résumé

Le cancer du sein HER2-positif est cliniquement agressif et se propage fréquemment aux ganglions lymphatiques régionaux, pourtant les programmes transcriptomiques associés à la propagation ganglionnaire restent incomplètement définis. Ici, nous avons profilé les ganglions lymphatiques drainants tumoraux (TDLN) appariés et les ganglions lymphatiques impliqués par la tumeur métastatique (TMLN) de six patientes atteintes d’un cancer du sein HER2-positif à l’aide du séquençage ARN (RNA-seq). Une analyse différentielle de l’expression a été réalisée avec DESeq2, appliquant la correction de Benjamini-Hochberg (FDR < 0,05) et un seuil absolu de multiplication log2 (|log2FC| ≥ 1). Nous avons identifié 237 gènes exprimés différemment (182 à la hausse et 55 à la baisse dans la TMLN par rapport à la TDLN). Les analyses d’enrichissement fonctionnel ont mis en lumière l’interaction matrice extracellulaire (MCE) récepteur, la signalisation PI3K-AKT, l’adhésion focale et le métabolisme du cholestérol comme voies marquantes associées aux ganglions lymphatiques métastatiques, suggérant un remodelage coordonné de la MCE et une activation de signalisation lors de la dissémination ganglionnaire. Parmi les gènes les plus augmentés, POSTN s’est révélé comme un candidat clé et a été également associé à des caractéristiques clinicopathologiques défavorables. Dans une cohorte de validation indépendante (n = 120), une expression plus élevée de POSTN était associée à une survie sans maladie inférieure. Collectivement, ces résultats désignent POSTN comme un biomarqueur pronostique potentiel et soutiennent des mécanismes centrés sur la MCE et liés à PI3K-AKT comme caractéristiques biologiques exploitables de la métastase ganglionnaire dans le cancer du sein HER2-positif.

Introduction

Le cancer du sein (BC) est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez les femmes et une cause majeure de mortalité par cancer dans le monde, avec un fardeau important et croissant en Chine^. Environ 15 % à 20 % des contraceptifs sont HER2-positifs (HER2+), caractérisés par une amplification/surexpression d’ERBB2 et un phénotype agressif avec des risques plus élevés de récidive et de décès ^2,3. Bien que la thérapie systémique anti-HER2 ait nettement amélioré les résultats, une proportion considérable de patients rechute ou développe encore des métastases, soulignant la nécessité d’une stratification du risque biologiquement informée et de nouvelles options^{thérapeutiques 4}.

La métastase ganglionnaire (LNM) est un déterminant clé de la stadification, du choix du traitement adjuvant et du pronostic chez la BC ; L’implication axillaire annonce une survie inférieure et facilite une diffusion ultérieure vers des organes^{éloignés 5,6}. Pourtant, les biomarqueurs robustes qui capturent la biologie de la propagation ganglionnaire dans la maladie HER2+ restent limités, et les facteurs cliniques actuels n’expliquent que partiellement l’hétérogénéité des^{résultats 7}.

Les avancées en RNA-seq permettent un profilage à large transcriptome et à large plage dynamique et sont désormais largement adoptées en oncologie^{translationnelle 8}. Cependant, la plupart des études d’expression dans HER2+ BC se concentrent sur les tumeurs primaires ou les cohortes non appariées, tandis que le profilage comparatif des ganglions lymphatiques drainants tumoraux (TDLN) et des ganglions lymphatiques métastatiques tumoraux (TMLN) est limité, limitant la compréhension des programmes moléculaires sous-jacents à la colonisation et à la progression des^{ganglions 9}.

Sur la base de l’importance clinique des métastases ganglionnaires lymphatiques et des preuves antérieures impliquant le remodelage de la matrice extracellulaire (ECM) et l’activation de PI3K-AKT dans le sémiement^{métastatique 10}, nous avons émis l’hypothèse que, chez le même patient, les ganglions lymphatiques tumeur-métastatiques (TMLN) présenteraient un programme transcriptomique distinct par rapport aux ganglions lymphatiques drainant la tumeur (TDLN) appariés, et qu’un sous-ensemble de gènes associés à la MCE constamment augmentés serait lié à des caractéristiques clinique-pathologiques indésirables et Risque de récidive. Pour tester cette hypothèse, nous avons profilé des paires TDLN et TMLN de six patients positifs à HER2 afin d’identifier des gènes différentiellement exprimés (DEG) et des voies associées à la dissémination ganglionnaire. Nous avons ensuite donné la priorité à POSTN et évalué sa pertinence pronostique dans une cohorte indépendante, liant le remodelage ECM et la signalisation PI3K-AKT à une stratification du risque cliniquement utile dans le cancer du sein HER2+. Les détails de l’évaluation HER2 (selon les critères contemporains ASCO-CAP), du séquençage, du contrôle qualité, de l’appel DEG avec DESeq2 et le contrôle Benjamini-Hochberg FDR, ainsi que des procédures de validation sont fournis^{ici 11,12}.

Protocole

Cette étude a été approuvée par le comité d’éthique institutionnelle et menée conformément à la Déclaration d’Helsinki et aux réglementations locales régissant l’utilisation des biospécimens humains. Cette étude a été approuvée par le comité d’éthique de l’hôpital Boai de Zhongshan (KY-2020-012-124). Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants avant toute procédure spécifique à l’étude.

Cohortes d’étude et échantillons
La cohorte de découverte comprenait des tissus jumelés de ganglion lymphatique drainant la tumeur (TDLN) et de ganglions lymphatiques métastatiques (TMLN) prélevés intraopératoirement sur 6 patientes atteintes d’un cancer du sein HER2-positif. Pour chaque patient, le TDLN apparié était défini comme un ganglion lymphatique drainant sans preuve histologique de métastase, et servait de comparateur témoin interne au patient, tandis que le TMLN était un tissu métastatique confirmé par pathologie. Les tissus frais étaient brièvement rincés dans une solution physiologique tamponnée au phosphate froid (PBS), séchés sous sécher, congelés instantanément dans de l’azote liquide dans les 30 minutes suivant l’excision, puis conservés à -80 °C jusqu’à l’extraction. Les critères d’inclusion étaient un carcinome du sein invasif confirmé pathologiquement, un statut HER2 positif selon ASCO/CAP, la disponibilité de ganglions appariés, et l’absence de traitement néoadjuvant. Les critères d’exclusion étaient un nombre d’intégrité tissulaire ou ARN (RIN) inadéquat < 7,0. Un échantillon initialement dépisté a échoué à la QC en raison d’un RIN < 7,0 et a été exclu, donc toutes les analyses de découverte utilisent systématiquement n = 6. La cohorte de validation indépendante comprenait 120 échantillons d’archives de ganglions lymphatiques FFPE avec suivi clinique et a été utilisée pour la qRT-PCR et les analyses des résultats. Pour la modélisation pronostique, les patients ont été comparés par groupes d’expression POSTN (Élevé vs. Bas, avec un point de coupure déterminé par la tuile X), le groupe Faible servant de comparateur de référence. Les cas avec un suivi manquant ou des covariables incomplètes ont été exclus de la modélisation pronostique.

Justification de la taille de l’échantillon (découverte et validation)
L’étape de découverte utilisait un design apparié TDLN-TMLN pour maximiser le contraste interne au patient et réduire la variance interindividuelle tout en contrôlant la multiplicité à FDR = 0,05. Pour la cohorte de validation (n = 120), l’expression POSTN a été dichotomisée au point de coupure déterminé par la tuile X (Haut/Faible = 40/80). Compte tenu de 48 événements de survie sans maladie (DFS) et α = 0,05, une approximation de Schoenfeld indique ≥ capacité de 80 % à détecter des rapports de risque cliniquement pertinents d’environ HR ≥ 2,3 sous allocation égale ; cela correspond à la taille de l’effet observée (HR = 2,31, IC à 95 % 1,41-3,77).

Définition de la positivité de HER2
La positivité HER2 suivait les critères ASCO/ CAP^{contemporains 13} : immunohistochimie (IHC) 3+ définie comme une coloration membranaire uniforme intense dans >10 % des cellules tumorales, ou l’hybridation in situ (ISH) amplifiée définie comme un rapport HER2/CEP17 ≥2,0 avec un nombre moyen de copies HER2 ≥4,0 signaux par cellule. Les résultats de l’IHC 2+ ont subi un réflexe ISH avec un recompte aveuglément de ≥20 cellules tumorales invasives afin de confirmer le statut d’amplification.

Traitement tissulaire et isolement de l’ARN
Toutes les procédures ont été réalisées sur glace sauf indication contraire, en utilisant des consommables sans RNase. Pour chaque échantillon contenant ≤ tissu de 100 mg, l’homogénéisation a été réalisée avec 1 mL de réactif acide guanidinium-thiocyanate-phénol-chloroforme (AGPC), suivie d’une addition de 200 μL de chloroforme avec un mélange vigoureux de 15 s et une incubation à température ambiante de 2 à 3 minutes. La séparation de phase a été réalisée par centrifugation à 12 000 x g pendant 15 minutes à 4 °C. La couche aqueuse a ensuite été transférée dans un tube frais, et l’ARN a été précipité avec 500 μL d’isopropanol après une incubation de 10 minutes à température ambiante. Le pelletage a été achevé à 12 000 x g pendant 10 minutes à 4 °C. Le pellet a été lavé avec 1 mL d’éthanol à 75 % puis centrifugé à 7 500 g pendant 5 minutes à 4 °C, séché à l’air pendant 5 à 10 minutes, puis dissous dans de l’eau sans RNase. Une digestion DNase I en colonne a été utilisée lorsque l’on soupçonnait un transfert d’ADN génomique. Les points de contrôle visuels comprenaient une séparation de phase claire après extraction du chloroforme et un pellet translucide intact après la précipitation d’isopropanol. Le dépannage comprenait la répétition du lavage à l’éthanol pour obtenir de faibles rapports A260/230 et l’extension des précipitations ou l’assurance du refroidissement lors de la mise en granule pour obtenir de faibles rendements.

Contrôle qualité ARN
La quantification a utilisé la spectrophotométrie pour surveiller A260/280 et A260/230 avec des cibles autour de 1,8-2,1, complétées par des mesures fluorométriques pour la précision. L’intégrité a été évaluée sur un système d’électrophorèse microfluidique et a nécessité un RIN ≥ 7,0. Des pics distincts de 18S/28S rRNA et l’absence d’un frottis génomique d’ADN ont été utilisés comme critères d’acceptation ; Les seuils d’échec des échantillons ont été réextraits ou exclus.

Préparation de la bibliothèque
Des bibliothèques d’ARNm à brin ont été construites avec une sélection poly(A) pour l’ARN intact, tandis que la déplétion de l’ARNr était autorisée pour les entrées partiellement dégradées. L’entrée typique était ≥ 1 μg d’ARN total par bibliothèque. La fragmentation a été réalisée autour de 94 °C pendant 8 minutes ; synthèse d’ADNc de première brin à 50 °C pendant 50 minutes ; synthèse du second brin à 16 °C pendant 60 minutes ; la ligation de l’adaptateur à 20 °C pendant 15 minutes ; et l’amplification PCR utilisait 10 à 12 cycles ajustés pour éviter la suramplification. Les nettoyages utilisaient des rapports de billes proches de 0,8x-1,0x, et la distribution attendue de la taille de la bibliothèque était de 300 pb, adaptateurs inclus. La qualité de la bibliothèque a été vérifiée par électrophorèse microfluidique ; La contamination adaptateur-dimère a entraîné un nettoyage plus strict, et des distributions de taille excessivement larges ont été corrigées en raccourcissant modestement la fragmentation.

Séquençage
Les bibliothèques indexées étaient séquencées en mode 150 bp (PE150) à l’extrémité paire, visant 30 millions de paires de lectures par bibliothèque. La qualité au niveau des runs nécessitait un Q30 ≥ 90 % et des densités de cluster stables avec un biais minimal de voie. Les bibliothèques ont été randomisées sur les voies pour atténuer les effets de batch, et pour exécuter des enregistrements, documenter les assignations de voies et tout contrôle sentinelle utilisé pour surveiller la contamination croisée.

Analyse computationnelle et expression différentielle
Des analyses ont été réalisées dans R (v4.3.2) sur Linux. La qualité brute de lecture a été évaluée avec FastQC (v0.11.9). Le découpage adaptateur et qualité a été effectué avec fastp (v0.23.4) utilisant la détection automatique d’adaptateurs, le découpage à fenêtre coulissante (taille de fenêtre 4 bp ; phred moyen Q ≥ 20), une longueur de lecture minimale de 50 bp, et le découpage poly-G lorsque les chimies pertinentes étaient détectées. Les lectures ont été alignées sur le génome de référence GRCh37/hg19 en utilisant HISAT2 (v2.2.1) avec des paramètres de brin appropriés à la bibliothèque et des indices connus du site de splice. Les comptages au niveau des gènes étaient générés avec des featureCounts (Subread v2.0.3) par rapport à GENCODE v19 en utilisant le comptage par extrémités par paires, la gestion des lectures chimériques, des paramètres multi-mappers, et le bon drapeau de brinement. Les gènes à faible comptage ont été filtrés en exigeant des décomptes ≥ 10 dans au moins trois échantillons. L’analyse d’expression différentielle (DE) a été réalisée à l’aide de DESeq2 (v1.40.2) selon un plan apparié (conception = ~ paire + condition) pour comparer TMLN à TDLN, avec normalisation par défaut du facteur de taille et rétrécissement par changement de fold log2 via apeglm. Les valeurs potentielles aberrantes ont été évaluées en utilisant la distance de Cook. La multiplicité à l’échelle du transcriptome était contrôlée à l’aide du taux de fausses découvertes de Benjamini-Hochberg (FDR). La signification était définie comme FDR < 0,05 et un seuil absolu log2 de changement de multiplication (|log2FC|) ≥ 1. Le cadre binomial négatif de DESeq2 fournit une modélisation moyenne-variance appropriée pour les données de comptage et stabilise les estimations du changement de pliage dans les cohortes petites à modérées. Pour les analyses de sensibilité, nous avons relancé les tests DE en utilisant edgeR et limma-voom avec les mêmes critères de filtrage et seuils FDR, ce qui a permis de produire des signaux concordants de premier rang, soutenant la robustesse des choix principaux d’analyse.

Enrichissement fonctionnel (GO et KEGG)
L’annotation fonctionnelle était effectuée dans R à l’aide de clusterProfiler (v4.8.3). Les DEG à la hausse et à la baisse ont été analysés séparément. Les identifiants génétiques ont été mappés aux identifiants géniques Entrez (organisme : Homo sapiens) avant l’enrichissement. L’enrichissement de l’ontologie génique (GO) a été réalisé à l’aide d’enrichGO (OrgDb : org. Hs.eg.db ; ONT = BP/CC/MF ; pAdajustMethod = « BH » ; pvalueCutoff = 0,05 ; qvalueCutoff = 0,05), et l’enrichissement des voies KEGG a été réalisé en utilisant enrichKEGG (organisme = « has » ; pAdajustMethod = « BH » ; pvalueCutoff = 0,05 ; qvalueCutoff = 0,05). L’univers de fond a été défini comme tous les gènes exprimés conservés après un filtrage à faible nombre dans l’analyse ED. Les termes enrichis ont été filtrés en outre pour conserver des ensembles de gènes avec 10 à 500 gènes annotés (minGSSize = 10 ; maxGSSize = 500). Les visualisations ont été générées à l’aide de ggplot2 (v3.5.1) et ComplexHeatmap (v2.16.1), incluant des diagrammes de points du rapport génique et des valeurs de -log10 (P ajusté) ; le terme « voies de réponse immunitaire » désigne des modules GO sélectionnés couvrant le traitement et la présentation des antigènes, la signalisation de l’interféron et l’activation des lymphocytes.

Interrogatoire externe de base de données
Les gènes candidats ont été interrogés dans des ressources externes afin de fournir un contexte orthogonal. L’expression tumeur versus ARNm normal a été interrogée à l’aide de GEPIA2 (v2.0) avec des échantillons de tumeurs du carcinome du sein invasif TCGA (TCGA-BRCA) comparés à des tissus mammaires normaux (normales GTEx/TCGA, si possible). Les valeurs d’expression rapportées par GEPIA2 (log2[TPM+1]) et son cadre statistique par défaut pour les comparaisons de groupes ont été utilisés pour générer des boxplots et des valeurs P pour chaque gène interrogé. La localisation au niveau des protéines a été évaluée à l’aide de l’Atlas des protéines humaines (HPA) en examinant les images et annotations immunohistochimiques de l’Atlas tissulaire et de l’Atlas de pathologie pour le tissu/cancer du sein, et en enregistrant l’intensité de coloration rapportée et le compartiment cellulaire (par exemple, stromal vs épithélial) lorsque disponibles.

Validation qRT-PCR
Des tissus ganglionnaires indépendants ont été traités comme ci-dessus pour extraire l’ARN total, et l’ADNc a été synthétisé à partir de 1 μg d’ARN lors de réactions de transcription inverse de 20 μL. La PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) a été réalisée en utilisant une chimie basée sur le SYBR, chaque réaction contenant 1x mélange maître et 0,2-0,4 μM de chaque amorce. La spécificité de l’amorce a été confirmée par des profils de courbe de fusion à crête unique, et l’efficacité d’amplification a été évaluée à l’aide de courbes standard en série de dilution, avec des efficacités acceptables définies entre 90 % et 110 %. Chaque échantillon a été analysé en triple exemplaire technique ; les réplications devaient respecter un seuil de cycle (Ct) SD ≤ 0,3. L’expression génique a été normalisée en GAPDH (ou un autre gène de référence validé, le cas échéant), et l’expression relative a été calculée à l’aide de la méthode 2^-ΔΔCt. La normalité a été évaluée à l’aide des tests de Shapiro-Wilk ; les comparaisons entre groupes utilisaient des tests t à deux faces pour des données approximativement normales ou des tests Mann-Whitney U autrement.

Analyse pronostique dans la cohorte de validation
La survie sans maladie (DFS) était le critère principal et était calculée de la date de l’opération jusqu’au premier événement de récidive documenté ou dernier suivi (censuré). Pour l’analyse primaire, l’expression du POSTN a été dichotomisée au point de coupure déterminé par la tuile X (Haut vs Faible = 40/80) ; Les analyses de sensibilité utilisaient des points de coupe alternatifs tels que les tertiles. Les courbes de Kaplan-Meier et les tests de rang logarithmique ont été utilisés pour les comparaisons univariables. Les modèles multivariables Cox à risques proportionnels ont été adaptés pour estimer les rapports de risque (HR) et les intervalles de confiance à 95 %, ajustant a priori selon l’âge, la taille de la tumeur, le statut ganglionnaire, le degré histologique et l’état des récepteurs. L’hypothèse des risques proportionnels a été évaluée à l’aide de résidus de Schoenfeld, la collinéarité a été examinée à l’aide de facteurs d’inflation de variance, et les observations influentes ont été évaluées à l’aide de dfbetas. Des analyses complètes de cas ont été réalisées après avoir exclu les cas avec des covariables de suivi manquantes ou incomplètes, comme décrit ci-dessus.

Statistiques générales et rapports
Sauf indication contraire, les données sont résumées en moyenne ± DE ou médiane (IQR), des tests bidirectionnels sont utilisés, et p < 0,05 est considérée comme statistiquement significative. Pour les analyses et l’enrichissement à l’échelle du transcriptome, la multiplicité est contrôlée avec BH-FDR, et les tailles d’effet sont accompagnées d’intervalles de confiance à 95 % lorsque cela est possible.

Sécurité et élimination des déchets
Les réactifs phénol-guanidinium et les solvants organiques étaient manipulés dans une hotte certifiée avec blouse de laboratoire, gants en nitrile et protection contre les éclaboussures. Les déchets organiques et halogénés ont été triés dans des contenants étiquetés et éliminés conformément aux politiques institutionnelles. Les déchets biologiques étaient autoclavés ou désinfectés chimiquement avant leur élimination, et les surfaces ainsi que les outils étaient décontaminés avec des solutions inactivant la RNase. Les dangers spécifiques aux réactifs, tels que la corrosivité et la toxicité, ont été documentés dans les procédures opérationnelles standard de laboratoire et observés lors de toutes les procédures.

Résultats

Cohortes et caractéristiques clinicopathologiques
La cohorte de découverte comprenait 6 échantillons appariés TDLN/TMLN, et la cohorte de validation comprenait 120 échantillons de ganglions lymphatiques archivistiques avec suivi longitudinal. Les caractéristiques clinicopathologiques de base pour les deux cohortes, incluant l’âge, la taille de la tumeur, le grade, le statut récepteur et le statut ganglionnaire, sont résumées dans le tableau 1.

Quali...

Discussion

Le cancer du sein HER2 positif se caractérise par une invasion accrue, des métastases ganglionnaires fréquentes (LNM) et des résultats inférieurs malgré une thérapie systémique^{moderne 15}. Les facteurs cliniqueopathologiques conventionnels n’expliquent que partiellement le pronostic dans ce sous-type, laissant un espace pour des marqueurs biologiquement fondés qui capturent le risque de diffusion^{ganglionnaire 16}. En profilant compar...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bioanalyseur	2100-BA	Agilent, USA	Équipement pour évaluer l’intégrité et le contrôle qualité de l’ARN.
DESeq2	N/A	R Bioconducteur	Logiciel d’analyse d’expression différentielle pour les données RNA-seq.
Logiciel FastQC	N/A	Babraham Bioinformatique	Logiciel de contrôle qualité pour les données RNA-seq afin d’évaluer la qualité des séquences.
Ligne cellulaire HEK293	ATCC-CRL-1573	ATCC, États-Unis	Lignée cellulaire embryonnaire humaine utilisée pour des expériences de transfection.
Kit qRT-PCR	4385616	ThermoFisher, États-Unis	Kit PCR quantitatif pour valider l’expression génique.
Kit d’extraction d’ARN	74204	Qiagen, Allemagne	Kit d’extraction d’ARN utilisé pour isoler de l’ARN de haute qualité à partir d’échantillons de tissu.
Kit de séquençage ARN	RS-122-2001	Illumina, USA	Kit de préparation de bibliothèque d’ARN pour séquençar des échantillons d’ARN.
Plateforme de séquençage	NovaSeq 6000	Illumina, USA	Plateforme de séquençage d’ARN à haut débit pour séquençar les bibliothèques d’ARN.
Équipement de congélation des tissus	TFE-300	Thermo Fisher, États-Unis	Équipement pour congeler des échantillons de tissus dans de l’azote liquide.
Thermomètre tympanique	55678-TT	ThermoScience, Japon	Thermomètre précis utilisé pour la mesure de la température corporelle.